BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN BẢO VỆ THỰC VẬT -*** CHUYÊN ĐỀ Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân gây bệnh thối đen ca cao thị phân tử Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước Mã số: ĐTĐL.2011- G/63 Chủ trì đề tài: ThS Nguyễn Hồng Tuyên Hà nội, 2015 1 Đặt vấn đề Theo Duncan Cooke, 2002, trước giai đoạn phát triển sinh học phân tử, tất loài nấm thật (fungi) nấm noãn (oomyces, kể loài thuộc chi Phytophthora) xác định dựa đặc điểm hình thái sinh học Cách xác định truyền thống nhìn chung khó dễ tạo kết không xác loài nấm Phytophthora Các đặc điểm hình thái nấm Phytophthora có giá trị chẩn đoán thường không thống nhất, phụ thuộc nhiều vào isolate điều kiện nuôi cấy Hiện nay, việc xác định phân loại phân tích quan hệ loài Phytophthora thực dễ dàng dựa kỹ thuật phân tích phân tử, nhiều vùng gen Phytophthora lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu vùng mã hóa không mã hóa DNA ribosome (rDNA), gen mã hóa cytochrome oxidase I II ty thể Để xác định xác tên loài nấm gây hại, xin thực chuyên đề: “Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân gây bệnh thối đen ca cao thị phân tử” Tài liệu tham khảo Một số phương pháp ứng dụng nghiên cứu nấm Phytophthora Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn giới hạn (Restriction fragment length polymorphism = RFLP) kỹ thuật sử dụng lần vào năm 1975 để xác định đa hình DNA nhằm lập đồ di truyền đột biến mẫn cảm nhiệt độ serotype adenovirus Kỹ thuật dựa việc cắt Enzyme cắt giới hạn (RE= Restriction enzyme) toàn bộ gen vi sinh vật Mặc dù cá thể loài có gen đồng chúng khác số nucleotide nguyên nhân sau: đột biến điểm, thêm/mất, chuyển vị trí, đảo vị trí lặp (duplication) nucleotide Kết sản phẩm cắt DNA có số lượng kích thước thay đổi Phân tích rDNA-RFLP sử dụng xác định nấm P palmivora MF4 từ isolate phân lập ớt Kong cộng sự, 2004 sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chuỗi đơn PCR - SSCP (Single stranded conformational polymorphism) cho rDNA - ITS để chẩn đoán nhanh Phytophthora ramorumich Sự khuếch đại DNA phân tích SSCP sản phẩm PCR tiến hành Mỹ Sử dụng cặp mồi thích hợp với nấm thuộc Oomycete (Cooke cộng sự, 2000), mồi xuôi (forward primer) ITS6: 5’-GAA GGT GAA GTC GTA ACA AGG-3’, vị trí 18S rDNA mồi ngược (reverse primer) ITS7: 5’- AGC GTT CTT CAT CGA TGT GC-3’, định vị 5-8 S rDNA để khuếch đại Theo tác giả Ivors cộng sự, 2004, kỹ thuật dựa phân tích đa hình đoạn dài khuyếch đại (amplified fragment length polymorphism = AFLP) áp dụng để nghiên cứu nấm Phytophthora Vos et al., 1995 người sử dụng kỹ thuật đa hình đoạn dài khuyếch đại kỹ thuật sử dụng nhiều nghiên cứu đa dạng thực vật, nấm vi khuẩn AFLP kỹ thuật hiệu nghiên cứu DNA fingerprinting kỹ thuật kết hợp ưu điểm RFLP (RE toàn bộ gen) PCR Đặc điểm quan trọng AFLP khả đánh giá mức độ đa hình toàn bộ gen hay nói cách khác kiểm tra đồng thời cách ngẫu nhiên sản phẩm từ nhiều locus Theo tác giả Blair, 2008, phân tích phân tử nhằm xác định đánh giá mối quan hệ loài nấm Phytophthora chủ yếu dựa vào vùng liên gen ITS (internally transcribed spacers) cụm gen rDNA Các rDNA nấm Phytophthora sinh vật nhân thật (Eukaryote) tổ chức thành đơn vị phiên mã Mỗi đơn vị phiên mã lặp lại nhiều lần genome Về cấu trúc, sinh vật nhân thật, đơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần kề thành cụm đơn vị phiên mã Một đơn vị phiên mã gồm gen xếp theo thứ tự 18S-5.8S-28S Xung quanh vùng gen 5.8S vùng ITS ký hiệu ITS1 (ở đầu 5’) ITS2 (ở đầu 3’) (Hình 1) Hình Sơ đồ minh họa cụm gen rDNA sinh vật nhân thật Vùng ITS1 ITS2 mũi tên Theo Duncan & Cooke, 2002, vùng ITS có tốc độ đột biến tương ứng với tốc độ biến hóa loài (tiến hóa trung tính) nên phân biệt mối quan hệ tới mức loài, chứng minh loài nấm Phytophthora Nguyễn Văn Viết, 2002, sử dụng kỹ thuật dựa PCR dùng mồi tùy ý (Random amplified polymorphic DNA= RAPD), xác định khác kiểu gen nấm Phytophthora colocasiae từ mẫu phân lập khoai sọ Việt Nam Theo Phạm Ngọc Dung Hà Viết Cường, 2010, tác nhân gây bệnh chết nhanh hồ tiêu Đăk Nông nấm Phytophthora tropicalis gây nên dựa vào phương pháp ITS , sử dụng mồi ITS5 ITS4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 3.1 Nội dung - Chạy PCR để nhân dòng - Dòng hoá sản phẩm PCR - Giải trình tự sản phẩm PCR - Phân tích phân loại 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Chuẩn bị nguồn nấm Các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao bị thối đen thu thập tỉnh Đăk Lăk, Bình Phước Đăk Nông Tác nhân gây bệnh phân lập môi trường chọn lọc Phytopthora PSM (Phytophthora selective medium) V8 agar chứa rifarmpicin, hymexazol pimaricin sau cấy truyền sang môi trường PDA (potato dextrose agar) V8 agar 3.2.2 Tách chiết ADN ADN chiết theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) Nấm nuôi cấy môi trường PDA nhiệt độ 250C - ngày Khoảng 100 mg sợi nấm chuyển sang ống effpendorf 1,5 mL rửa với ml nước cất Sợi nấm nghiền ống effpendorf với 500 µl đệm chiết (2 M NaCl, 25 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, % polyvinyl pyrrolidone và % CTAB) dùng chày nhựa nhỏ Dịch nghiền chiết lần với chlorophorm:isoamyl alcohol (24:1) Cặn ADN rửa lần ethanol 70 %, làm khô không khí 30 phút hòa 50 µl đệm TE Dịch ADN giữ -20 OC 3.2.3 Chạy phản ứng PCR Hai mồi ITS4 ITS5 (White et al., 1990) sử dụng để nhân toàn vùng ITS nấm Phytophthora Các phản ứng PCR thực tube 0,5 ml với tổng thể tích phản ứng 25 µl chứa 2,5 µl đệm DreamTaq PCR X10 (Fermantas), 0,5 µl dNTPS (10 mM môi loại A, T, G, C, Roche), 0,5 µl loại mồi (đều đươc chuẩn bị nồng độ 20 μM), 0,25 μL DreamTaq polymerase (5U/µl, Fermentas) 0,5 µl DNA Phản ứng PCR thực máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính 94 OC phút; 35 chu trình PCR (biến tính 94 OC 40 giây, gắn mồi 50OC 45 giây tổng hợp sợi 72OC phút) Phản ứng kết thúc với phút 72OC Sản phẩm PCR điện di gel agarose % chuẩn bị đệm TAE chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide Gel chạy thiết bị điện di Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE điện 100 V 30 phút Bản gel kiểm tra ánh sáng tử ngoại chụp máy ảnh số 3.2.4 Dòng hóa giải trình tự Sản phẩm PCR tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLink TM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn nhà sản xuất Hàm lượng DNA ước lượng nồng độ điện di agarose Sản phẩm PCR tinh chiết nối vào vector pTZ57R/T kít dòng hóa InsTA Clone (Fermentas) theo hướng dẫn nhà sản xuất biến nạp vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli dòng XL1-Blue Plasmid tinh chiết dùng kít tinh chiết plasmid (Bionier) Các dòng vi khuẩn tái tổng hợp kiểm tra có mặt vector tái tổ hợp PCR dùng mồi ITS Plasmid tái tổ hợp giải trình tự chiều dùng kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) máy PCR Sản phẩm giải trình tự tinh chiết, làm khô gửi đọc Viện Công nghệ sinh học Hà Nội Trình tự nucleotide biên tập lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene) 3.2.5 Phân tích trình tự chuỗi ADN Đầu tiên, chuỗi mẫu xác đinh danh tính so sánh với chuỗi công bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Phân tích chuỗi xây dựng phả hệ thực với phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX1.83 MEGA 4.0 Kết nghiên cứu 4.1 Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái tiêu quan trọng việc phân loại giám định Tất 20 mẫu nấm kích thích sinh bào tử nhằm quan sát đặc điểm hình thái bào tử nang (sporangium), cành bào tử nang (sporangiophore), bào tử hậu (chlamydospore) (Bảng 1) Các quan sát hinhfthias cho thấy: • Bào tử nang (sporangium) tất mẫu nấm có núm, số mẫu nấm có bào tử nang núm Hình dạng bào tử nang biến động: hình cầu, hình trứng tới hình ellip (hình 1) • Bào tử nang hình thành cành bào tử nang (sporangiophore) dạng sym (Hình 2) • Hầu hết mẫu hình thành bào tử hậu (chlamydospore) mức độ khác Bào tử hậu hình thành đỉnh sợi nấm (Hình 3) Hình Đặc điểm bào tử nang: hình cầu, trứng, ellip, bất qui tắc, bào tử nang có hai núm (minh họa từ trái sang phải, CCĐL 3.6, CCĐL 15.1, CCĐL 13, CCĐL 5.1, CCĐL11.4) Hình 2: Bào tử nang hình thành cành bào tử mọc dạng sym (minh họa mẫu CĐL1.3) Hình 3: Bào tử hậu hình thành đỉnh sợi (mẫuCBP 10.1) sợi (mẫu CCBP 5) Các đặc điểm hình thái mẫu nấm Phytophthora caccao nhìn chung giống với nấm công bố cacao P capsici (nhóm 2), P palmivora, P megakarya (nhóm 4) Thiếu đặc điểm liên quan tới sinh sản hữu tính hình thái bao đực (antheridium), bao trứng (oogonium), bào tử trứng (oospore) cách giao phối dẫn tới định danh loài mẫu Phytophthora cacao Bảng Đặc điểm hình thái mẫu Phytophthora phân lập từ cacao Stt Mẫu Bào tử hậu (Đường kính (µm)/ vị trí hình thành Cành bào tử nang Bào tử nang (sporangium) Hình dạng Dài (µm) Rộng (µm) Núm Lỗ thoát động bào tử (µm) 23-65 16-27 núm 20-37 17-32 núm CCĐL 1.3 19 ( mọc đầu sợi) Dạng sym CCĐL 2.3 Hiếm, 27( mọc sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip, bất qui tắc Cầu, trứng CCĐL 2.4 25 - 40 (mọc đầu, sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 22-50 20-32 - núm CCĐL 3.6 25 - 32 (mọc đầu, sợi) Dạng sym Cầu, trứng 22-55 20-42 núm 5 CCĐL 4.2 20 - 30 (mọc đầu, sợi) Dạng sym 22-45 17-35 núm CCĐL 5.1 17 - 25 (mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip Cầu, trứng, ellip, bất quy tắc 25-47 20-40 núm CCĐL 11.4 Dạng sym Cầu, trứng 22-57 17-52 - núm CCĐL 13.2 25 -27 (mọc đầu, mọc nhiều sợi) 25 - 30 (mọc sợi) Dạng sym Trứng, cầu 25-59 21-51 núm CCĐL 15.1 22 - 25 (mọc đầu, sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 25-52 20-37 - núm 2.5 – 10 CCĐL 16.1 20 - 25(mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng 20-42 15-30 núm 11 CCĐN 19 - 23 (mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 27-57 17-30 núm 12 CCĐN 15 - 17 (mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 22-45 15-30 núm 13 CCĐN 25 - 32 (mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng 27-60 22-40 1- núm 14 CCĐN 27 - 35 (mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng 27-50 12 37 1- núm 15 CCBP 20 - 32 (mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng 27-55 20-40 1- núm 16 CCBP 14 - 21(mọc đầu sợi) Dạng sym 18-48 15-31 1- núm 4—5 17 CCBP 21 - 32 (mọc đầu, sợi) Dạng sym 27-50 22-40 núm 18 CCBP 10.1 30 - 40(mọc đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng Hình thành bào tử Cầu, trứng Cầu, trứng, ellip 23-60 17-40 núm 19 CCBP 10.2 17 - 32 (mọc đầu, sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 20-40 12 40 núm 20 CCBP 10.3 17 - 30 (mọc đầu, sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 27-47 17-38 núm PCR giải trình tự vùng ITS Tất 20 mẫu nấm chiết DNA, thực PCR (Hình 4) giải trình tự Sau lắp ráp, tất 20 mẫu có kích thước đoạn đọc từ 729 – 782, tương ứng với sản phẩm PCR (Bảng 2, Phụ lục 1) Đoạn đọc tất 20 mẫu chứa vùng ITS ITS cần cho phân tích Hình PCR nhân vùng ITS cặp mồi ITS4 ITS5 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao M thang DNA kb (GeneRuler kb, Fermentas) với băng tham khảo 750 bp mũi tên Các giếng: (CCBP3), (DL3.6), (DL11.4), (DL4.2), (CCDN4), (CCBP2), (DL15.1), (CCBP10.1), (CCBP5), 10 (CCDN7), 11 (CCDN3), 12 (CCDN8), 13 (DL5.1), 14 (DL16.1), 15 (DL2.4), 16 (DL2.3), 17 (CCBP10.3) Bảng Kết giải trình tự mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Mẫu CCBP10.1 CCBP10.1 CCBP10.2 CCBP10.2 CCBP10.3 CCBP10.3 CCBP2 CCBP2 CCBP3 CCBP3 CCBP5 CCBP5 CCDN3 CCDN3 CCDN4 CCDN4 CCDN7 CCDN7 CCDN8 CCDN8 DL1.3 DL1.3 DL11.4 DL11.4 DL13.2 DL13.2 DL15.1 DL15.1 DL16.1 DL16.1 DL2.3 DL2.3 DL2.4 DL2.4 DL3.6 DL3.6 DL4.2 DL4.2 DL5.1 DL5.1 Mã Sequencing Mồi giải trình tự CCBP10-1_ITS4 13COZAA003 13D1ZAB010 13D1ZAB011 CCBP10-3_ITS4 13COZAA004 CCBP2_ITS4 13COZAA000 CCBP3_ITS4 13COZAA001 CCBP5_ITS4 13COZAA002 CCDN3_ITS4 13COZAA005 13D1ZAB008 13D1ZAB009 CCDN7_ITS4 13COZAA006 CCDN8_ITS4 13COZAA007 13D1ZAB004 13D1ZAB005 DL11-4_ITS4 13COZAA013 13D1ZAB006 13D1ZAB007 DL15-1_ITS4 13COZAA014 DL16-1_ITS4 13COZAA015 DL2-3_ITS4 13COZAA008 DL2-4_ITS4 13COZAA009 DL3-6_ITS4 13COZAA010 DL4-2_ITS4 13COZAA011 DL5-1_ITS4 13COZAA012 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 ITS4 ITS5 Chất lượng Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Tốt 1/4 bên phải Tốt 3/4 bên trái Sản phẩm cuối (bp) 781 782 750 729 781 756 757 776 792 748 783 710 775 736 764 782 779 761 773 751 Chúng nhận thấy tất 20 mẫu giải trình tự có đặc điểm giống sau: 10 • Tất 20 mẫu giải trình tự với mồi ITS5 có khoảng 650 nucleotide phía bên trái có chất lượng tốt, phần lại có chất lượng xấu (nhiễu) • Tất 20 mẫu giải trình tự với mồi ITS4, trái lại, có khoảng 100 nucleotide phía bên phải có chất lượng tốt, phần lại có chất lượng xấu (nhiễu) • Đối với tất 20 sản phẩm PCR, vị trí phân chia vùng có trình tự chất lượng tốt – xấu cặp giải trình giống minh họa mẫu Cacao-BB5 Hình Hiện tượng xuất giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR mà sản phẩm chứa vị trí có trình tự không đồng Hậu quả, DNA polymerase đọc trình tự tính từ phái hạ lưu vị trí không đồng Không giống nấm túi, nấm noãn oomyces Phytophthora có gen lưỡng bội Vị trí không đồng xem locus dị hợp tử, hậu sinh sản hữu tính loài Phytophthora nhóm dị tản (Heterothalic) > Cacao-PB5 ATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAAAACTTAGTTGGGGGTCTCT 11 TTCGGCGGCGGCTGCTGGCTTCATTGCTGGCGGCTGCTGTTGGGAGAGCTCTATCATG GCGAGCGTTTGGGCTTCGGTCTGAACTAGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTTTATAACT GATTATACTGTAGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTG GATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAAT TGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCC TGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTTCCTTCCGTGTA GTCGGTGGTGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTCTTCGGATCGGCTGT GAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCCAAAAGCGTGGCGTTGCT GATTGTGGAGGCTGCTTGCGTAGCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTCTGCTGTGGCGTTA ATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGAA TATTTCTTCAGCTGTGGTGGTATGARTTGGTGAACCGTAGCTATGTGAGCTTGGCTTT TGAATTGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGTCGATCC AT Hình Minh họa vị trí xuất locus dị hợp tử sản phẩm giải trình tự mẫu Cacao-BP5 Hướng giải trình tự mồi mũi tên Hình đánh dấu vị trí locus dị hợp tử Vị trí tương ứng trình tự cuối sản phẩm PCR đóng khung Tìm kiếm trình tự tương đồng Gen Bank Phytophthora.ID Dựa trình tự mẫu thu được, tìm kiếm sở liệu GenBank Phytophthora.ID Kết tìm kiếm cho thấy tất 10 mẫu Phtophthora Việt Nam gần gũi với loài Phytophthora palmivora với mức đồng trình tự 99 % toàn đoạn so sánh (Bảng 3) 12 Bảng Xác đinh danh tính loài mẫu Phytophthora ca cao dựa tìm kiếm sở liệu STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CCBP10.1 CCBP10.2 CCBP10.3 CCBP2 CCBP3 CCBP5 CCDN3 CCDN4 CCDN7 CCDN8 DL1.3 DL11.4 DL13.2 DL15.1 DL16.1 DL2.3 DL2.4 DL3.6 DL4.2 DL5.1 GenBank & Phytophthora-ID % đoạn so Mức đồng Loài gần gũi sánh trình tự (%) Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phân tích phả hệ Phân tích phả hệ dùng trình tự mẫu thu trình tự loài Phytophthora gần gũi xác định thông qua tìm kiếm sở liệu số loài Phytophthora đại diện khác cho kết tương tự (Hình 5) Tất 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao Việt Nam phân nhóm chặt chẽ với mẫu P palmivora GenBank hình thành cụm loài riêng biệt Thậm chí loài P megakarya, công bố gây hại ca cao thuộc nhóm phân loại (nhóm 4) với P palmivora hình thành nhóm độc lập với cụm loài 13 76 53 87 P palmivora-HQ237477 P palmivora-AM422704 Cacao-PB2 Cacao-PB10.1 Cacao-PB10.2 Cacao-PB3 P palmivora-GQ924478 61 P palmivora -HQ237480 P palmivora -GU111660 Cacao-DL11.4 Cacao-DL13.2 Cacao-PB10.3 P palmivora -GU111663 P palmivora -GU111661 60 P palmivora -GQ131800 Phytophthora CaCao-DN3 palmivora Cacao-DN8 Cacao-DL2.3 Cacao-DL2.4 Cacao-DL1.3 Cacao-DL5.1 Cacao-DL4.2 CaCao-DN4 Cacao-DL3.6 Cacao-DL16.1 Cacao-DN7 Cacao-DL15.1 P palmivora -AF266780 98 P palmivora -HQ643146 P palmivora -GQ398157 Cacao-PB5 P megakarya-HQ261611 P nicotiana-AF266776 P megasperma-HQ643281 P citricola-GU259136 P tropicalis-DQ464057-T 87 P capsici-DQ464056-T 50 75 P colocasiae-HQ261539 54 P meadii-AY251649 100 P botryosa-AF266784 57 P citrophthora-AF266785 P katsurae-FJ172258 P hevea-AF266770 100 0.02 Hình Cây phả hệ không rễ dựa chuỗi ITS cho thấy mối quan hệ 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao Việt Nam với loài Phytophthora Mã truy cập (Accesion number) mẫu GenBank rõ Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền Các số nốt giá trị boostrap tính theo % (500 lần lặp) theo phương pháp NJ (Neighbour Joining) Mẫu Việt Nam rõ chấm đen 14 Kết luận đề nghị 5.1 Kết luận • Đã giải trình tự toàn vùng ITS 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao • Phân tích trình tự phả hệ xác định tất 20 mẫu thuộc loài P palmivora • Phân tích trình tự cho thấy có sinh sản hữu tính quần thể P palmivora hại cac cao Việt Nam 5.2 Đề nghị Các loài cần lây nhiễm nhân tạo để xác định tác nhân gây bệnh thối đen ca cao Người viết báo cáo Chủ nhiệm đề tài TS Hà Viết Cường ThS Nguyễn Hồng Tuyên 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO Drenth, A and Guest, D.I (2004), Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, 235 pp Drenth, A and Sendall, B (2004), “Isolation of Phytophthora from infected Plant Tisue and soil, and Principles of Species Identification” In “Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia”, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, pp 94 – 102 Duncan, J., and Cooke, D (2002) Identifying, diagnosing and detecting Phytophthora by molecular methods Mycologist, Vol.16, Part 2: 59-66 Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996), “Phytophthora diseases worldwide”, St Paul, Minnessota, USA, American Phytopathological Society Press, 562 pp Guest, D.I.,Pegg, K.G.and Whiley, A.W.(1995), “Control of Phytophthora diseases of tree crops using trunk-injected phosphonates”, Horticultural Reviews, 17, p 299 - 330 Keane, P.J (1992), Disease of pest and cocoa: an overview In: Keane, P.J and Putter, C.A., ed., Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australasia Rome, Italya, Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO Plant Production and Protection Paper No.112 16 [...]... palmivora-AM422704 Cacao-PB2 Cacao-PB10.1 Cacao-PB10.2 Cacao-PB3 P palmivora-GQ924478 61 P palmivora -HQ237480 P palmivora -GU111660 Cacao-DL11.4 Cacao-DL13.2 Cacao-PB10.3 P palmivora -GU111663 P palmivora -GU111661 60 P palmivora -GQ131800 Phytophthora CaCao-DN3 palmivora Cacao-DN8 Cacao-DL2.3 Cacao-DL2.4 Cacao-DL1.3 Cacao-DL5.1 Cacao-DL4.2 CaCao-DN4 Cacao-DL3.6 Cacao-DL16.1 Cacao-DN7 Cacao-DL15.1 P palmivora... 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao • Phân tích trình tự và phả hệ đã xác định được tất cả 20 mẫu này đều thuộc loài P palmivora • Phân tích trình tự cũng cho thấy có sinh sản hữu tính trong quần thể P palmivora hại cac cao ở Việt Nam 5.2 Đề nghị Các loài này cần lây nhiễm nhân tạo để xác định tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Người viết báo cáo Chủ nhiệm đề tài TS Hà Viết Cường ThS Nguyễn Hồng... GATTATACTGTAGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTG GATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAAT TGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCC TGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTTCCTTCCGTGTA GTCGGTGGTGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTCTTCGGATCGGCTGT GAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCCAAAAGCGTGGCGTTGCT GATTGTGGAGGCTGCTTGCGTAGCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTCTGCTGTGGCGTTA ATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGAA... liệu và một số loài Phytophthora đại diện khác cũng cho kết quả tương tự (Hình 5) Tất cả 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao Việt Nam phân nhóm chặt chẽ cùng với các mẫu P palmivora trên GenBank và hình thành một cụm loài riêng biệt Thậm chí loài P megakarya, đã được công bố gây hại trên ca cao và thuộc cùng nhóm phân loại (nhóm 4) với P palmivora cũng hình thành một nhóm độc lập với cụm loài này 13... 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 3 Phân tích phả hệ Phân tích phả hệ dùng các trình tự mẫu thu được và các trình tự của loài Phytophthora gần gũi nhất được xác định. .. túi, nấm noãn oomyces như Phytophthora có bộ gen lưỡng bội Vị trí không đồng nhất có thể được xem là một locus dị hợp tử, hậu quả của sinh sản hữu tính của một loài Phytophthora nhóm dị tản (Heterothalic) > Cacao-PB5 ATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAAAACTTAGTTGGGGGTCTCT 11 TTCGGCGGCGGCTGCTGGCTTCATTGCTGGCGGCTGCTGTTGGGAGAGCTCTATCATG GCGAGCGTTTGGGCTTCGGTCTGAACTAGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTTTATAACT GATTATACTGTAGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTG... DL5.1 GenBank & Phytophthora- ID % đoạn so Mức đồng nhất Loài gần gũi nhất sánh trình tự (%) Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora palmivora 100 99 Phytophthora. .. Nam với các loài Phytophthora Mã truy cập (Accesion number) của các mẫu GenBank được chỉ rõ Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền Các số trên nốt là giá trị boostrap tính theo % (500 lần lặp) theo phương pháp NJ (Neighbour Joining) Mẫu Việt Nam được chỉ rõ bằng chấm đen 14 5 Kết luận và đề nghị 5.1 Kết luận • Đã giải trình tự toàn bộ vùng ITS của 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao • Phân tích... trên Gen Bank và Phytophthora. ID Dựa trên trình tự mẫu thu được, chúng tôi tìm kiếm trên cả 2 cơ sở dữ liệu GenBank và Phytophthora. ID Kết quả tìm kiếm cho thấy tất cả 10 mẫu Phtophthora Việt Nam gần gũi nhất với một loài duy nhất là Phytophthora palmivora với mức đồng nhất trình tự 99 % trên toàn bộ đoạn so sánh (Bảng 3) 12 Bảng 3 Xác đinh danh tính loài của các mẫu Phytophthora ca cao dựa trên tìm... -GQ398157 Cacao-PB5 P megakarya-HQ261611 P nicotiana-AF266776 P megasperma-HQ643281 P citricola-GU259136 P tropicalis-DQ464057-T 87 P capsici-DQ464056-T 50 75 P colocasiae-HQ261539 54 P meadii-AY251649 100 P botryosa-AF266784 57 P citrophthora-AF266785 P katsurae-FJ172258 P hevea-AF266770 100 0.02 Hình 5 Cây phả hệ không rễ dựa trên chuỗi ITS cho thấy mối quan hệ của 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao ... Cacao-DL13.2 Cacao-PB10.3 P palmivora -GU111663 P palmivora -GU111661 60 P palmivora -GQ131800 Phytophthora CaCao-DN3 palmivora Cacao-DN8 Cacao-DL2.3 Cacao-DL2.4 Cacao-DL1.3 Cacao-DL5.1 Cacao-DL4.2 CaCao-DN4... cytochrome oxidase I II ty thể Để xác định xác tên loài nấm gây hại, xin thực chuyên đề: Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân gây bệnh thối đen ca cao thị phân tử Tài liệu tham khảo Một số phương... cụm loài 13 76 53 87 P palmivora-HQ237477 P palmivora-AM422704 Cacao-PB2 Cacao-PB10.1 Cacao-PB10.2 Cacao-PB3 P palmivora-GQ924478 61 P palmivora -HQ237480 P palmivora -GU111660 Cacao-DL11.4 Cacao-DL13.2