Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN - LƢU THỊ NHƢ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA SÂM LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI MỘT SỐ LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành:Thực vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ PHƢƠNG TRANG TS HÀ MINH TÂM Hà Nội, 2013 Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong trình làm khóa luận, nhận hướng dẫn giúp đỡ TS Nguyễn Thị Phương Trang TS Hà Minh Tâm Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện thuận lợi tận tình giúp đỡ suốt trình tìm hiểu nghiên cứu viện Trong trình thực đề tài, nhận giúp đỡ nhiều tổ chức, cá nhân trường Nhân dịp này, xin trân trọng cảm ơn: Ban chủ nhiêm khoa Sinh – KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; đặc biệt giúp đỡ, động viên gia đình, bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu Một lần nữa, xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Lưu Thị Như Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực, khách quan khóa luận, xin cam đoan: Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền Sâm lào (Panax sp.) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số loài Sâm khác chi Panax ” công trình nghiên cứu riêng tôi, thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Phương Trang TS Hà Minh Tâm Các kết trình bày khóa luận trung thực, khách quan chưa công bố công trình trước Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Lưu Thị Như Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems ABI 3100 DNA Sequencer (máy đọc trình tự) ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn ADN khuếch đại) ARN Acid Ribonucleic Bp Base pair (cặp bazơ) CI Cloroform-Isoamyalcohol cpDNA Chloroplast Acid Deoxyribonucleic (genome lục lạp) cpSSR Chloroplast-Simple Sequence Repeat (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp) dH20 Nước khử ion dNTP Deoxyribonucleotide triphosphtate (các nucleotide tự do) Genbank Ngân hàng gen quốc tế ISSR Internal sinple sequence repeat (vùng đoạn trình tự lặp lại đơn giản) ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilobase MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) rDNA ADN ribosome RE Restriction Enzyme (enzyme giới hạn) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism DNA Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội SSR Khóa luận tốt nghiệp Simple Sequence Repeat (trình tự đoạn lặp đơn giản) DANH LỤC BẢNG trang Bảng Danh sách trình tự sử dụng nghiên cứu 18 Bảng Khoảng cách di truyền Sâm lào so sánh với số 25 loài khác chi Panax DANH LỤC HÌNH Trang Hình Nhâm sâm việt nam – Panax vietnamensis Hình Sâm ngọc linh (thu Trà My, tỉnh Quảng Nam) Hình Lá củ Sâm lào 15 Hình Điện di ADN tổng số gel Agarose gel 1% 15 Hình Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% 19 Hình So sánh trình tự vùng ITS-rDNA Sâm lào 20 Sâm ngọc linh với số loài khác chi Panax Hình Hình ảnh đỉnh (peak) sản phẩm PCR 21 máy đọc trình tự ABI 3100 Hình So sánh trình tự vùng ITS-rADN Sâm lào 22 Sâm ngọc linh với số loài khác chi Panax Hình Mối quan hệ di truyền loài Sâm lào (Panax sp.) 27 Panax vietnamensis với số loài khác chi Panax sở phân tích trình tự vùng ITSrDNA phương pháp Maximum Parsimony Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài: Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv 1985) tìm thấy Việt Nam coi loài đặc hữu hẹp, phân bố miền trung Việt Nam (vĩ độ 14015) độ cao 1800m so với mặt biển [18] Sâm ngọc linh xác định thuốc quý giá trị sử dụng giá trị nguồn gen [16] Nhiều công trình nghiên cứu Sâm ngọc linh triển khai, đặc biệt từ năm 1985, thông qua hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với nhà khoa học Ba Lan Nhật Bản cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp chất Saponin, có 24 saponin xác định có cấu trúc hoàn toàn mới, lần công bố Khi so sánh với nhóm sâm trồng có giá trị giới Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P quinquefolius) Tam thất (P notoginseng) thành phần saponin Sâm ngọc linh giống với loài hàm lượng lại cao nhiều Điều khẳng định Sâm ngọc linh loài độc đáo thành phần hóa học [17], thuốc quý có giá trị sử dụng cao Tuy nhiên, thị trường thuốc xuất loại sâm (đặc điểm hình thái gần giống Sâm ngọc linh) có nguồn gốc từ Lào, làm giả Sâm ngọc linh Do mẫu vật thu mẫu củ nên chưa đủ sở hình thái để chứng minh mối quan hệ chúng với Sâm ngọc linh, vậy, để phân tích mối quan hệ di truyền loài sâm với Sâm ngọc linh Việt Nam, thực nghiên cứu “Phân tích mối quan hệ di truyền Sâm lào (Panax sp.) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số loài Sâm khác chi Panax” Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Điểm đề tài đề tài nghiên cứu hoàn toàn chưa công bố công trình khoa học nào, đề tài đăng hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI Mục đích đề tài Đánh giá khác biệt mặt di truyền sâm có nguồn gốc từ Lào Sâm ngọc linh Việt Nam dựa phân tích trình tự gen ITS, từ đánh giá mối quan hệ di truyền chúng với số loài sâm khác giới Nội dung nghiên cứu - Tách ADN tổng số mẫu Sâm, nhân vùng gen ITS- rDNA - Giải trình tự gen ITS – rDNA - Phân tích số liệu: so sánh, phân tích trình tự DNA mẫu thu so với Panax vietnamsis Quảng Nam, loài chi Panax Ý nghĩa khoa học thực tiễn Ý nghĩa khoa học: Góp phần bổ sung vốn kiến thức đa dạng thực vật cấp độ phân tử, chuẩn bị cho nghiên cứu loài Sâm lào Ý nghĩa thực tiễn: Đánh giá sai khác mặt di truyền sâm có nguồn gốc từ Lào Sâm ngọc linh Việt Nam Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Sâm (Panax) Chi Nhâm sâm (Panax L.) chi nhỏ họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn chi Sâm (Panax L.) giới biết chắn có 11 loài loài (thứ -var) [23] Sự phân bố chi Panax L giới cho thấy chúng xuất bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ Tây Nam Canada (có loài P quinquefolius (P trifoliatus) Vùng Đông Bắc Á (gồm viễn đông Nga, đông bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên Nhật Bản) có loài P ginseng P japonica Trung tâm phân bố chi Panax L từ vùng Tây Nam Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc Việt Nam Thực chất khu vực gồm tỉnh biên giới kề Vân Nam (Trung Quốc) Lào Cai (Việt Nam) Ở có tới loài thứ (dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên Hai loài trồng P notoginseng nhập từ Bắc Mỹ P pseudoginseng (không tìm thấy hoang dại giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya kết lai tự nhiên loài gần gũi đó) Đây coi trung tâm phân bố chi Sâm (Panax L.) giới Ở Bắc Mỹ có loài (P notoginseng; P quinquefolius P trifoliatus) Giới hạn cuối phía Nam chi Panax L loài Sâm ngọc linh (Panax Vietnamensis) miền trung Việt Nam, 14015’ vĩ độ Bắc Chính Sâm ngọc linh coi loài đặc hữu hẹp miền trung Việt Nam [6] Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ, sợ rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều nhiệt độ cao, sợ gió nóng Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng 20 - 280C Candolle, 1830, Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm cánh, nhụy có noãn, mọng chín màu đỏ cam, có Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 10 Khóa luận tốt nghiệp - hạt Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số năm sinh trưởng [20] Khái niệm chấp nhận công trình nghiên cứu sau (Wen Zimmer, 1999; Choi Wen, 2000) [34, 39] Hình 1: Sâm Việt Nam - Panax vietnamensis (nguồn: Wikipedia.org) 1.2 Sâm ngọc linh 1.2.1 Đặc điểm hình thái Sâm ngọc linh thân thảo, sống nhiều năm Thân rễ có đường kính 3.5cm, rễ phụ dầy dự trữ, số phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm Đốt thân rễ tồn 1- thân Thân cao từ 40cm - 100cm, rỗng, Lá mọc vòng, thường có (ít 3, 5, 6) Lá kép chân vịt có (ít 6,7) chét, dài - 12cm (ít 15cm) Lá chét hình trứng ngược hình mũi mác, dài - 14cm, rộng - Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 24 Khóa luận tốt nghiệp Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agrarose 1% tinh Qiaquick gel extranction kit (Qiagen,Đức) 2.4.4 Đọc trình tự Sản phẩm PCR sau tinh sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp với mồi PaITS - F, sử dụng Bigdye terminator cycler đọc kết hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems.Mỹ) 2.4.5 Phân tích số liệu Trình tự ADN loài Sâm lào Sâm ngọc linh so sánh, phân tích với loài khác thuộc chi Panax loài nhóm (Aralia foliolosa) dùng làm tham chiếu (Bảng 3) sử dụng phần mềm Clustal W MEGA 5.1 Bảng Danh sách trình tự sử dụng nghiên cứu Tên khoa học Mã hiệu Genbank Panax quinquefolius AY233328 Panax japonicus FJ980423 Panax japonicus var bipinnatifidus AY271921 Panax notoginseng JX680329 Panax pseudoginseng var bipinnatifidus AY271923 Panax stipuleanatus U41690 Panax variabilis AY233329 Aralia foliolosa DQ007383 Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chúng tiến hành giải mã đoạn gen ITS Sâm lào Sâm ngọc linh, so sánh số loài khác chi Panax để làm rõ vị trí phân loại Sâm lào nói riêng mối quan hệ di truyền Sâm lào với Sâm ngọc linh 3.1 Kết tách ADN tổng số Mẫu củ Sâm lào Sâm ngọc linh nghiền nitơ lỏng (-196oC) thành dạng bột mịn Khoảng 100mg bột nghiền dùng để tách ADN tổng số, sử dụng Dneasy plant mini kit (Qiagen, Đức) Kết sau điện di kiểm tra gel Agarose 1% (Hình 5) Hình Điện di tổng số ADN gel Agarose 1% Giếng ADN tổng số từ Lá Sâm ngọc linh Giếng ADN tổng số từ Củ Sâm ngọc linh Giếng ADN tổng số từ Lá Sâm lào Giếng ADN tổng số từ củ Sâm lào Ảnh điện di cho thấy có ADN xuất tất mẫu, nhiên giếng số (mẫu Sâm ngọc linh), (củ Sâm ngọc linh), (lá Sâm lào) có vạch sang rõ nét hơn, giếng số (mẫu củ Sâm lào) vạch mờ, chứng tỏ ADN tách từ củ Sâm lào có chất lượng không tốt mẫu lại Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 26 Khóa luận tốt nghiệp 3.2 Kết khuếch đại gen ITS PCR Chúng chọn ADN tổng số mẫu Sâm ngọc linh ADN tổng số mẫu Sâm lào làm khuôn để khuếch đại đoạn gen ITS PCR Theo lý thuyết sử dụng cặp mồi đặc hiệu PaITS-F PaITS-R khuếch đại đoạn gen ITS dài 700bp Sau chạy PCR, sản phẩm PCR mẫu Sâm ngọc linh Sâm lào kiểm tra điện di gel agrarose 1% (hình 6) Hình Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% Lưu Thị Như Giếng M: 100bp DNA ladder (invitrogen) Giếng 1: Sản phẩm PCR từ Sâm ngọc linh Giếng 2: Sản phẩm PCR từ mẫu Sâm lào K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 27 Khóa luận tốt nghiệp Kết điện di cho thấy xuất băng ADN có kích thước khoảng 700bp theo dự kiến, điều chứng tỏ mồi thiết kế cho đoạn gen ITS dài 700bp đặc hiệu Để khẳng định kết PCR, đoạn ADN sau tinh QIAquick Gel extraction Kit (QIAGEN) xác định trình tự máy đọc trình tự ABI 3100 Avant genetic Analyer (Applied Biosystems) theo phương pháp tổng hợp Sanger cộng (1977) với kit xác định trình tự Bigdye terminator v3.1 Hình Hình ảnh đỉnh (peak) sản phẩm PCR máy đọc trình tự ABI 3100 Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 28 Khóa luận tốt nghiệp Kết giải trình tự cho hình ảnh rõ ràng, không bị nhiễu nền, chứng tỏ sản phẩm PCR đẫ tinh tốt Trình tự sau kiểm tra chương trình BLAST-NCBI Kết so sánh Blast-NCBI khẳng định sản phẩm PCR gen ITS 3.3 So Sánh trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu với số loài Sâm ngân hàng gen Kết đọc trình tự vùng ITS - rADN mẫu Sâm lào thu trình tự đoạn gen ITS với tổng số 700bp Kết dùng để so sánh với số mẫu sâm khác genbank (bảng 3) Hình 8: So sánh trình tự vùng ITS-rADN Sâm lào Sâm ngọc linh với số loài khác chi Panax P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng P.stipuleanatus GTCGAAACCTGCATAGCAGAACGACCCGCGAACACGTTACAATACCGGGTGAGGGACGAGGGGTGCGCAAGCTCCCCA .A C T T C T .C C A T T.G .C C A Aralia foliolosa .C C T A .A P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng AGTTGCAAACCCATGGTCGGGGACCGCCCTTGGGTGGCTCTCGTCCGAACAACGACCCCCCGGCGCGGAATGCGCCAA - .A A A .- A T A .A C .A C P.stipuleanatus Aralia foliolosa A TA TTC G .C ATTC T A - P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius GGAAATCAAACTGAACTGCGCGCGTCCCCCCCGTTTGCGGGCGGCGGAAGCGTCTTTCTAAAACACAAACGACTCTCG A .A A A T TA .A Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 29 Khóa luận tốt nghiệp P.notoginseng P.stipuleanatus T A .A T .G Aralia foliolosa T .AA G T P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng GCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTG A P.stipuleanatus Arali foliolosa P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng AACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGC T P.stipuleanatus Arali foliolosa P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng P.stipuleanatus GTCGCCCCCCAGCTCATCACTCCC-TCACGGGAGTCGAGGCGGAGGGGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGC A - A.C C.TG .T .A.C -.TG .T .A.C T -.TG .T T T .A.C -.TG T A.C .T-.TG .A.C T - G T .-.A.C.CG .- T .T Aralia foliolosa A.C.CG .- T AT T A P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng P.stipuleanatus CGTTGGCCCAAATGCGAGTCCTTGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCGTG G G AT G G G A G G T G C T Aralia foliolosa G T C.T P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius CGGTGACGCGT-CGC-CAGCAAAAGCTCTCATGACCCTGTTGCGCCGTCCTCGACGCGCGCTCCGACCGCGACCCCAG .C - - T .G G.GG G.G T .C - - A T .C - - .A C - - A .C - - T Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội P.notoginseng P.stipuleanatus Aralia Khóa luận tốt nghiệp C - - T .C - - A.G T A Aralia foliolosa P.sp P.japonicus P.vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng P.variabilis P.quinquefolius P.notoginseng P.stipuleanatus 30 GT - - .G A .T G-TCAGGCG - -.G .- .- .- .- .- .- .- Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS dài 700 nucleotite mẫu Sâm lào Sâm ngọc linh với mẫu khác thuộc họ Ngũ gia bì cho thấy xuất 21 nucleotite khác (hình 8) Trong số 21 vị trí sai khác V (variable) giá trị Pi (parsimony informative) (là vị trí có giá trị Parsimony) chiếm vị trí 3.4 Khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu này, khoảng cách di truyền 10 mẫu Sâm tính toán theo liệu tổng hợp vùng gen ITS- rADN Trình tự ADN sau so sánh cắt bỏ phần không trùng khớp hai đầu ghép lại với Tính toán khoảng cách thực phần mềm MEGA 5.1 theo thông số mặc định mô hình hiệu chỉnh Kimura, khoảng cách di truyền tính theo đột biến hoán đổi (transition) nucleotide A - T G - C hoán vị (tranversion) nucleotide A - C A G T - C hoăc T - G Dữ liệu DNA coi trình tự tương đồng (homologous) có nghĩa loài tiến hóa từ tổ tiên Sự khác cặp loài sở phân tích theo mô hình Kimura thông số (kimura 1980) xác định Kết phân tích cho thấy loài Aralia foliolosa có khoảng cách di truyền xa với tất loài lại, điều trùng khớp với dự kiến loài nằm chi Panax, mẫu đối chứng để chứng tỏ phương pháp phần mềm sử dụng tính toán chuẩn xác Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 31 Khoảng cách di truyền mẫu Sâm lào (Panax sp.) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) 0.028 Trong khoảng cách di truyền loài khác biệt cho giá trị lớn (ví dụ khoảng cách di truyền P.vietnamensis với P.notoginseng 0,042, với P.stipuleanatus 0,054, P.japonicus với P.notoginseng 0,036, với P.stipuleanatus 0,048, P.pseudogingeng Var bipinnatifidus với P.stipuleanatus 0,052, P.variabilis với P.stipuleanatus 0,043, P.notoginseng với P.stipuleanatus 0,05…(bảng 2) P.japonicus Var bipinnatifidus thứ loài P.japonicus, khoảng cách di truyền chúng 0,025 Kết kết luận : có sai khác trình tự nucleotit vùng ITS-rADN Sâm lào Sâm ngọc linh (Hình 6), với tỉ lệ thấp không đặc trưng cho đơn vị phân loại Như vậy, khác biệt di truyền Sâm lào Sâm ngọc linh sai khác cấp độ loài Bảng 2: Khoảng cách di truyền Sâm lào so sánh với số loài khác chi Panax T Loài 10 T Panax.sp P.japonicus Var 0.006 bipinnatifidus P.vietnamensis 0.028 0.028 P.japonicus 0.028 0.025 0.026 P.pseudogingeng 0.028 0.024 0.03 0.026 Var bipinnatifidus P.variabilis 0.023 0.02 0.028 0.025 0.021 P.quinquefolius 0.016 0.013 0.018 0.015 0.018 0.013 P.notoginseng 0.03 0.026 0.042 0.036 0.038 0.029 0.026 P.stipuleanatus 0.043 0.04 0.054 0.048 0.052 0.043 0.04 0.05 10 Aralia foliolosa 0.061 0.056 0.076 0.072 0.075 0.064 0.062 0.065 Lưu Thị Như 0.048 K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 32 Khóa luận tốt nghiệp Các đột biến nucleotide phân loại theo nhiều cách khác Khoảng cách di truyền tính toán theo phân loại Theo cách xếp nucleotide purine hay pyrimidine, đột biến làm thay đổi purine thành purine khác gọi đột biến hoán đổi (transition) Ngược lại đột biến làm biến đổi purine thành pyrimidine gọi đột biến hoán vị (transversition) Trong gen đột biến hoán đổi dễ xảy so với đột biến hoán vị Các đột biến tính toán theo biến đổi thành phần amino axit phân tử protein mà gene mã hóa Tuy nhiên thoái hóa mã di truyền không xảy tất đột biến để dẫn đến sai khác amino acid Một đột biến không làm thay đổi amino acid gọi đột biến “synonymus”, ngược lại đột biến làm thay đổi amino acid gọi đột biến “non-synonymus” Khi so sánh cấu trúc trình tự ADN, kết quan sát giống hay khác chúng không phản ánh khối lượng tiến hóa hai loài Do có trạng thái nucleotide A, T, G, C nên vị trí ba-zơ đa hình, số lượng đột biến thay nucleotide xảy quan sát một, thực tế xảy nhiều đột biến Các nhà khoa học cho số lượng đột biến thực tế lớn nhiều khối lượng thu từ thống kê nucleotide đa hình 3.5 Xây dựng phát sinh chủng loại Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Maximum Parsimony sở đối chiếu trình tự tương đồng với trình tự ITSrDNA mẫu Sâm thu Lào (Panax sp) Quảng Nam (P.vietnamensis) với loài khác chi Panax thể hình Loài Aralia foliolosa sử dụng loài tham chiếu nhóm Từ kết tính toán khoảng cách di truyền loài so sánh, sơ đồ mối quan hệ di truyền loài thiết lập (hình 7) Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 33 Khóa luận tốt nghiệp Hình Mối quan hệ di truyền loài Sâm lào (Panax sp.) Panax vietnamensis với số loài khác chi Panax sở phân tích trình tự vùng ITS - rADN phƣơng pháp Maximum Parsimony Việc phân tích mối quan hệ di truyền sở trình tự nucleotide vùng ITS- rADN 10 loài họ Ngũ gia bì theo phương pháp MP cho thấy Sâm ngọc linh (P.vietnamensis) có quan hệ di truyền gần gũi với P.japonicus, Sâm lào (Panax.sp) có quan hệ di truyền gần gũi với P japonicus var bipinnatifidus, P japonicus var bipinnatifidus thứ loài P japonicus với hệ số sai khác di truyền 0.025 Như vậy, dựa phân tích trình tự gen ITS, kết luận, quan hệ di truyền, Sâm lào thứ loài Sâm ngọc linh (với số sai khác di truyền Sâm lào Sâm ngọc linh 0,028), Cũng từ sơ đồ phát sinh chủng loại này, ta nhận định tổ tiên Panax vietnamensis Panax sp hình thành từ nguồn gốc chung với loài P japonicus Điều bộc lộ qua mức độ tương đồng trình tự cao loài với mẫu nghiên cứu Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 34 Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết dẫn liệu thu được, thu số kết luận đây: Đã giải mã 700 nucleotide thuộc vùng gen nhân (ITS) Sâm lào Sâm ngọc linh Kết phân tích trình tự gen ITS cho thấy mẫu Sâm thu Lào (Panax L.) thứ Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) Sau sử dụng phương pháp sinh học phân tử phân tích mối quan hệ di truyền Sâm lào (Panax sp.) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nằm loài, có sai nucleotit khác nội loài Sâm lào có quan hệ gần gũi với loài khác chi Panax ĐỀ NGHỊ Do thời than nghiên cứu điều kiện nghiên cứu có hạn nên đề nghị số ý kiến: Cần giải mã thêm vài trình tự gen khác để so sánh, từ đưa đến kết luận xác mối quan hệ di truyền loài sâm có nguồn gốc từ Lào loài Sâm ngọc linh Việt Nam Cần có nghiên cứu thêm dẫn liệu hình thái để khẳng định mối quan di truyền loài Sâm Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 35 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Tiến Bân - Chủ biên (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập 2, tr 1078-1079, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải cộng (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, tr 256-260, Nxb KH&KT, Hà Nội Bộ khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ Việt Nam, Phần II- Thực vật, tr.499-502, 530-532, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Bộ khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007), Danh lục đỏ Việt Nam,tr 232-233, Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Bộ y tế (2003), Hội thảo Bảo tồn phát triển sâm Việt Nam, Tam Kí – Quảng Nam Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, tr.425-426, NXB Y học Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Lã Đình Mỡ, Lưu Đàm Cư, Trần Minh Hơi, (2001), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam, tập 1,2, Nxb nông nghiệp Hà Nội Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2008), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội 10 Nguyễn Minh Đức cộng (1973), Nghiên cứu kháng sinh thảo mộc Một số đề tài nghiên cứu đông y, Nxb Y học, Hà Nội 11 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, tr.222-225, NXB Trẻ Tp Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 36 Khóa luận tốt nghiệp Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Thúy Hạnh, Phạm Quang Chung, Hoàng Minh Tuyết (2004), “Nguyên cứu đa dạng di truyền số dòng lúa chọn làm cấp lai tạo giống suất cao”, tạp chí công nghệ sinh học, 2(1), tr 101-108 13 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Huy Hoàng, Đặng Văn Hạnh, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2003), “Tách dòng xác định trình tự gen 18S-rRNA hai loài Lan hài Paphiopedilium helenae Paphiopedilium micrranthum”, Tạp chí sinh học 25 (1), tr 35-38 14 Phạm Hoàng Hộ Cộng (1991), Cây cỏ Việt Nam, 2(2): 611, Nxb Mekong Santa Ana 15 Nguyễn Thị Thu Hương, (2003) Kết nghiên cứu tác dụng dược lý Sâm Việt Nam Hội thảo bảo tồn phát triển Sâm Việt Nam, Tam Kỳ, tr 76-90 16 Trần Công Luận, (2003) “Kết nghiên cứu hóa học Sâm Việt Nam 1978-2002” Hội thảo bảo tồn phát triển Sâm Việt Nam, Tam Kỳ, tr 67 –75 17 Đỗ Tất lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, tr 808 – 810 18 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Thanh Trăng, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Văn Phượng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân loài Mỡ Hải Nam (Manglietia hainanensis Dandy) thị RAPD cpSSR”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 2, tr 918–925 19 Lê Thanh Sơn Nguyễn tập (2006), “Những đặc điểm sinh thái Sâm ngọc linh”, Tạp chí Dược liệu, 14 (4), 145-147 20.Khuất Hữu Thanh (2005), Kỹ thuật gen –Nguyên lý ứng dụng, tr 36-40 NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 21 Nguyễn Minh Tâm, Nguyễn Thị Phương Trang, Nguyễn Tiến Hiệp, Trần Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 37 Khóa luận tốt nghiệp Đình Lý, Ludwig Triest (2005), “Đánh giá đa dạng di truyền quần thể Tuế Cycas dolichophylla (Cycadaceae)”, Tạp chí công nghệ sinh học,3(1), tr 79-88 22 Nguyễn Đức Thành, Henry Nguyễn (1999), “Nghiên cứu đa dạng phân tử lúa kỹ thuật đa hình chuỗi lặp đơn giản (SSB)”, Tạp chí Sinh học, 21(1b), tr 107-112 23 Nguyễn Tập (2005), “Các loài chi Panax L Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 10(3),71-76 24 Nguyễn Tập, 2006, “Danh lục đỏ thuốc Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu 3(11), tr 97 – 105 25 Dương Hữu Thời, (1963), Sinh thái học thực vật, Đại học Tổng hợp Hà Nội xuất 26 Đặng Tất Thế, Lê Xuân Cảnh, Nông Văn Hải (2004), “Phân tích gen ty thể giả voọc thuộc giống Trachypithecus Việt Nam”, Tạp chí sinh học,số 27 (4a), tr 63–70 27 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1988), Hệ thống học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tiếng anh 28 Ahlquist, Jon E., (1999), A commentary on 30 years of collaboration The Auk, vol 116, No 29 Avise CJ (1992), Molecular population structure and the biogeographic history of regional fauna: a case history with lessons for conservation biology Oikos No 63: pp: 62-76 30 Avise CJ (1995), Mitochondrial DNA polymorphism and a connection between genetics and demography of relevance to conservation Conservation Biology Vol 9: pp: 686 – 690 Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 31 Baldwin BG (1993), 38 Molecular Khóa luận tốt nghiệp phylogenetics of Calycadenia (Compositae) based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA: chromosomal and morpho 32 Baldwin BG Sanderson MJ, Poter JM, et al (1995), The ITS region of nuclear ribisomal DNA: a valuable soirce of evidence on angiosperm phylogeny Annals of the Missouri Boranic Garden No 82, pp: 247-277 33.Choi H.-K J Wen 2000 A phylogenetic analysis of Panax (Araliaceae): integrating cpDNA restriction site and nuclear rDNA ITS sequence data Plant Systematics and Evolution Vol 224, pp: 109-120 34 Corbin KW, Ferguson A, Wilson AC, Brush AH, Ahlquist JE (1974) Genetic polymorphism in New Guinea starlings of the genus Aplonis Condor No 76, pp: 301-18 35 Densmore LD, Dessauer HC (1984), Low levels of protein divergece detected between Gavialis and Tomistoma: Evidence for crocodilian monophyly Biochemistry and Physiology No 77, pp: 715-720 36.Eriksen B.(1993), Floral anatomy and morphology in the Polygalaceace Plant Systermatics and Evolution No 186, pp.17-32.28 37 Etherington, T and M Palermo (2006) Products and Markets Non-wood News Vol 13, pp: 1-91 38 Jun Wen and Joan W Nowicke, 1999 Pollen ultrastructure of Panax(the ginseng genus, Araliaceae),an eastern Asian and eastern NorthAmerican disjunct genus”, American Jounal of Botany, vol 86, No 11, pp: 16241636 39 F Sanger and A R Coulon, 1999, DNA sequencing with chain – terminating inhibitors, Proc Natl Acad Set USA vol 74, No.12, pp: 5463-5467 Lưu Thị Như K35C - Sinh [...]... phân tích được mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp. ) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv .) có thể cùng nằm trong 1 loài, có sự sai này nucleotit chỉ là sự khác trong nội bộ loài Sâm lào có quan hệ gần gũi với các loài khác trong chi Panax ĐỀ NGHỊ Do thời than nghiên cứu và điều kiện nghiên cứu của chúng tôi có hạn nên chúng tôi đề nghị một số ý kiến: 1 Cần giải mã thêm một vài... (P .vietnamensis) có quan hệ di truyền gần gũi với P.japonicus, trong khi Sâm lào (Panax. sp) có quan hệ di truyền gần gũi với P japonicus var bipinnatifidus, trong khi P japonicus var bipinnatifidus là một thứ của loài P japonicus với hệ số sai khác di truyền là 0.025 Như vậy, dựa trên phân tích trình tự gen ITS, có thể kết luận, về quan hệ di truyền, Sâm lào là 1 thứ của loài Sâm ngọc linh (với chỉ số. .. ĐHSP Hà Nội 2 33 Khóa luận tốt nghiệp Hình 9 Mối quan hệ di truyền của loài Sâm lào (Panax sp. ) và Panax vietnamensis với một số loài khác trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự vùng ITS - rADN bằng phƣơng pháp Maximum Parsimony Việc phân tích mối quan hệ di truyền trên cơ sở trình tự nucleotide của vùng ITS- rADN của 10 loài trong họ Ngũ gia bì theo phương pháp MP cho thấy Sâm ngọc linh (P .vietnamensis) ... ITS-rADN giữa Sâm lào và Sâm ngọc linh (Hình 6), nhưng với tỉ lệ thấp và không đặc trưng cho một đơn vị phân loại mới Như vậy, những khác biệt di truyền giữa Sâm lào và Sâm ngọc linh chỉ là sự sai khác ở cấp độ dưới loài Bảng 2: Khoảng cách di truyền của Sâm lào so sánh với 1 số loài khác trong chi Panax T 1 Loài 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T 1 Panax .sp 2 P.japonicus Var 0.006 bipinnatifidus 3 P .vietnamensis 0.028... trên cơ sở đối chi u các trình tự tương đồng với trình tự ITSrDNA của mẫu Sâm thu được ở Lào (Panax sp) và Quảng Nam (P .vietnamensis) với 7 loài khác trong chi Panax được thể hiện hình 7 Loài Aralia foliolosa được sử dụng là loài tham chi u ngoài nhóm Từ kết quả tính toán về khoảng cách di truyền giữa các loài so sánh, sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các loài này được thiết lập (hình 7) Lưu Thị Như... tự nucleotide mẫu nghiên cứu với một số loài Sâm trên ngân hàng gen Kết quả đọc trình tự vùng ITS - rADN của mẫu Sâm lào thu được trình tự đoạn gen ITS với tổng số 700bp Kết quả này được dùng để so sánh với 1 số mẫu sâm khác trên genbank (bảng 3) Hình 8: So sánh trình tự vùng ITS-rADN của Sâm lào và Sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax P .sp P.japonicus P .vietnamensis P.japonicus P.pseudoginseng... 6 Panax stipuleanatus U41690 7 Panax variabilis AY233329 8 Aralia foliolosa DQ007383 Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chúng tôi đã tiến hành giải mã 1 đoạn gen ITS của Sâm lào và Sâm ngọc linh, so sánh một số loài khác trong chi Panax để làm rõ vị trí phân loại của Sâm lào nói riêng cũng như mối quan hệ di truyền Sâm lào với Sâm ngọc linh. .. LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ các kết quả và những dẫn liệu thu được, chúng tôi đã thu được một số kết luận dưới đây: 1 Đã giải mã được 700 nucleotide thuộc vùng gen nhân (ITS) của Sâm lào và Sâm ngọc linh 2 Kết quả phân tích trình tự gen ITS cho thấy mẫu Sâm thu được tại Lào (Panax L .) có thể là một thứ của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) 3 Sau khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử chúng tôi đã phân. .. và cộng sự đã nghiên cứu Nhâm sâm việt nam, so sánh với Nhâm sâm Triều Tiên (Panax ginseng), Nhâm sâm nhật bản (Panax japonicus) và Nhâm sâm hoa kỳ (Panax quinquefollium) [17] Kết quả có thể tóm tắt như sau: Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng Chi. .. mềm chúng tôi sử dụng trong tính toán là chuẩn xác Lưu Thị Như K35C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 31 Khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu Sâm lào (Panax sp. ) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) là 0.028 Trong khi đó khoảng cách di truyền giữa 2 loài khác biệt đều cho giá trị lớn hơn (ví dụ như khoảng cách di truyền giữa P .vietnamensis với P.notoginseng là 0,042, với P.stipuleanatus là ... tự vùng ITS-rADN Sâm lào 22 Sâm ngọc linh với số loài khác chi Panax Hình Mối quan hệ di truyền loài Sâm lào (Panax sp.) 27 Panax vietnamensis với số loài khác chi Panax sở phân tích trình tự vùng... trung thực, khách quan khóa luận, xin cam đoan: Khóa luận Phân tích mối quan hệ di truyền Sâm lào (Panax sp.) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số loài Sâm khác chi Panax ” công... hệ di truyền Sâm lào (Panax sp.) Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nằm loài, có sai nucleotit khác nội loài Sâm lào có quan hệ gần gũi với loài khác chi Panax ĐỀ NGHỊ Do thời than