TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ĐINH THỊ THU HƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA CHỦNG NẤM MỐC M151 BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS Phƣơng Phú Công Hà Nội, 2012 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phƣơng Phú Công hƣớng dẫn, bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện để em thực hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Đinh Thị Kim Nhung thầy cô tổ môn Vi sinh vật học, toàn thể thầy cô khoa Sinh - KTNN, Ban giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Cuối em xin cảm ơn giúp đỡ, động viên gia đình, bạn bè suốt trình làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày…tháng năm 2012 Sinh viên Đinh Thị Thu Hương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các kết nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày khóa luận trung thực không trùng với kết tác giả khác Hà Nội, ngày…tháng năm 2012 Sinh viên Đinh Thị Thu Hương MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài Điểm đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose 1.2 Cơ chế phân giải cellulose 1.3 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 1.3.1 Nấm sợi 1.3.2 Vi khuẩn 1.3.3 Xạ khuẩn 1.4 Hệ thống cellulase 1.5 Ứng dụng cellulase 10 1.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật 14 1.6.1 Giống vi sinh vật 14 1.6.2 Nguồn dinh dƣỡng 14 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy 16 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu vi sinh vật 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Môi trƣờng 17 2.1.3 Hóa chất – thiết bị 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh 19 2.2.2 Phƣơng pháp hóa sinh 20 2.2.2.1 Nuôi cấy chủng để thử hoạt tính 20 2.2.2.2 Xác định hoạt tính phƣơng pháp cấy chấm điểm 20 2.2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch (William, 1983) 20 2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng đến hoạt tính Cellulase 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 22 3.2 Ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng đến khả sinh cellulase chủng M151 24 3.2.1 Ảnh hƣởng nguồn cellulose tự nhiên 24 3.2.2 Ảnh hƣởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M151 26 3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase 28 3.2.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 29 3.2.5 Ảnh hƣởng độ ẩm 30 3.2.6 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG Bảng 1.1 Hàm lƣợng cellulose số nguyên liệu Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose (D-d) cm Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nguồn chất khác đến khả sinh cellulose chủng mốc M151 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng phối trộn phế phụ phẩm đến khả sinh cellulase chủng nẩm mốc M151 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Bảng 3.6 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả sinh cellulase Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc lập thể cellulose Hình 1.2 Cấu trúc cellulose Hình 3.1 Khả sinh cellulase chủng đƣợc nghiên cứu Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm mốc M151 Hình 3.3 Ảnh hƣởng nguồn cellulose tự nhiên đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nguồn cellulose phối trộn đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.5 Khả sinh cellulase tỷ lệ phối trộn cellulose tự nhiên Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.7 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.8 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.9 Khả sinh cellulase chủng M151 mức độ ẩm Hình 3.10 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.11 Khả sinh cellulase chủng M151 nguồn nitơ CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CBH Cellobiohydrolase CMC Cacboxyl methyl cellulose HEC Hydroxyethyl cellulose CMCase Cacboxyl methyl cellulase Cs Cộng C1 Exoglucanase Cx Endoglucanase MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trên giới ngày nay, đặc biệt nƣớc công nghiệp phát triển, nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm enzyme ngày trở nên mạnh mẽ Theo thống kê gần đây, hầu hết enzyme công nghiệp có nguồn gốc từ vi sinh vật Qui mô sản xuất, mức độ hiệu ứng dụng tùy thuộc trình độ sản xuất công nghiệp nƣớc Tuy nhiên, đa số chế phẩm enzyme hữu đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, y tế, nghiên cứu khoa học bảo vệ môi trƣờng Trong nghiên cứu sản xuất ứng dụng cellulase đƣợc quan tâm cách đặc biệt cellulose nguồn nguyên liệu dồi trái đất Cellulase phức hệ enzyme quan trọng đƣợc ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Trong tƣơng lai, ngƣời ta sử dụng cellulase cho hai mục đích chính: Dùng cellulase trực tiếp phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc công nghệ môi truờng; thủy phân cellulose tạo chất lên men để thu sản phẩm cuối khác Đặc biệt chăn nuôi, biện pháp nâng cao suất vật nuôi nâng cao hiệu suất sử dụng chất dinh dƣỡng thức ăn mức cao Để giải nhiệm vụ này, ngƣời ta dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào phần ăn vật nuôi Các enzyme với enzyme có sẵn đƣờng tiêu hóa phân giải chất dinh dƣỡng thức ăn giúp cho vật nuôi tiêu hóa đƣợc tốt [14] Từ lâu, ngƣời biết đến chủng nấm mốc ứng dụng chúng nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dƣợc phẩm, công nghệ môi trƣờng, nông nghiệp Tuy nhiên chƣa có nhiều nghiên cứu tập trung vào chủng nấm mốc phân giải cellulose, nguyên nhân tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật ƣu so với nấm mốc khả sinh celllulase Nhƣng xét khả sử dụng nguồn cacbon, nguồn nitơ, khả chống chịu pH…thì nấm mốc tỏ ƣu so với nhóm vi sinh vật khác [4] Hàng năm, hoạt động ngành nông nghiệp thải môi trƣờng hàng trăm phế thải, nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng Nếu lƣợng phế phẩm đƣợc xử lý làm thức ăn gia súc phân bón nguồn lợi lớn Trên giới nhƣ Việt Nam, có nhiều nghiên cứu cellulase ứng dụng thức ăn chăn nuôi nhƣ: Chu Thị Thanh Bình cs (2002) ứng dụng chủng nấm men chế biến bã thải hoa giàu cellulose làm thức ăn gia súc [1], theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) lên men xốp sắn cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…và kết cho nhiều triển vọng [5] Đề tài tập trung vào nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M151, ứng dụng việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc M151 tuyển chọn đƣợc Nội dung nghiên cứu 3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 3.2 Ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng đến khả sinh cellulase chủng M151 Ý nghĩa khoa học đề tài Ý nghĩa lí luận: nghiên cứu nhằm sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose 10 enzyme nhỏ cm Trong có chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase mạnh chủng có kí hiệu M4v (đƣờng kính vòng phân giải cm), M251 (đƣờng kính vòng phân giải 1,9 cm), M151 (đƣờng kính vòng phân giải 1,7 cm) So sánh kết với nghiên cứu trƣớc nhƣ Trịnh Đình Khá (2007), chủng thu đƣợc có hoạt tính cellulase cao Tuy nhiên việc nghiên cứu đƣợc sâu đạt đƣợc kết xác nhất, nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả sinh cellulase chủng M151 Có thể hy vọng chủng M151 sinh trƣởng phát triển tốt nguồn chất rẻ tiền, có khả sinh nhiều loại enzyme với hoạt tính cao có nhiều ứng dụng hiệu thực tiễn, đặc biệt sinh enzyme để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi 3.2 Ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng đến khả sinh cellulase chủng M151 3.2.1 Ảnh hƣởng nguồn cellulose tự nhiên Nguồn cacbon có ảnh hƣởng lớn đến khả tạo sinh khối sinh enzyme nấm Nó có vai trò nhƣ chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulose Do đó, tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn cellulose tự nhiên đến khả sinh cellulose chủng nấm tuyển chọn Chủng M151 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng rắn thích hợp với nguồn cacbon lần lƣợt vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô, sử dụng nguồn dinh dƣỡng khoáng môi trƣờng Czapek - Dox thích hợp thời gian ngày, sau lấy dịch nuôi cấy, đem li tâm, loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase dịch nuôi phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch (William, 1983) Kết đƣợc trình bày bảng 3.2 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn chất khác đến khả sinh cellulose chủng mốc M151 Chủng nấm Khả sinh cellulase D-d (cm) mốc Vỏ trấu Vỏ lạc Lõi ngô M151 1,6 1,3 0,7 Đường kính vòng phân giải (cm) 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 Lõi ngô Vỏ trấu Vỏ lạc Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên đến khả sinh cellulase chủng M151 Kết nghiên cứu cho thấy, chủng M151 tuyển chọn đƣợc, có khả phân giải nguồn chất tự nhiên để sinh cellulase Vỏ trấu nguồn cellulose tự nhiên tốt cho sƣ phát triển sinh tổng hợp enzyme Điều tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn nguồn cacbon rẻ tiền để lên men thu enzyme bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi Kết phù hợp với kết nghiên cứu trƣớc, chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh môi trƣờng có nguồn cacbon tự nhiên (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh etal.,2003; Vũ Ngọc Mai (k32-sp2), 2010) 33 3.2.2 Ảnh hƣởng phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả sinh cellulase chủng M151 Chủng M151 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng rắn thích hợp với nguồn cacbon phối trộn vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô theo tỉ lệ khác lần lƣợt 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2, 6:3:1 sử dụng nguồn dinh dƣỡng khoáng môi trƣờng Czapek- Dox thích hợp thời gian ngày, sau cân 1mg mẫu + 1ml nƣớc, cho vào ống nghiệm lắc đều, để lắng lấy dịch Xác định hoạt tính cellulase dịch phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch (William, 1983) Kết thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng phối trộn phế phụ phẩm đến khả sinh cellulase chủng nẩm mốc M151 Hoạt tính cellulase chủng Nguồn bon M151 (D-d) cm Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 1,6 4:3:3 Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 2,1 4:4:2 Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 1,9 6:2:2 Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 6:3:1 34 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nguồn cellulose phối trộn đến khả sinh cellulase chủng M151 Tỷ lệ 4:4:2 Tỷ lệ 4:3:3 Hình 3.5 Khả sinh cellulase tỷ lệ phối trộn cellulose tự nhiên Vậy từ kết thu đƣợc nhƣ có đƣợc kết luận rằng, chủng M151 có khả phân giải nhiều nguồn chất cellulose tự nhiên để sinh cellulase Qua nghiên cứu số tỷ lệ phối trộn, cho thấy tỷ lệ 4:4:2 tốt để chủng M151 sinh tổng hợp cellulase 35 3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Chúng tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc M151 môi trƣờng rắn theo tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) mức nhiệt độ khác Sau 36 lên men, xác định hoạt tính cellulase phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch Kết đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Hoạt tính cellulase (D-d) cm Chủng VSV 25oC 30oC 35oC 40oC M151 1,4 1,5 1,2 Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase chủng M151 Từ kết thu đƣợc trên, đƣa kết luận chủng M151 có khả sinh tổng hợp cellulase cao 300C, sau khả giảm dần mức nhiệt độ 350C, 400C 36 Các chủng nấm thƣờng chủng ƣa nhiệt nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp cellulase 300C nhiệt độ khảo sát Những nghiên cứu trƣớc cho thấy, chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp cellulase cao dải nhiệt độ từ 310C – 340C (Đặng Minh Hằng, 1999) Nhiệt độ thích hợp với đa số nấm mốc 300C - 320C [13] Vậy qua nghiên cứu chủng M151 sinh cellulase cao dải nhiệt từ 300C – 350C 3.2.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy Chủng đƣợc nuôi cấy môi trƣờng rắn với tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) mức thời gian khác từ 12h – 48h Sau 12h, 24h, 36h, 48h, lấy 1ml mẫu với 1ml nƣớc bỏ vào ống nghiệm, lắc để lấy phần dịch Xác định hoạt tính cellulase phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch Kết đƣợc trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase Hoạt tính cellulase (D-d) cm Chủng VSV M151 12h 24h 36h 48h 0,7 1,3 1,7 1,5 37 Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M151 Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36h-60h Mốc A.oryzae A.awamori nuôi môi trƣờng cám để sản xuất amylase khoảng 36h – 40h Nhiều chủng Aspergillus tạo thành enzyme cao lúc bắt đầu sinh bào tử [11] Kết thu đƣợc cho thấy, hoạt tính cellulase chủng tăng dần theo thời gian đạt giá trị lớn sau 36 nuôi cấy Sau 36 nuôi cấy hoạt tính chủng nghiên cứu giảm dần, nguyên nhân sinh trƣởng nấm mốc giảm dần, chất dinh dƣỡng môi trƣờng cạn kiệt… 3.2.5 Ảnh hƣởng độ ẩm Chủng M151 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng rắn với tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) mức độ ẩm khác từ 50% - 60% Sau 36 lên men 300C, xác định hoạt tính cellulase phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch Kết đƣợc trình bày bảng 3.6 38 Bảng 3.6 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh cellulase Hoạt tính cellulase (D-d) cm Chủng VSV M151 50% 60% 70% 80% 1,7 2,1 2,4 1,9 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh cellulase chủng M151 39 Hình 3.10 Khả sinh cellulase chủng M151 mức độ ẩm Kết thí nghiệm cho thấy độ ẩm chất (4:4:2) thích hợp cho chủng M151 phát triển tốt 70% hoạt tính enzyme cao với đƣờng kính phân giải 2,4 cm Điều phù hợp với công bố tác giả Trịnh Đình Khá cs cho độ ẩm 60-70% nấm mốc thuộc chủng Penicillium sp cho sinh khối enzyme lớn [10] 3.2.6 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Cellulose loại polysaccarit khó bị phân giải, tế bào vi sinh vật muốn phân giải đƣợc phải tổng hợp đƣợc lƣợng lớn cellulase, trình sinh tổng hợp cần tới lƣợng lớn nitơ, có chủng sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc trình lên men có ý nghĩa quan trọng Chủng nấm mốc M151 tuyển chọn đƣợc đem nuôi cấy môi trƣờng Czapek – Dox thích hợp (môi trƣờng rắn) với nguồn nitơ đƣợc sử dụng lần 40 lƣợt NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, pepton Sau xác định hoạt tính enzyme phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch Kết đƣợc trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Hoạt tính cellulase (D-d) cm Chủng VSV Pepton NaNO3 (NH4)2SO4 NH4Cl M151 2,5 2,1 1,9 Hình 3.11 Biểu đồ biểu biễn ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase chủng M151 Sau 36h lên men rắn với tỷ lệ chất (4 vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) nhiệt độ 300C độ ẩm 70% Kết thu đƣợc bảng số liệu, cho thấy chủng M151 có khả sử dụng nhiều nguồn nitơ Trong nguồn nitơ đƣợc nghiên cứu pepton tốt cho sinh tổng hợp cellulase với hoạt tính enzyme 2,5 cm, sau NaNO3 với hoạt tính enzyme 2,1 cm 41 Nhƣng sử dụng nguồn dinh dƣỡng nitơ hữu sản xuất hiệu kinh tế lại thấp giá thành cao Vì ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ vô muối NaNO3 Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu cho nitrat nguồn nitơ thích hợp cho tổng hợp cellulase nhiều nấm sợi nhƣ Aspergillus, Trichoderma… Các muối nitrat nguồn thức ăn thích hợp với nhiều xạ khuẩn, nấm mốc tảo [18] Acharya cs (2008) nghiên cứu chủng A.niger cho thấy pepton, ammonium sunfate ure nguồn nitơ thích hợp cho chủng A.niger sinh tổng hợp cellulase Hình 3.12 Khả sinh cellulase chủng M151 nguồn nitơ 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Từ 25 chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase phân lập đƣợc từ mẫu cành gỗ, cây, rơm rạ mục, đất mùn Hà Nội, Vĩnh Phúc, tuyển chọn đƣợc chủng M151, M4v, M251 có khả tổng hợp cellulase cao Trong sâu tìm hiểu chủng M151 1.2 Nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng M151 rút điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tốt cho trình sinh tổng hợp cellulase chủng M151 là: Nhiệt độ thích hợp 300C Thời gian lên men rắn 36 Độ ẩm thích hợp 70% Nguồn nitơ vô tốt NaNO3 , hữu tốt pepton Nguồn cellulose tự nhiên thích hợp vỏ trấu, nguồn cellulose phối trộn thích hợp với tỷ lệ 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) Kiến nghị 2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái định loại chủng M151 2.2 Kết bƣớc đầu cho thấy chủng M151 có khả ứng dụng để sản xuất cellulase 2.3 Tiếp tục nghiên cứu đặc tính lý-hóa enzyme cellulase chủng M151 đƣợc tuyển chọn ứng dụng việc sản xuất cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp nƣớc ta, để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Qua nâng cao giá trị phế phụ phẩm nông nghiệp, góp phần cải thiện kinh tế cho ngƣời nông dân, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng 43 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] Chu Thi Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thị Thùy Dƣơng (2002); Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội [2] Phạm Thị Chân Châu, Trần Thị Áng (1992) Hóa sinh học Nxb Giáo dục; tr 80-81 [3] Nguyễn Lân Dũng (1976) Góp phần nghiên cứu cải tiến cấu thức ăn chăn nuôi lợn, Báo cáo Hội nghị khoa học, Trƣờng Đại học Tổng Hợp [4] Nguyễn Lân Dũng (1994) Nghiên cứu khả phân giải cellulose số chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam, Báo cáo Hội nghị khoa học ủy ban Khoa học kĩ thuật nông nghiệp [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo (1991) Điều kiện sinh khối nấm sợi Aspergillus hennebergii TH 386 môi trường xốp sắn ngô, Tạp chí nông nghiệp công nghiệp thực phẩm [6] Nguyễn Thành Đạt (2007) Cơ sở sinh học vi sinh vật Nxb ĐHSP; tr 201-203 [7] Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu sử dụng lượng giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí khoa học công nghệ chăn nuôi-Viện chăn nuôi quốc gia: 16 [8] Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo 44 khoa học, Hội nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc Nxb Khoa Học Kỹ Thuật; tr 333-339 [9] Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase Aspergillus niger RNNL-363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [10] Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sĩ Lê Thanh (2007), Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng penicillium sp DTQ-HK1, Tạp chí Công nghệ sinh học (3), 355-362 [11] Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chon số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học, hội nghị viên Công nghệ sinh học toàn quốc Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội:177-182 [12] Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Sản xuất cà phê theo phương pháp enzyme, Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc Nxb khoa học kỹ thuật Hà Nội: 318-320 [13] Lƣơng Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông Nghiệp, tr 269 – 272 [14] Đỗ Hữu Phƣơng; Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, số 3/2004 [15] Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hƣng, Phạm Văn Toản (2003) Công nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý môi trường Nxb Nông Nghiệp 45 [16] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [17] Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007) Tương lai ứng dụng enzyme xử lý phế thải, Tạp chí khoa học ĐHQG Hà Nội, Khoa học tự nhiên công nghệ 23:75-85 [18] Trần Cẩm Vân; Vi sinh vật học môi trường Nxb ĐHQG Hà Nội; tr 67 Tiếng Anh [19] Robert A Samson, Jonh I Pitt (2000) Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83 – 113 [20] Raper Fennell (1965) The Genus Aspergillus, The Williams & Wikins Company 428 E.Preston street Baltimore, Md.21202 U.S.A, 570pp [21] Hrmova M, Fincher GB (2009) Plant and microbial enzymes involved in the depolymerisation of (1,3)-β-D-glucans and related polysaccharides In: Chemistry, Biochemistry and Biology of (1,3)-β-D-glucans and related Polysaccharides, Academic Press, Elsevier Inc, San Diego, USA, 677 pp, 16 color plates ( Bacic T, Fincher GB, Stone BA, eds), pp 119 – 170 [22] Acharya PB, Acharya DK, Modi HA (2008) Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate, Afr J Biotechnol, 7:4147-4152 Tài liệu Internet [23] http://www.Sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1839 [24] http://S4 Zetaboards.com/Biofood-tech/topic/9374593/1 [25] http://www.thuviensinhhoc.com 46 [...]... đến khả năng sinh cellulase của chủng M151 Có thể hy vọng rằng chủng M151 sinh trƣởng và phát triển tốt trên nguồn cơ chất rẻ tiền, có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme với hoạt tính cao sẽ có nhiều ứng dụng hiệu quả trong thực tiễn, đặc biệt là sinh enzyme để bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi 3.2 Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng M151 3.2.1 Ảnh hƣởng của. .. Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng nấm mốc M151 Hình 3.2 Khả năng sinh cellulase của các chủng được nghiên cứu Trong số 25 chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose đã phân lập đƣợc tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Sinh – KTNN, trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, có tới 9 chủng có hoạt tính enzym lớn hơn 1cm, 16 chủng có hoạt tính 31 enzyme nhỏ hơn 1 cm Trong đó có 3 chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase mạnh... thu đƣợc nhƣ trên có đƣợc kết luận rằng, chủng M151 có khả năng phân giải nhiều nguồn cơ chất cellulose tự nhiên để sinh cellulase Qua nghiên cứu một số tỷ lệ phối trộn, cho thấy tỷ lệ 4:4:2 là tốt nhất để chủng M151 sinh tổng hợp cellulase 35 3.2.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc M151 trên môi trƣờng rắn theo tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: 4... nhiệt độ khác nhau Sau 36 giờ lên men, xác định hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase Hoạt tính cellulase (D-d) cm Chủng VSV 25oC 30oC 35oC 40oC M151 1,4 2 1,5 1,2 Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase của chủng M151 Từ kết quả thu đƣợc ở... ảnh hƣởng lớn đến khả năng tạo sinh khối và sinh enzyme của nấm Nó có vai trò nhƣ một chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulose Do đó, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulose của chủng nấm tuyển chọn Chủng M151 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng rắn thích hợp với nguồn cacbon lần lƣợt là vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô, sử dụng nguồn dinh dƣỡng khoáng là môi. .. enzyme ở nhiều chủng [13] 23 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy * Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong số các yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau Nhiệt độ tối thích cho sự sinh trƣởng của đa số các loài nấm mốc trên môi trƣờng rắn là 250C – 400C Nhiệt độ trên 400C hoặc dƣới 250C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài, giảm khả năng tổng hợp... 29 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose Qua quá trình nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose, đã phân lập đƣợc 25 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase Hoạt tính cellulase của các chủng đƣợc trình bày ở bảng sau: Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose (D-d) cm Mẫu STT Lá cây 1 2 mục... lấy dịch nuôi cấy, đem li tâm, loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch (William, 1983) Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng sinh cellulose của chủng mốc M151 Chủng nấm Khả năng sinh cellulase D-d (cm) mốc Vỏ trấu Vỏ lạc Lõi ngô M151 1,6 1,3 0,7 Đường kính vòng phân... Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulase của chủng M151 Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng M151 tuyển chọn đƣợc, có khả năng phân giải nguồn cơ chất tự nhiên để sinh cellulase Vỏ trấu là nguồn cellulose tự nhiên tốt nhất cho sƣ phát triển và sinh tổng hợp enzyme Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn nguồn cacbon rẻ tiền để lên men thu enzyme bổ... cho môi trƣờng kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật, nhƣng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1- cellulase và Cx- cellulase cao hơn so với nấm men Nƣớc chiết nấm men ... đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.7 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.8 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả sinh cellulase chủng M151 Hình 3.9 Khả sinh cellulase chủng. .. tìm hiểu chủng M151 1.2 Nghiên cứu số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng M151 rút điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tốt cho trình sinh tổng hợp cellulase chủng M151 là:... cellulase chủng nấm mốc M151 tuyển chọn đƣợc Nội dung nghiên cứu 3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 3.2 Ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng đến khả sinh cellulase chủng M151