BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.) Ở TỈNH ĐỒNG THÁP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN TRỊNH THỊ LỆ HOA MSSV: 3113715 LỚP: VSVH K37 Cần Thơ, Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.) Ở TỈNH ĐỒNG THÁP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN TRỊNH THỊ LỆ HOA MSSV: 3113715 LỚP: VSVH K37 Cần Thơ, Tháng 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký tên) (Ký tên) PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Trịnh Thị Lệ Hoa DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong thời gian thực luận văn tốt nghiệp trường Đại học Cần Thơ, nhận nhiều hướng dẫn dạy tận tình quý Thầy, Cô, giúp đỡ nhiệt tình bạn quan tâm động viên từ gia đình Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực thí nghiệm hoàn thành luận văn Cán quản lý phòng thí nghiệm vi sinh vật giúp đỡ, động viên chia sẻ khó khăn giúp hoàn thành tốt luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ ủng hộ phương diện, sức mạnh tinh thần giúp vươn lên sống Xin kính chúc quý Thầy, Cô bạn sinh viên dồi sức khỏe thành công Cần Thơ, ngày 30 tháng 11 năm 2014 Trịnh Thị Lệ Hoa Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT TÓM TẮT Diếp cá (Houttuynia corata T.) có tính kháng khuẩn tốt ứng dụng y học, nghiên cứu trước sử dụng dịch trích mà chưa quan tâm nhiều đến vi khuẩn nội sinh Diếp cá Vì vậy, việc phân lập dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá thực Mười bảy dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ, thân Diếp cá thu huyện Châu Thành huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp Hầu hết vi khuẩn có dạng hình que, số khác có dạng cầu đôi Trong có 14 dòng thuộc vi khuẩn Gram âm dòng thuộc vi khuẩn Gram dương, phần lớn chúng có khả chuyển động Kết khảo sát khả cố định đạm tổng hợp IAA cho thấy, tất dòng vi khuẩn có khả tổng hợp đạm IAA Trong đó, dòng DR3 tổng hợp đạm cao ngày thứ dòng DR2 tổng hợp IAA cao ngày thứ Chỉ có dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân khó tan Khảo sát khả kháng khuẩn 17 dòng vi khuẩn phân lập được, kết cho thấy dòng có khả kháng Aeromonas hydrophila, dòng có khả kháng Escherichia coli dòng có khả kháng loài vi khuẩn gây bệnh Kết giải trình tự gene 16S-rRNA, dòng DR2, DR3 DL4 nhận diện Bacillus aryabhattai dòng B8W22 với tỉ lệ đồng hình 95%, 97% 96% Từ khóa: Ammonium, Diếp cá, hòa tan lân, IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH xi CÁC TỪ VIẾT TẮT xii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên tỉnh Đồng Tháp 2.1.1 Vị trí địa lý 2.1.2 Địa hình 2.1.3 Khí hậu 2.1.4 Thủy văn 2.2 Sơ lược Diếp cá 2.2.1 Tên gọi phân loại 2.2.2 Đặc điểm 2.2.3 Phân bố 2.2.4 Thành phần hóa học 2.2.5 Tác dụng Diếp cá y học 2.2.5.1 Tác dụng kháng khuẩn 2.2.5.2 Tác dụng kháng viêm 2.2.5.3 Tác dụng hệ hô hấp 2.2.5.4 Tác dụng hệ miễn nhiễm Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 2.2.5.5 Tác dụng lợi tiểu 2.2.5.6 Tác dụng chống oxy hóa 2.2.5.7 Tác dụng chống ung thư 2.3 Vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Định nghĩa vi khuẩn nội sinh 2.3.2 Sơ lược vi khuẩn nội sinh 2.3.3 Sự xâm nhập nội sinh mô thực vật vi khuẩn nội sinh 2.3.3.1 Nguồn gốc 2.3.3.2 Di chuyển 2.3.3.3 Tiếp cận 2.3.3.4 Xâm nhập hay xuyên thấu 2.3.3.5 Sinh sản 10 2.3.3.6 Xâm nhập 10 2.3.3.7 Định cư 10 2.3.4 Một số đặc tính vi khuẩn nội sinh 10 2.3.4.1 Khả cố định đạm 10 2.3.4.2 Khả hòa tan lân khó tan 11 2.3.4.3 Khả tổng hợp IAA 12 2.3.4.4 Khả đối kháng sinh học 12 2.4 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp 13 2.4.1 Vi khuẩn Bacillus 13 2.4.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 13 2.4.1.2 Vi khuẩn Bacillus cereus 14 2.4.2 Vi khuẩn Klebsiella 14 2.4.3 Vi khuẩn Pseudomonas 14 2.4.4 Vi khuẩn Azotobacter 15 2.4.5 Vi khuẩn Azospirillum 15 2.5 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp 16 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 2.5.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 16 2.5.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila) 16 2.6 Tình hình nghiên cứu Diếp cá nước 17 2.6.1 Trong nước 17 2.6.2 Ngoài nước 17 2.7 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 18 2.7.1 Nguyên lý chung kỹ thuật PCR 18 2.7.2 Mồi (primer) sử dụng kỹ thuật PCR 19 2.8 Điện di gel agarose 20 2.8.1 Nguyên tắc kỹ thuật điện di 20 2.8.2 Điện di gel agarose 20 2.9 Phương pháp giải trình tự DNA 20 2.9.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy 20 2.9.2 Giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 21 2.9.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA giải mã 21 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Phương tiện nghiên cứu 23 3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực 23 3.1.2 Vật liệu 23 3.1.3 Dụng cụ - Thiết bị 23 3.1.4 Hóa chất 24 3.1.4.1 Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn 24 3.1.4.2 Hóa chất trích DNA 24 3.1.4.3 Hóa chất thực phản ứng PCR 24 3.1.4.4 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh 25 3.1.4.5 Môi trường khảo sát khả tổng hợp NH4+ 26 3.1.4.6 Môi trường khảo sát khả hòa tan lân 27 3.2 Phương pháp nghiên cứu 27 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 3.2.1 Thu thập xử lý mẫu 27 3.2.2 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân Diếp cá 28 3.2.3 Quan sát hình dạng, khả chuyển động kích thước vi khuẩn 28 3.2.4 Nhuộm Gram vi khuẩn 30 3.2.5 Khảo sát khả tổng hợp NH4+ 31 3.2.5.1 Nguyên tắc 31 3.2.5.2 Hóa chất 31 3.2.5.3 Tiến hành thí nghiệm 31 3.2.5.4 Định lượng đạm vi khuẩn sinh ngày 2, 4, (sau chủng) 31 3.2.6 Khảo sát khả hòa tan lân khó tan 33 3.2.7 Khảo sát khả tổng hợp IAA 33 3.2.7.1 Chuẩn bị 33 3.2.7.2 Hóa chất 33 3.2.7.3 Phương pháp 34 3.2.8 Thử nghiệm khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn 35 3.2.9 Nhận diện số dòng vi khuẩn nội sinh 35 3.2.10 Xử lý số liệu 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 38 4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc 39 4.1.2 Đặc điềm tế bào vi khuẩn 42 4.2 Kết khảo sát khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập dựa lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp 43 4.2.1 So sánh khả tạo ammonium dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Diếp cá (Nhóm 1) 44 4.2.2 So sánh khả tạo ammonium dòng vi khuẩn phân lập từ thân Diếp cá (Nhóm 2) 46 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 4.2.3 So sánh khả tạo ammonium dòng vi khuẩn phân lập từ Diếp cá (Nhóm 3) 48 4.2.4 So sánh khả tạo ammonium dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh Diếp cá 50 4.3 Kết khảo sát khả hòa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập từ Diếp cá 52 4.4 Kết khảo sát khả tổng hợp IAA (indol-3-acetic acid) dòng vi khuẩn phân lập từ Diếp cá 53 4.4.1 So sánh khả tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Diếp cá (Nhóm 1) 54 4.4.2 So sánh khả tổng hợp IAA dòng vi khau6n3 phân lập từ thân Diếp cá (Nhóm 2) 56 4.4.3 So sánh khả tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập từ Diếp cá (Nhóm 3) 57 4.4.4 So sánh khả tổng hợp IAA dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh Diếp cá 58 4.5 Kết khảo sát khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập từ Diếp cá 60 4.5.1 Khả kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli 60 4.5.2 Khả kháng khuẩn với vi khuẩn Aeromonas hydrophila 62 4.6 Kết nhận diện số dòng vi khuẩn kỹ thuật PCR 65 CHƯƠNG KẾ LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69 5.1 Kết luận 69 5.2 Đề nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 78 Phụ lục 1: Hình biểu đồ đường chuẩn NH4+ IAA Đường chuẩn đo đạm Đường chuẩn đo IAA Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Level R1 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR7 DR8 N 3 3 3 3 Mean StDev 2,4444 0,2546 4,9444 0,2546 2,3889 0,0962 1,3889 0,2546 1,3333 0,1667 1,1667 0,1667 1,2222 0,2546 4,2778 0,2546 Trường ĐHCT Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -(-* ) (-*-) (-*-) ( *-) (-*-) ( *-) (-*-) ( *-) -+ -+ -+ -+ -1,2 2,4 3,6 4,8 Pooled StDev = 0,2205 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DR2 DR8 DR1 DR3 DR4 DR5 DR7 DR6 N Mean Grouping 4,9444 A 4,2778 B 2,4444 C 2,3889 C 1,3889 D 1,3333 D 1,2222 D 1,1667 D 3 3 3 3 Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,09001 Level DR1 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 N 3 3 3 DF 16 23 SS 66,80195 0,12963 66,93158 R-Sq = 99,81% Mean 3,4630 6,9259 2,9074 3,1852 2,1667 2,1852 Chuyên ngành Vi sinh vật học StDev 0,0849 0,1398 0,0321 0,0849 0,0556 0,0321 MS 9,54314 0,00810 F 1177,90 P 0,000 R-Sq(adj) = 99,72% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ (*) (*) *) *) *) (* Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 DR7 DR8 3 3,7778 6,2407 0,1111 0,1156 Trường ĐHCT (*) (* + -+ -+ -+ 3,0 4,5 6,0 7,5 Pooled StDev = 0,0900 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DR2 DR8 DR7 DR1 DR4 DR3 DR6 DR5 N 3 3 3 3 Mean Grouping 6,9259 A 6,2407 B 3,7778 C 3,4630 D 3,1852 E 2,9074 F 2,1852 G 2,1667 G Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,08226 Level DR1 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR7 DR8 N 3 3 3 3 DF 16 23 SS 56,96690 0,10827 57,07518 R-Sq = 99,81% Mean 1,3684 4,3825 1,0000 1,1404 1,7895 1,8421 1,5088 5,4070 StDev 0,0526 0,1184 0,0526 0,0804 0,0526 0,0526 0,0804 0,1269 MS 8,13813 0,00677 F 1202,61 P 0,000 R-Sq(adj) = 99,73% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -*) (* (*) (* (*) *) (* (*) -+ -+ -+ -+ -1,2 2,4 3,6 4,8 Pooled StDev = 0,0823 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DR8 DR2 DR6 DR5 DR7 DR1 DR4 DR3 N Mean Grouping 5,4070 A 4,3825 B 1,8421 C 1,7895 C 1,5088 D 1,3684 D 1,1404 E 1,0000 E 3 3 3 3 Means that not share a letter are significantly different c Kết thống kê lượng IAA dòng vi khuẩn thân Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,2357 Level DT1 DT2 DT3 DT4 DF 11 SS 5,8611 0,4444 6,3056 MS 1,9537 0,0556 R-Sq = 92,95% N Mean 2,8333 2,5556 4,3889 3,2222 3 3 StDev 0,1667 0,2546 0,3469 0,0962 F 35,17 P 0,000 R-Sq(adj) = 90,31% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( -* ) ( * -) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -+2,80 3,50 4,20 4,90 Pooled StDev = 0,2357 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DT3 DT4 DT1 DT2 N 3 3 Mean Grouping 4,3889 A 3,2222 B 2,8333 B C 2,5556 C Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1200 Level DT1 DT2 DT3 DT4 DF 11 SS 13,3999 0,1152 13,5152 MS 4,4666 0,0144 R-Sq = 99,15% N Mean 3,1111 4,3148 5,8148 5,4444 3 3 StDev 0,0556 0,0849 0,2103 0,0556 F 310,11 P 0,000 R-Sq(adj) = 98,83% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) -+ -+ -+ -+ -3,20 4,00 4,80 5,60 Pooled StDev = 0,1200 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DT3 DT4 DT2 DT1 N 3 3 Mean Grouping 5,8148 A 5,4444 B 4,3148 C 3,1111 D Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,09488 Level DT1 DT2 DT3 DT4 N 3 3 DF 11 SS 9,94160 0,07202 10,01362 R-Sq = 99,28% Mean 2,2105 2,8772 4,1404 4,4386 Chuyên ngành Vi sinh vật học StDev 0,1053 0,0804 0,0804 0,1096 MS 3,31387 0,00900 F 368,09 P 0,000 R-Sq(adj) = 99,01% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ (-*) (-*-) (-*-) (*-) Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT + -+ -+ -+ 2,10 2,80 3,50 4,20 Pooled StDev = 0,0949 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DT4 DT3 DT2 DT1 N Mean Grouping 4,4386 A 4,1404 B 2,8772 C 2,2105 D 3 3 Means that not share a letter are significantly different d Kết thống kê lượng IAA dòng vi khuẩn Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,2755 Level DL1 DL2 DL3 DL4 DL5 N 3 3 DF 10 14 SS 16,6222 0,7593 17,3815 R-Sq = 95,63% Mean 2,8333 1,3889 2,6667 1,1667 4,0556 StDev 0,1667 0,2546 0,5000 0,1667 0,0962 MS 4,1556 0,0759 F 54,73 P 0,000 R-Sq(adj) = 93,88% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * -) ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* ) + -+ -+ -+ 1,0 2,0 3,0 4,0 Pooled StDev = 0,2755 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping DL5 4,0556 A DL1 2,8333 B DL3 2,6667 B DL2 1,3889 C DL4 1,1667 C Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,2451 Level DL1 DL2 DL3 DL4 DL5 DF 10 14 SS 18,6967 0,6008 19,2975 MS 4,6742 0,0601 R-Sq = 96,89% N Mean 4,7593 3,0000 3,2963 2,9630 5,7593 3 3 StDev 0,0849 0,0556 0,4659 0,1398 0,2313 F 77,80 P 0,000 R-Sq(adj) = 95,64% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( * ) ( * ) ( -* ) ( -* ) + -+ -+ -+ 3,0 4,0 5,0 6,0 Pooled StDev = 0,2451 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DL5 DL1 DL3 DL2 DL4 N Mean Grouping 5,7593 A 4,7593 B 3,2963 C 3,0000 C 2,9630 C 3 3 Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1313 Level DL1 N DF 10 14 SS 9,0296 0,1724 9,2020 R-Sq = 98,13% Mean 3,5193 Chuyên ngành Vi sinh vật học MS 2,2574 0,0172 F 130,93 P 0,000 R-Sq(adj) = 97,38% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev StDev -+ -+ -+ -+-0,0634 ( *-) Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 DL2 DL3 DL4 DL5 3 3 2,3333 2,2982 1,5263 3,5263 0,0804 0,2487 0,0526 0,1053 Trường ĐHCT ( * ) ( * ) (-* ) ( * ) -+ -+ -+ -+-1,80 2,40 3,00 3,60 Pooled StDev = 0,1313 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DL5 DL1 DL2 DL3 DL4 N Mean Grouping 3,5263 A 3,5193 A 2,3333 B 2,2982 B 1,5263 C 3 3 Means that not share a letter are significantly different e Kết thống kê lượng IAA dòng vi khuẩn triển vọng Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,2222 Level L1 L5 R2 R8 T3 T4 N 3 3 3 DF 12 17 SS 9,2299 0,5926 9,8225 MS 1,8460 0,0494 R-Sq = 93,97% Mean 2,8333 4,0556 4,9444 4,2778 4,3889 3,2222 StDev 0,1667 0,0962 0,2546 0,2546 0,3469 0,0962 F 37,38 P 0,000 R-Sq(adj) = 91,45% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ -+ 2,80 3,50 4,20 4,90 Pooled StDev = 0,2222 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R2 T3 R8 L5 N 3 3 Mean 4,9444 4,3889 4,2778 4,0556 Chuyên ngành Vi sinh vật học Grouping A B B B Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 T4 L1 3 3,2222 2,8333 Trường ĐHCT C C Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1533 Level L1 L5 R2 R8 T3 T4 DF 12 17 SS 8,0098 0,2819 8,2917 MS 1,6020 0,0235 N 3 3 3 R-Sq = 96,60% Mean 4,7593 5,7593 6,9259 6,2407 5,8148 5,4444 StDev 0,0849 0,2313 0,1398 0,1156 0,2103 0,0556 F 68,19 P 0,000 R-Sq(adj) = 95,18% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * ) (-* ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+ -4,90 5,60 6,30 7,00 Pooled StDev = 0,1533 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R2 R8 T3 L5 T4 L1 N 3 3 3 Mean 6,9259 6,2407 5,8148 5,7593 5,4444 4,7593 Grouping A B C C D E Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: IAA ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1030 Level L1 L5 R2 R8 N 3 3 DF 12 17 SS 7,3807 0,1274 7,5081 MS 1,4761 0,0106 R-Sq = 98,30% Mean 3,5193 3,5263 4,3825 5,4070 StDev 0,0634 0,1053 0,1184 0,1269 Chuyên ngành Vi sinh vật học F 139,03 P 0,000 R-Sq(adj) = 97,60% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( *-) (-*-) (-*-) (-*-) Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 T3 T4 3 4,1404 4,4386 0,0804 0,1096 Trường ĐHCT (-*-) (-*-) + -+ -+ -+ 3,60 4,20 4,80 5,40 Pooled StDev = 0,1030 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R8 T4 R2 T3 L5 L1 N 3 3 3 Mean 5,4070 4,4386 4,3825 4,1404 3,5263 3,5193 Grouping A B B C D D Means that not share a letter are significantly different Kết khảo sát khả kháng khuẩn a Kết khảo sát khả kháng E coli Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS Dòng vi khuẩn 10,9744 Error 0,5350 Total 17 11,5094 S = 0,2438 R-Sq = 95,35% Level DL1 DL2 DL3 DL4 DR1 DR2 DR3 DT1 DT2 N 2 2 2 2 Mean 4,3500 2,3500 3,8500 3,0000 2,9000 2,1000 2,1000 3,4000 2,1000 StDev 0,2121 0,2121 0,2121 0,0000 0,1414 0,1414 0,1414 0,1414 0,5657 MS 1,3718 0,0594 F 23,08 P 0,000 R-Sq(adj) = 91,22% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( -* ) ( -* ) ( * ) ( -* ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * -) ( * ) -+ -+ -+ -+ 2,40 3,20 4,00 4,80 Pooled StDev = 0,2438 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DL1 DL3 DT1 DL4 DR1 DL2 DR2 DT2 DR3 N Mean Grouping 4,3500 A 3,8500 A B 3,4000 B C 3,0000 C 2,9000 C D 2,3500 D E 2,1000 E 2,1000 E 2,1000 E 2 2 2 2 Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1291 Level DL1 DL2 DL3 DL4 DR1 DR2 DR3 DT1 DT2 DF 17 SS 7,5744 0,1500 7,7244 MS 0,9468 0,0167 R-Sq = 98,06% N Mean 3,6000 1,6000 2,9000 2,0000 2,5500 1,6500 1,9000 2,5000 1,6000 2 2 2 2 StDev 0,1414 0,1414 0,1414 0,0000 0,0707 0,2121 0,1414 0,0000 0,1414 F 56,81 P 0,000 R-Sq(adj) = 96,33% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) + -+ -+ -+ 1,40 2,10 2,80 3,50 Pooled StDev = 0,1291 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DL1 DL3 DR1 N 2 Mean Grouping 3,6000 A 2,9000 B 2,5500 C Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 DT1 DL4 DR3 DR2 DT2 DL2 2 2 2 2,5000 2,0000 1,9000 1,6500 1,6000 1,6000 Trường ĐHCT C D D E E F F F Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1650 Level DL1 DL2 DL3 DL4 DR1 DR2 DR3 DT1 DT2 N 2 2 2 2 DF 17 SS 6,4400 0,2450 6,6850 R-Sq = 96,34% Mean 2,9000 0,9000 2,1000 1,4000 1,9000 1,2500 1,0000 2,0000 1,4000 StDev 0,1414 0,1414 0,1414 0,1414 0,1414 0,3536 0,0000 0,0000 0,1414 MS 0,8050 0,0272 F 29,57 P 0,000 R-Sq(adj) = 93,08% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( * -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( * -) ( -* ) ( -* -) -+ -+ -+ -+ -0,70 1,40 2,10 2,80 Pooled StDev = 0,1650 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping DL1 2,9000 A DL3 2,1000 B DT1 2,0000 B DR1 1,9000 B DT2 1,4000 C DL4 1,4000 C DR2 1,2500 C D DR3 1,0000 D DL2 0,9000 D Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT b Kết khảo sát khả kháng A hydrophila Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1890 Level DL2 DL3 DL4 DR2 DR3 DT1 DT2 DF 13 SS 2,6786 0,2500 2,9286 MS 0,4464 0,0357 R-Sq = 91,46% N Mean 2,0000 1,2500 2,0000 1,0000 1,0000 1,7500 2,0000 2 2 2 StDev 0,0000 0,3536 0,0000 0,0000 0,0000 0,3536 0,0000 F 12,50 P 0,002 R-Sq(adj) = 84,15% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ -+ 1,00 1,50 2,00 2,50 Pooled StDev = 0,1890 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DT2 DL4 DL2 DT1 DL3 DR3 DR2 N 2 2 2 Mean Grouping 2,0000 A 2,0000 A 2,0000 A 1,7500 A 1,2500 B 1,0000 B 1,0000 B Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1 DF 13 SS 5,1271 0,0700 5,1971 R-Sq = 98,65% Chuyên ngành Vi sinh vật học MS 0,8545 0,0100 F 85,45 P 0,000 R-Sq(adj) = 97,50% Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Level DL2 DL3 DL4 DR2 DR3 DT1 DT2 N Mean 3,9000 1,9500 3,0000 2,1500 2,5000 3,0000 2,5000 2 2 2 StDev 0,1414 0,0707 0,0000 0,2121 0,0000 0,0000 0,0000 Trường ĐHCT Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( *-) ( * ) ( * ) ( *-) ( * ) ( *-) + -+ -+ -+ 1,80 2,40 3,00 3,60 Pooled StDev = 0,1000 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DL2 DT1 DL4 DT2 DR3 DR2 DL3 N Mean Grouping 3,9000 A 3,0000 B 3,0000 B 2,5000 C 2,5000 C 2,1500 D 1,9500 D 2 2 2 Means that not share a letter are significantly different Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0,1389 Level DL2 DL3 DL4 DR2 DR3 DT1 DT2 N 2 2 2 DF 13 SS 21,1286 0,1350 21,2636 R-Sq = 99,37% Mean 4,9000 2,0000 6,0000 3,1000 4,4500 3,3500 3,3500 Chuyên ngành Vi sinh vật học StDev 0,1414 0,0000 0,0000 0,1414 0,0707 0,2121 0,2121 MS 3,5214 0,0193 F 182,59 P 0,000 R-Sq(adj) = 98,82% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) -+ -+ -+ -+ -2,4 3,6 4,8 6,0 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Pooled StDev = 0,1389 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn DL4 DL2 DR3 DT2 DT1 DR2 DL3 N 2 2 2 Mean Grouping 6,0000 A 4,9000 B 4,4500 C 3,3500 D 3,3500 D 3,1000 D 2,0000 E Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Chuyên ngành Vi sinh vật học Trường ĐHCT Viện NC & PT Công nghệ sinh học [...]... hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay Vì vậy, nhằm mục đích phát hiện các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá nên đề tài: Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá (Houttuynia corata T.) ở tỉnh Đồng Tháp được thực hiện Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Vi n NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp... tạo ra của các dòng vi khuẩn phân lập được 2 Kết quả khảo sát hàm lượng IAA được tạo ra của các dòng vi khuẩn phân lập được 3 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được 4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được a Khả năng kháng E coli của các dòng vi khuẩn phân lập được b Khả năng kháng A hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập được Phụ... của vi khuẩn nội sinh 36 Bảng 8: Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc 39 Bảng 9: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá 40 Bảng 10: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA đặc 42 Bảng 11: Lượng ammonium do 17 dòng vi khuẩn nội. .. của các dòng vi khuẩn phân lập được a Kết quả thống kê lượng ammonium của 17 dòng vi khuẩn phân lập được b Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn ở rễ c Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn ở thân d Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn ở lá 2 Kết quả thống kê lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được a Kết quả thống kê lượng IAA của 17 dòng vi khuẩn. .. tài Phân lập được các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp cá ở tỉnh Đồng Tháp có những đặc tính tốt như: tính kháng khuẩn, khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Đồng Tháp 2.1.1 Vị trí địa lý Đồng Tháp là tỉnh. .. Trường ĐHCT 2.3 Vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Định nghĩa vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian chu kì sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi et al., 2000; Bandara et al., 2006) 2.3.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang... và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh 2.3.3.1 Nguồn gốc Qua những kết quả thu được từ thân, lá, hạt, rễ (Mano và Morisaki, 2008) cho rằng nguồn của vi khuẩn nội sinh là đất vùng rễ Kết hợp nhiều kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất Vai trò của hạt như là một nguồn của vi khuẩn nội. .. dòng vi khuẩn DR1 tạo ra trên môi trường NBRIP .52 Hình 11: Hàm lượng IAA của các dòng vi kkhuẩn phân lập được từ thân của cây Diếp cá 56 Hình 12: Hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng phân lập được từ cây Diếp cá 59 Hình 13: Khả năng kháng khuẩn của dòng DL1 và DL3 với vi khuẩn E coli sau 1 ngày ủ 61 Hình 14: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi. .. – 3 ngày chủng vi khuẩn vào môi trường NFb bán đặc .38 Hình 6: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường PDA đặc 41 Hình 7: Vi khuẩn có Gram âm (A) và Gram dương (B) 43 Hình 8: Hàm lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân cây Diếp cá 46 Hình 9: Hàm lượng ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng phân lập được từ cây Diếp cá ... nhập vào cây chủ , các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002) Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều