CHƯƠNG NGUYÊN LÝ VÀ KỸ THUẬT TÁCH DÒNG Cách tiến hành dòng hóa - Bước 1: Tách chiết xử lý đoạn DNA cần tạo dòng - Bước 2: Chọn xử lý vector - Bước 3: Tạo vector tái tổ hợp (DNA tái tổ hợp), thiết kế vector-DNA nhân dòng - Bước 4: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ - Bước 5: Nuôi cấy, tạo dòng xác định dòng cần tìm - Bước 6: Kiểm tra thu nhận sản phẩm gen tái tổ hợp 2.3: Tạo vector tái tổ hợp • Vector tái tổ hợp tạo việc nối (tạo liên kết hóa trị bền vững) vector qua xử lý với đoạn DNA ngoại lai (insert) • Phản ứng nối phân tử DNA cần enzyme DNA ligase DNA ligase xúc tác trình tạo liên kết phosphodiester nhóm 5′-phosphate nucleotide đoạn DNA nhóm 3′-hydroxyl đoạn DNA Enzyme DNA ligase thường dùng T4 DNA ligase (thu từ bacteriophage T4) 2.3: Tạo vector tái tổ hợp Phản ứng nối phân tử DNA dùng DNA ligase: (a) phân tử DNA tạo từ phản ứng cắt với EcoRI; (b) Liên kết hydrogen base tương hợp làm phân tử tạm thời dính với nhau; (c) phân tử tạo liên kết hóa trị nhánh DNA ligase, phần hở nhánh nối lại DNA ligase chế sửa chữa DNA tế bào chủ 2.3 Tạo vector tái tổ hợp • Phản ứng dùng DNA ligase đòi hỏi ATP nguồn lượng hóa học • T4 DNA ligase giúp nối phân tử DNA có đầu tù, hiệu suất phản ứng thấp Æyêu cầu nồng độ enzyme lớn phản ứng in vitro • Chú ý cần làm hoạt tính hay loại bỏ enzyme giới hạn trước thực phản ứng nối DNA • Trong phản ứng nối plasmid phân đoạn DNA cần tạo dòng xúc tác DNA ligase có trường hợp sau xẩy ra: 2.3 Tạo vector tái tổ hợp (c) đoạn DNA cần tạo dòng nối vào vector- kết mong đợi; (d) đầu dính vector nối lại đoạn DNA gắn vào; (e) đoạn DNA gắn với ngẫu nhiên không gắn vào vector 2.3 Tạo vector tái tổ hợp Quá trình tạo vector tái tổ hợp với vector khác plasmid a/ với bacteriophage λ Cụm gene trung tâm Tay λ Tách λ DNA DNA ngoại lai Cắt vector DNA ngoại lai enzyme giới hạn Nối DNA (ligation) Nạp vector vào áo phage in vitro 2.3 Tạo vector tái tổ hợp Quá trình tạo vector tái tổ hợp với vector khác plasmid b/ với YAC vector DNA ngoại lai Nối DNA (ligation) 2.4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ (biến nạp vector -transformation) • Các loại tế bào chủ có lực cao thu nhận DNA từ bên gọi tế bào chịu biến nạp hay tế bào khả biến (competent cell) Hiện tượng tế bào tiếp nhận DNA ngoại lai gọi tượng chịu biến nạp (competency) tế bào • Tế bào chủ thường dùng kỹ thuật tạo dòng DNA tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E.coli • E.coli khả khả biến tự nhiên (khác với số vi khuẩn khác) nên cần xử lý đặc biệt để di nạp DNA bên Có phương pháp biến nạp 2.4.1 Biến nạp DNA ph pháp hóa học E.coli nuôi cấy thu nhận giai đoạn phát triển log; tế bào ly tâm rửa vài lần dd lạnh chứa ion hóa trị 2, thường CaCl2; sau tế bào khả biến hòa lượng nhỏ dd đệm để tiếp nhận DNA Thêm plasmid 4oC 30 phút Sốc nhiệt 42oC phút Tế bào khả biến Phục hồi 37oC 30 phút Trải đĩa thạch chọn lọc, 37oC 16 Thêm dịch nuôi cấy 2.4.1 Biến nạp DNA ph pháp hóa học • Cơ chế: DNA từ bên kết nối với lipopolysaccharide màng tế bào tế bào khả biến DNA đưa vào tế bào qua “dò dỉ” màng tế bào tác dụng Ca2+ sốc nhiệt • Hiệu suất tế bào chịu di nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố đó, quan trọng chủng E.coli sử dụng • Nhược điểm: hiệu suất biến nạp thấp, tốn thời gian ( xử lý với CaCl2), loại tế bào cần trình riêng, thường không dùng cho tế bào động vật, thực vật 2.4.1 Biến nạp DNA ph pháp hóa học • Ví dụ quy trình xử lý E.coli pp hóa học: 1) Nuôi cấy ml vi khuẩn E coli nuôi qua đêm vào 100 ml môi trường SOC SOC: Tryptone 20g, yeast extract 5g, NaCl 10mM, KCl 2,5mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, glucose 20mM 2) Ủ 370C đủ mật độ tế bào, lắc nhẹ nhàng ủ 3) Chuyển sang ống tiệt trùng Để nước đá 10 - 15 phút 4) Quay li tâm 1.000 ×g 15 phút 40C 5) Đổ bỏ nước mặt, để lại chút nước rót bỏ hết được, lật úp ống, gõ nhẹ lên mặt giấy thấm số lần cho mặt tốt 6) Cho vào ống 30 ml dung dịch CPG làm lạnh, trộn đảo nhẹ Dung dịch CPG chứa CaCl2.2H2O 50mM, KCl 100mM, glycerol 10% (w/v) CH3COOK (pH 7,5) 10mM, điều chỉnh pH cuối đến 6,2, hấp cao áp tiệt trùng (hoặc lọc qua lọc vi khuẩn 0,2 µm) 7) Để nước đá khoảng 30 phút 8) Quay li tâm 1.000 ×g 40C 15 phút 9) Bỏ nước mặt, để lại giọt dịch rót bỏ hết 10) Hòa vào ml CPG làm lạnh (Glycerol có thành phần dung dịch CPG chất chống đóng băng, ngăn trở hình thành tinh thể nước đá lạnh sâu tăng thể tích có khả chọc thủng tế bào vi khuẩn) 11) Rót khoảng 0,2 - 1,0 ml vào ống có nắp (cryo vial, ống Eppendorf 1,5 hay 2,0 ml), đậy kín làm lạnh nhanh nitơ lỏng Bảo quản nitơ lỏng −700C 2.4.2 Biến nạp DNA pp điện biến nạp (electroporation) • Các tế bào vi khuẩn thu hoạch rửa pp trước với nước cất lạnh dd đệm với nồng độ ion thấp mẫu nhỏ dịch huyền phù đặc chứa tế bào trộn với DNA ngoại lai cuvette đặc biệt xung điện ngắn với điện (voltage) cao đưa qua dịch huyền phù • Ưu điểm: hiệu suất biến nạp cao pp hóa học; sử dụng cho tế bào động vật thực vật • Tuy hiệu suất biến nạp nhìn chung thấp Các tế bào chủ DNA ngoại lai tạo thành dịch huyền phù cho vào cuvette nhựa có điện cực Edit your company slogan Cuvet nhựa với hai điện cực alluminum bên Có kích thước: Các cuvette máy xung gen Dung tích 100µl (độ rộng khe Electroporator 2510 hai điện cực là: 1mm) Dung tích 400µl (độ rộng khe hai điện cực 200) Dung tích 800µl (độ rộng khe hai điện cực 4mm) Đóng gói riêng khử trùng tia gamma Multiporator với cuvette Thành cuvet cấu tạo dạng đệm chuyên dụng cho nhám, dễ dàng ghi đánh dấu biến nạp (transfection) Ðể tạo xung điện cao thời gian ngắn người ta sử dụng thiết bị gọi máy xung gen (gene pulser) Chức - Biến nạp xung điện vi khuẩn, nấm hay vi sinh vật khác - Dung hợp tế bào với tế bào động vật, thực vật, Multiporator – Máy xung điện nấm đa Eppendorf Các thông số kĩ thuật • Nặng khoảng 5,5 kg, • Kích thước 25x35x12 cm (chỉ lớn trang giây A4 ít) • Xung điện cao thời gian cực ngắn (tới 1200 V 5µs) Với khoảng thời gian cực ngắn, tế bào đủ để nhận DNA/RNA/Protein ngoại lai mà khả sống lớn Hiệu suất điện biến nạp Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều thường lên tới 70-90% Hiệu suất phương pháp phụ thuộc vào yếu tố sau: - Nồng độ tế bào chủ - Nồng độ DNA tái tổ hợp - Giai đoạn phát triển tế bào (tế bào già non không thích hợp) - Môi trường dung dịch đệm - Cấu trúc màng tế bào - Độ mạnh điện trường tác động khác loại tế bào khác - Độ dài thời gian (thời gian ngắt xung - ms) [...]... nạp thấp, tốn thời gian ( xử lý với CaCl2), mỗi loại tế bào cần 1 quá trình riêng, và thường không dùng cho tế bào động vật, thực vật được 2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph pháp hóa học • Ví dụ của quy trình xử lý E.coli bằng pp hóa học: 1) Nuôi cấy 1 ml vi khuẩn E coli đã nuôi qua đêm vào 100 ml môi trường SOC SOC: Tryptone 20g, yeast extract 5g, NaCl 10mM, KCl 2,5mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, glucose 20mM...2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph pháp hóa học • Cơ chế: DNA từ bên ngoài kết nối với lipopolysaccharide ở màng tế bào của tế bào khả biến và các DNA được đưa vào tế bào qua sự “dò dỉ” của màng tế bào bởi tác dụng của Ca2+ và sốc nhiệt • Hiệu suất... bỏ hết 10) Hòa vào 8 ml CPG đã làm lạnh (Glycerol có trong thành phần dung dịch CPG là chất chống đóng băng, ngăn trở sự hình thành các tinh thể nước đá càng lạnh sâu càng tăng thể tích và có khả năng chọc thủng tế bào vi khuẩn) 11) Rót khoảng 0,2 - 1,0 ml vào ống có nắp (cryo vial, ống Eppendorf 1,5 hay 2,0 ml), đậy kín rồi làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng Bảo quản trong nitơ lỏng hoặc ở −700C 2.4.2... đặc chứa các tế bào được trộn với DNA ngoại lai trong 1 cuvette đặc biệt và 1 xung điện ngắn với điện thế (voltage) rất cao được đưa qua dịch huyền phù đó • Ưu điểm: hiệu suất biến nạp cao hơn pp hóa học; có thể sử dụng cho tế bào động vật và thực vật • Tuy vậy hiệu suất biến nạp nhìn chung vẫn rất thấp Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa... (transfection) Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser) Chức năng chính - Biến nạp bằng xung điện vi khuẩn, nấm hay các vi sinh vật khác - Dung hợp tế bào với các tế bào động vật, thực vật, Multiporator – Máy xung điện nấm đa năng của Eppendorf Các thông số kĩ thuật • Nặng khoảng 5,5 kg, • Kích thước chỉ 25x35x12 cm (chỉ ... hợp Phản ứng nối phân tử DNA dùng DNA ligase: (a) phân tử DNA tạo từ phản ứng cắt với EcoRI; (b) Liên kết hydrogen base tương hợp làm phân tử tạm thời dính với nhau; (c) phân tử tạo liên kết hóa... 2.3 Tạo vector tái tổ hợp • Phản ứng dùng DNA ligase đòi hỏi ATP nguồn lượng hóa học • T4 DNA ligase giúp nối phân tử DNA có đầu tù, hiệu suất phản ứng thấp Æyêu cầu nồng độ enzyme lớn phản ứng... (tạo liên kết hóa trị bền vững) vector qua xử lý với đoạn DNA ngoại lai (insert) • Phản ứng nối phân tử DNA cần enzyme DNA ligase DNA ligase xúc tác trình tạo liên kết phosphodiester nhóm 5′-phosphate