MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong xã hội công nghiệp hóa nay, mặt sống ngƣời ngày đƣợc cải thiện, đời sống đƣợc nâng cao nhƣng công nghiệp hóa làm nảy sinh nhiều bệnh tật mang tính xã hội nhƣ: tiểu đƣờng, mỡ máu, béo phì… Chính vậy, nhà dƣợc học, thực vật học mong muốn tìm loài thực vật dùng làm thuốc hay làm thức ăn phòng chữa trị đƣợc bệnh Cây Nƣa (Amorphophallus spp.) đƣợc dùng làm thức ăn từ lâu đời Trung Quốc nƣớc Đông Nam Á Ở Trung Quốc Nhật Bản, bột từ củ Nƣa đƣợc chế biến thành nhiều loại thức ăn khác nhƣ mì, miến, thạch, bánh, kẹo Hơn nữa, bột Nƣa có chứa đƣờng glucomannan với hàm lƣợng cao, giúp làm giảm mỡ máu, chống béo phì đƣợc chế biến thành viên giảm béo loại thực phẩm chức phổ biến Ngoài ra, bột Nƣa đƣợc sử dụng mỹ phẩm làm đẹp da Theo nghiên cứu viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Việt Nam nơi phân bố số loài Nƣa có hàm lƣợng glucomannan tƣơng đối cao, Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) số Để phát triển nguồn nguyên liệu củ Nƣa krausei thu glucomannan cho công nghiệp chế biến thực phẩm thực phẩm chức vấn đề nhân giống Nƣa krausei cần thiết Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan trọng phổ biến công nghệ sinh học giúp nhân nhanh giống trồng bảo tồn loài thực vật quý Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống loài Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) phƣơng pháp nuôi cấy mô” để phục vụ sản xuất Mục đích nghiên cứu - Xây dựng đƣợc quy trình nhân giống loài Nƣa krausei phƣơng pháp nuôi cấy mô Nội dung nghiên cứu - Xác định điều kiện khử trùng hiệu - Xác định công thức môi trƣờng thích hợp tạo mô sẹo tái sinh ống nghiệm - Xác định công thức môi trƣờng thích hợp tạo đa chồi hoàn chỉnh ống nghiệm - Xác định giá thể thích hợp cho nuôi cấy mô nuôi trồng tự nhiên Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Kết đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy ống nghiệm nhân giống bảo tồn loài Nƣa krausei - Ý nghĩa thực tiễn: Kết đề tài góp phần nhân giống phục vụ trực tiếp cho ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dƣợc học Điểm đề tài - Đây công trình nghiên cứu nhân giống loài Nƣa krausei phƣơng pháp nuôi cấy mô Việt Nam Bố cục khoá luận: gồm 41 trang, 12 bảng, 16 hình ảnh đƣợc chia thành phần nhƣ sau: Mở đầu (2 trang), chƣơng (Tổng quan tài liệu: 15 trang), chƣơng (Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu: trang), chƣơng (Kết thảo luận: 14 trang), Kết luận kiến nghị (1 trang), Tài liệu tham khảo: 42 tài liệu, phụ lục Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu chi Nƣa giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới Chi Nƣa (Amorphophallus) chi lớn thuộc họ Ráy (Aracae) Trên giới chi Nƣa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới thuộc Châu Phi Châu Á Hiện nhiều loài đƣợc nghiên cứu triển khai trồng với diện tích lớn nhiều nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand, Ấn Độ, Thái Lan, In đô nê xi-a, v.v Ở Trung Quốc, riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn hecta đất đồi núi đƣợc sử dụng để trồng Nƣa, Nƣa đƣợc trồng Nam Ninh, Quảng Đông, Quảng Tây, Trùng Khánh Ở Nhật Bản, vùng Jinnejo Uedama, từ năm 70 kỷ trƣớc, hàng năm khoảng 15 nghìn Nƣa đƣợc trồng với sản lƣợng đạt tới hàng nghìn Do tầm quan trọng nguồn lợi từ củ Nƣa, nên đƣợc nhập trồng từ Nhật Bản vào New Zealand từ hàng chục năm trƣớc [23] Nƣa trồng mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên năm qua có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm sinh học nhƣ kỹ thuật canh tác Nƣa Hiroshi Kurihama (1979) đƣa định hƣớng kinh nghiệm trồng trọt Nƣa konjac đất đất dốc tỉnh Jinnejo Uedama Nhật Bản, nhƣ yếu tố nhiệt độ, đất, sâu bệnh thời vụ [26] Dhua cs (1988) có nghiên cứu ảnh hƣởng chất hoá học đến trình nảy mầm, phát triển sản lƣợng củ Nƣa chuông (Amorphophallus paeoniifolius Nicols.) [20] Liu & cs (1998) nghiên cứu sinh trƣởng phát triển số loài Nƣa Trung Quốc điều kiện sinh thái Nƣa Theo nhóm nghiên cứu, Nƣa đòi hỏi nhiều nƣớc, có khả chịu hạn tốt nhƣng không chịu đƣợc ngập úng Về nhiệt độ, Nƣa ƣa ấm, có khả chịu biến thiên nhiệt độ từ - 43oC, nhiệt độ tối thích 20 - 25oC, nhiệt độ xuống dƣới 0oC lên 48oC chết sau ngày Nghiên cứu đƣa số mức nhiệt tối thích cho phát triển củ rễ, khả lai số loài Nƣa thu đƣợc nhiều kết khả quan Cũng theo nghiên cứu cho biết Nhật Bản Trung Quốc hai nƣớc có lịch sử trồng sử dụng bột Nƣa (bột konjac) nhƣ loại thực phẩm truyền thống từ hàng nghìn năm trở trƣớc Dựa nghiên cứu rộng rãi an toàn thực phẩm, Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đƣa bột Nƣa vào thực phẩm quản lý thông thƣờng từ năm 1998 Ở Mỹ ngƣời ta chấp nhận bột Nƣa nhƣ thực phẩm bổ sung (năm 1997), cho phép sử dụng bột Nƣa nhƣ nhân tố làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa chất ổn định thực phẩm Ngày Nhật Bản, Trung Quốc số nƣớc sử dụng bột Nƣa làm nguyên liệu công nghệ dƣợc phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ trợ nhiều bệnh nhƣ đái tháo đƣờng, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ trợ giảm cân [29] Long Chu Lin (1998) có công trình nghiên cứu thực vật dân tộc học loài Nƣa, nghiên cứu ngƣời dân Trung Quốc sử dụng Nƣa làm thức ăn từ 3000 - 4000 năm trƣớc, nhiều kiến thức kỹ thuật trồng Nƣa theo lối cổ truyền đƣợc đề cập Theo nghiên cứu này, hạt số loài Nƣa khó nảy mầm tự nhiên, nhiên lại nảy mầm dễ dàng sau qua đƣờng tiêu hóa số loài chim Theo cách nảy mầm nhân tạo, Nƣa chín sau rửa vỏ cơm quả, trộn lẫn với cát ẩm tỉ lệ 1:4 cất vào chỗ tối phủ lớp đất dày dễ dàng nảy mầm [30] Theo Santosa cs (2002) Nƣa chuông lƣơng thực quan trọng Java năm 1940 - 1950, sau thời gian đƣợc sử dụng, Nƣa trở thành loài có triển vọng kinh tế lớn, có mặt loài vƣờn nhà Java ngày nhiều Trong nghiên cứu sinh trƣởng ứng dụng Nƣa chuông từ 2003 đến 2008 nhóm tác giả cho biết chu kỳ tăng tƣởng Nƣa chuông khác số nƣớc Nam Á nhƣ: Tây nam Trung Quốc, bắc Mianma, bắc Thái Lan chu kì tăng trƣởng tháng 5, kết thúc vào tháng 10, In đô nê xi-a lại tháng 11 kết thúc vào tháng 5, giai đoạn tăng trƣởng kéo dài 160180 ngày tất khu vực [37] Liu (2004) đề cập kỹ nguồn gốc, phân bố chi Nƣa, phân loại học, hình thái học, chu trình sinh trƣởng phát triển, sinh thái, chuyển hóa glucomannan, trồng trọt, nhân giống chế biến nhƣ bảo quản sau thu hoạch… loài Nƣa Theo Liu giới biết khoảng 173 loài Nƣa, có 20 loài đƣợc phát triển thƣơng mại Trung Quốc, Nhật Bản, Malaisia, Ấn Độ In đô nê xi-a, hàng năm giới sản xuất khoảng 30 nghìn bột konjac Sản lƣợng củ Nƣa tƣơi đạt tới 30 - 35 tấn/ha nhƣng khoảng 2,5 glucomannan đƣợc chiết xuất từ số lƣợng củ [28] Douglas cs (2005) có công trình nghiên cứu kỹ thuật trồng Nƣa konjac New Zealand thu đƣợc nhiều kết trọng lƣợng, chất lƣợng củ Nƣa trồng dƣới tán rừng trồng trực tiếp dƣới ánh sáng mặt trời [22] Theo Zhang Liu (2006) Nƣa phát triển theo mùa, chúng thƣờng rụng vào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý Nƣa kéo dài từ 60 80 ngày có tác nhân phá vỡ trạng thái ngủ để hình thành chồi giai đoạn Sau ngủ, bắt đầu nảy mầm, phát triển mạnh để hình thành củ mới, lúc củ mẹ hết chất dinh dƣỡng chết Trong tự nhiên, Nƣa cần năm để để phát triển đủ lớn hoa Do đó, Nƣa đƣợc đánh giá sinh trƣởng chậm cho suất thấp [40] Kết nghiên cứu Nedunchezhiyan cs (2006) giới thiệu cụ thể bƣớc nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng, tƣới nƣớc, thu hoạch, nhƣ bảo quản củ Nƣa chuông Ấn Độ Theo tác giả, Nƣa chuông hoàn toàn nhân giống đƣợc cách cắt củ thành phần khoảng 100gram trọng lƣợng Ở Ấn Độ, Nƣa chuông có tên gọi Elephant foot yam, đƣợc biết đến nhƣ rau củ giàu chất dinh dƣỡng trồng lâu đời Tây Bengat, Andhra Pradesh, Tamil Nadu, Bihar… suất Nƣa chuông khoảng 30 - 35 tấn/ha [33], [35] Nedunchezhiyan cs (2012) có công trình nghiên cứu phát sinh chồi Nƣa chuông, ảnh hƣởng loại giá thể, kích thƣớc củ giống ảnh hƣởng chất nhƣ thiourea, gibberellic acid, kali nitrat đến trình hình thành chồi Nƣa chuông [34] Theo Melinda Chua cs (2010), Trung Quốc, Nƣa đƣợc trồng xen canh với ngô kê đạt xuất cao [31] Zhang cs (2010) công bố kết nghiên cứu nhân giống so le loài Nƣa là: A.bulbifer A muelleri nhằm tìm loài Nƣa thích hợp cho vùng Nam Á Sau nghiên cứu so sánh với Nƣa konjac (A konjac), nhóm nghiên cứu kết luận loài A muelleri có khả thích ứng tốt với khí hậu Nam Á, cho hàm lƣợng glucomannan cao (>70%) phát triển trồng bắc Mianma Lào Nghiên cứu giải thích Nam Á ngƣời ta sử dụng củ mà không sử dụng hạt Nƣa làm vật liệu nhân giống Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậu khu vực thuận lợi cho phát triển loài cỏ dại, từ hạt thƣờng không đủ sức cạnh tranh Hơn nữa, có nguồn gốc từ hạt cho củ lớn thời gian năm điều kiện tự nhiên [41] Mặc dù có nhiều tác giả nghiên cứu Nƣa nhƣng tài liệu đƣợc công bố chủ yếu tài liệu phân loại học hình thái học tài liệu sinh trƣởng, phát triển nhƣ trồng trọt, nhân giống chủ yếu đƣợc nghiên cứu số loài nhƣ: A konjac, A muelleri, A.bulbifer, A paeoniifolius Các loài Nƣa khác đƣợc biết đến có Nƣa krausei 1.1.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam, chi Nƣa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam nhƣng hầu hết tập trung tỉnh miền núi, số tỉnh duyên hải hải đảo Một số loài đƣợc dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không làm thực phẩm mà nguồn dƣợc liệu tự nhiên quý giá Ngƣời dân thƣờng trồng Nƣa lấy củ làm lƣơng thực, thân cành dùng chăn nuôi, cuống (bèn hay chột) Nƣa dùng nấu canh muối dƣa ăn Củ đƣợc dùng làm thuốc nhiều thuốc dân gian để chữa trị đờm tích phổi, trúng phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau nhức, đầy bụng, tức ngực, ăn uống không tiêu, sốt rét, trục thai chết [14], [42] Tài liệu Nƣa Việt Nam chủ yếu công trình phân loại chi Nƣa Các loài Nƣa Việt Nam đƣợc Gagnepain tổng hợp mô tả sách Thực vật chí Đại cƣơng Đông dƣơng (1942) với loài Đó Nƣa chuông (A campanulatus Bl = A paeoniifolius Nicolson), Nƣa rex (A rex Prain = A paeoniifolius Nicolson), Nƣa đứt đoạn (A interruptus Engl.), Nƣa rivieri (A rivieri Dur = A konjac K Koch) Nƣa Bắc Bộ (A tonkinensis Engl.) [24] Phạm Hoàng Hộ (1993) thống kê mô tả loài, từ năm 1994 2000, nhiều loài Nƣa đƣợc số nhà thực vật mô tả từ mẫu thu đƣợc Việt Nam Dựa mô tả Phạm Hoàng Hộ (2000) thống kê đƣợc 18 loài Nƣa Việt Nam [4], [5], [10] Cùng với nhà thực vật nƣớc ngoài, Nguyễn Văn Dƣ (2001 & 2004), mô tả nhiều loài Nƣa cho khoa học số loài Nƣa bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam, làm cho số loài chi lên tới 25 loài Trong đó, loài Nƣa phổ biến là: Nƣa chuông (A paeoniifolius), Nƣa bắc (A tonkinensis), Nƣa đầu nhăn (A corrugatus) Nƣa vân nam (A yunnanensis) [4], [5], [6] Gần nguồn glucomannan từ củ số loài Nƣa nƣớc ta đƣợc biết tới Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tiến hành nghiên cứu theo hƣớng này, theo báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ công bố loài Nƣa có triển vọng công nghiệp thực phẩm Việt Nam là: Nƣa đầu nhăn (A corrugatus), Nƣa vân nam (A yunnanensis) Nƣa krausei (A krausei) [7] Hiện loài đƣợc tiếp tục nghiên cứu Đối với Nƣa krausei, thông tin thành phần hóa học, đặc tính sinh trƣởng phát triển, trồng trọt, nhân giống chế biến chƣa đƣợc tài liệu nƣớc đề cập 1.2 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân nhanh giống trồng 1.2.1 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật - Tính toàn tế bào Năm 1902, Haberlandt đƣa giả thuyết tính toàn tế bào thực vật Ông cho tất tế bào có tính toàn (totipotency), nghĩa tế bào mang toàn lƣợng thông tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Đến năm 1922, Kotte Robbins nuôi đƣợc đỉnh sinh trƣởng từ đầu rễ hoà thảo 12 ngày Nhƣ vậy, lần tính toàn tế bào đƣợc chứng minh thực nghiệm Từ đến nay, nhiều công trình nghiên cứu tạo đƣợc hoàn chỉnh từ tế bào riêng lẻ, khối mô hay phần quan Điều khẳng định tính toàn tế bào thực vật sở khoa học nuôi cấy mô, tế bào thực vật [17], [19] - Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Biệt hoá (phân hóa) biến đổi tế bào từ trạng thái tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng môi trƣờng nuôi cấy biệt hoá cấu trúc chức Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phôi trình gọi trình phản phân hoá Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Hình 1.1 Mối quan hệ trình phân hóa phản phân hóa Trong thể, tế bào có khả phân hoá, phản phân hoá triển vọng nuôi cấy thành công khác Những tế bào chuyên hoá chức (đã biệt hoá sâu) khó xảy trình phản phân hoá ngƣợc lại, nhƣ tế bào mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật Ngƣời ta chứng minh rằng: tế bào gần trạng thái tế bào phôi khả nuôi cấy thành công cao nhiêu [8] Sự phân hoá phản phân hoá tế bào trình hoạt hoá, ức chế hoạt động gene Trong giai đoạn phát triển định cây, gene trạng thái ức chế không hoạt động đƣợc hoạt hoá tính trạng Ngƣợc lại số gene lại bị ức chế đình hoạt động Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn theo chƣơng trình đƣợc lập sẵn cấu trúc hệ gene tế bào, giúp cho sinh trƣởng, phát triển thể thực vật đƣợc hài hoà Khi tách riêng tế bào làm giảm kích thƣớc khối mô tạo điều kiện cho việc hoạt hoá gene tế bào [8] Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật cách có định hƣớng dựa vào phân hoá phản phân hoá tế bào thực vật để điều khiển phát sinh hình thái tế bào, ngƣời ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng thực vật auxin cytokinin Tỷ lệ hàm lƣợng hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng mô nuôi cấy khác tuỳ mục đích nghiên cứu (phát sinh chồi, rễ mô sẹo) [8] 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật Vào thời kì Haberlandt tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết nhu cầu dinh dƣỡng khoáng hạn chế, đặc biệt vai trò chất kích thích sinh trƣởng hầu nhƣ chƣa đƣợc khám phá Chính mà Haberlandt không thành công [18] Đến có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại môi trƣờng bao gồm thành 10 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi Với có mặt BAP sau ngày cấy, chồi bắt đầu tăng kích thƣớc phần củ, hình thành mô phôi sinh màu xanh, sau phân hoá thành cụm chồi Bảng 3.5 kết thu đƣợc sau 30 ngày nuôi cấy Bảng 3.5 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi CTMT BAP (mg/l) Số chồi cấy Số chồi tạo thành Hệ số nhân chồi ĐC 40 54 1,35 AMORM1 0,5 40 92 2,30 AMORM2 1,0 40 136 3,40 AMORM3 1,5 40 168 4,20 AMORM4 2,0 40 208 5,20 AMORM5 2,5 40 220 5,50 AMORM6 3,0 40 228 5,70 Kết cho thấy: môi trƣờng AMORM1 AMORM2 cho hệ số nhân chồi thấp (1,35 2,30) Các môi trƣờng AMORM4, AMORM5, AMORM6 cho hệ số nhân chồi cao, lần lƣợt 5,20; 5,50 5,70 Ta thấy nồng độ BAP cao hệ số nhân chồi tăng nhƣng công thức môi trƣờng AMORM5, AMORM6 hệ số nhân chồi tăng chậm môi trƣờng AMORM1, AMORM2, AMORM3 AMORM4 Theo quan sát thấy môi trƣờng AMORM4 chồi phát sinh khoẻ mạnh, đồng nhất, số lƣợng chồi tạo thành thích hợp với không gian ống nghiệm Chính vậy, thí nghiệm môi trƣờng AMORM4 (2,0mg/l BAP) môi trƣờng thích hợp để nhân đa chồi Nƣa krausei 35 A B Hình 3.6 Nhân đa chồi Nƣa krausei môi trƣờng AMORM5 A Chồi cấy ban đầu B Chồi thu đƣợc sau 30 ngày 3.4 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ Kích thích rễ khâu cuối giai đoạn nghiên cứu in vitro Các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin đóng vai trò quan trọng phân chia tế bào hình thành rễ Trong thí nghiệm này, sử dụng chất kích thích sinh trƣởng NAA nồng độ khác là: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 1,0 (mg/l) để nghiên cứu ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ Nƣa krausei Kết thu đƣợc sau 20 ngày nuôi cấy đƣợc trình bày bảng 3.6 36 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ CTMT NAA (mg/l) Số chồi cấy Số chồi rễ Tổng số rễ Tỷ lệ chồi rễ (%) Số rễ TB/chồi ĐC 45 35 42 77,78 1,2 AMORN1 0,2 45 45 279 100 6,20 AMORN2 0,4 45 45 308 100 6,84 AMORN3 0,6 45 45 325 100 7,22 AMORN4 0,8 45 45 340 100 7,56 AMORN5 1,0 45 45 365 100 8,11 Kết bảng 3.6 cho thấy tất công thức môi trƣờng thí nghiệm cho tỷ lệ rễ 100%, số rễ trung bình/chồi tăng lên nồng độ NAA tăng Qua thí nghiệm thấy rằng, nồng độ NAA cao rễ nhiều phân hoá rễ phụ nhanh Qua quan sát thấy, phát triển công thức môi trƣờng AMORN1 tốt, cứng có xanh đậm, rễ mập, đều, phát triển khoẻ mạnh, nhiều rễ phụ thuận lợi cho việc chuyển sang giai đoạn trồng bầu Vì vậy, thí nghiệm chọn môi trƣờng AMORN1 (0,2mg/l NAA) môi trƣờng tạo rễ thích hợp Hình 3.7 Tạo Nƣa krausei hoàn chỉnh môi trƣờng AMORN2 37 3.5 Ảnh hƣởng giá thể đến tỉ lệ sống bầu Cây có đầy đủ thân, rễ đƣợc đƣa trồng bầu, giai đoạn cần có chế độ chăm sóc đặc biệt, cần đảm bảo đƣợc độ ẩm ánh sáng vừa phải để dần thích nghi với điều kiện tự nhiên Khi đƣa môi trƣờng để có tỷ lệ sống cao cần có giá thể sống thích hợp Trong thí nghiệm này, thử nghiệm với loại giá thể khác nhau, sau 35 ngày trồng bầu, kết thu đƣợc bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng giá thể đến trồng bầu Loại giá thể Tỷ lệ Số trồng Số sống Tỷ lệ sống sau 15 ngày Cát đen + Trấu hun 1:1 100 88 88,0 Trấu hun 100 95 95,0 Trấu hun + Đất 1:4 100 92 92,0 Từ kết bảng 3.7 cho thấy: Các loại giá thể cho tỷ lệ sống cao, giá cát đen + trấu hun có tỷ lệ sống thấp với 100 thí nghiệm có 88 sống chiếm 88,0% Giá thể trấu hun trấu hun + đất cho tỷ lệ sống cao 95,0% 92,0% với 95 92 sống Tuy giá thể trấu hun thí nghiệm cho tỷ lệ sống cao nhƣng giá thể trấu hun nhẹ tơi xốp nên thích hợp cho sống phát triển giai đoạn đầu Sau 20 ngày, phát triển chậm, chuyển sang vàng, sức sống yếu dần, trồng trấu hun không thuận lợi cho việc vận chuyển trồng tự nhiên bầu dễ vỡ Vì vậy, nghiên cứu chọn giá thể thích hợp để trồng Nƣa krausei bầu trấu hun + đất với tỷ lệ 1:4 38 Hình 3.8 Cây Nƣa krausei trồng giá thể trấu hun + đất sau 35 ngày Hình 3.9 Cây Nƣa krausei in vitro Hình 3.10 Cây Nƣa krausei invitro trồng trấu hun đất sau 50 ngày sau trồng nhà lƣới 20 ngày 39 Hình 3.11 Cây Nƣa krausei trồng Hình 3.12 Hoa Nƣa krausei Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh hoc Hình 3.13 Thao tác buồng cấy Hình 3.14 Một số sản phẩm từ bột Nƣa 40 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ Kết luận Từ nghiên cứu thử nghiệm nhân giống loài Nƣa krausei thông qua kỹ thuật nhân giống mô sẹo nhân đa chồi trực tiếp từ nguyên liệu vô trùng, có số kết luận sau: Đã xác định dung dịch khử trùng javen 70% 10 phút để tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt Nƣa nuôi cấy ống nghiệm Xác định đƣợc phận tạo mô sẹo thích hợp củ Nƣa krausei, môi trƣờng tạo mô sẹo từ củ hiệu AMORC2 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 2mg/l 2,4D + 0,5g/l BAP) với tỷ lệ tạo mô sẹo 95,0% Môi trƣờng thích hợp để tái sinh Nƣa krausei từ mô sẹo AMORB1 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 0,2mg/l NAA + 0,5mg/l BAP) với tỷ lệ tái sinh 40%, số chồi trung bình/mẫu tái sinh 1,35 Môi trƣờng tạo đa chồi hiệu AMORM4 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 2,0mg/l BAP) với hệ số nhân chồi 5,2 Môi trƣờng tạo hoàn chỉnh thích hợp môi trƣờng AMORN1 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 0,2mg/l NAA) có tỷ lệ tạo rễ 100%, số rễ trung bình/chồi 6,20; sinh trƣởng tốt Giá thể thích hợp để trồng Nƣa krausei sau giai đoạn nuôi cấy ống nghiệm trấu hun + đất với tỷ lệ 1:4, cho tỷ lệ sống 92,0% Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện khả tạo mô sẹo, tái sinh nhân đa chồi Nƣa krausei - Nghiên cứu sinh trƣởng phát triển Nƣa krausei nuôi ống nghiệm trồng điều kiện tự nhiên 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, 1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân, Hà Hồng Hải (2005), "Kết bƣớc đầu nhân giống in vitro Vù hƣơng (Cinamomum balansae Licomte) kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học", Kỷ yếu Hội nghị quốc gia Khoa học sống, 450-453, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Dƣ (2006), Nghiên cứu phân loại họ Ráy (Araceae) Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Nguyễn Văn Dƣ (2005), Araceae Juss - họ Ráy, Danh lục loài thực vật Việt Nam, 3, 871-897, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Dƣ, Nguyễn Khắc Khôi (2004), “Bổ sung ba loài thuộc chi Nƣa-Amorphophallus Blume ex Decne (họ Ráy-Araceae Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 26(4A), 57-60 Nguyễn Văn Dƣ, Hà Tuấn Anh, Trƣơng Anh Thƣ, Bùi Văn Thanh (2011), "Ba loài Nƣa (Amorphophallus) họ Ráy (Aracae) có triển vọng công nghiệp thực phẩm", Báo cáo sinh thái tài nguyên sinh vật, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ 4, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Trần Đình Đạt (2006), Công nghệ di truyền, NXB Giáo dục, Hà Nội Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2004), “Nhân nhanh bảo tồn Màng tang (Litsea verticillata) đƣợc tìm thấy Vƣờn Quốc gia Cúc Phƣơng 42 kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4), 479-486 10 Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, 2(2), NXB Montréal 11 Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hoà sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội 12 Vũ Văn Liết, Nguyễn Văn Hoan (2007), Sản xuất hạt giống công nghệ hạt giống, Trƣờng ĐHNN I - Hà Nội 13 Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl chịu nước thuốc (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó tiến sĩ sinh học, Hà Nội 14 Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, 136-137, NXB Y học, Hà Nội 15 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ sinh học, Hà Nội 16 Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Thị Quỳnh (2007),"Nghiên cứu khử trùng, tạo chồi tạo rễ in vitro giống điều cao sản (Anacardium occidebtable L.)", Phần IV - Công nghệ tế bào thực vật, 440 446, Hội nghị Khoa học Công nghệ 17 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nuôi cấy ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 18 Vũ Văn Vụ (2009), Sinh lí học thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội 19 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục, Hà Nội Tài liệu nƣớc ngoài: 20 Dhua RS, Ghosh SK, Biswas J, Mitra SK, Sen H (1988), "Effect of some chemiscals on sprouting, growth and corm yield of Amorphophallus campanulatus", Journal of Root Crops, 14(2), 47-49 43 21 Dix PJ (1986), Plant cell culture technology, Oxford, Blackwell Scentific Publiccation, 143-201 22 Douglas JA, Follett JM, Waller JE (2005), "Research on konjac (Amorphophallus konjac) production in New Zealand", Acta Hort, 670, 173180 23 Fang W, Wu P (2004), “Variations of Konjac glucomannan (KGM) from Amorphophallus konjac and its refined powder in China”, Food Hydrocolloids, 18(1), 167-170 24 Gagnepain F (1942), "Araceae", Flore Générale de L'Indo-Chine, 6, 1075-1196 25 Heng L, Guanghua Z, Peter CB, Jin M, Wilbert LAH, Josef B, Niels J (2007), "Araceae", Flora of China, 23, 24-30 26 Hiroshi K (1979), "Trends and problems of Konjac (Amorphophallus konjac) Cultivation in Japan", Japan Agriculture Research, 18(3), 174-179 27 Konzak CK (2001), Breeding in Crop Plant - Mutation and In Vitro Mutation Breeding, Crop Science, 41, 253-256 28 Liu PY (2004) Konjac, China Agriculture Press, Beijing, China 29 Liu PY, Zhang SL, Zhang XG (1998), "Research and utilization of Amorphophallus in China", Acta Botanica Yunnanica, 10, 48-61 30 Long CL (1998), "Ethnobotany of Amorphophallus of China", Acta Botanica Yunnanica, 10, 89-92 31 Melinda Chua, Baldvin C, Hocking J, Kelvin Chan (2010), "Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K Koch ex N, E Br.", Journal of Ethnopharmacology, 128(2), 268-278 32 Murashige T, Skoog FC (1962), "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture", Physiologia Plantarum, 15, 473-497 44 33 Nedunchezhiyan M (2008), "Seed corm production techniques in elephant foot yam", Orissa Review, 65(2-3), 64-66 34 Nedunchezhiyan M, Jata SK, Misra RS, Mukherjee A (2012), "Sprout bud culture:A rapid multiplication technique for Elephant foot yam (Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson) propagation", Aroideana, 35, 132-143 35 Nedunchezhiyan M, Saurabh A, Ranasingh N (2006), "Elephant foot yam: A commercial crop for Orissa", Orissa Review, 63(1), 71-72 36 Poddar K, Vishnoi RK, Kothari SL (1985), "Plant regeneration from embryogenesis callus", Rice Bio Quar, 35, 37 Santosa E, Sugiyama N, Lontoh AP, Sutoro HS, Kawabata S (2002), "Cultivation of Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson in home garden in Java", Japan Journal Tropical Agriculture, 46, 94-99 38 Singh J, Tiwari KN (2010), "Evaluation of cotyledonary node of Clitoria ternatea L for high frequency in vitro axillary shoot proliferation", Asian Journal of Plant Science, 9(6), 351-357 39 Sugiyama N, Santosa E (2008), "Edible Amorphophallus in Indonesia", Potential Crops in Agroforestry, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, 125 40 Zhang SL, Liu Y (2006), Small konjac could be a big industry in China’s new countryside, The 5th National Konjac Symposium, Janshi, Hubei, China,1-5 41 Zhang D, Wang Q, Srzednicki GS (2010), "Mechanism of staggered multiple seedling production from Amorphophallus bulbifer and Amorphophallus muelleri and its Application to Cultivation in Southeast Asia", Tropical Agriculture Development, 54(3), 84-90 Website: 42 http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy/thuocdongy/K/KhoaiNua 45 MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu chi Nƣa giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân nhanh giống trồng 1.2.1 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 10 1.3.3 Những tồn kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phương hướng giải 17 Chƣơng VẬT LIỆU, THỜI GIAN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Thiết bị hoá chất 19 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei 19 46 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thí nghiệm 20 2.3.2.1 Thu thập mẫu 20 2.3.2.2 Khử trùng mẫu, tạo nuôi in vitro 21 2.3.2.3 Tái sinh Nưa krausei thông qua mô sẹo 21 2.3.2.4 Tạo đa chồi 23 2.3.2.5 Tạo in vitro hoàn chỉnh 24 2.3.2.6 Trồng bầu 25 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phân loại đặc điểm sinh học Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) Việt Nam 27 3.1.1 Một số thông tin phân loại loài Nưa krausei 27 3.1.2 Đặc điểm hình thái Nưa krausei 27 3.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái 28 3.2 Xây dựng hệ thống tái sinh Nƣa krausei qua mô sẹo 29 3.2.1 Tạo mẫu Nưa krausei in vitro 29 3.2.2 Cảm ứng tạo mô sẹo từ mảnh lá, cuống lá, bẹ lá, củ rễ 30 3.2.3 Ảnh hưởng 2,4D BAP đến khả tạo mô sẹo củ Nưa krausei 32 3.2.4 Tái sinh Nưa krausei thông qua mô sẹo 33 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi 35 3.4 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ 36 3.5 Ảnh hƣởng giá thể đến tỉ lệ sống bầu 38 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ 2,4D BAP công thức môi trƣờng tạo mô sẹo 22 Bảng 2.2 Môi trƣờng tái sinh từ mô sẹo 23 Bảng 2.3 Môi trƣờng tạo đa chồi 24 Bảng 2.4 Môi trƣờng rễ nƣa krausei 25 Bảng 2.5 Giá thể trồng Nƣa krausei 26 Bảng 3.1 Kết tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt 30 Bảng 3.2 Kết tạo mô sẹo từ mảnh lá, cuống lá, bẹ lá, củ rễ 31 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng 2,4D BAP đến khả tạo mô sẹo củ 32 Bảng 3.4 Kết tái sinh Nƣa krausei thông qua mô sẹo 33 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi 35 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ 37 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng giá thể đến trồng bầu 38 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mối quan hệ trình phân hóa phản phân hóa Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 20 Hình 3.1 Cây Nƣa krausei 27 Hình 3.2 Cây Nƣa krausei vô trùng từ hạt ống nghiệm 30 Hình 3.3 Mô sẹo từ số phận Nƣa Krausei 31 Hình 3.4 Mô sẹo từ củ Nƣa krausei môi trƣờng AMORC2 33 Hình 3.5 Cây Nƣa krausei tái sinh môi trƣờng AMORB1 34 Hình 3.6 Nhân đa chồi Nƣa krausei môi trƣờng AMORM5 36 Hình 3.7 Tạo Nƣa krausei hoàn chỉnh môi trƣờng AMORN2 37 Hình 3.8 Cây Nƣa krausei trồng giá thể trấu hun + đất sau 35 ngày 39 Hình 3.9 Cây Nƣa krausei in vitro trồng trấu hun đất sau 50 ngày 39 Hình 3.10 Cây Nƣa krausei invitro sau trồng nhà lƣới 20 ngày 39 Hình 3.11 Cây Nƣa krausei trồng Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh hoc 40 Hình 3.12 Hoa Nƣa krausei 40 Hình 3.13 Thao tác buồng cấy 40 Hình 3.14 Một số sản phẩm từ bột Nƣa 40 49 [...]... (Amorphophallus krausei Engl. ) thuộc: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Một lá mầm (Liliopsida) Bộ: Ráy (Arales) Họ: Ráy (Araceae) Chi: Nƣa (Amorphophallus) Loài: Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl. ) [6] Hình 3.1 Cây Nƣa krausei 3.1.2 Đặc điểm hình thái Nưa krausei Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl. ) là cây thân củ, cao tới gần 1m hoặc hơn Thân củ hình cầu dẹp,... thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhƣng có hiệu suất tái sinh thấp Hàm lƣợng các nguyên tố đa lƣợng và các nguyên tố vi lƣợng phụ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy và các đối tƣợng nuôi cấy [9] - Nguồn cacbon Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dƣỡng, không có khả năng tổng hợp cacbon Vì vậy việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Trong phần lớn các môi trƣờng... Nƣa krausei vô trùng sau 15 ngày cấy trên môi trƣờng bổ sung 2,4D và BAP bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo ở mặt cắt phía không tiếp xúc với môi trƣờng, sau đó phát triển thành một khối mô sẹo mền Sau 30 ngày nuôi cấy kết quả thu đƣợc trong bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của 2,4D và BAP đến khả năng tạo mô sẹo của củ CTMT 2,4D BAP (mg/l) (mg/l) Tổng số mẫu cấy Tổng số Tỷ lệ mẫu tạo mô Đặc điểm mô sẹo tạo mô sẹo... gian nghiên cứu Từ tháng 05/2012 đến tháng 05/2013 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei - Thu thập, nghiên cứu và kế thừa các tài liệu về phân loại và hình thái học 19 - Quan sát, ghi chép các đặc điểm của mẫu tƣơi và cây trồng tại trại thực nghiệm sinh học – Viện công nghệ sinh học - So sánh với các tài liệu phân loại và hình thái học trƣớc đây 2.3.2 Phương. .. này mô sẹo rất mỏng và nhỏ Trong thí nghiệm, mẫu củ cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất (66,67 %), mô sẹo tuy mỏng nhƣng xốp có thể sử dụng để tái sinh chồi Chính vì vậy, tôi chọn củ làm nguyên liệu để tạo mô sẹo cây Nƣa krausei A C B Hình 3.3 Mô sẹo từ một số bộ phận của Nƣa Krausei A Mô sẹo từ cuống lá B Mô sẹo từ củ C Mô sẹo từ lá 31 3.2.3 Ảnh hưởng của 2,4D và BAP đến khả năng tạo mô sẹo của củ Nưa krausei. .. toán theo phƣơng pháp phân tích thống kê toán học Quá trình xử lý đƣợc thực hiện trên máy vi tính theo chƣơng trình Microsof Office Excel 2007 26 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân loại và đặc điểm sinh học của Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl. ) ở Việt Nam 3.1.1 Một số thông tin phân loại loài Nưa krausei Cây Nƣa krausei hay còn gọi là Khoai nƣa (Amorphophallus krausei Engl. ) thuộc: Giới:... phát triển của mẫu cây nuôi cấy - Chất giá thể (thạch - Agar) Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trƣờng nuôi cấy, hàm lƣợng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lƣợng 15 Khi nồng độ agar cao, môi trƣờng trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dƣỡng cũng nhƣ sự hấp thụ của mô gặp khó khăn Đa số nuôi cấy phôi đƣợc thực hiện trên môi trƣờng có agar nhƣng... 0,5cm - Mẫu đƣợc cấy trên môi trƣờng : MS + 30g/l đƣờng saccharose + 8g/l agar + 2mg/l 2,4D, trong điều kiện thiếu sáng [21] Sau 30 ngày, thu mô sẹo và đánh giá khả năng tạo mô sẹo của các bộ phận của cây qua các chỉ tiêu sau: + Tỷ lệ tạo mô sẹo tính theo công thức: 21 Số mẫu tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy + Màu sắc mô sẹo + Tính chất mô sẹo Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng... nuôi cấy Nhiệt độ: là nhân tố quan trọng ảnh hƣởng rõ rệt tới sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong các mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hƣởng đến hoạt động của auxin do đó ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây nuôi cấy mô Nhiệt độ nuôi cấy cần đƣợc giữ ổn định trong khoảng 25 - 270C 16 Ánh sáng: có ảnh hƣởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cƣờng độ,... Tỷ lệ biến dị thƣờng thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhƣng sau đó chiều hƣớng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng Một nghiên cứu cho thấy khi nhân giống dứa in vitro nếu cấy chuyển quá 5 lần sẽ xuất hiện biến dị soma Tỷ lệ biến dị tăng dần khi cấy chuyển trên 5 lần và có thể đạt 5% Các dạng biến dị của cây dứa nuôi cấy in vitro thƣờng có biểu hiện hình thái: ... chồi, rễ mô sẹo) [8] 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào... nghiên cứu 19 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei 19 46 2.3.2 Phương pháp nghiên. .. Nam 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 05/2012 đến tháng 05/2013 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei - Thu thập, nghiên cứu kế thừa tài liệu