i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  LÊ NGỌC HÊN TÁCH CHIẾT ENZYME BROMELAIN TỪ PHẾ LIỆU VỎ DỨA (ANANAS COMOSUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Bảo NHA TRANG, 8/2015 ii LỜI CẢM ƠN Qua thời gian nghiên cứu thực tập phòng thực nghiệm Trường Đại Học Nha Trang, em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Để hoàn thành đồ án này, nổ lực thân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giúp đỡ tận tình quý Thầy Cô bạn bè Trước hết xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chế biến, thầy cô Khoa tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành chương trình học tập thực tốt công tác tốt nghiệp Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy giáo hướng dẫn: TS Nguyễn Bảo định hướng, tận tình bảo em suốt trình thực đề tài em xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Công Minh, tất Cô phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, phòng Chế biến thủy sản, phòng Công nghệ cao, Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài Cuối em xin bày tỏ biết ơn đến Cha Mẹ tạo điều kiện, động viên lo lắng bạn bè giúp đỡ em thời gian học tập trình thực đồ án Nha Trang, tháng năm2015 Sinh viên thực Lê Ngọc Hên iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dứa 1.2 Tổng quan enzyme bromelain 1.2.1 Khái niệm enzyme 1.2.2 Đặc điểm, nguồn gốc ứng dụng enzyme bromelain 1.2.3 Tính chất enzyme broemelain 1.3 Các phương pháp tách chiết tinh enzyme 18 1.3.1 Tách chiết enzyme phương pháp kết tủa 19 1.3.2 Phương pháp hấp phụ chọn lọc 19 1.3.3 Phương pháp trao đổi ion 20 1.3.4 Phương pháp tách hệ pha nước [5] 20 1.3.5 Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration) 20 1.4 Phương pháp xác định khả xúc tác enzyme 22 1.4.1 Phương pháp định lượng protein Microbiuret 23 1.4.2 Xác định protein phương pháp A280 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Phương tiện nghiên cứu 25 2.2 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 25 iv 2.2.1 Đối tượng chiết rút enzyme bromelain 25 2.2.2 Xác định hàm lượng protein enzyme bromelain Phương pháp microbiuret: 33 2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp A280 35 2.3 Bố trí thí nghiệm 38 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát chế độ ly tâm cho trình lọc 11 µm 38 2.3.2 Thí nghiệm 2: Cut-off công đoạn khác để khảo sát ảnh hưởng hoạt tính enzyme bromelain 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết khảo sát thông số ly tâm sau công đoạn lọc thô 43 3.2 Hiệu suất thu hồi định mức sản phẩm 45 3.4 Hàm lượng protein phương pháp microbiuret 46 3.5 Hoạt tính riêng enzyme bromelain công đoạn phương pháp A280 48 3.6 Kết nghiên cứu cut-off công đoạn ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain 49 3.7 Đề xuất quy trình sản xuất hoàn thiện 49 Quy trình 49 Thuyết quy trình 50 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 55 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BSA: Bovine serum albumin TCA: Tricloroacetic Acid BAA: Benzyol – L –Arginine Amidez BAEE: Benzyol – L –Arginine Ethyl Esther BAEM: Benzyol – L –Arginine Methyl Esther vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa tỉnh thành nước (2013) Bảng 1.2 Thành phần amino acid nhóm khác bromelain 11 Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải bromelain 14 Bảng 1.4 Hằng số Michaelis (pH 6,5, 50 ºC) với chất khác 14 Bảng 2.1 Mối quan hệ áp suất độ thăng hoa nước đá 32 Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA phương pháp microbiuret 34 Bảng 2.3 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA phương pháp A280 36 Bảng 2.4 Đánh giá cảm quan dịch dứa sau ly tâm 40 Bảng 2.5 Miêu tả cảm quan dịch dứa sau ly tâm 40 Bảng 3.1 Kết đánh giá cảm quan thông số ly tâm sơ 43 Bảng 3.2 Kết đánh giá cảm quan cho thời gian công đoạn ly tâm thông số 3000 vòng 44 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quả dứa Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon enzyme bromelain 10 Hình 1.3 Cấu trúc bậc bromelain 11 Hình 1.4 Trình tự xếp amino acid dứa 12 Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid bromelain thân 13 Hình 1.6 Tổng quan trình lọc 21 Hình 2.1 Vỏ dứa 25 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme bromelain 26 Hình 2.3 Máy đông khô 29 Hình 2.4 Giản đồ pha nước 29 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí khảo sát chế độ ly tâm cho trình lọc 11 µm 39 Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme bromelain công đoạn 41 Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi hỗn hợp enzyme bromelain qua công đoạn qui trình chiết rút 45 Hình 3.2 Khối lượng riêng dịch chiết công đoạn trình chiết rút hỗn hợp enzyme bromelain 46 Hình 3.3 Đồ thị hàm lượng protein (%) 47 Hình 4.4 Đồ thị hoạt tính riêng protein enzyme 48 Hình 3.5 Quy trình tách chiết enzyme bromelain từ vỏ dứa 49 LỜI MỞ ĐẦU Hầu phản ứng hóa học thể sống cần phải có vai trò xúc tác enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm công dụng khác enzyme Những nghiên cứu công nghệ enzyme tiến hành nhiều tác sử dụng phủ tạng lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có thử nghiệm công nghệ sản xuất amino acid từ nhộng tằm protease, bột protein thịt enzyme bromelain từ vỏ dứa Nghiên cứu enzyme có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, số bệnh, đặc biệt bệnh mang tính di truyền, thiếu hay hẳn số enzyme mô, điều kiện không bình thường xuất hoạt tính dư thừa số enzyme đặc hiệu Do xác định hoạt tính số enzyme huyết tương, hồng cầu mô cần thiết việc chẩn đoán bệnh trở thành công cụ thực tế thiếu y học công nghệ hóa học, chế biến thực phẩm Hiện giới enzyme sản xuất từ nguồn động vật đối mặt với nhiều vấn đề đạo đức, tôn giáo, truyền thống văn hóa, phong tục truyền thống quốc gia ngày cạn kiệt nguồn nguyên liệu nên việc thực nguồn thực vật dần trọng Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn nguồn nghiên liệu phong phú, dồi (dứa, đu đủ…) Trong trình chế biến dứa đóng hộp sử dụng phần dứa, phần lại phụ phẩm Nếu tận dụng nguồn phế phẩm vừa giảm thiểu chất hữu gây ô nhiễm môi trường vừa sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ dứa Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase, esterase phân hủy chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao Từ lợi ích enzyme bromelain mang lại, chấp nhận Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nha Trang hướng dẫn Thầy Nguyễn Bảo, em xin tiến hành thực Đồ án tốt nghiệp “Tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) phương pháp lọc” Nội dung nghiên cứu - Đề xuất qui trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa - Khảo sát thông số kỹ thuật công đoạn - Đánh giá hiệu suất thu hồi bã qua công đoạn - Đánh giá hàm lượng protein qua công đoạn - Đánh giá hoạt tính enzyme bromelain qua công đoạn Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu quy trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) phương pháp lọc, phương pháp tinh cho sản phẩm enzyme có chất lượng tốt Từ áp dụng sản xuất rộng rãi thực tế Ý nghĩa khoa học: Góp phần cung cấp thông tin nghiên cứu tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu dứa enzyme khác (papain từ nhựa đu đủ, ficin từ nhựa sung) phương pháp lọc Cung cấp thêm nguồn enzyme từ thực vật cho thị trường giới Ý nghĩa thực tiễn: - Năng cao thu nhập cho người nông dân trồng dứa - Giảm ô nghiễm môi trường, giảm chi phí xử lý rác thải mang lại nguồn lợi nhuận từ phế liệu dứa cho nhà máy chế biến đồ hợp dứa CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dứa Hình 1.1 Quả dứa Nguồn gốc – phân bố Dứa gọi khóm (miền Nam) Loài dứa loại ăn nhiệt đới tiếng Hoa tập hợp quanh trục lớn thành ngắn, hoa mọc kẽ màu tím, bầu dưới, mọng Quả dứa phức, phần ăn gồm trục hoa bắc mọng nước, thật nằm mắt dứa Dứa chứa nhiều vitamin vi chất có lợi cho thể, giúp giảm stress Ngoài dứa dùng để ăn, gần dứa trở thành nguyên liệu chiết bromelain dùng nhiều ngành công nghiệp làm thuốc chữa bệnh Loại chữa số bệnh khó tiêu, viêm ruột, sốt nóng, cảm nắng Thuộc họ Dứa (Bromeliaceae), biết đến nhiều loài Ananas comosus, loại dứa cho ăn Chi có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ đưa tới đảo khu vực Caribe nhờ thổ dân Anh điêng Carib Năm 1493, Christopher Columbus lần nhìn thấy loại chi Guadeloupe Nó đưa sang châu Âu từ người Anh Tây Ban Nha phát tán tới đảo Thái Bình Dương Các cánh đồng trồng dứa thương phẩm thành lập Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida Cuba Dứa trở thành loại ăn trái phổ biến giới Từ Ananas có nguồn gốc từ tiếng Guarani để dứa Tại Việt Nam, dứa trồng phổ biến, phân bố từ Phú Thọ đến Kiên Giang Tiền Giang tỉnh có sản lượng dứa đứng đầu nước Năm 2013, sản lượng 42 Cách tiến hành khảo sát hoạt độ enzyem bromelain: Sau thu dịch công đoạn sơ đồ trên, mang đông khô Sản phẩm sau đông khô sát định hàm lượng protein theo phương pháp microbiuret hoạt tính phương pháp A280 Để so sánh kết phân tích công đoạn 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát thông số ly tâm sau công đoạn lọc thô Mục đích công đoạn ly tâm sau lọc thô tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn lọc 11 µm Thực tế trình thí nghiệm không thực ly tâm gây tắc màng lọc nhanh chóng Chính tiến hành nghiên cứu công đoạn để tìm thông số ly tâm hợp lí kết thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết đánh giá cảm quan thông số ly tâm sơ Mẫu Chỉ tiêu Màu sắc Trạng thái Điểm Ly tâm 2000 Vàng sậm vòng/10 phút Cặn lơ lững nhiều, bã Ly tâm 3000 Vàng vòng/10 phút Cặn lơ lững vừa phải, lớp huyền phù phần bã dịch vừa phải Ly tâm 4000 Vàng nhạt vòng/10 phút Cặn lơ lững ít, có bã Ly tâm 5000 Không màu vòng/10 phút Dịch trong, bã nhiều, lớp huyền phù phần bã dịch Nhận xét: Từ điểm đánh giá cảm quan ta chọn thông số ly tâm tốt (số điểm cao nhất) 3000 vòng/10 phút lớp huyền phù phần bã dịch vừa phải Chúng chọn tiêu chí phải hài hòa đồng thời tiêu chí loại bỏ phần lớn bã không hòa tan (có kích thước nhỏ) dịch chiết dứa đồng thời không để thất thoát nhiều hàm lượng enzyme bromelain hòa tan dịch dứa Khối lượng phân tử họ enzyme bromelain từ vỏ dứa nằm khoảng 20-30 kDa lớn[8] nên việc tác động lực ly tâm lớn hiệu suất thu hồi enzyme thấp Ngoài số vòng hợp lý cần phải có thời gian ly tâm hợp lý Chúng cố định số vòng ly tâm 3000 khảo sát thời gian ly tâm phút, 10 phút 15 phút Kết cảm quan thể bảng 3.2 sau: 44 Bảng 3.2 Kết đánh giá cảm quan cho thời gian công đoạn ly tâm thông số 3000 vòng Chỉ tiêu Mẫu Điểm Màu sắc Trạng thái Ly tâm 3000 vòng/15 phút Vàng nhạt Dịch không đục, lớp huyền phù phần bã dịch vừa phải Ly tâm 3000 vòng/10 phút Vàng Dịch đục ít, lớp huyền phù phần dịch bã nhiều Ly tâm 3000 vòng/5 phút Vàng sậm Dịch đục, lớp huyền phù phần bã dịch Từ số điểm cao thang điểm (3 điểm) bảng đánh giá cảm quan cho thời gian công đoạn ly tâm thông số 3000 vòng ta chọn thông số ly tâm tốt nhất: 3000 vòng, thời gian 15 phút - Chọn thông số ly tâm hợp lí cho công đoạn ly tâm giải vấn đề quy trình công nghệ, không ly tâm làm cho dịch bị tắt công đoạn lọc sau Ly tâm không tốt với số vòng lớn, thời gian dài tốn chi phí nhiên liệu, làm cho chất chứa enzyme có hoạt tính lắng xuống theo bã thất thoát lượng enzyme lớn 45 3.2 Hiệu suất thu hồi định mức sản phẩm Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi hỗn hợp enzyme bromelain qua công đoạn qui trình chiết rút Nhận xét: Hiệu suất thu hồi công đoạn trình chiết hỗn hợp enzyme bromelain giảm qua công đoạn Công đoạn ép: Giảm khoảng 40% so với nguyên liệu ban đầu, phần trăm công đoạn bao gồm bã, chất rắn hoà tan, nước, chất màu đường Công đoạn lọc thô: Dịch chiết giảm khoảng 40% so với công đoạn ép Qua vải lọc ta thu dịch chiết chứa chất có kích thước nhỏ vải lọc loại bỏ phần bã có kích thước lớn Công đoạn lọc thô đến lọc 1,2 µm dịch chiết giảm ít, không thay đổi nhiều, chủ yếu loại lượng bã kích thước nhỏ Công đoạn cutoff 10 kDa mục đích thu nhận làm giàu mẫu enzyme cách loại nước chất hòa tan nước có kích thước nhỏ 10 kDa Kết hiệu suất thu hồi dịch giảm 4,9 lần so với công đoạn lọc 1,2 µm Cần phải ý hiệu suất thu hồi giảm qua công đoạn đồng nghĩa khả loại bỏ tạp chất “phi” enzyme bromelain cao Từ hiệu suất thu hồi (% khối lượng ướt so với nguyên liệu ban đầu) công đoạn quy trình chiết hỗn hợp enzyme bromelain cho thấy phương pháp lọc có hiệu tốt 46 3.3 Khối lượng riêng dịch dứa qua công đoạn Hình 3.2 Khối lượng riêng dịch chiết công đoạn trình chiết rút hỗn hợp enzyme bromelain Nhận xét: Kết khối lượng riêng dịch chiết dứa giảm dần qua công đoạn từ công đoạn “Lọc thô” đến “cut-off 10 kDa” (xem hình 3.2), chứng tỏ phương pháp lọc hiệu Cụ thể công đoạn “Lọc thô”, khối lượng riêng 0,12 g/ml, công đoạn cuối “cut-off 10 kDa” 0,054 g/ml, khối lượng riêng giảm lần, chứng tỏ hàm lượng chất “phi” enzyme bromelain giảm lần suốt trình xử lí 3.4 Hàm lượng protein phương pháp microbiuret 47 Hình 3.3 Đồ thị hàm lượng protein (%) Nhận xét: Kết thực nghiệm cho ta thấy hàm lượng protein qua công đoạn tách chiết tăng dần qua bước tinh Từ công đoạn lọc thô đến công đoạn lọc 11 µm không tăng, từ công đoạn lọc 11 µm đến công đoạn lọc 1,2 µm lại tăng dần tăng cao công đoạn cut off 10 kDa Sự tăng đột biến này, cho thấy công đoạn lọc 1,2 µm hàm lượng protein bắt đầu tăng mạnh đến công đoạn tinh sau Kết công đoạn cut off 10 kDa, khối lượng riêng thấp (xem hình 3.2) hàm lượng protein chất khô cao (xem hình 3.3) Dựa hai kết này, kết luận hàm lượng protein công đoạn cuối cao tinh so với công đoạn khác, phù hợp với mục tiêu đề Giả thuyết đặt ta tiến hành trực tiếp từ công đoạn lọc thô qua công đoạn 1,2 µm mà bỏ qua hai công đoạn ly tâm lọc 11 µm để giảm chi phí sản xuất, công lao động thời gian mà hai công đoạn không làm thay đổi hàm lượng protein Vấn đề lại xảy ra, tiếp tục qua bước lọc 1,2 µm mà không qua công đoạn ly tâm với lọc 11 µm dịch bị tắt, trình lọc màng 1,2 µm không thực Dó đó, bắt buộc phải hết trình công nghệ mà không bỏ qua bước quy trình 48 3.5 Hoạt tính riêng enzyme bromelain công đoạn phương pháp A280 Hình 3.4 Đồ thị hoạt tính riêng protein enzyme Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy enzyme tinh hoạt tính cao, tăng dần từ công đoạn lọc thô đến cuối cao công đoạn Cut off 10 kDa Cụ thể hoạt tính riêng công đoạn cuối 2283 U/g, cao 10 lần so với công đoạn lọc thô (213 U/g) Bên cạnh đó, hoạt tính công đoạn ly tâm (552 U/g) cao lần so với công đoạn lọc thô, kết củng cố thêm cho kết lựa chọn thông số ly tâm phù hợp Với thông số ly tâm phù hợp vừa loại bã khỏi dịch chiết, vừa làm tăng nồng độ protein enzyme dịch chiết bromelain Điều đáng ý hoạt tính riêng enzyme bromelain hai công đoạn lọc 11 µm 1,2 µm khác biệt đáng kể, 1534 U/g 1404 U/g Ngoài ra, hoạt tính công đoạn cuối gấp khoảng 1,5 lần so với hai công đoạn Điều lý thú rút góc độ công nghệ chiết rút chấp nhận chất lượng enzyme bromelain chất lượng nên dừng lại công đoạn lọc 11 µm, cho phép tiết kiệm chi phí sản xuất 49 3.6 Kết nghiên cứu cut-off công đoạn ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain Giả thuyết ban đầu có hay không dừng lại công đoạn tách chiết enzyme bromelain đó, hay thực đến hết quy trình tách chiết Nếu công đoạn hoạt tính nhau, không thay đổi ta nên dừng lại công đoạn lọc thô đến tinh cuối không cần thiết, tốn Còn ngược lại kết hoạt tính thay đổi, tăng dần qua bước tách chiết thực đến hết quy trình Dựa vào kết hoạt tính công đoạn xác định hình 3.4 cho ta thấy enzyme tinh hoạt tính cao Nó đáp ứng yêu cầu khắt khe tiêu chí enzyme để phục vụ nghiên cứu khoa học cho lĩnh vực khác quan trọng Chất lượng enzyme tốt, giá thành cao Thu lợi nhuận lớn từ phế liệu dứa, giảm ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí lớn xử lý rác thải nhà máy thực phẩm dứa qua năm Ngoài sử dụng enzyme bromelain mà không đòi hỏi cao chất lượng, dừng lại công đoạn 11 µm nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất Do đó, quy trình tách chiết đến bước tinh cuối 3.7 Đề xuất quy trình sản xuất hoàn thiện Quy trình Hình 3.5 Quy trình tách chiết enzyme bromelain từ vỏ dứa 50 Thuyết quy trình - Nguyên liệu Vỏ dứa gọt từ dứa thu mua chợ Vĩnh Hải – Nha Trang, Khánh Hòa Được làm sạch, cắt nhỏ ép thu dịch Để tăng hiệu suất dịch ép, vỏ dứa làm đông trước ép, mục đích làm phá vỡ cấu trúc tế bào dứa - Lọc thô Dịch sau ép, lọc qua hai lần lọc kích thước vãi lọc khác nhau, nhiệt độ lạnh Mục đích: Loại bỏ bã, chất tan có kích thước lớn phi protein khỏi dung dịch tạo thuận lợi cho qua trình lọc kích nhỏ - Ly tâm Dịch sau lọc thô mang ly tâm 3000 vòng 15 phút, thu dịch loại bỏ bã chất rắn, thuận lợi cho trình Mục đích: Qua trình thực nghiệm, dùng dịch lọc thô trực tiếp đưa qua giấy lọc 11 µm dịch bị tắt, bã có kích thước lớn làm cản trở dòng chảy Do ly tâm dịch thô cần thiết - Lọc giấy lọc kích thước 11 µm màng 1,2 µm Bước dịch ly tâm lọc hút chân không (giảm thời gian lọc) qua giấy lọc kích thước 11µm Sau lại lọc qua màng 1,2 µm Nhằm tăng độ tinh cho sản phẩm protein thô công đoạn cuối Mục đích: Tăng mức độ tinh dịch, thuận lợi cho trình siêu lọc - Công đoạn siêu lọc Dùng micropipet hút 0,04 ml dịch dứa lọc qua màng 1,2 µm vortex đồng mẫu cho vào ống cut off 10 kdal, sau đặt vào ống ly tâm oppendoft, cân cho khối lượng mẫu nhau, đặt đối trọng ống với xoay vai nắp bên trong, đậy nắp máy ly tâm, chỉnh thông số ly tâm 14000 x g 30 phút vận hành máy Kết thúc trình ly tâm lạnh, công đoạn thu dịch cô đặc ta chút ngược ống cut off cho vào ống oppendof khác chuẩn bị sẵn đặt vào 51 máy lúc ban đầu, ý không đậy nắp chỉnh thông số 1020 x g phút thu mẫu Dịch cô đặc sau rút micropipet 20-200 µl, cho vào tủ đông -40ºC trước dùng khăn giấy lớp buộc chặt miệng ống chứa dịch cô đặc cho vào sấy đông khô Mục đích: Thu bã (enzyme tinh) có kích thước 10 kDa, trình cho chất enzyme với kích thước nhỏ 10 kDa nước qua màng lọc - Đông khô trình loại bỏ nước lại enzyme, thu sản phẩm enzyme thô có hàm lượng ẩm thấp - Sản phẩm Kết thúc trình đông khô ta thu bột khô (bromelain thô) cho vào bao bì PE lọ thủy tinh, bảo quản -20 0C 52 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận: - Chọn thông số ly tâm tốt cho công đoạn ly tâm: 3000 vòng, thời gian ly tâm 15 phút - Hoàn thiện quy trình: “Tách chiết enzyme bromelain từ vỏ dứa phương pháp lọc” - Hiệu suất thu hồi enzyme bromelain thô 0,0542 g/ml - Enzyme bromelain sau tinh có hàm lượng protein 47,78% hoạt tính 2283,02 U/g Tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm mà ta cut-off công đoạn ban đầu đến công đoạn cuối nhằm giảm chi phí sản xuất, tránh làm giá trị hoạt tính enzyme Đề xuất ý kiến: Do thời gian điều kiện nghiên cứu hạn chế nên trình làm thí nghiệm thu kết ban đầu không tránh khỏi thiếu sót Do đó, cần tiến hành nghiên cứu điều kiện khác để đề tài hoàn thiện ứng dụng thực tế sản xuất có hiệu Đề tài xin đề xuất số ý kiến sau: - Nghiên cứu ứng dụng quy trình “Tách chiết enzyme bromelain phương pháp lọc” cho nguyên liệu dứa (phế phẩm) khác như: Lõi, lá, thân dứa - Dùng phương pháp lọc “Tách chiết enzyme ficsin từ nhựa sung”, “Tách chiết enzyme papain từ nhựa đu đủ” - Nghiên cứu sử dụng phương pháp sấy phun công đoạn đông khô nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm enzyme bromelain - Sử dụng enzyme bromelain phục vụ cho sản phẩm làm mềm thịt 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Lê Thanh Mai, 1997 Nghiên cứu Bromelain đường ứng dụng chúng, luận văn phó tiến sĩ sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên [2] Nguyễn Đức Lượng, 2004 Công nghệ enzyme, nhà xuất ĐH Quốc Gia TPHCM Tài liệu nước [3] Barman, T.E.: Enzyme Handbook, Vol II Springer, New York-Heidelberg-BerlinTokyo, 1985 [4] Lauwers, A.; Scharpé, S.: Pharmaceutical Enzymes, drugs and pharmaceutical sciences., Volume 84, Marcel Dekker, Inc., New York-Basel-Hong Kong, 1997 [5] Stellmach, B.: Bestimmungsmethoden Enzyme für Pharmazie, Lebensmittelchemie, Technik, Biochemie, Biologie, Medizin Steinkopff-Verlag, Darmstadt, 1988 [6] Raghavarao K.S.M.S, Ranganathan T.V., Srinivas N.D and Barhate R.S (2003), [7] S J Taussig and S Batkin, “Bromelain, the enzyme complex of pineapple (Ananas comosus) and its clinical application An update,” J Ethnopharmacol., vol 22, no 2, pp 191–203, Mar 1988 [8] Z I M Arshad, A Amid, F Yusof, I Jaswir, K Ahmad, and S P Loke, “Bromelain: an overview of industrial application and purification strategies,” Appl Microbiol Biotechnol., vol 98, no 17, pp 7283–7297, Sep 2014 [9] W M Cooreman, S Scharpé, J Demeester, and A Lauwers, “Bromelain, biochemical and pharmacological properties,” Pharm Acta Helv., vol 51, no 4, pp 73–97, 1976 [10] H R Maurer, “Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use,” Cell Mol Life Sci CMLS, vol 58, no 9, pp 1234–1245, Aug 2001 [11] International Union of Biochemistry Nomenclature Committee: Enzyme Nomenclature Academic Press, Inc., London 1984 [12] Godfrey, T., Reichelt, J.: Industrial Enzymology Macmillan Publishers Ltd., Surrey (U.K.), 1983 Aqueous two phase extraction an environmentally benign technique Clean Technology Environment Policy, 5, 136–141 54 Tài liệu web [13] “Dứa,” Wikipedia tiếng Việt 21-May-2015 [14] Uniprot, “Alignment [completed].” [Online] Available: http://www.uniprot.org/align/A2015081264XGQ07PPH [Accessed: 12-Aug-2015] [15] “BIOZYM Gesellschaft für Enzymtechnologie mbH.” [Online] Available: about:reader?url=http%3A%2F%2Fwww.biozym.de%2Fdatasheets%2Fbromelain.php [Accessed: 12-Aug-2015] 55 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn Đường chuẩn BSA phương pháp microbiuret µmol 0,9034 1,8068 3,6136 7,2272 14,4544 30,12839 Cmg/ml 0,02 0,04 0,08 0,16 0,32 0,667 OD 325 0,0217 0,0459 0,1028 0,2241 0,4526 0,9181 OD325 y = 0.0308x - 0.0044 R² = 0.9996 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 OD325 0.4 Linear (OD325) 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 Đường chuẩn BSA phương pháp A280 0,4517 0,9034 1,8068 3,6136 7,2272 14,4544 30,12839 Cmg/ml 0,01 0,02 0,04 0,08 0,16 0,32 0,667 OD280 0,0038 0,0092 0,0221 0,0442 0,0865 0,1769 0,3634 Umol 56 Hình 4.6 Đường chuẩn BSA phương pháp A280 Phụ lục 2: hình ảnh sản phẩm enzyme công đoạn Bột ly tâm Bột lọc thô Bột lọc 1.2 µm Bột lọc 11 µm Bột enzyme cut-off 10 kDa [...]... quy trình tách chiết bromelain từ vỏ dứa dự kiến: Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme bromelain Thuyết minh quy trình: Vỏ dứa được gọt ra từ quả dứa thu mua tại chợ Vĩnh Hải – Nha Trang, Khánh Hòa Được làm sạch, cắt nhỏ rồi ép thu dịch Để tăng hiệu suất dịch ép, vỏ dứa được làm đông trước khi ép, mục đích làm phá vỡ cấu trúc tế bào của dứa Sau đó dịch được lần lượt lọc thô qua hai vải lọc có kích... chuyên sản xuất, chế biến các thực phẩm từ quả dứa [13] Hằng năm tổng sản lượng phế phẩm của vỏ dứa từ các tỉnh là rất lớn, gây ô nhiễm môi trường và hết sức lãng phí Đây cũng là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc tách chiết bromelain tăng giá trị kinh tế Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013) Tỉnh Sản lượng dứa (tấn) Lượng vỏ dứa phế liệu (tấn) Phú Thọ 2000 515 Ninh Bình... năng ứng dụng của enzyme này như: Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tính sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao Nghiên cứu còn cho thấy có thể sử dụng enzyme này để rút ngắn... muối trung tính ít gây giảm hoạt lực của enzyme hơn so với kết tủa bằng dung môi hữu cơ 1.3.2 Phương pháp hấp phụ chọn lọc Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzyme quan trọng và thành công nhất Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từ qua cột chất hấp phụ Khi đó tùy theo khả năng tương tác của chất hấp phụ với từng loại enzyme, các enzyme khác nhau sẽ được hấp phụ với... biến tính chọn lọc nhờ tác dụng 19 của nhiệt độ hay pH môi trường Việc tách enzyme có thể sử dụng nhiều phương pháp sau: 1.3.1 Tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa - Tủa bằng dung môi: Tuỳ theo tính chất của từng loại enzyme sẽ kết tủa tối đa ở nồng độ dung môi nào đó Các dung môi hữu cơ dùng kết tủa phổ biến là: Aceton, ethanol, izopropionic Các dung môi này có thể gây nên sự vô hoạt enzyme nên... hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên 1.3 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch của enzyme Enzyme có mặt trong tất cả các tế bào, chúng tồn tại ở dạng nội bào hay ngoại bào.Vì vậy vấn đề tách và thuần khiết enzyme là công việc rất khó khăn, đặc biệt đối với các enzyme nội bào Muốn tách enzyme nội bào... thích hợp để triết rút enzyme ra khỏi cột Phương pháp hấp phụ thường được dung để làm đặc dung dịch enzyme Có thể thực hiện hấp phụ chọn lọc các enzyme theo hai cách: - Hấp phụ âm tính: Nếu enzyme không được hấp phụ, phương pháp xử lý này có thể xem như là dung chất hấp phụ để tách những hợp chất tạp ra khỏi dung dịch enzyme - Hấp phụ dương tính: Nếu enzyme được hấp phụ, nó sẽ được tách ra khỏi những cấu... tính enzyme Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ thấp (5 ºC) Hiện nay, thật sự chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme Do đó, việc làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng, kết hợp với nhau, tạo ra hệ thống phương pháp nổi tiếp nhau một cách hoài hòa nhất 1.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme. .. Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002) nghiên cứu điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm khô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Streamline XL với hiệu suất cao Tạp trí khoa học đại học Cần Thơ “trích ly enzyme bromelain từ phế phẩm khóm Cầu – Đúc Hậu Giang”, theo Nguyễn Văn Thành và cộng tác viên... bình tam giác, phễu lọc, giấy lọc, màng lọc, pipet thủy tinh (1ml, 5ml, 10ml), micropipet (10-100 µml, 20-200 µml, 100-1000 µml), đầu tiếp các loại, cốc thủy tinh (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml), ống đông (100 ml, 500 ml) 2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng chiết rút enzyme bromelain Hình 2.1 Vỏ dứa 26 Tham khảo từ các tạp chí, nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước đến nay như ... tốt nghiệp Tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) phương pháp lọc 2 Nội dung nghiên cứu - Đề xuất qui trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa - Khảo sát... tính enzyme bromelain qua công đoạn Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu quy trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) phương pháp lọc, phương pháp tinh cho sản phẩm enzyme. .. tượng phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng chiết rút enzyme bromelain Hình 2.1 Vỏ dứa 26 Tham khảo từ tạp chí, nghiên cứu nước từ trước đến : Tôi đưa quy trình tách chiết bromelain từ vỏ dứa