Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Việt Nam nằm vành đai có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, với nét đặc trưng thay đổi từ điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình ở những vùng đất thấp phía nam đến các đặc điểm mang tính chất cận nhiệt đới ở vùng núi cao phía bắc Nước ta, phần đất liền trải dài từ 8o30’ đến 23o22’ vĩ độ Bắc, phía đông và phía nam giáp với biển Đông, tây giáp với Lào và Campuchia, bắc giáp với Trung Quốc Với diện tích 330.000 km2, đó đồi núi chiếm gần 4/5 Đây là những điều kiện thuận lợi tạo nên hệ thực vật rất phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, đó có tới 4000 loài được nhân dân dùng làm thảo dược [3] Điều này thực sự có ý nghĩa rất to lớn cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được rất nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh, song các hợp chất này có một số hạn chế, gây tác dụng phụ không mong muốn Mặt khác, nước ta là nước phát triển, thu nhập bình quân đầu người thấp mà các thuốc chữa bệnh hầu đều nhập khẩu từ nước ngoài và kèm theo đó là giá thành cao, gây khó khăn cho người sử dụng Do đó, nhà nước đã có chủ trương và khuyến khích tăng cường sản xuất thuốc nước Một các nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc được lấy từ thiên nhiên bởi đặc tính ít gây tác dụng phụ, ít độc, dễ hấp phụ và không làm tổn hại đến môi trường Vì vậy, vấn đề được đặc biệt quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách từ sản phẩm thiên nhiên Theo công bố hiện có khoảng 60-70% các loại thuốc chữa bệnh được lưu hành hoặc thời gian thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [2] Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Trong số các loài cần quan tâm nghiên cứu có Kháo (Phoebe tavoyana) Cây Kháo thường phân bố ở miền nam Trung Quốc và miền bắc Việt Nam thường mọc ở độ cao 700-2500m Theo kinh nghiệm dân gian lá các của chi Kháo dùng để tiêu mụn nhọt và thuốc sắc vỏ dùng để trừ phong thấp [5] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số hợp chất Kháo có khả kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng tiểu cầu và hoạt tính chống ung thư Xuất pháp từ ý nghĩa thực tiễn nên đã chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kháo (Phoebe tavoyana)” Với mục đích nghiên cứu thành phần flavonoit có Kháo và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập Từ đó tạo sở cho những nghiên cứu tiếp theo lĩnh vực tìm các phương thuốc mới cũng giải thích được tác dụng chữa bệnh của các thuốc cổ truyền Việt Nam Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của nền y học Nhiệm vụ của đề tài là: Thu mẫu lá Kháo, xử lí mẫu, tạo dịch chiết Phân lập các hợp chất flavonoit Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm, tính vị công dụng Kháo 1.1.1 Mô tả Tên khoa học: Phoebe tavoyana Tên tiếng Việt: Cây Kháo (Sụ lá to, Bời lời cơm) Họ: Long não (Lauraceae) Là loại gỗ nhỏ, cao 10 m, cành nhỏ, phủ lông dày màu nâu Lá có phiến thon gọn ở đầu, dài 20 - 27cm, rộng - 13cm, đầu nhọn, gốc hình nêm, mặt nhẵn, mặt dưới có lông, có Hình 1.1: Cây Kháo - 11 đôi gân bậc hai Cuống lá dài 1,5 - 2,5cm, có lông Cụm hoa chùy ở đầu cành, dài 10cm, phủ lông dày, cuống hoa dài - 7mm Mảnh bao hoa 6, các mảnh của vòng ngoài nhỏ của vòng trong, phủ lông nâu Nhị hữu thụ 9, nhị ở hai vòng ngoài không lông, nhị Hình 1.2: Quả Kháo vòng có lông, ở gốc chỉ nhị có hai tuyến hình tim có chân Nhị lép hình đầu mũi tên có lông Bầu hình cầu, vòi hình đầu Quả hình cầu, đường kính khoảng 1cm Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2 Phân bố, sinh thái Chi Kháo có khoảng 23 loài, phân bố ở miền nam Trung Quốc và miền bắc Việt Nam Cây thường mọc ở độ cao 700-2500m Ở Việt Nam, Kháo phân bố ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc và Như Xuân, Thanh Hóa [5] Ngoài ra, phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Lào, Thái Lan, Campuchia, Ma-lay-xi-a Inđô-nê-xi-a Nơi sống và sinh thái: Mọc rất rải rác dưới tán rừng mưa nhiệt đới thường xanh mưa mùa ẩm, ở độ cao khoảng 300m trở lên, cùng với một số loài của các họ khác Na (Annonaceae), Đậu (Fabaceae), Thầu Dầu (Euphoriaceae), Sinh học: Cây tái sinh bằng hạt, mùa quả chín tháng 12, quả chỉ có một hạt giống nhất và chúng thường xuyên phân tán bởi các loài chim Kết quả là những hạt giống này điều kiện tốt sẽ nảy mầm 1.1.3 Thành phần hóa học Ở Việt Nam có ít nghiên cứu và chưa có nghiên cứu chuyên sâu về Kháo Năm 2005, hai tác giả Nguyễn Văn Hùng và Nguyễn Văn Tuyến [7] đã công bố hợp chất ancaloit phân lập từ vỏ thân Kháo là: Corydin (1), Pronuciferin (2), Anonain (3), Norcorydin (4), Stepharin (5), Nmetyllaurotetenin (6) và N- metyllaurolitsin (7) H3CO H3CO N N HO O CH3 H3CO H H H3CO H3CO H3CO NH O O H3CO Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp H3CO H3CO NH HO H3CO HO NH H3CO NH N H3CO H3CO H H H H3CO O H3CO H3CO H3CO OH OH Cho đến nay, thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về các loài chi Kháo (P molocella, P pittier, P formosana, P valeriana, P.grandis ) thuộc họ Long não [11,12,16,17,18,19] Người ta đã phân lập và xác định cấu trúc của rất nhiều aporphin ancaloit từ các chi này Theo tác giả Hanita Omar, năm 2009, từ vỏ của Phoebe tavoyana đã cô lập và tinh chế ancaloit, đó có hợp chất mới: (+)-tavoyanine 101 và (-)-tavoyanine 102 cùng với aporphines đã biết là: 77 norboldine, 73 laetanine, roemrine 84, boldine 74 và hợp chất morphinandienone: sebiferine 103 [22] 1.1.4 Hoạt tính sinh học Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của aporphin ancaloit có Kháo Một số aporphin ancaloit có khả kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng tiểu cầu và hoạt tính chống ung thư Các hợp chất này được tìm thấy các loài của chi Kháo (P pittieri, P chinensis…)[7] Trong chương trình sàng lọc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật Việt Nam của Viện Hóa Sinh biển đã thử hoạt tính sơ bộ dịch chiết MeOH của lá Kháo Phoebe tavoyana (Meisn.) Hook.f Kết quả cho thấy, dịch chiết MeOH này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư gan người (Hep-2) và ung thư màng tim (RD) Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học hợp chất được phân lập từ Kháo (Phoebe tavoyana (Meisn.) Hook.f.) Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp có ý nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống 1.1.5 Công dụng Theo kinh nghiệm dân gian thì lá của được dùng để tiêu mụn nhọt và nước sắc vỏ được dùng để trừ phong thấp [5] 1.2 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có Kháo 1.2.1 Giới thiệu chung [1,4,10,13,19] Flavonoit là một những hợp chất phân bố rộng rãi nhất tự nhiên Theo quá trình tiến hóa của thực vật, flavonoit bắt đầu xuất hiện ở hai loại tảo vàng, cách 280 triệu năm và sống ở nước ngọt hay nước lợ Sự tiến hóa của flavonoit liên quan đến sự tiến hóa thực vật và dẫn đến ba sự thay đổi quan trọng về mặt cấu trúc của flavonoit:  Sự biến mất Proantoxianidin  Sự mất ba nhóm OH ở vòng benzen  Sự thay thế flavonol bởi flavon Flavonoit có mặt hầu hết các bộ phận của như: lá, hoa, quả, thân, rễ… và cư trú ở thành tế bào Nó tham gia vào sự hình thành màu sắc của đặc biệt là hoa Flavonoit một nhóm hợp chất polyphenol đa dạng về cấu trúc và tác dụng sinh học Các polyphenol có thể phản ứng lẫn qua nhóm OH để tạo thành phân tử phức tạp hoặc hay có thể liên kết với các hợp cất khác Các chất flavonoit có cấu tạo gồm hai vòng benzen A và B được nối với bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon C6-C3-C6 Việc phân loại các flavonoit dựa sự khác của nhóm C3 (các glicozit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin là các chất tan nước và thường nằm không bào) Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Các flavonoit là các dẫn xuất của 2–phenyl chromen (flavan) A 1' O B 3' 2' 4' 5' 10 6' C Hình 1.3 : Flavan (2-phenyl chromen) 1.2.2 Các nhóm flavonoit [1,4,10,13,19] 1.2.2.1 Flavon flavonol: Nhóm flavon và flavonl rất phổ biến tự nhiên Công thức cấu tạo của chúng chỉ khác ở vị trí Cacbon số O O OH RO OH RO OH O O Hình 1.4: Flavon Hình 1.5: Flavonol Trong thưc vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng tự mà thường dưới dạng glycozit 1.2.2.2 Flavanon: Các flavanon nằm cân bằng hỗ biến các Chalcon vòng dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy mở vòng chuyển thành chalcon O OR RO O Hình 1.6: Flavanon Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2.3 Flavanonol-3: Có nguyên tử cacbon bất đối là C-2 C-3 nên chúng có tính quang hoạt Các hợp chất thường gặp là aromadendrin, fustin taxifolin OR O RO OH O Hình 1.7: Flavanonol-3 1.2.2.4 Chalcon: Chalcon khác với các loại flavonoit là gồm vòng benzen A và B được nối với bởi mạch hở có nguyên tử cacbon Chalcon có thể bị đồng phân hoá thành flavonon đun nóng với axit clohidric (HCl) OR OH RO O Hình 1.8: Chalcon 1.2.2.5 Auron: Có màu đậm và không tạo màu thực hiện phản ứng shinoda (phản ứng định tính flavonoit) O RO A C OR CH B O Hình 1.9: Auron Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2.6 Antoxianidin: Công thức chung sau OR O RO OH Hình 1.10: Antoxianidin Thường gặp tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan nước Màu sắc của nó thay đổi theo pH 1.2.2.7 Leucoantoxianidin: Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng agycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit O OH O Hình 1.11: Leucoantoxianidin 1.2.2.8 Catechin: Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol Do có trung tâm cacbon bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng cặp đồng phân đối quang OH O HO OH OH O HO OH OH OH OH OH Hình 1.12: (+)-Catechin Hình 1.13: (-)-Catechin OH O HO OH OH O HO OH OH Hình 1.14: (+)-Epicatechin Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học OH OH OH Hình 1.15: (-)-Epicatechin Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2.9 Isoflavonoit: Bao gồm các dẫn xuất của 3-phenyl chroman O O O Hình 1.16: 3-phenyl chromen Hình 1.17: 3-phenylchromen-4-one 1.2.2.10 Rotenoit neoflavonoit: Các rotenoit có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc cũng sinh tổng hợp H O O O H O OMe MeO Hình 1.18: Rotenoit 1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 1.3.1 Đặc điểm chung chiết - Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà tan với - Mục đích của chiết: + Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 10 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết phân đoạn phân lập hợp chất Mẫu lá của Kháo được rửa sạch, phơi khô bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, rồi đem nghiền nhỏ thành bột thu được 5,0kg bột khô Sau đó, bột khô được ngâm chiết với metanol ba lần, thu được 300,0 g cặn chiết metanol Cặn metanol được hoà tan vào lít nước cất và chiết lần lượt bằng n-hexan, cloroform và etyl axetat Sau loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn n-hexan (50,0 g), cloroform (90,0 g), etyl axetat (75,0 g) và nước (65,0 g) Cặn etyl axetat được tẩm vào 150g silicagel, cô đuổi dung môi cho đến thu được bột tơi, khô Tiến hành sắc ký cột nhồi silicagel pha thường cỡ hạt 230 - 400 mesh (0,04 - 0,063 mm), rửa giải bằng hệ dung môi cloroform: metanol với độ phân cực tăng dần (từ 20:1 - 2:1, v/v) thu được phân đoạn F1 (20,0 g), F2 (12,5 g), F3 (8,5 g), F4 (12,0 g) F5 (18,0 g) Phân đoạn F1 (20,0 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là cloroform/metanol (10/1, v/v) thu được hợp chất F1.1 (20 mg) và hợp chất F1.2 (30 mg) Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 27 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CÆn MeOH (300 g) Hexan: n-íc 1/1 Líp n-íc Bæ sung CHCl3 CÆn Hexan (50 g) CHCl3: n-íc 1/1 Líp n-íc CÆn CHCl3 (90 g) EtOAc: n-íc 1/1 Líp n-íc CÆn EtOAc (75 g) CÆn n-íc (65 g) Hình 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn từ loài Phoebe tovoyana CÆnEtOAc (75 g) Silica gel CC Cloroform/metanol: 20/1 – 2/1 F2 (12,5 g) F3 (8,5 g) F4 (12,0g) F5 (18,0 g) Silica gel CC cloroform/ metanol: 10/1 F1 (20,0 g) F1.1 (20 mg) F1.2 (30 mg) Hình 3.2: Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn EtOAc Kháo Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 28 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 3.2.1 Hợp chất F1.1 Chất thu được dưới dạng tinh thể màu vàng Điểm nóng chảy Mp: 245oC Độ quay cực []D-50,4o Phổ khối lượng xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 313 [M+Na]+ 289 [M-H]- M= 290, công thức phân tử là C15H14O6 H-NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): 4,83 (1H, s, H-2), 4,19 (1H, m, H-3), 2,77 (1H, dd, J = 16,5, 2,5 Hz, Ha-4), 2,89 (1H, dd, J = 16,5, 4,5 Hz, Hb-4), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,97 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,77 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,83 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6') 13 C-NMR (150 MHz, CD3OD)  (ppm): 79,82 (C-2), 67,44 (C-3), 29,21 (C-4), 157,59 (C-5), 95,90 (C-6), 157,32 (C-7), 96,41 (C-8), 157,93 (C9), 100,09 (C-10), 132,25 (C-1′), 115,90 (C-2′), 145,88 (C-3′), 145,71 (C-4′), 115,30 (C-5′), 119,40 (C-6′) 3.2.2 Hợp chất F1.2 Chất thu được dưới dạng tinh thể màu vàng Điểm nóng chảy Mp: 175 -177oC Độ quay cực []D+50,4o Phổ khối lượng xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 289 [M-H]- , M=290, công thức phân tử là C15H14O6 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 4,57 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-2), 3,99 (1H, m, H-3), 2,53 (1H, dd, J = 8,5, 16,0 Hz, Ha-4), 2,88 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz, Hb-4), 5,87 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 5,94 (1H, d, J = 2,5 Hz, H- Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 29 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 8), 6,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,77 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,74 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 82,88 (C-2), 68,83 (C-3), 28,51 (C-4), 157,58 (C-5), 96,35 (C-6), 157,85 (C-7), 95,56 (C-8), 156,93 (C-9), 100,87 (C-10), 132,28 (C-1′), 115,29 (C-2′), 146,26 (C-3′), 146,26 (C-4′), 116,11 (C-5′), 120,04 (C-6′) Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 30 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất F1.1 Chất F1.1 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng, phổ khối lượng xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 313 [M+Na]+ 289 [M-H]- kết hợp với phổ NMR dự đoán công thức phân tử là C15H14O6 Phổ 1H-NMR của chất F1.1 xuất hiện tín hiệu của hai proton ở vị trí meta với tại  5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,97 (1H, d, J = 2,0 Hz, H8), đồng thời phổ phổ 1H-NMR cũng xác định sự xuất hiện của một vòng thơm thế kiểu 1, 3, bởi các tín hiệu  7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,77 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,83 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6') Ngoài xuất hiện tín hiệu của một nhóm metin tại  4,83 (1H, s, H-2), một proton nối với oxi tại 4,19 (1H, m, H-3) và hai proton của nhóm metilen tại 2,77 (1H, dd, J = 16,5, 2,5 Hz, Ha-4), 2,89 (1H, dd, J = 16,5, 4,5 Hz, Hb-4) H×nh 3.3: Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt F1.1 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 31 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phổ 13 Khóa luận tốt nghiệp C-NMR và phổ DEPT của chất F1.1 xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon đó có tín hiệu của cacbon bậc ở C: 157,59 (C-5), 157,32 (C-7), 157,93 (C-9), 100,09 (C-10), 132,25 (C-1’), 145,88 (C-3’), 145,71 (C-4’); tín hiệu của nhóm metin đó có tín hiệu của metin nhân thơm ở C: 95,90 (C-6), 96,41 (C-8), 115,90 (C-2’), 115,30 (C-5’), 119,40 (C-6’) và tín hiệu nhóm oxmetin ở C: 79,82 (C-2), 67,44 (C-3); tín hiệu của nhóm metilen ở C 29,21 (C-4) Ta thấy, tín hiệu của hai nhóm metin tại C 79,82/H 4,83 (s) C 67,44/H 4,19 (m) phù hợp với vị trí C-2 C-3 của khung 3α-hydroxyflavan Tín hiệu proton tại vị trí H-2 dạng singlet khẳng định proton H-2 H-3 cùng dạng β H×nh 3.4 Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt F1.1 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 32 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp H×nh 3.5 Phæ DEPT cña hîp chÊt F1.1 So sánh các dữ kiện phổ và độ quay cực của chất F1.1 với các dữ kiện phổ của chất (-)-epicatechin tài liệu tham khảo [20] thấy có sự phù hợp hoàn toàn Như vậy chất F1.1 được khẳng định là (-)-epicatechin một chất đã được phân lập từ nhựa loài Croton lechleri Bảng 1: Số liệu phổ NMR chất F1.1 chất tham khảo C * δCd,e 79.4 66.9 28.9 δCa,b 79.82 67.44 29.21 DEPT CH CH CH2 10 1' 2' 3' 157.6 95.7 157.0 96.2 157.6 99.7 132.2 115.4 145.4 157.59 95.90 157.32 96.41 157.93 100.09 132.25 115.90 145.88 C CH C CH C C C CH C Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học δHa,c mult (J= Hz) 4.83 s 4.19 m 2.77 dd (16.5, 2.5) 2.89 dd (16.5, 4.5) 5.94 d (2.0) 5.97 d (2.0) 7.00 d (2.0) - 33 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 145.2 145.71 C 115.2 115.30 CH 6.77 d (8.0) 119.2 119.40 CH 6.83 dd (8.0, 2.0) a b c d đo CD3 OD, 125MHz, 500MHz, đo DMSO-d6, e f 150MHz, 600MHz * Số liệu phổ theo chất (-)-epicatechin tài liệu số [20] 4' 5' 6' OH OH 3' 4' 2' HO O 1' 10 5' 6' OH OH Hình 3.6 Cấu trúc hóa học hợp chất F1.1 Hình 3.7 Phổ khối lượng hợp chất F1.1 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất F1.2 Hợp chất F1.2 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng, phổ khối lượng xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 289 [M-H]- gợi ý công thức phân tử là C15H14O6 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Phổ 1H-NMR của F1.2 khá giống với F1.1, đó có hai proton ở vị trí meta với tại  5,87 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) 5,94 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8); một vòng thơm bị thế 1, 3, được khẳng định bởi các tín hiệu tại  6,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2'), 6,77 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5') 6,74 (1H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-6'); hai nhóm metin có nối với nguyên tử oxi tại  4,57 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2) 3,99 (1H, m, H-3); hai proton của nhóm metilen tại  2,53 (1H, dd, J = 16,0, 8,5 Hz, Ha-4) 2,88 (1H, dd, J = 16,0, 5,5 Hz, Hb-4) H×nh 3.8 Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt F1.2 Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất F1.2 cũng xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon của một hợp chất flavan đó có tín hiệu của cacbon bậc ở C: 157,58 (C-5), 157,85 (C-7), 156,93 (C-9), 100,87 (C-10), 132,28 (C-1’), 146,26 (C-3’), 146,26 (C-4’); tín hiệu của nhóm metin Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 35 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp đó có tín hiệu của metin nhân thơm ở C: 96,35 (C-6), 95,56 (C-8), 115,29 (C-2’), 116,11 (C-5’), 120,04 (C-6’) và tín hiệu nhóm oximetin ở C: 82,88 (C-2), 68,83 (C-3); tín hiệu của nhóm metilen ở C 28,51 (C-4) Ta thấy, tín hiệu của hai nhóm metin tại  82,88 68,83 tương ứng phù hợp với C-2 C-3 của khung 3β- hydroxyflavan So sánh các dữ kiện phổ và độ quay cực của hợp chất F1.2 với các dữ kiện phổ của chất (+)-catechin [2] thấy có sự phù hợp hoàn toàn Từ những phân tích nêu trên, hợp chất F1.2 được khẳng định là (+)-catechin, một thành phần quan trọng của tannin chè xanh đã được chứng minh có tác dụng chống oxi hóa hiệu quả [21] H×nh 3.9 Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt F1.2 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 36 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.10 Phổ DEPT hợp chất F1.2 Bảng Số liệu phổ NMR hợp F1.2 δHa,c mult (J= Hz) 4.57 d (7.5) 3.99 m 2.53 dd (16.0, 8.5) 2.88 dd (16.0, 5.5) 156.1 157.58 C 95.3 96.35 CH 5.87 d (2.5) 156.4 157.85 C 94.0 95.56 CH 5.94 d (2.5) 155.3 156.93 C 10 99.2 100.87 C 130.7 132.28 C 1' 114.5 115.29 CH 6.86 d (1.5) 2' 144.8 146.26 C 3' 144.8 146.26 C 4' 115.1 116.11 CH 6.77 d (8.0) 5' 118.4 120.04 CH 6.74 dd (8.0, 1.5) 6' a đo CD3 OD, b 125MHz, c 500MHz, d đo DMSO-d6, e 150MHz, f 600MHz * Số liệu phổ theo chất (+)-catechin tài liệu số [21] C * δCd,e 81.0 66.4 27.7 δCa,b 82.88 68.83 28.51 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học DEPT CH CH CH2 37 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp OH OH 3' 4' 2' HO 1' O 10 5' 6' OH OH Hình 3.11 Cấu trúc hóa học hợp chất F1.2 Hình 3.12 Phổ khối lượng hợp chất F1.2 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 38 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Trong quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kháo (Phoebe tavoyana)” Từ lá Kháo (Phoebe tavoyana), bằng các phương pháp chiết và sắc ký hết hợp sắc ký cột nhồi silica gel pha thường, sắc ký lớp mỏng điều chế, đã phân lập được hợp chất flavonoit sau: Hợp chất F1.1: (-)-epicatechin Hợp chất F1.2: (+)-catechin Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1H-NMR, 13CNMR, DEPT 135, DEPT 90) và phổ khối lượng Bảng Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAc Kháo OH OH OH OH 3' HO O 10 2' 2' 1' 5' 1' 6' HO OH OH Hợp chất F1.1: (-)-epicatechin M = 290, C15H14O6 O 3' 4' 5' 6' 10 4' OH OH Hợp chất F1.2: (+)-catechin M = 290, C15H14O6 Các kết quả nghiên cứu bước đầu đã đóng góp thêm vào việc làm sáng tỏ thành phần hoá học của Kháo (Phoebe tavoyana) và giải thích được tác dụng chữa bệnh cũng định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm khai thác có hiệu quả nguồn tài nguyên dược liệu nước Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 39 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Hayerman A.E., Butler I.G., Assay of condensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249 (1994) [2] Nguyễn Tiến Bân và cộng sự, Sách đỏ Việt Nam (Phần II Thực vật), trang 177, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 2010 [3] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tập I, trang 875-876 (2004) [4] Ternai B., Markham K.R., C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 (1976) [5] Võ Văn Chi, 1999 Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội, trang 471 [6] Phạm Hoàng Hộ, Cây Cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ, quyển 1, trang 394 (1999) [7] Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Văn Tuyến, Các hợp chất aporphin ancaloit từ Kháo (Sụ lá to), Phoebe tovoyana (Meissn.) Hook F (Họ Long não), Tạp chí Hóa học, tập 43 (5), trang 586-589, 2005 [8] Duc Do Khac, Sung Tran Van, Angela Martha Campos, Jean-Yves Lallemand and Marcel Fetizon, Ellagic acid compounds from Diplopanax stachyanthus, Phytochemistry, Vol.29(1), pp 251-256 (1990) [9] E Martinez, A M P De Diaz, P Nathan, J Planta Medica, P.361362 (1988) Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 40 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp [10] Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., The syrematic indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New york, (1970) [11] F Stermitz, O C Castro J Nat Prod., Vol.46, P 913-916 (1983) [12] F M Huang, C F Huang, S S Lee The Chinese Pharmaceutical Journal, Vol 49, P 217-227 (1997) [13] Harborn J.B., The flavonoids advance in research since 1986, Chaprman & Hall, (1994) [14] Peter J Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from Desfontainia spinosa, Phytochemistry, Vol.25(8), pp 1939-1944 (1986) [15] Liang Guang-Yi, Alexander I Gray and Peter G Waterman, Pentacylic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol.52, pp 162-167 (1989) [16] M R Mukhtar, M T Martin, M Domansky, M Pais, A H A Hadi, K Awang Phyto-chemistry, Vol 45, P 1543-1546 [17] N H Laijs, Z Manhud, R F Toia J Nat Prod., Vol 54,P 612-614 (1991) [18] O C Castro, J V Lopez, A G Vergara Phytochemistry, Vol 24, P.203-204 (1985) [19] Agrawal P.K., Carbon-13 NMR of flavonoids, Elsevier Science Pub B.V., (1989) [20] Y.Cai, F J Evans, M F Roberts, J D Phillipson, M H Zenk and Y Y Gleba Polyphenolic compounds from Croton lechleri Phytochemistry, Vol 30, No 6, 2033-2040, 1991 [21] Chien- Chang Shen, Yuan-Shiun Chang and Li-Kang Ho Nuclear magneti resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids Phytochemistry, Vol 34, No 3, 843-845,1993 [22] http://hdl.handle.net/1812/489 Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 41 [...]... K35C- Khoa Hóa học 23 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Mẫu lá cây Kháo (Phoebe tavoyana) được thu hái vào tháng 08 năm 2011 tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc Mẫu cây được PGS.TS Ninh Khắc Bản ,Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định Mẫu tiêu... CÆn EtOAc (75 g) CÆn n-íc (65 g) Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá loài Phoebe tovoyana CÆnEtOAc (75 g) Silica gel CC Cloroform/metanol: 20/1 – 2/1 F2 (12,5 g) F3 (8,5 g) F4 (12,0g) F5 (18,0 g) Silica gel CC cloroform/ metanol: 10/1 F1 (20,0 g) F1.1 (20 mg) F1.2 (30 mg) Hình 3.2: Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ cặn EtOAc của cây Kháo Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 28 Trường Đại học Sư... hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không... Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chloroform, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa Những tạp chất của chloroform... Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp khiết Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu 1.5.2 Độ quay cực ([α]D) Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện trường... Spectroscopy, NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 20 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa... bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó... Phạm Thị Hoài, K35C- Khoa Hóa học 26 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất Mẫu lá của cây Kháo được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, rồi đem nghiền nhỏ thành bột thu được 5,0kg bột khô Sau đó, bột khô được ngâm chiết... trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn Sau khi ... đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kháo (Phoebe tavoyana) Với mục đích nghiên cứu thành phần flavonoit có Kháo và xác định cấu trúc... quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kháo (Phoebe tavoyana) Từ lá Kháo (Phoebe tavoyana), bằng các phương pháp chiết và sắc ký... sắc vỏ được dùng để trừ phong thấp [5] 1.2 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có Kháo 1.2.1 Giới thiệu chung [1,4,10,13,19] Flavonoit là một những hợp chất phân bố rộng rãi nhất