Đang tải... (xem toàn văn)
TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP GNRH-TBK Ở E. COLI
! "#$% !"#$%&'()*+,-./0--102!3)4-/567 89)*:/*;3<!=-->*?8=$@"+-/$--*,6,/6 --2A*;!"*-,.B-4.-6-<*C-./8DCEFG H$''$I9.-.,,*-.JK!KL !3)'9MNTrichosanthes 6*L//?-4=N-6$/6,?8>OP .9A*Q!K"/$,RA%=STESU/V.-6-EW$X!9Y9Z'[( )**-,AN99.-DTSFL,-$,/*,*$?'7/-+$8->C\] ^2A<',,*-+2A8N!'*Y#$%L!_!3)*' BNJH.JK9.-'3A`aN9JN9bDc]FLd :/e!_!3)6a$@*;3<!=-6"!"#$%'()* 3,-./fVfg6--1L-!?fVfe*-,.B-4.-6- !3)'9MNfN-///,//LfVf!_?8>OY9!K6"$I 9.-3?.h'.JKDcFL 9*":HYAJ989A,-.h,_-'-*-,/R E.coliDCF-.N`<AJ'!J8.hA89Z>9-4*-, '()*NL &'()*'+,-).' 2.1 Nguyên liệu ,-.h*/,_-'-*-,/!3)9894fI -'6f-,DCFLihHY.h?6a$@9.-jL -UkEC+ljT235k/,/+k26-*-*N-βl//-6$,+0f2 /*A'-'B358'L 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Điện di SDS-PAGE i$.9=*-,.GlfVj+CEcm2!3)9,-'*3d*'*U/ k/,DCEFL 2.2.2 Sắc kí trao đổi ion trên hệ FPLC /8.h68"9.-!3)4A*'.G6H-!c\^6k* n\?Y/E\^jlV-oC\\\CmN6-pN,C\\µqLNJ$9.-6/8*' !3)NRCE\\\AIq*`-E\*`!h'H*;KA(Lf;(!3)4* rA-^,*/-6,+oCsqE\2Lf-,/!='$B6t!3):HI '*-,8'.%a/8u.G!6k*n\L!3)9*@a/-!98 V EW\ R4!35JL^X!3)/8u.G/$,v!\\\S^/5 3d[*;JHwfk+f///-,2L 2.2.3 Western blotting và phân tích trình tự đầu N của protein tái tổ hợp '*3d*'*x,6,.-A1'!%[7'/1/!;,-NHyj$/ !3)93!_>DCTF /0'1+1'2 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của GnRH-TBK 9.-E. coliUkEC+ljT2Y/A,-.h*!_!3)Y?.h (!%DCF9*@!3)6a$@!"3)-HYNLNH *-,4!"A<9.-U+E .coli2H!3).h/UN9R $48/+6-.-$,62Ll-APN!h?h!3)R$4/!v51N $7ZN[64G*@A@-'HY9*,-[A1'!% !J8.h=)*96Y;9L-*4AHYU/[`9 8>-6'67>3RU/!<67.hU/R$4/L7.h U/!3)98>-6'REE - T\ - ATn - L9.-!3)BN- 35ku-'.[/'"/QE\\AIq*`RTn - -!98V s\\ !4 \LS\LsL>Y.G0f+v!"\LS^2A9*@QE\\AIq*`REE - T\ - ATn - L8"9.-R'5!h8'/CETS5AZ/!H+Cs52!3)4.GN Rc\\\AIq*`A*'.G6H-!3!_>RHLNJ$%9.-6/8 *'!3)NRCE\\\AIq*`-E\*`!h'H'*;KA(Lf-,(6" !3)R*;(AK!3)8h/.G!$lfVjH,*-N/N/$,CEcmLM 89Z>!3)-BNREE - A6/Cs5!3)>Y*-,!3)4-/P* UN9R$4/L3z5/HRT\ - ATn - *-,4!3) .h/UN9R$48/L 3.2 Tinh chế protein GnRH-TBK tái tổ hợp ih*@A@-9A:HY9*,-Z'[.h*-,!3) 9REE - Z/!H+Cs52L8"'9.-A8{kEC+ljT2!3)1ay3!_ >R*;*3d*'*Lf;(6/N!3)4*rA-^,*/-6,+oCsqE\2H wfk+f///-,2L'4*B!3)a/.G!c\^6*n\-!98 VEW\R4!35JL0--1'()*!3)/8u.G/$, v!\\\S^/-!c\^6*n\A<"!$I>Ns\q5A8= 3<|*!-4CL [C}9*-,/L V}f(6Q8y9Z/^,*/-6,+oCsqE\2Hwfk+f/// -,2~ }i$lfVj'*!-4*-,!3)~^}/*-,{~CCE}'* !-4R!•*(~x}x,6,.-A<N9/u8' H[CV*(6Q8y!K-X!3)Mc\\$%BNLH*(?!• B*@$NB!K3-*-,/Lh/'*!-4R!•U/*(6Q8y .GlfVjH,*-N/N/$,CEcmL9Z>!3)R[C-BN|* !-4•1BC.O*-,$NB?8=3<3dYA<8=3<yN9U/ T\8l/L3APN'*!-4*-,R!•Y/--A?! 64/-L9Z>x,6,.-'*!-4R!•-*>Y!KA<N9/ u8'L9Z>*=[7/1/!;U/64-BN-4 M/1/!;HU/*-,'()*^,'/1/9*,-6*,N Nk,€[7NzA<89Z>x,6,.-8r!%*-,!3)= *-,/L '2 0--1'()*!_!3).hRY8'/--E. coliUkEC+ljT2 38'/R'!J8/N!(MEE - !9Tn - L/'.3<6ay!d> $4-/?h!3)9.G6Q8y/-!(-Z/^,*/-6,HwfkL +*'341 CLiK/f/O+E\\T2qqlNJAY$@+!/2 ELf/O+E\\C2qq>-"9E\\CLsssWL TLf/O-"35N#yf4-4kH;[+E\\\2qq :AB!Jd.>-6oi4"/LETEWL SLf//-/--N,N/x-00/$k,/+E\\C2qq -,-LV**L-,LTS}Wc]E cL•,/k8f**,l,‚‚$,l,6A-N,6f/6/,V$/•,//$-^‚, •-A,-qqwjk,,6SnE+E\\\2ESCESsL sLj-6Lƒ$,L„/„Lx,6*/,LpLlL/$/NVLL+C]]T2qq•L Lj$--L^,/.LnnCScWCSsSL nL/NVL8xL/N-LL8-/L/$x/1/•L+C]]\2qqL•L/,sE]s ]]L WL0/VL„--Lk$/LwL/$//N/L+C]]S2qq/,nSEcccEcsCL ]L8/-AL-86,kL/$-AL-8jL/$/NVL+C]]\2qqj$---NCEn T\cET\s\L C\L0/VL-.,L/8/VL/$/8L„-L/$//N/L+C]]n2qqjL•L„.6, N,-L,*-L-LnSnTnWL CCL0/VL/8/VL-.,L//8L/$//N/L+C]]n2qq0L•L„-LCT]nC\\L CELk/,…LL+C]n\2qq/,EEn}sW\sWcL CTL-†.L/,,L/$-$-•L+C]n]2qqf-L/LV/$LL…VnsSTc\STcSL 5'443( 67!8!9:!;;87<9;=!:86>!;?7;:<!!E. coli 0--16-6,/,†-$/Ng-,,/,-g/,6,,N/,,6$6*/N 6*,g6g/,,,*-6-/,6L0--16-///$6/6/-†g/- ---//.-$N-g/,-g//.-$N†6-,,$-/*-,-1L-16 ,A,†,$,,$,//N*-,6*-$,$.N*/6-./,/†8/,,6+ fVf-fjl€2L,,N†,/A,6-/,$-./8+2/N*,C.-6-,/A/ *-,+0f26-/,$g-Trichosanthes6*L//W]W+./,/,g/N2†,A,/6 /A//$//,/AN-,6$,,N-*/6L†/6*-A,$-.,/--$/$$/,g- ,-6--g$gg,,g6-*-,6/6,-./ --16&LV./,/,1*,66- */6$,-$/6/g6-*-,†-/$--*,,/6--,+2/,- $,/*,*$,†,,*-6,6-6,A,/N/,---6/6.,,-6,$L,g6- lV†,,/*g,$.Nf66*,g*,6$,6,$g-,lV6,Z,,6-g 8,/$.8,,6/$6,,$-*jEC$+‡2,1*,66-A,-L6*/*,,*,6,6,,66 -g,,1*,66--g,,-./g6-*-,E. coli 6/kEC+ljT2L, ,1*,66--g,*-,†/6/66,66,$.N//N66-g-/*-,.NlfVjL0†/66-†// EE - †/6,1*,66,$/N6-.,g-†,/T\ - -Tn - ,*-,†/6 ,1*,66,$.-6-.,g-/$6-.-$,6L,,-./*-,6†/6*g,$- --,,N.N^,*/-6,-/-/*N-wfkN6,L,*-,/6,-,//66 -g/.-T\8l//$,6*,g-,/AN†/.-$,6//6/6†/66-†.N lfVj/$x,6,.-L,6*,g/ANq-1N-g,*g,$,-./ --16$,6$NL 35{!%$8-/}6LN#= *}qq†††L6-A,/L-qAq-$,6L**ˆ/,‰f/,6C-‰*/,*$‰Tc @9?AB?@?9!C:7D::!>E9FG@9HI?7;:<! @!!J -'(YU/dh6"*-,?hR$3<$47$--'$%6AP-K$3< $489)*-K.%;-'9.-Ld:/-9.-?Y/[-4*-, 8'/9/;HYM-4*-,3<9*>9`A64`L= A[APN'8ŠP9`64AHY*-,RA%=U/'H Y?/6A!3)P*PA!4?/L @9=!J?@?9K:!C:HLM?7;:<!6NO:L '*3d*'*9`A64*-,!J$7/H:=B?/yU/*-,3! =!8=3<*a!I//LLLU/*-,;9`LJ*-,IH89A<' *a68'HA9`'*-,NI*@A-.>BU/'H89L ^"P!3)'*-,NHhY*-,?B>=B7H!K3U/ ?;6a$@'.*'*8'/L 2.1. Nhiệt độ ih''*-,8'/$7/H89U/U/`35/?h6a$@*3d*'*.9 =5'$@U/L^!J;3y•H$z!"A<35)*' *-,,pN,.JA<Ll%*-,,pN,!3):Rc\n\‹…fŒ\‹q…fŒ-5 /1'!%6/!?*-,4*!_.%.9=!3)-4.u.G'-KNL3APN$% 9*-,.JA<?h!3)P.G'-89U/8P%*; <'*-,4*L ihP9*{*-,,-*3d*'*89U/P%.G'"=; 9R!B*!"A<$:d;9R!$3<\‹…fŒ\‹q…fŒ '.9=!K.*-,,pN,L 2.2. Nồng độ proton (pH) f-,'B3•=A[APN-'$$%/$A8J`6t.%*N36/} ‹ˆ1}/,6*/,*,g1‰-6‰Ž}6,/6-6-g-}-gg,}-gg,ŽqŒ‹-}*Œ‹q-}*Œ ‹ˆ1}/,6*/,*,g1‰A6‰Ž}6,/6-6-g-}AŽqŒ‹A}6/*,N*,$‰•1\\\\•nc 6-8,$‰ŽgŽg,$‰ŽgŽ*/‰Ž•S•c•S•CC•]•CC•]•c1,Ž-}*,g,,/A,‰ŽŽ-}6*‰ŽncŽ --$6p,‰ŽECs\\ECs\\ŽŒ‹A}6-8,‘-6N,‰Ž,ŽŒ‹qA}6-8,Œ‹A}g-/6Œ‹A}g,Z‰Žg ,l/†*1,k,x$\ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž6•\C\ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž6\\ •CŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž*-$•ECEŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž*-$•TECs\\*1,x$ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g ,Z‰Ž*-$•TECs\\*1,,ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž6•\\CŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž*-$•sC EŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž*-$•nECs\\*1,x$ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž6•WECs\\\ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g ,Z‰Ž*-$•nECs\\*1,,ŽŒ‹qA}gŒ‹A}g,Z‰Ž6•C\ECs\\\ŽŒ‹qA}gŒ‹qA}g-/6Œ‹A}*/ -}-,N*,‰Ž,Ž/$,6/*,-8‰ŽŽ-},16--8‰ŽgŽŒ‹qA}*/Œ‹-}-8/6*,/-‰ŽŽ A},1‰Ž,$ŽŒ‹q-}-8Œ‹qA}6/*,N*,Œ‹A}6/*,$‰•1\\\\•C\Ec6N,‰Žx0l}ES\*~j0} ]s*Ž/‰Ž’ “ $NH ” • /./ ” - – H • 8—d ” H • ” ’ “ / “ NLŽ N*,‰Ž˜•1\\\\•ncŽŒ‹A}/,$//-},g‰Ž*}qq/L--,L-q/qˆ /,‰gEETTE]]sSc/CsL‘*/$‰\LT$6*‰A/A,†‰/‰CC$]S,]S]SCTWWnŽ 6‰Žg,}qqq}™l„…^jšC™6,A,™k„VkšC™,*™6-C™\C™*• /,\\CL‘*ŽŒ‹qA}/,$//Œ‹qA}6/*,Œ‹-}*Œ‹q-}*Œ l-'/$/-|*-N*,*$,Iv4J?Y7$-$3<$4'-?/ NH4-/=!/!U/*-,Lfa*-,B$H?-7$-PzU/ |*-N*,*$,8!'8hUN9'?Y7$-8'U/|.H+2ZN9!% =B=!U/*a*-,+?/.-1NU//-/$„U/N-6, ‹…ŒE‹q…ŒU/N6,/$U/V,$/p-U/6$,2 [...]... chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch 4.2.6 Kết tinh protein Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn,... tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng Một điều cần chú ý là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch (NH4)2SO4... dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh 4.2.7 Làm khô và bảo quản chế phẩm protein Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein enzyme bị biến tính Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dang khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt... pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine Độ hấp thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào... hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột 5.2 Đánh giá tính đồng thể của protein: Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương... kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch - Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì nồng độ của protein tổng được tính tương đối từ độ... 9,7 - 10,8 Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH của môi trường Dịch protein enzyme được giữ ở pH 5 trong thời gian xác định Protein tạp... lượng protein - Định lượng nitrogen theo phương pháp kjeldahl: Phần lớn các phương pháp gián tiếp xác định protein đều dựa trên cơ sở xác định lượng nitrogen Lượng nitrogen có trong các protein là gần giống nhau không phụ thuộc vào chất lượng và nguồn protein Đương nhiên trên cơ sở lượng nitrogen có thể xác định chỉ các protein đã được tinh sạch hoặc lượng protein của các mẫu nghiên cứu mà ngoài protein. .. giá trị pH Các nhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường acid Như vậy, ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau... Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu IV Tinh sạch protein 4.1