TRNG I HC CN TH KHOA NễNG NGHIP B MễN KHOA HC CY TRNG Giỏo trỡnh K THUT IN DI Cỏn b biờn son: tin s Vế CễNG THNH 12-2004 LI M U Trong vic ng dng cụng ngh sinh hc vo lnh vc chuyờn mụn ca tng ngnh núi chung v di truyn chn ging núi riờng thỡ mụn hc k thut in di úng gúp vai trũ quan trng nhm giỳp ngi phõn tớch phỏt hin c cỏc bin d, thun ht ging, a dng di truyn, mc phõn t DNA, enzyme hay protein Giỏo trỡnh ny nhm trang b cho cỏc sinh viờn bc i hc, cao hc, nghiờn cu sinh, v cỏn b nghiờn cu thuc nhiu ngnh nh trng trt, chn nuụi, thy sn, cụng ngh sinh hc, bo v thc vt, y khoa nm bt c s lý thuyt v dng vo cụng tỏc chuyờn mụn ca mỡnh Nhm ỏp ng yờu cu cp thit ca bn c v sinh viờn hin nay, tỏc gi ó c gng biờn san giỏo trỡnh theo hng lý thuyt thc hnh nhm giỳp c gi nhanh chúng tip cn mt s k thut in di ph bin trờn th gii, qua ú ngi c cú th tip cn c s lý lun v cú nng lc c v gii thớch c phn no cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ó ng ti trờn cỏc chớ, bi bỏo v ngũai nc v lnh vc ng dng cụng ngh sinh hc, nht l lónh vc a dng sinh hc v di truyn chn ging Xin chõn thnh cỏm n hi ng khoa hc ca B mụn Khoa Hc Cõy Trng, khoa Nụng Nghip & Sinh Hc ng Dng, phũng o to Trng i Hc Cn Th ó tớch cc to iu kin cho vic xut bn giỏo trỡnh ny Tỏc gi rt mong c cỏc ng giỏo viờn, sinh viờn v cỏc bn c, quỏ trỡnh s dng, s úng gúp cho nhiu ý kin giỳp cho vic biờn san ln sau c tt hn Tỏc gi MC LC Ta Trang Chng 1: K thut in di Protein 1.1 Cỏc dung dch m 1.2 Thit b in di 1.3 Quỏ trỡnh in di 1.4 Cỏc loi gel Polyacrylamide 1.5 in di Protein 1.6 Phỏt hin cỏc protein gel SDS Polyacrylamide 1.7 Ghi nhn kt qu v sy gel 1.8 Cỏc ng dng ca SDS-PAGE 1.9 in di gel n gin 11 1.10 in di gel gradient 11 1.11 Isoelectric focusing (IEF) 12 Chng 2: K thut in di Isoenzyme 2.1 Gii thiu 18 2.2 Phng tin & phng phỏp 19 2.3 Phng phỏp c lng tn s allele 24 2.4 Phng phỏp c lng bin d di truyn 32 2.5 Phng phỏp tớnh phõn húa di truyn 34 Chng 3: K thut in di ADN 3.1 Vi quỏ trỡnh ly trớch ADN ph bin 42 3.2 Chun b gel agarose 49 3.3 nh lng ADN 50 3.4 Phng phỏp minigel 50 3.5 Chp hỡnh kt qu in di 50 3.6 Mt s phng phỏp PCR ph bin 50 Chng 4: Phng phỏp c lng tớnh a hỡnh bờn v gia cỏc qun th 4.1 nh ngha 59 4.2 Tớnh a dng v tớnh phõn húa mc allele 62 4.3 Tớnh a dng v tớnh phõn húa mc nucleotide 64 CHNG K THUT IN DI PROTEIN Cỏc dung dch m Sinh vt v cỏc t bo cú th chu ng c s thay i v pH ca mụi trng bờn ngoi Ngc li, cỏc quỏ trỡnh t bo li mn cm vi s thay i pH v xy mt mụi trng m pH c hiu chnh cn thn Tuy nhiờn, cú s bin thiờn pH gia cỏc t bo nh b mt cỏc t bo Cỏc quỏ trỡnh xy gia cỏc t bo ch yu l pH trung tớnh Ti pH trung tớnh thng cỏc quỏ trỡnh bin dng xy vi tc ti a Tuy nhiờn, cỏc hydrolases cua lysosomes cú hot tớnh cao nht vựng pH (ti pH ny a s t bo b cht) Dch tiờu hoỏ (gastric juice) ti d dy ca ng vt hu nh cú hot tớnh ti a vi pH 1, ti pH ny enzyme pepsin ng tiờu hoỏ ti a protein Cỏc h thng dung dch m ch yu c phỏt hin dch t bo l phosphate, bicarbonate, amino acid, v protein Tớnh mn cm cỏc quỏ trỡnh sinh hc vi pH cú l l mt vi nguyờn nhõn Quỏ trỡnh cú th b xỳc tỏc cỏc ion hydrogen hoc cú th ion hydrogen l cht phn ng hay l sn phm S thay i pH lm thay i s phõn b ca mt hp cht hay ion xuyờn qua mng, cú th l tớnh thm (permeability) ca mng t bo Ging nh cỏc cu trỳc sinh hc v cỏc phõn t khỏc cỏc mng t bo cú cỏc nhúm cú kh nng ion trng thỏi chớnh xỏc ca ion hoỏ nh hng n cu hỡnh phõn t nờn nh hng n hot tớnh sinh hc iu ny c bit ỳng vi trng hp protein v enzyme Vi protein tu thuc vo s thay i nh v pH ca mụi trng hon thnh chc nng sinh hc ca chỳng Mt dung dch m chng li s thay i nng ion hydrogen thờm acid hay cht kim Tớnh chng li ny c gi l hot ng m (buffer action) Tm quan trng ca hot ng m gi l kh nng m () v c c lng bng lng base mnh cn cú lm thay i mt n v: = db/ d(pH) ú d(pH) l s gia tng pH thờm db ca base Trong thc hnh, cỏc dung dch m thng bao gm hn hp mt acid hay base yu v mui ca nú, thớ d nh acetic acid v sodium acetate (theo thut ng ca Bronsted v Lowry, l hn hp mt acid yu v base liờn hp ca nú) Trong mt dung dch acid yu (RCOOH) v mui ca nú (RCOO-), ion hydrogen c thờm vo b trung ho cỏc anion ca mui, ú nú cú hot tớnh nh l mt base yu, v ngc li thờm cỏc ion hydrogen b loi i trung ho acid Nh vy, kh nng m ca mt acid c bit v base liờn hp ca nú s ti a nng ca chỳng bng Thớ d pH=pKa ca acid Kh nng m cng tu thuc vo nng tng s ca acid v mui cng nh t l tng i - nng tng cng cng ln thỡ kh nng m cng ln Nng thụng thng ca acid v mui cỏc dung dch m dao ng khong 0,05 - 0,20M v cỏc hn hp cú kh nng m chp nhn c khong pH = pKa Tiờu chun dung dch m nghiờn cu sinh hc cú th tng kt nh sau: (1) cú kh nng m khong pH yờu cu; (2) cú tinh khit cao; (3) ho tan nc cao v khụng thm vi cỏc mng sinh hc; (4) n nh vi enzyme v thu phõn (5) cú pH ớt b nh hng nng ca chỳng, nhit v nh hng mụi trng cú thnh phn ion hoc mui; (6) khụng c; (7) ch cú cỏc dng phc vi cation ho tan; (8) khụng b hp thu vựng ỏnh sỏng thy c hay tia cc tớm Bng Giỏ tr pKa ca mt s acid v base thng dựng dung dch m Acid hoc base Acetic acid Barbituric acid Carbonic acid Citric acid Glycylglycine Hepesa Phosphoric acid Phthalic acid pKa (25oC) 4,75 3,98 6,10; 10,22 3,10; 4,76; 5,40 3,06; 8,13 7,50 1,96; 6,70; 12,30 2,90; 5,51 Pipesb Succinic acid Tartaric acid Trisc 6,80 4,18; 5,56 2,96; 4,16 8,14 a Hepes: N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid Pipes: piperazine-N-N'-bis(2-ethanesulphonic acid) c Tris: 2-amino-2hydroxymethylpropane-1,3-diol b RCOOH = RCOO- + H+ Acid Base liờn hp Hng s ion Ka c biu th theo cụng thc sau õy: Ka = [RCOO-] [H+]/ [RCOOH] Trong trng hp base yu nh amine ion theo phng trỡnh RNH2 + H20 = RNH+3 + 0HBase Acid liờn hp Hng s ion cú th biu th theo giỏ tr Kb: Kb = [RNH+3] [0H-]/ [RNH2] [H20] thụng thng ngi ta biu th tr s Ka theo acid liờn hp Ka = [RNH2] [H+]/ [RNH+3] Trong cỏc trng hp nh vy, tớch s Ka v Kb bng vi Kw ca nc Trong thc hnh, tr s Ka cú giỏ tr rt nh nờn ngi ta thng dựng tr s pKa, vi pKa = -log10Ka Vi base yu, pKa +pKb = 14; acid yu c tớnh nh sau: pH = pKa + log10 [base liờn hp]/[acid] hoc pH = pKa + log10 [dng ion]/[dng khụng ion] Trong trng hp base yu phng trỡnh c biu th theo acid liờn hp nh sau: pH = pKa + log10 [base]/[acid liờn hp] hoc pH = pKa + log10 [ dng ion]/[dng ion] Thit b in di Cú nhiu thit b in di ó c dựng phõn tỏch protein trờn nn gel polyacrylamide; hu ht cỏc thit b cú dng hỡnh ng (tube) hay bn (slab) Gel dng bn cú im thun li l chỳng ta cú th so sỏnh hn hp cỏc protein vi cựng mt gel nờn loi gel ny c dựng rt thụng dng phõn tớch sinh hoỏ v sinh hc phõn t Gel dng bn cú cu to bờn ngoi l hai cp king thu tinh, mt mt c ch to sn g cao t mm n 1.5 mm hai bờn nhng phớa ỏy trng, xung quanh g ta dựng mt ming roan (spacer) bng plastic cú dy tng ng bao quanh Khi gel bng agarose hay polyacrylamide lng, sau ú t lc (comb) xen gia hai ming kớnh thu tinh phớa trờn to ging (well) Khi gel t v trc lp vo b khung in di, thỏo kp phớa ỏy c s phõn tỏch cỏc protein khỏc hn hp ly trớch c tt, ging nh sc ký lc gel (gel-filtration chromatography), ta nờn dựng mt lng protein nh iu ny l lp gel cụ (stacking gel) cú chiu di ngn phớa trờn gel phõn tỏch (separating gel), lp gel cụ ny cú c im l cỏc protein ca mu em phõn tớch trung v cho phộp phõn tỏch cỏc protein bao quanh vi kớch c khỏc Lp gel cụ c trựng hp vi t l (%) acrylamide v bisacrylamide thp cú c l to, dung dch m l Tris-HCl cú pH 6,8 lp gel phõn tỏch cú t l (%) acrylamide cao hn vi dung dch m Tris-HCl cú pH 8,8 Dung dch m in di phớa trờn v phớa di b cha thng cú pH 8,3 v cht glycine Cựng vi hn hp protein vi pH 6,8 ngi ta thờm mt ớt thuc nhum theo dừi quỏ trỡnh in di thuc nhum bỏm vo protein nh nht Quỏ trỡnh in di Khi mt in trng c t dung dch cú cha ion, mt dũng in s phỏt sinh ú cỏc anion di chuyn hng v cc dng (anode) v cỏc cation di chuyn hng v cc õm (cathode), Mt dung dch cha vi ion nh nc tinh khit hay benzene s cú sc khỏng cao v s mang dũng in rt thp in di l mt quỏ trỡnh m cỏc phõn t mang in tớch c tỏch mt in trng kh nng di chuyn khỏc ca cỏc phõn t Cỏc yu t nh hng n kh nng chuyn ng (mobility) ca mt phõn t in trng bao gm in tớch ca phõn t q v gradient ca in trng E, c hai cựng cung cp vi to lc di chuyn ion, v sc khỏng ma sỏt ca mụi trng f lm thỳc y s di chuyn Kh nng chuyn ng c nh ngha l tc di chuyn vi mt gradient hiu th 1V/cm v c c lng bng cm2/giõy/volt Trong thc hnh ngi ta thng xỏc nh kh nng chuyn ng tng i ca protein Rf, l t s khong cỏch ca mi protein di chuyn so vi khong cỏch ca cht nhum anion nh nht (vch ỏnh du) T l lng vi in tớch (charge-to-mass ratio) ca cht nhum cao to cho cht nhum di chuyn phớa trc cỏc protein Rf = q.E/f Cỏc protein cú mt in tớch thun bt k pH nờn t gel mt in trng , cỏc protein s di chuyn hng v cc mang in tớch trỏi du a s cỏc protein cú im ng in pI = 3-10, ph bin l pI [...]... không phải do riêng kích cỡ gây ra, và kỹ thuật thường không thích hợp để xác định trọng lượng phân tử Một vài loại điện di đơn giản chuyên biệt như điện di giới hạn cỡ lỗ là thích hợp cho việc xác định khối lượng phân tử của các protein đơn phân tự nhiên Kỹ thuật thì tương tự như kỹ thuật điện di đơn giản như đã đề cập phần trên, ngoại trừ gel phân tách được đổ với gradient polyacrylamide từ 30% ở phía... và sự ly giải protein có giới hạn Tuy nhiên, giới hạn của kỹ thuật nầy là giá mua các chất ampholite và thiết bị chuyên biệt tương ứng rất đắt Tuy vậy, nếu phối hợp với kỹ thuật SDS-PAGE với phương pháp điện di hai chiều thì kỹ thuật IEF đóng vai trò cực kỳ quan trọng để xác định được đồng thời nhiều loại protein 12 Điện di gel hai chiều Điện di gel hai chiều là sự phối hợp của IEF và SDS-PAGE Một gel... linh động của protein là do điện tích của chúng, điện tích tuỳ thuộc vào pH Tại pH đẳng điện của nó (pI), một protein không mang điện tích và do đó nó không di chuyển trong điện trường điện di Đặc tính này được khai thác bằng kỹ thuật IEF do khả năng tách theo các giá trị pI Để phân tích IEF, phương thức thông thường là dùng ống thuỷ tinh có đường kính nhỏ để đổ gel Gradient pH được thiết lập bên trong... ampholite di chuyển về một vị trí mà tại đây giá trị pH bằng với giá trị pI, tạo ra một gradient pH trong gel Kế đến mẫu protein cần phân tích được thêm vào, và điện di được tiếp tục cho đến khi cường độ dòng điện gần bằng không Tại điểm nầy, mỗi thành phần phải di chuyển đến vị trí trong gel nơi có giá trị pH bằng với giá trị pI Dùng kỹ thuật IEF là hữu ích để xác định giá trị pI của các protein Kỹ thuật. .. đệm điện di cũng không được dùng Sự di chuyển của các protein trong gel đơn giản là do cả hai điện tích thuần và kích cỡ protein Thường gel phân tách có pH= 8-9 tuỳ thuộc vào protein cần thấy Các băng protein được thấy bằng cách dùng chất nhuộm giống như phương pháp SDS-PAGE Mặc dù năng lực của điện di đơn giản không lớn bằng phương pháp SDSPAGE nhưng có vài ứng dụng kỹ thuật cũng hữu ích Thí dụ, kỹ thuật. .. loại protein theo điện di theo phương pháp SDSPAGE Hình 1.3 Phổ điện di protein loại albumin (bên trái) và globulin (bên phải) trong hạt bắp bình thường (N) và opaque-2 Mũi tên chỉ các protein ở bắp opaque-2 bị thay đổi (C.M Wilson 1987) Hinh 1.4 Hệ thống đánh số băng protein theo phương pháp IEF trên 6 dòng cận huyết bắp (Wilson 1985) 15 Hình 1.5 Phổ điện di của hai kỹ thuật điện di protein theo IEF... nhau nhưng chúng lại có cùng tính di chuyển (d) Vấn đề đặt ra là sự đa hình allozyme là thích nghi hay trung tính, vấn đề nầy còn đang tranh cải 18 Đa số các phương pháp điện di có thể áp dụng để phân tích các isozyme Điện di gel nằm ngang là hướng thường áp dụng vì kỹ thuật nầy thường dùng trong các khảo sát quần thể và dễ làm Hai môi trường gel được dùng trong kỹ thuật là: polyacrylamide và tinh bột... quá trình tinh sạch protein bởi vì phưong pháp điện di cho phép chúng ta thấy được sự lẫn tạp có thể có Chúng ta có thể phân biệt sự lẫn tạp do một lượng nhỏ do nhiều loại protein, hoặc một lượng khá lớn protein Với trường hợp sau, dùng phương pháp điện di cho phép chúng ta thiết lập các điều kiện phân tách tối hảo từ sự lẫn tạp gây ra Do nhận di n các lẫn tạp thường chưa biết, phương pháp điện di là... tạo màu Điện di gel đơn giản cũng tỏ ra hữu ích trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng của enzyme Hiệu chỉnh tính đồng hoá trị của protein mà nó làm thay đổi điện tích và/hay khối lượng protein thường có thể được phát hiện bằng điện di gel đơn giản Thí dụ, uridylyl hoá và de-uridylyl hoá của protein tín hiệu biến nạp homotrimeric E coli PII được kiểm tra bằng điện di gel đơn giản Mặc dù lượng uridine... chỉnh đồng hoá trị giúp thêm các điện tích vào protein, gây nên sự thay đổi tỷ số khối lượng -điện tích và do đó thay đổi tính linh động điện di Phương pháp điện di gel đơn giản phát hiện được các chất trung gian của protein II như protein tam phân (trimeric protein) có ba nhóm uridylyl Để tinh sạch lượng nhỏ protein của một enzyme đơn phân (oligomeric enzyme) bằng điện di đơn giản và sau đó xác định ... linh động protein điện tích chúng, điện tích tuỳ thuộc vào pH Tại pH đẳng điện (pI), protein không mang điện tích không di chuyển điện trường điện di Đặc tính khai thác kỹ thuật IEF khả tách... kết sấy gel 1.8 Các ứng dụng SDS-PAGE 1.9 Điện di gel đơn giản 11 1.10 Điện di gel gradient 11 1.11 Isoelectric focusing (IEF) 12 Chương 2: Kỹ thuật điện di Isoenzyme 2.1 Giới thiệu 18 2.2 Phương... mang dòng điện thấp Điện di trình mà phân tử mang điện tích tách điện trường khả di chuyển khác phân tử Các yếu tố ảnh hưởng đến khả chuyển động (mobility) phân tử điện trường bao gồm điện tích