Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Thùy Vân PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, người tận tình bảo giúp đỡ em thời gian học tập nghiên cứu luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô giáo tổ môn Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giảng dạy khuyến khích em thời gian học tập Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ, động viên em Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Vũ Văn Khoan Vũ Văn Khoan i K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan viết luận văn thật Đây kết nghiên cứu riêng Tất số liệu thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, số liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết công bố Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Vũ Văn Khoan Vũ Văn Khoan ii K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục hình bảng biểu Danh mục từ viết tắt Mở đầu Nội dung Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.1 Lược sử nghiên cứu 1.1.2 Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.2 Đặc điểm chế hình thành màng bacterial cellulose 10 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc màng bacterial cellulose 10 1.2.2 Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose 11 1.3 Đột biến vi sinh vật 12 Chương 2: Phương pháp nghiên cứu 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu hóa chất 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp vi sinh 15 2.2.2 Phương pháp đột biến vi sinh vật 17 2.2.3 Phương pháp tuyển chọn sơ chủng sau đột biến 17 2.2.4 Phương pháp toán học 18 Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận 19 3.1 Chọn chủng đầu dòng 19 3.2 Xác định sơ thời gian đột biến phương pháp đột biến phù hợp 20 Vũ Văn Khoan iii K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 3.2.1 Xác định sơ thời gian đột biến 20 3.2.2 Xác định phương pháp đột biến phù hợp 22 3.3 Tuyển chọn kiểm tra khả tạo màng chủng sau đột biến 23 3.3.1 Đột biến tuyển chọn 23 3.3.2 Kiểm tra khả tạo màng BC chủng sau đột biến 25 3.4 Xác định biến đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng trước sau đột biến 26 Kết luận kiến nghị 30 Tài liệu tham khảo 31 Vũ Văn Khoan iv K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG BIỂU HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn A.xylinum Hình 1.2 Cấu trúc cellulose 10 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp cellulose A.xylinum 12 Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum BHN2 19 Hình 3.2 Sơ đồ đột biến phù hợp với vi khuẩn A.xylinum tia UV 22 Hình 3.3 Khuẩn lạc sau đột biến chủng D7BHN2.3 24 Hình 3.4 Chủng sau đột biến nhân ống nghiệm 24 Hình 3.5 Khả tạo màng chủng D7BHN2.3 25 Hình 3.6 Màng BC chủng D7BHN2.3 26 Hình 3.7 Hình thái tế bào vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước đột biến (A) sau đột biến (B) 28 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước đột biến (A) sau đột biến (B) 28 BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur (1950) Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 sau tuyển chọn 20 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian tác động tia UV đến khả sinh trưởng vi khuẩn A.xylinum BHN2 21 Bảng 3.3 Khả tạo màng chủng sau đột biến 23 Bảng 3.4 So sánh khả tạo màng chủng đột biến 25 Bảng 3.5 Điểm sai khác chủng ban đầu chủng sau đột biến A.xylinum BHN2 27 Vũ Văn Khoan v K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.xylinum : Acetobacter xylinum BC : Bacterial cellulose PMG : Phosphoglucomutase UGP : Glucose-1-phosphate uridylytransferase 1PFK : Fructose-1-phosphate kinase Fru-6-P : Fructose-6-phosphate Glc-1-P : Glucose-1-phosphate UDPGlc : Uridine diphosphoglucose GK : Glucokinase FBP : Fructose-1,6-biphosphate phophatase G6PDH : Glucose-6-phosphate dehydrogenase PGI : Phosphoglucoisomerase PTS : Hệ thống phosphotransferase Fru-bi-P : Fructose-1,6-bi-phosphate Glc-6-P : Glucose-6-phosphate PGA : Phosphogluconic acid FK : Fructokinase CS : Cellulose synthase CFU : Colony Forming Unit UV : Ultra Violet VSV : Vi sinh vật cs : Cộng Vũ Văn Khoan vi K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae Vi khuẩn A.xylinum tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường dịch lỏng, chúng hình thành bề mặt lớp màng Bacterial cellulose (màng BC), tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose Màng BC cấu tạo chuỗi polimer--1,4 glucopyranose không phân nhánh tổng hợp từ số loài vi khuẩn nuôi cấy chúng môi trường dịch lỏng Hầu hết nghiên cứu A.xylinum loài vi khuẩn tổng hợp màng BC có hiệu cao [23] Màng BC A.xylinum tạo có cấu trúc hóa học đặc tính học giống với cellulose thực vật có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả thấm hút nước nhanh, khả polymer hóa lớn Vì BC ứng dụng rộng rãi giới nhiều lĩnh vực công nghệ Một ứng dụng quan tâm sản xuất màng BC điều trị bỏng tổn thương da [6] Màng BC hoàn toàn sản xuất nước phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn A.xylinum môi trường lỏng Tuy nhiên vấn đề gặp phải chủng A.xylinum dễ bị thoái hóa, việc không ngừng nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp cellulose cần thiết Chính lý mà định chọn đề tài: “Nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp cellulose chủng A.xylinum BHN2 tia UV” Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng đột biến từ chủng A.xylinum BHN2 có khả sinh tổng hợp cellulose chủng gốc Nội dung đề tài + Chọn chủng đầu dòng + Xác định thời gian đột biến phương pháp đột biến thích hợp + Đột biến tuyển chọn chủng đột biến + Xác định thay đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng trước sau đột biến Ý nghĩa đề tài Tạo chủng đột biến tạo màng BC có chất lượng tốt rút ngắn thời gian, hạ giá thành so với chủng bình thường Từ sản xuất màng BC với số lượng nhiều đáp ứng nhu cầu Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.1 Lược sử nghiên cứu 1.1.1.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới Hiện nay, vi khuẩn A.xylinum ứng dụng quan tâm nhiều nhà khoa học giới Tập trung theo hai hướng bản:  Hướng thứ nhất: Chủ yếu phân lập tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính sinh học A.xylinum từ xác định vị trí phân loại chúng sinh giới Tiêu biểu nghiên cứu Beijerinck, Frateur [19] Trên sở nghiên cứu đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa tác giả xác định nguồn gốc, đặc điểm phân loại A.xylinum Các nghiên cứu số nhà khoa học Nhật Bản Kumiko Nanda cs, P M Kutima; T.T Kadere cs [24] Các tác giả phân lập tuyển chọn nghiên cứu đặc tính sinh học A.xylinum Và số chủng vi khuẩn acetic khác phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống Nhật Mnazi, Komesu, Kurosu  Hướng thứ hai: Nghiên cứu trình sinh tổng hợp, đặc điểm ứng dụng BC vi khuẩn A.xylinum Đó nghiên cứu khả tổng hợp cellulose chủng A.xylinum; ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp cellulose Mở đầu S Hestrin; M Scharmn cs [21], [26], [25], sau loạt nghiên cứu tương tự, [18], [20], [22] Tiếp đến nghiên cứu chế tổng hợp màng BC, đường chuyển hóa cacbon vi khuẩn A.xylinum Mở đầu nghiên cứu R.M Brown cs, K.Zaar [17] Gần chế sinh tổng hợp cenllulose, hệ enzyme Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội tham gia đường chuyển hóa cacbon vi khuẩn A.xylinum dần sáng tỏ [26] Từ nửa sau kỷ XIX đến có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng màng BC lĩnh vực khác Đặc biệt màng trị bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng thu kết tốt Wan Millon đăng ký quyền làm màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng [27] Về sau có nhiều tác giả khác nghiên cứu hướng 1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum Việt nam Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế dịch, máu qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt bỏng sâu người ta thường sử dụng loại vật liệu che phủ tạm thời Việc sử dụng vật liệu che phủ tạm thời có nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng sử dụng từ lâu Tuy nhiên, việc sử dụng loại da dừng lại cách sử dụng đơn giản, da tươi Mặc dù da dị loại tươi có ưu điểm, đặc biệt khả bám dính tốt, có nhược điểm định Hơn nữa, việc sử dụng lại bị động, bảo quản xử lý phức tạp, khó sử dụng rộng rãi lâm sàng Vật liệu từ da đồng loại lý tưởng cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhiều trường hợp khan hiếm; không đủ đáp ứng Chính vật liệu che phủ tạm thời từ loại màng sinh học lựa chọn số một, có vai trò quan trọng điều trị bỏng Một loại màng sinh học quan tâm ngày màng cellulose vi khuẩn Tại Việt Nam việc nghiên cứu sử dụng màng BC từ vi khuẩn A.xylinum ngày quan tâm Có số nghiên cứu, công bố liên quan đến A.xylinum hình thành màng BC ứng dụng màng BC Các công Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian tác động tia UV đến khả sinh trưởng vi khuẩn A.xylinum BHN2 Thời gian đột biến (phút) Khả mọc vi khuẩn ++++ +++ ++ 10 + 15 - Chú thích: + + + + : Mọc tốt (mật độ khuẩn lạc > 50 CFU/ đĩa petri) + + + : Mọc tốt (mật độ khuẩn từ 31 – 50 CFU/đĩa petri) + + : Mọc (mật độ khuẩn lạc từ 11- 30 CFU/đĩa petri) + : Mọc yếu (mật độ khuẩn lạc từ 1-10 CFU/đĩa petri) - : Không mọc 50% số đĩa petri Qua bảng số liệu ta thấy , thời gian tác động tia UV dài ảnh hưởng mạnh tới khả sống sót vi khuẩn Ở thời gian 15 phút, không tế bào vi khuẩn sóng sót, nhiên tác động tia UV phút chúng mọc tốt Có thể giải thích điều sức sống tế bào vi khuẩn khác nên chúng chống chịu khác tia tử ngoại Tại thời điểm phút, khả sống sót vi khuẩn lớn định chọn thời gian phút, với khoảng cách đèn tử ngoại 20 cm thích hợp cho trình tác động tia UV vi khuẩn A.xylinum BHN2 nhằm thu dòng đột biến Vũ Văn Khoan 21 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 3.2.2 Xác định phương pháp đột biến phù hợp Đột biến qua dịch: Nuôi vi khuẩn A.xylinum môi trường lỏng 25-300C 8-12h Sau tiến hành đột biến đèn UV Đột biến môi trường thạch đĩa: Nuôi vi khuẩn A.xylinum môi trường dịch thể 25-300C 8-12h Pha loãng mẫu, trang môi trường thạch Để tủ ấm 25-300C 2-3h để tế bào phân chia Sau tiến hành đột biến đèn UV Qua hai cách đột biến nêu trên: Đột biến qua dịch đột biến qua thạch đĩa, thấy phương pháp đột biến thạch đĩa petri đơn giản, dễ tiến hành thu kết xác Từ phương pháp đột biến phù hợp nêu đưa sơ đồ đột biến sau: Đột biến: Đèn UV λ= 253,7 nm, phút, d = 20 cm Pha loãng, trang môi trường thạch đĩa Nuôi môi trường dịch lỏng 25 – 300C 25 – 300C – 12h – 3h 25-300C Quan sát, tách riêng khuẩn lạc có hình thái đặc biệt Nhân thuần, hoạt hóa thử khả tạo màng Hình 3.2 Sơ đồ đột biến phù hợp với vi khuẩn A.xylinum tia UV Vũ Văn Khoan 22 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 3.3 Tuyển chọn kiểm tra khả tạo màng chủng sau đột biến 3.3.1 Đột biến tuyển chọn Dòng BHN2.3 tiến hành đột biến theo phương pháp nêu thu kết thể bảng sau: Bảng 3.3 Khả tạo màng chủng sau đột biến STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo màng Khả tạo màng D1BHN2.3 - - D2BHN2.3 - - D3BHN2.3 – ngày + D4BHN2.3 - - D5BHN2.3 - - D6BHN2.3 – ngày + D7BHN2.3 – ngày + D8BHN2.3 - - D9BHN2.3 - - Chú thích: + : Tạo màng - : Không tạo màng Như vậy, qua đột biến thu chủng là: D1BHN2.3, D2BHN2.3, D3BHN2.3, D4BHN2.3, D5BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3, D8BHN2.3, D9BHN2.3 (hình 3.3 hình 3.4) Kiểm tra khả tạo màng Vũ Văn Khoan 23 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội chủng thu chủng D3BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3 có khả tạo màng chủng lại hoạt tính không khả tạo màng Giải thích nguyên nhân chủng sau đột biến khả tạo màng: Tia UV tác động vào máy di truyền vi khuẩn A.xylinum làm thay đổi đoạn gen mã hóa khả tạo màng chủng BHN2 Do gen mã hóa tạo màng bị thay đổi dẫn tới khả tạo màng chủng đột biến Hình 3.3 Khuẩn lạc sau đột biến chủng D7BHN2.3 Hình 3.4 Chủng sau đột biến nhân ống nghiệm Vũ Văn Khoan 24 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 3.3.2 Kiểm tra khả tạo màng BC chủng sau đột biến Nuôi cấy chủng (D3BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3) môi trường dịch thể, điều kiện môi trường nuôi cấy tĩnh, nhiệt độ phòng để kiểm tra khả tạo màng chủng Kết thể bảng sau: Bảng 3.4 So sánh khả tạo màng chủng đột biến STT Tên chủng Thời gian tạo màng Đặc điểm màng BC D3BHN2.3 – ngày Mỏng, nhẵn D6BHN2.3 – ngày Mỏng, không đồng nhẵn D7BHN2.3 – ngày Mỏng, đồng nhẵn Nhận xét: qua quan sát thấy chủng D3BHN2.3 có thời gian tạo màng dài so với chủng lại; màng BC tạo mỏng, nhẵn Còn chủng D6BHN2.3 thời gian ngắn so với chủng D3BHN2.3 màng tạo không đồng Đối với chủng D7BHN2.3 có thời gian ngắn màng BC mỏng, đồng nhẵn So với chủng gốc BHN2 ban đầu chủng đột biến D7BHN2.3 có khả tạo màng BC tốt D7BHN2.3 D7BHN2.3 Hình 3.5 Khả tạo màng chủng D7BHN2.3 Vũ Văn Khoan 25 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội Hình 3.6 Màng BC chủng D7BHN2.3 3.4 Xác định biến đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng trước sau đột biến Để xác định thay đổi hình dạng tế bào hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn A.xylinum sau đột biến tiến hành nhuộm tế bào quan sát Kết thể bảng 3.5, hình 3.7 hình 3.8: Vũ Văn Khoan 26 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội Bảng 3.5 Điểm sai khác chủng ban đầu chủng sau đột biến A.xylinum BHN2 Điểm sai khác Hình thái Thời gian quan khuẩn lạc sát rõ khuẩn Trước đột biến Sau đột biến (BHN2) (D7BHN2.3) - ngày - ngày lạc Hình dạng Hình tròn, nhẵn Hình tròn, nhẵn xù xì Mép phẳng xù xì Mép phẳng gợn sóng Hình thái gợn sóng Màu sắc Trắng trắng sữa Trắng trắng sữa Kích thước 1- 1,5 mm 0,5 – 1,2 mm Hình dạng Hình que riêng lẻ Hình que riêng lẻ xếp thành chuỗi xếp thành chuỗi tế bào Kích thước 1,5 – 2μm 1,5 – 2μm Nhuộm Gram Bắt màu G - Bắt màu G - Khả sinh Không Không Không Không bào tử Khả di động Vũ Văn Khoan 27 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội A BHN2 B D7BHN2.3 Hình 3.7 Hình thái tế bào vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước đột biến (A) sau đột biến (B) A B Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước đột biến (A) sau đột biến (B) Từ kết ta thấy: Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng trước sau đột biến có khác biệt không đáng kể Chứng tỏ rằng: đột biến tia UV không làm thay đổi hình dạng tế bào hình thái khuẩn lạc Quá trình đột biến không làm biến đổi chủng mà đưa lại kết quả: Chủng đột biến kiểm tra khả tạo màng cho màng BC mỏng độ đồng cao Vũ Văn Khoan 28 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội chủng BHN2 trước đột biến Tuy nhiên quan sát hình dạng tế bào hình thái khuẩn lạc chưa đủ để khẳng định chủng A.xylinum BHN2 bị đột biến tác động tia UV Cần nghiên cứu so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa đặc điểm sinh học phân tử chủng đột biến chủng gốc để có tiêu cụ thể biến đổi Vũ Văn Khoan 29 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Chúng chọn chủng từ chủng A.xylinum BHN2 để kiểm tra khả tạo màng chọn chủng BHN2.3 làm chủng đầu dòng để đột biến đèn UV - Đã xác định thời gian đột biến thích hợp phút với khoảng cách 20cm lựa chọn phương pháp đột biến phù hợp đột biến qua thạch đĩa petri với bước sóng 253,7nm - Qua đột biến tạo chủng có chủng (D3BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3) có khả tạo màng Trong đó, chủng D7BHN2.3 có khả tạo màng tốt chủng gốc BHN2 - Hình dạng tế bào hình thái khuẩn lạc chủng BHN2 chủng đột biến D7BHN2.3 có khác biệt không đáng kể Kiến nghị - Do thời gian có hạn nên nghiên cứu ảnh hưởng tia UV tới khả sống sót chủng A.xylinum BHN2 gây đột biến lần đầu Để có kết tốt cần gây đột biến số lần - Cần nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng môi trường tới khả tạo màng chủng đột biến - Cần xác định rõ chất việc đột biến phương pháp phân tử - Cần nghiên cứu so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng đột biến chủng gốc để có tiêu cụ thể biến đổi Vũ Văn Khoan 30 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) Vi sinh vật học Nxb Giáo dục, tr.149-150 Nguyễn Thành Đạt (1999) Cơ sở vi sinh vật học Tập 1, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 52-55, 62-102, 185-309 Nguyễn Thành Đạt (2005) Cơ sở vi sinh vật học, tập 2, Nxb Đại học Sư phạm, tr 7-9, 37-61, 169-171 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh vật Nxb Giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 1-50 Nguyễn Thúy Hương (2006) Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn Luận án tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Trương Thị Ngọc Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương (2005) Đa dạng hóa môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum Số 2, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Phạm Thành Hổ (2006) Di truyền học, Nxb Giáo dục, tr 238-258 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006) Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng, Tạp chí dược học, số 361 10 Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Quốc Hiển (2009) Bước đầu nghiên cứu hiệu ứng làm lành vết Vũ Văn Khoan 31 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội thương hỗn hợp Chitosan tan nước – Bacterial cellulose – Nano bạc Tạp chí Phát triển KH & CN, tập 12, số 09 11 Chu Văn Mẫn (2003) Ứng dụng tin học sinh học Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh (2006) Di truyền học, tập 1, Nhà xuất Đại học Sư phạm, tr 99-137 13 Đinh Thị Kim Nhung (1996) Nghiên cứu số đặc điểm vi khuẩn Acetobacter ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm Luận án PTS khoa học Sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội 14 Đinh Thị Kim Nhung, Trần Như Quỳnh, Nguyễn Thị Thuỳ Vân (2009) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng bacterial celulose ứng dụng điều trị bỏng Báo cáo khoa học 15 Đặng Hùng Thắng (1999) Thống kê ứng dụng Nxb Giáo dục, tr 214267 16 Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng Bacterial cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam Luận văn Thạc sỹ khoa học Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội B TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Brown R.M., K.Zaar (1999) Cellulose structure and biosynthesis Pure Appl Chem Vol, 71, pp 765-775 18 Canon, R.E., and Anderson, S.M (1991) Biogenesis of Bacterial cellulose Critical Reviews in Microbiology Vol, 17, pp 435-447 19 Frateur J (1950) Essai sur la systesmatique des Acetobacter La cellule Vol 53, pp 278-398 Vũ Văn Khoan 32 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 20 Forng E.r., Anderson S.M., Canon R.E (1989) Synthetic medium for Acetobacter xylinum that can be used for isolation of auxotrophic mutants and study cellulose Biosynthesis Applied and Enviromene microbiology, pp 1317-1319 21 Hong Joo Son, Moon Su Heo, Young Gyun Kim, Sang Joon Lee (2001) Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp A9 in shaking cultures Biotechnol Appl Bichem Vol 33, pp 1-5 22 Hong Joo Son, Hee Goo Kim, Keun Ki Kim, Han soo Kim, young Gyun Kim, Sang Joo Lee (2002) Inceased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp V6 in synthetic media under shaking culture conditions Bioresorse technology Vol 86, pp 215-219 23 Jonas, R & Frarad, L.F (1998) Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability Vol 59, pp 101 – 106 24 Kumiko Nanda, Kadere T.T, Kutima P.M, Njoroge M.S (2008) “Isolation and identification of the genera Acetobacter and gluconobacter in coconut toddy (mnazi)” African Journal of biotechnology Vol 7, No 16, pp 2963-2971 25 Trygve Brautaset, Rune Sandal, Espen Fjarvik, Svein Valla (1994) Nucleotide sequence and epression analysis of Acetobacter xylinum phosphoglucomutase gene Microbilogy Vol 140, pp 1183-1188 26 Tomonori N., Naoto I., Teruko K., Yukiko K., Takayasu T., Fumihiro Y., Fukumi S., Takahis H (1999) Enhancement of cellulose production by expression of sucrose synthase in Acetobacter xylinum Applied Biological sciences Vol 96, pp 14-18 27 Wan, WK & Millon E (2005) Poly – bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl Publ US 2005037082 Al, 16 Vũ Văn Khoan 33 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 28.http://www.cesti.gov.vn/kh-cn-trong-n-c/m-t-s-ng-d-ng-c-a-cellulose-vikhu-n-bacterial-cellulose-bc-trong-l-nh-v-c-th-c-ph-m.html 29.http://www.dostbinhdinh.org.vn/MagazineNewsPage.asp?TinTS_ID=568 &TS_ID=51 Vũ Văn Khoan 34 K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Vũ Văn Khoan Đại học Sư phạm Hà Nội 35 K33B Khoa Sinh – KTNN [...]... sinh trưởng và khả năng chống chịu với tia tử ngoại c a vi khuẩn, từ đó đ a ra thời gian đột biến phù hợp Kết quả thể hiện ở bảng sau: Vũ Văn Khoan 20 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng c a thời gian tác động tia UV đến khả năng sinh trưởng c a vi khuẩn A. xylinum BHN2 Thời gian đột biến (phút) Khả năng mọc c a vi khuẩn 3 ++++ 5 +++ 8 ++ 10 + 15 -... màng Như vậy, qua đột biến chúng tôi thu được 9 chủng là: D 1BHN2. 3, D 2BHN2. 3, D 3BHN2. 3, D 4BHN2. 3, D 5BHN2. 3, D 6BHN2. 3, D 7BHN2. 3, D 8BHN2. 3, D 9BHN2. 3 (hình 3.3 và hình 3.4) Kiểm tra khả năng tạo màng Vũ Văn Khoan 23 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 c a 9 chủng thì thu được 3 chủng D 3BHN2. 3, D 6BHN2. 3, D 7BHN2. 3 có khả năng tạo màng các chủng còn lại mất hoạt tính không còn... chủng sau đột biến mất khả năng tạo màng: Tia UV đã tác động vào bộ máy di truyền c a vi khuẩn A. xylinum làm thay đổi đoạn gen mã h a khả năng tạo màng các chủng BHN2 Do vậy khi gen mã h a tạo màng bị thay đổi sẽ dẫn tới mất khả năng tạo màng ở các chủng đột biến Hình 3.3 Khuẩn lạc sau đột biến c a chủng D 7BHN2. 3 Hình 3.4 Chủng sau đột biến được nhân trong các ống nghiệm Vũ Văn Khoan 24 K33B Khoa Sinh. .. định sự thay đổi hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc c a chủng vi khuẩn A. xylinum sau đột biến chúng tôi tiến hành nhuộm tế bào và quan sát Kết quả thể hiện ở bảng 3.5, hình 3.7 và hình 3.8: Vũ Văn Khoan 26 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Bảng 3.5 Điểm sai khác gi a chủng ban đầu và chủng sau đột biến c a A. xylinum BHN2 Điểm sai khác Hình thái Thời gian quan khuẩn... nghiên cứu c a ông chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt h a học nên nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [29] Nghiên cứu về màng trị bỏng c a tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan, nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose c a A. xylinum và hoạt chất tái sinh mô c a dầu mù... tiêu chuẩn: Khả năng oxy h a acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [19]…Theo quan điểm này A. xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây: Vũ Văn Khoan 7 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học... pyrophosphorylase hay UGP): Xúc tác tổng hợp UDP – Glucose Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP – glucose Con đường sinh tổng hợp cellulose được thể hiện rõ ở hình 1.3: Vũ Văn Khoan 11 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum 1.3 Đột biến ở vi sinh vật Vi sinh vật bao gồm những sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn... truyền riêng rẽ sang từng ống nghiệm thạch nghiêng Chúng tôi đã l a chọn được 5 chủng là: BHN2. 1, BHN2. 2, BHN2. 3, BHN2. 4, BHN2. 5 và đã kiểm tra khả năng tạo màng c a 5 chủng này Vũ Văn Khoan 19 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn A. xylinum BHN2 sau khi được tuyển chọn Chủng BHN2 Khả năng tạo màng Thời gian tạo màng Đặc điểm màng BHN2. 1 4 – 5 ngày... Nội 2 hơn chủng BHN2 trước đột biến Tuy nhiên chỉ quan sát về hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc ch a đủ để khẳng định chủng A. xylinum BHN2 đã bị đột biến dưới tác động c a tia UV Cần nghiên cứu và so sánh đặc điểm sinh lý, sinh h a và đặc điểm sinh học phân tử c a chủng đột biến và chủng gốc để có được những chỉ tiêu cụ thể về sự biến đổi này Vũ Văn Khoan 29 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt... gian ngắn và màng BC mỏng, đồng đều và nhẵn So với chủng gốc BHN2 ban đầu thì chủng đột biến D 7BHN2. 3 có khả năng tạo màng BC tốt hơn D 7BHN2. 3 D 7BHN2. 3 Hình 3.5 Khả năng tạo màng c a chủng D 7BHN2. 3 Vũ Văn Khoan 25 K33B Khoa Sinh – KTNN Kh a luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Hình 3.6 Màng BC c a chủng D 7BHN2. 3 3.4 Xác định sự biến đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc c a chủng trước và sau ... tài: Nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp cellulose chủng A.xylinum BHN2 tia UV Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng đột... khuẩn A.xylinum môi trường lỏng Tuy nhiên vấn đề gặp phải chủng A.xylinum dễ bị thoái hóa, việc không ngừng nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp cellulose cần thiết Chính lý mà định chọn đề tài: Nâng. .. biến từ chủng A.xylinum BHN2 có khả sinh tổng hợp cellulose chủng gốc Nội dung đề tài + Chọn chủng đầu dòng + Xác định thời gian đột biến phương pháp đột biến thích hợp + Đột biến tuyển chọn chủng