BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY KERATIN TỪ CHẤT THẢI LÔNG GIA SÚC – GIA CẦM TẠI BA QUẬN THUỘC THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN VƯƠNG THÀNH VŨ MSSV:3092455 LỚP:CNSH K35 Cần Thơ, Tháng 8/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) TS Bùi Thị Minh Diệu SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Vương Thành Vũ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho suốt quá trình học tập tại trường Đại học Cần thơ Đặc biệt cảm ơn TS Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho những lời khuyên hết sức quý báu suốt thời gian thực hiện đề tài Thầy Trần Vũ Phương, cố vấn học tập khóa 35, đã quan tâm và tạo điều kiện tốt cho thời gian thực hiện luận văn Cán bộ, anh chị em phòng thí nghiệm Sinh Học Phân tử Thực vật đã tạo điều kiện về các trang thiết bị quá trình thực hiện luận văn cũng chia sẽ kinh nghiệm để thực hiện tốt luận văn này Gia đình và bạn bè là nguồn lực và động viên Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT TÓM TẮT Keratin loại protein khó phân hủy thành phần chủ yếu lông gia súc, gia cầm Từ 10 mẫu đất nước thu lò giết mổ gia súc, gia cầm trại nuôi gà ba quận Cái Răng, Ô Môn Ninh Kiều thuộc Thành phố Cần Thơ, phân lập 11 dòng vi khuẩn có khả phát triển môi trường bột lông gia cầm Tất 11 dòng tạo vòng thủy phân môi trường sữa với đường kính từ 1,6 đến 7,2 mm thể hoạt tính enzyme keratinase từ 18,4 đến 79,3 U/ml Tất dòng vi khuẩn có khả làm giảm khối lượng bột lông gia cầm môi trường lỏng từ 41,9 đến 54,1%; 7,9 đến 32% khối lượng bột lông gia súc môi trường lỏng sau ngày nuôi cấy Sau 10 ngày nuôi lắc, 11 dòng vi khuẩn làm tách rời sợi lông khỏi sợi lông ống, dòng CT5 CT8 cho kết hiệu 80 75% Các từ khóa: keratin, keratinase, lông gia cầm, lông gia súc, vòng thủy phân, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT i LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT .i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG .iv DANH SÁCH HÌNH .v TỪ VIẾT TẮT vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về keratin 2.2 Một số loại rác thải chứa keratin 2.3 Sơ lược về enzyme keratinase 2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển vi sinh vật 2.5 Tình hình nghiên cứu thế giới và ở Việt Nam .4 2.5.1 Trên thế giới 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.2 Vật liệu 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ .7 3.1.4 Hóa chất 3.1.5 Môi trường phân lập .8 3.2 Phương pháp nghiên cứu Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT 3.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả phân hủy keratin 3.2.2 Đánh giá hoạt tính protease các dòng vi khuẩn .11 3.2.3 Đánh giá hoạt tính keratinase các dòng vi khuẩn (Areeb et al., 2012) 12 3.2.3.1 Tổng hợp azo – keratin 12 3.2.3.2 Chuẩn bị enzyme keratinase thô từ môi trường bột lông 13 3.2.3.3 Đánh giá hoạt tính keratinase 13 3.2.4 Đánh giá khả phân hủy bột lông gia cầm các dòng vi khuẩn .13 3.2.5 Đánh giá khả phân hủy bột lông gia súc (lông heo) các dòng vi khuẩn 14 3.2.6 Đánh giá khả phân hủy lông gà nguyên các dòng vi khuẩn 15 3.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn phân hủy chất thải lông .16 4.1.1 Kết quả phân lập 16 4.1.2 Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào vi khuẩn 16 4.1.3 Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn 17 4.2 Kết quả đánh giá hoạt tính protease các dòng vi khuẩn .18 4.3 Kết quả đánh giá hoạt tính enzyme keratinase các dòng vi khuẩn 19 4.4 Đánh giá khả phân hủy bột lông gia cầm các dòng vi khuẩn 20 4.5 Đánh giá khả phân hủy bột lông gia súc (lông heo) các dòng vi khuẩn 21 4.6 Đánh giá khả phân hủy lông gà nguyên các dòng vi khuẩn 22 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .24 5.1 Kết luận .24 5.2 Đề nghị 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO .25 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng Thành phần hóa chất môi trường Milk agar Bảng Thành phần hóa chất môi trường bột lông gia cầm Bảng Đặc điểm hình thái và kích thước khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được .16 Bảng Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn phân lập được 17 Bảng Đường kính thủy phân các dòng vi khuẩn môi trường sữa sau 24 giờ ủ ở 37˚C 18 Bảng Kết quả đo hoạt tính enzyme keratinase 19 Bảng Khả phân hủy lông gia cầm các dòng vi khuẩn 20 Bảng Khả phân hủy lông gia súc các dòng vi khuẩn 21 Bảng Phụ lục khả phân hủy casein các dòng vi khuẩn sau 24 giờ Bảng 10 Phụ lục kết quả đo hoạt tính enzyme keratinase Bảng 11 Phục lục thí nghiệm phân hủy bột lông gia cầm Bảng 12 Phụ lục thí nghiệm phân hủy bột lông gia súc (lông heo) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình Vòng thủy phân casein dòng vi khuẩn CT4 sau 24 giờ ủ ở 37˚C 18 Hình Khả phân hủy sợi lông gia cầm dòng vi khuẩn CT5 22 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT CFU Colony-forming unit FMA Feather meal agar H Hour SMA Skim milk agar STT Số thứ tự TCA Trichloroacetic acid Vi khuẩn/ml Vi khuẩn một ml Vòng/phút Vòng phút UV ultraviolet U Unit U/ml Đơn vị hoạt tính enzyme một ml Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Dân số thế giới gia tăng rất nhanh qua năm, theo thống kê cục điều tra dân số Mỹ đến tháng năm 2012 dân số thế giới là 7.01 tỷ người (nguồn: viwikipedia.org 26/6/2013) Dân số gia tăng đặt một thách thức là phải đảm bảo vấn đề lương thực cho tất cả mọi người Sự phát triển mạnh ngành chăn nuôi là một yếu tố quan trọng góp phần giải quyết vấn đề lương thực toàn cầu Tuy nhiên, ngành chăn nuôi phát triển mạnh lại gây nhiều ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, đòi hỏi người phải tìm biện pháp xử lý thích hợp Trong số loại chất thải tạo quá trình chăn nuôi và giết mổ gia súc – gia cầm phế phẩm lông khó xử lý nhất; ngày một lượng lớn chất thải lông chưa qua xử lý được thải trực tiếp môi trường, thành phần loại chất thải chủ yếu là keratin, một hợp chất cao phân tử rất khó bị phân hủy cấu trúc phức tạp và vì thế tích tụ dần dẫn đến ô nhiễm môi trường Để giải quyết vấn đề này, rất nhiều phương pháp hóa học và vật lý đã được áp dụng, nhiên, các phương pháp này vẫn chưa đạt được hiệu quả và tiêu tốn nhiều lượng Công nghệ sinh học phát triển đã giúp mở một hướng mới để giải quyết vấn đề này, sử dụng các loài vi sinh vật có hoạt tính enzyme keratinase để phân hủy các nguồn chất keratin Phương pháp này không những giúp giải quyết hiệu quả vấn đề ô nhiễm môi trường mà sản phẩm sinh sau quá trình xử lý làm thức ăn chăn nuôi, phân sinh học Với mục tiêu đa dạng các dòng vi sinh vật có khả phân hủy chất keratin nói chung cũng lông gia súc, gia cầm nói riêng nên đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả phân hủy keratin từ chất thải lông gia súc – gia cầm tại ba quận thuộc thành phố Cần Thơ” được thực hiện 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả phân hủy keratin từ chất thải lông gia súc, gia cầm ở thành phố Cần Thơ Đánh giá khả phân hủy chất chứa keratin (lông gia súc, gia cầm) các dòng vi khuẩn phân lập được và chọn lọc dòng vi khuẩn có khả phân hủy keratin cao Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzyme protease dựa sự phân hủy casein môi trường sữa là một phương pháp đơn giản để kiểm tra hoạt tính protease ngoại bào Như vậy, tất cả 11 dòng vi khuẩn phân lập được đều hứa hẹn khả phân hủy chất thải lông Để làm sáng tỏ cho điều này cần thực hiện thí nghiệm đánh giá hoạt tính enzyme keratinase 4.3 Kết đánh giá hoạt tính enzyme keratinase dòng vi khuẩn Kết quả khảo sát hoạt tính hoạt tính enzyme keratinase cho thấy các dòng vi khuẩn cho hoạt tính protease thì cũng cho thấy có hoạt tính keratinase (Bảng và 6) Tuy nhiên, hoạt tính keratinase không tỉ lệ thuận với hoạt tính protease các dòng vi khuẩn Nguyên nhân là sự khác về bản chất enzyme và chất đã được sử dụng Sau ngày nuôi cấy môi trường bột lông vũ Dịch nuôi vi khuẩn được lọc giấy lọc để loại bỏ sinh khối vi khuẩn và bột lông vũ Dung dịch thu được dùng là dịch enzyme thô để khảo sát hoạt tính keratinase theo phương pháp Areeb et al (2012) Bảng Kết đo hoạt tính enzyme keratinase Dòng Hoạt tính enzyme keratinase (U/ml) Dòng Hoạt tính enzyme keratinase (U/ml) CT1 28,3d CT7 56,4b CT2 71,5a CT8 22,9de CT3 79,3a CT9 38,3c CT4 78,4a CT10 18,4e CT5 60,6b CT11 53,7b CT6 59,3b Ghi chú: Các giá trị hoạt tính enzyme keratinase có mẫu tự theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5% Hoạt tính enzyme keratinase 11 dòng vi khuẩn đo được biến thiên từ 18,4 đến 79,3 U/ml Như vậy, có thể thấy 11 dòng vi khuẩn phân lập được đều có hoạt tính enzyme keratinase ngoại bào Ba dòng vi khuẩn CT2, CT3, CT4 cho hoạt tính enzyme keratinase đo được cao có ý nghĩa so với hoạt tính enzyme các dòng vi khuẩn còn lại Theo Gupta và Ramnani (2006), sự phân hủy chất keratin được chia thành Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT hai giai đoạn là: phá hủy cầu nối disulfite và phân hủy chuỗi polypeptide, đó tế bào đóng vai trò quan trọng việc phá hủy các cầu nối disulfite Vì vậy, để biết chính xác khả phân hủy chất thải lông cần tiến hành các thí nghiệm điều kiện có mặt các tế bào vi khuẩn 4.4 Đánh giá khả phân hủy bột lông gia cầm dòng vi khuẩn Các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme keratinase đều thể hiện khả phân hủy bột lông gia cầm Tuy nhiên, khả phân hủy bột lông gia cầm không tỷ lệ thuận với hoạt tính enzyme keratinase các dòng vi khuẩn Kết quả thí nghiệm cho thấy 11 dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả phân hủy bột lông gia cầm Dòng vi khuẩn cho kết quả phân hủy thấp nhất là CT2 (41,9 %) và dòng CT7 cho kết quả phân hủy cao nhất (54,1 %) (Bảng 7) Bảng Khả phân hủy lông gia cầm dòng vi khuẩn STT Dòng CT1 Phần trăm Phần trăm STT Dòng 52,5ab CT7 54,1a CT2 41,9c CT8 52,2ab CT3 50,2ab CT9 50,6ab CT4 47,3bc 10 CT10 49,2ab CT5 53,3ab 11 CT11 53,6ab CT6 52,5ab 12 DC 1,8d phân hủy (%) phân hủy (%) Ghi chú: Số liệu thể bảng trung bình ba lần lặp lại, giá trị trung bình có mẫu tự theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5% Kết quả phân tích thống kê số liệu cho thấy khả phân hủy bột lông gia cầm các dòng vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa với và cao nhiều so với mẫu đối chứng không có chủng vi khuẩn Dòng CT7 có khả phân hủy cao nhất 54,1% khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với các dòng còn lại Dòng CT2 có kết quả phân hủy thấp nhất 41,9% vẫn cao rất nhiều lần so với mẫu đối chứng Các dòng vi khuẩn khác cho kết quả phân hủy từ 47,4 đến 53,6% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Kết quả thí nghiệm thu được thấp so với kết quả các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất và lông vũ nghiên cứu Nguyễn Huy Hoàng et al (2010) cho hiệu quả phân hủy từ 52,40% đến 98,45% sau một tuần lắc ủ ở 30˚C Thành phần môi trường và nhiệt độ là hai yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến sự tổng hợp enzyme keratinase vi khuẩn Sự tối ưu hóa hai yếu tố này có thể giúp nâng cao hiệu quả tổng hợp keratinase lên đến 40 lần (Brandelli, 2007) 4.5 Đánh giá khả phân hủy bột lông gia súc (lông heo) dòng vi khuẩn Các dòng vi khuẩn thể hiện khả phân hủy bột lông gia cầm thì cũng thể hiện khả phân hủy bột lông gia súc Tuy nhiên, khả phân hủy lông gia súc không tỷ lệ thuận với khả phân hủy lông gia cầm Sau một tuần chủng vi khuẩn và lắc ủ ở 37˚C, khối lượng lông gia súc giảm từ 7,9% đến 32,0% (Bảng 8), khác biệt so với mẫu đối chứng Kết quả này cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được có khả phân hủy lông gia súc và hòa tan một phần vào dung dịch Trong đó, dòng CT5 và dòng CT8 là hai dòng phân hủy lông gia súc cao nhất 11 dòng được khảo sát Bảng Khả phân hủy lông gia súc dòng vi khuẩn STT Dòng CT1 Phần trăm Phần trăm STT Dòng 20,4b CT7 10,2de CT2 7,9e CT8 28,4a CT3 13,5cd CT9 12,8cd CT4 8,6e 10 CT10 21,1b CT5 32,0a 11 CT11 14,3c CT6 15,4c 12 DC 2,1f phân hủy (%) phân hủy (%) Ghi chú: Số liệu thể bảng trung bình ba lần lặp lại, giá trị trung bình có mẫu tự theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5% Kết quả phân tích thống kê số liệu cho thấy khả phân hủy lông gia súc dòng vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa với và khác biệt so với đối chứng Dòng vi khuẩn CT5 có kết quả phân hủy cao nhất (32 %) không có khác biệt so với các dòng CT8 (28,4 %) Dòng vi khuẩn CT2 cho kết quả phân hủy thấp nhất (7,9 %) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT không có khác biệt so với các dòng CT4 (8,6 %) Các dòng còn lại cho kết quả phân hủy từ 10,2 đến 21,1% 4.6 Đánh giá khả phân hủy lông gà nguyên dòng vi khuẩn Kết quả theo dõi khả làm gãy rụng lông sợi lông gà nguyên 11 dòng vi khuẩn sau 10 ngày nuôi lắc cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả làm gãy rụng sợi lông Trong đó, dòng CT5 cho kết quả tốt nhất bắt đầu làm rụng lông từ ngày thứ ba sau chủng và 80% lông bị rụng sau 10 ngày nuôi lắc Kế đến là dòng CT8 bắt đầu làm rụng lông từ ngày thứ tư và sau 10 ngày khoảng 75% lông bị rụng Các dòng CT1, CT2, CT4, CT7, CT9 cho kết quả tương đối bắt đầu làm rụng lông từ ngày thứ năm, và làm rụng khoảng 50% số lông sau 10 ngày nuôi lắc Các dòng còn lại là CT3, CT6, CT10, CT11 yếu nhất với thời gian bắt đầu làm rụng lông từ ngày thứ năm, sau 10 ngày nuôi lắc chưa đến 40% số lông bị làm rụng sợi lông ống A B Hình Khả phân hủy sợi lông gia cầm dòng vi khuẩn CT5 (A): Trước chủng (B): 10 ngày sau chủng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Tóm lại, tùy vào mục đích để thu lượng enzyme cao, hay ứng dụng để phân hủy lông, có thể chọn những dòng vi khuẩn cho phù hợp Nếu muốn thu được lượng enzyme cao nên chọn dòng CT2, CT3 và CT4 Mặt khác nếu muốn ứng dụng để phân hủy lông thì chọn hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 là hai dòng vi khuẩn có khả phân hủy chất keratin hiệu quả nhất số 11 dòng vi khuẩn phân lập được, khả phân hủy chất bột lông gia cầm hai dòng vi khuẩn này không khác biệt so với các dòng vi khuẩn còn lại khả phân hủy lông gia cầm nguyên và lông gia súc thì tốt hẳn Tuy nhiên hoạt tính enzyme keratinase hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 so với các dòng vi khuẩn còn lại thì thấp rất nhiều Theo Gupta Ramnani (2006), khả phân hủy keratin phụ thuộc nhiều vào enzyme keratinase tế bào vi khuẩn tiết tế bào vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng quá trình phân hủy này, trình phân hủy keratin được chia thành hai giai đoạn phá hủy các cầu nối disulfide và phân hủy protein, tế bào sống giữ vai trò quan trọng việc hỗ trợ các enzyme ngoại bào phá hủy các cầu nối disulfide Từ đó, có thể thấy hoạt tính enzyme keratinase cao chưa thể khẳng định khả phân hủy chất keratin vi khuẩn cũng cao mà cần được thí nghiệm điều kiện có sự hiện diện tế bào vi khuẩn Với mục tiêu đề tài là chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy chất keratin cao thì dòng vi khuẩn CT5 và CT8 là hai dòng vi khuẩn tốt nhất số các dòng vi khuẩn phân lập được Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu đất và mẫu nước thu thập được đã phân lập 11 dòng vi khuẩn có khả phát triển môi trường bột lông vũ Đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn, không đều, màu trắng trong, trắng đục, kích thước khuẩn lạc dao động từ 1,0 – 3,5 mm Cả 11 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính protease và keratinase 11 dòng vi khuẩn có khả làm giảm từ 43,9 đến 54,1% khối lượng bột lông gia cầm sau một tuần nuôi lắc ở 37˚C Đồng thời, cả 11 dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả làm rụng sợi lông gà nguyên Kết quả khảo sát khả phân hủy lông gia súc (lông heo) cho thấy 11 dòng vi khuẩn đều có khả làm giảm khối lượng bột lông gia súc từ 7,9 đến 32% Hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 cho thấy khả phân hủy chất keratin tốt nhất 11 dòng vi khuẩn phân lập được 5.2 Đề nghị Định danh hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi cấy cho hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 nhằm tăng khả phân hủy chất keratin hai dòng vi khuẩn này để có thể ứng dụng hai dòng vi khuẩn phân lập được vào thực tiễn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Thực tập Vi sinh vật đại cương Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp 2011 Giáo trình vi sinh vật học đại cương NXB Đại học Cần thơ, trang 77-85 Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai và Nguyễn Ngọc Dũng 2010 Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, và Phạm Văn Ty 2012 Vi sinh vật học NXB Giáo Dục Việt Nam, trang 378-407 Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai và Nguyễn Huy Hoàng 2010 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium có khả phân hủy lông vũ Tạp chí công nghệ sinh học 8(3A), trang 923-928 Tiếng anh Areeb I., N Sahera, S Rashiqua 2012 “Screening and production of extra cellular feather degrading enzyme from bacterial isolates” Indian J.L.Sci.1(2), pp 19-24 Bo Xu, Z Qiaofang, T Xianghua, Y Yunjuan and H Zunxi 2009 “Isolation and characterization of a new keratinolytic bacterium that exhibits significant featherdegrading capability” African Journal of Biotechnology Vol (18), pp 45904596 Bockle B., B Galunsky, R Muller 1995 “Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530” Applied and Environmental Microbiology 61, pp.3705-3710 Bressollier P., F Leutourneau, M Urdaei, B Verneuil 1999 “Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albiodfalvus” Applied and Enviromental Microbiology 65, pp.2570-2576 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Chitte R.R., V.K Nalawade, S Dey 1999 “Keratinolytic activity from the broth of a fearther-degrading thermophilic Streptomyces thermoviolaceus strain SD8” Lett Appl Microbiol 28, pp.131-136 Daniel M T T., L G S Maria 2007 “Production and partial characterization of keratinase produced by a microorganism isolated poultry processing plant wastewatter” Afican Journal of Biotechnology 7, pp.296-300 Daroit D J., A P F Corrêa, A Brandelli 2009 “Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp.P45isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus” InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 63(2009)358–363 De Toni C.H., M.F Richter, J.R Chagas, J.A Henriques, C Termignoni 2002 “Purification and characterization of a alkaline serine endopeptidase from a feather-degrading Xanthomonas matlophila strain” Canadian Journal of Microbiology 48, pp.342-348 Dozie I.N.S., C.N Okeke, NC Unaeze 1994 “A thermostable, alkalineactive, keratinolytic proteinase from Chrysosporium keratinophilum” World J Microbiol Biotechnol 10, pp.563-567 Friedrich A.B., G Antranikian 1996 “Keratin degradation by Fervidobacterium pannavorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order thermotogales” Appl Environ Microbiol 62, pp.2875-2882 Fuchs E 1995 “Keratin and the skin” Annual Reviews in Cell and Developmental Biology 11, pp.123-153 Gradisar H., S Kern, J Friedrich 2000 “Keratinase of Doratomyces microsporus” Appl Microbiol Biotechnol 53, pp.196-200 Gupta R and P Ramnani 2006 “Microbial keratinases and their prospective applications: an overview” Appl Microbiol Biotechnol, 70:21–33 Letourneau F., V Soussotte, P Bressolier, P Branland, B Verneuil 1998 “Keratinolytic activity of Streptomyces sp SK 1-02: a new isolated strain” Lett Appl Microbiol 26, pp.77-80 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Lin X., C.G Lee, E.S Casale & J.C.H Shih 1995 “Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis chain” Appl Environ Microbiol 58, pp.3271-3275 Mukhapadhayay R.P., A.L Charndra 1990 “Keratinase of a Streptomycete” Indian J Exp Biol 28, pp.575-577 Noval J., and W J Nickerson 1959 “Decomposition of native keratin by Streptomyces fradiea” J Bacterial 77, pp.251-263 Onifade, N.A A.A.Al-Sane, A.A Al-Musallam, S Al-Zarban 1998 “A review: potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganism and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources” Bioresource Technogoly 66, pp.1-11 Park G.T and H.J Son 2009 “Keratinolytic activity of Bacillus megaterium F7-1, a feather-degrading mesophilic bacterium” Microbiological Research, 164: 478485 Parry D.A.D., A.C.T North 1998 “Hard a-keratin intermediate filament chains: substructure of the N- and C-terminal domains and the predicted structure and fuction of the C-terminal domains of type I and type II chains” Journal of Structural Biology 122 pp.279-290 Prassad H V., G Kumar, L Karthik, B.K.V Rao 2010 “Screening of Extracellular Keratinase Producing Bacteria from Feather Processing Areas in Vellore, Tamil Nadu, India” J Sci Res 2, 3:559-565 Riffel A and A Brandelli, 2006 “Keratinolytic bacteria isolated from feather waste” Brazilian Journal of Microbiology, ISSN 1517-8382 Riffel A., F Lucas, P Heeb, A Brandelli 2003 “Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather” Arch Microbiol., 179, 258265 Sangali and Brandelli 2000 “Feather keratin hydrolysis by a Vibrio sp kr2 strain J” Appl Microbiol 89, pp.735-743 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Veslava M., M Danutė, G Saulius 2009 “Degradation of keratin containing wastes by bacteria with keratinolytic activity” International Scientific and Practical Conference Volume 1, pp.284-289 Wang J.-J., H.E Swaisgood, J.C.H Shih 2003 “Production and characterization of bioimmobilized keratinase in proteolysis and keratinolysis” Enzyme and Microbial Technology 32, pp.812-819 Trang Web http://vi.wikipedia.org/wiki/D%C3%A2n_s%E1%BB%91_th%E1%BA%BF_gi%E1 %BB%9Bi ngày truy cập 26/6/2013 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục Kết đếm mật số vi khuẩn Mật số vi khuẩn trung bình sau ngày nuôi lắc ở 37oC, 121 rpm (chuẩn bị cho khảo sát hoạt tính protease) Mật số vi khuẩn Dòng (CFU/ml) CT1 1,5x1011 CT2 4,3x1011 CT3 2,8x1011 CT4 2x1011 CT5 3,3x1011 CT6 5,5x1011 CT7 3,2x1011 CT8 8,3x1011 CT9 6,2x1011 CT10 1,7x1011 CT11 6,7x1011 Mật số vi khuẩn trung bình sau ngày nuôi lắc ở 37oC, 121 rpm (chuẩn bị cho khảo sát hoạt tính keratinase) Mật số vi khuẩn Dòng (CFU/ml) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học CT1 3,9x1011 CT2 1,9x1011 CT3 6,4x1011 CT4 3,8x1011 CT5 2,7x1011 CT6 5,6x1011 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT CT7 7,2x1011 CT8 3,3x1011 CT9 1,2x1011 CT10 7,8x1011 CT11 2,6x1011 Mật số vi khuẩn trung bình sau ngày nuôi lắc ở 37oC, 121 rpm (chuẩn bị cho khảo sát khả phân hủy bột lông gia cầm) Mật số vi khuẩn Dòng (CFU/ml) CT1 2,8x1011 CT2 6,3x1011 CT3 2,2x1011 CT4 1,3x1011 CT5 4,7x1011 CT6 6,4x1011 CT7 2,1x1011 CT8 1,9x1011 CT9 4,4x1011 CT10 2,5x1011 CT11 5,7x1011 Mật số vi khuẩn trung bình sau ngày nuôi lắc ở 37oC, 121 rpm (chuẩn bị cho khảo sát khả phân hủy bột lông gia súc) Mật số vi khuẩn Dòng (CFU/ml) CT1 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3,3x1011 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT CT2 1,7x1011 CT3 5x1011 CT4 2,6x1011 CT5 4,3x1011 CT6 2,7x1011 CT7 2,3x1011 CT8 3x1011 CT9 2,5x1011 CT10 1x1011 CT11 3,6x1011 Phụ lục Các bảng số liệu thống kê Bảng Phụ lục khả phân hủy casein các dòng vi khuẩn sau 24 giờ ANOVA Table for Duong kinh vong thuy phan mm by Dong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 117.983 10 11.7983 198.64 0.0000 Within groups 1.30667 22 0.0593939 Total (Corr.) 119.29 32 Multiple Range Tests for Duong kinh vong thuy phan mm by Dong -Method: 95.0 percent LSD Dong Count Mean Homogeneous Groups -CT10 1.63333 X CT11 2.06667 X CT5 2.13333 X CT3 3.83333 X CT2 4.06667 X CT9 5.56667 X CT7 5.63333 X CT1 6.1 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT CT8 6.16667 XX CT6 6.56667 X CT4 7.16667 X Bảng 10 Phụ lục kết quả đo hoạt tính enzyme keratinase ANOVA Table for Hoat tinh azokeratinase by Dong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14080.7 10 1408.07 Within groups 628.213 22 28.5552 49.31 0.0000 Total (Corr.) 14708.9 32 Multiple Range Tests for Hoat tinh azokeratinase by Dong -Method: 95.0 percent LSD Dong Count Mean Homogeneous Groups -CT10 18.4 X CT8 22.9 XX CT1 28.3 X CT9 38.3 X CT11 53.7333 X CT7 56.4333 X CT6 59.3333 X CT5 60.5667 X CT2 71.5 X CT4 78.3667 X CT3 79.3 X Bảng 11 Phục lục thí nghiệm phân hủy bột lông gia cầm ANOVA Table for Ti le phan huy by Dong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6922.71 11 629.337 41.32 0.0000 Within groups 365.58 24 15.2325 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012 Trường ĐHCT Total (Corr.) 7288.29 35 Multiple Range Tests for Ti le phan huy by Dong -Method: 95.0 percent LSD Dong Count Mean Homogeneous Groups -DC 1.9 X CT2 41.9 X CT4 47.4333 XX CT10 49.1667 XX CT3 50.1667 XX CT9 50.6333 XX CT8 52.2 XX CT1 52.4667 XX CT6 52.5333 XX CT5 53.3 XX CT11 53.6 XX CT7 54.1 X Bảng 12 Phụ lục thí nghiệm phân hủy bột lông gia súc (lông heo) ANOVA Table for Phan tran phan huy by Dong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2462.87 11 223.897 38.59 0.0000 Within groups 139.24 24 5.80167 Total (Corr.) 2602.11 35 Multiple Range Tests for Phan tran phan huy by Dong -Method: 95.0 percent LSD Dong Count Mean Homogeneous Groups -DC 2.1 X CT2 7.86667 X CT4 8.63333 X CT7 10.2 XX CT9 12.7667 XX CT3 13.5333 XX CT11 14.3 X CT6 15.3667 X CT1 20.4 X CT10 21.1 X CT8 28.4 X CT5 32.0333 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... heo) của các dòng vi khuẩn Các dòng vi khuẩn thể hiện khả năng phân hủy bột lông gia cầm thì cũng thể hiện khả năng phân hủy bột lông gia súc Tuy nhiên, khả năng phân hủy lông gia súc không tỷ lệ thuận với khả năng phân hủy lông gia cầm Sau một tuần chủng vi khuẩn và lắc ủ ở 37˚C, khối lượng của lông gia súc gia m từ 7,9% đến 32,0% (Ba ng 8), khác biệt so với mẫu đối... khuẩn Các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme keratinase đều thể hiện khả năng phân hủy bột lông gia cầm Tuy nhiên, khả năng phân hủy bột lông gia cầm không tỷ lệ thuận với hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn Kết quả thí nghiệm cho thấy 11 dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân hủy bột lông gia cầm Dòng vi khuẩn cho kết quả phân hủy thấp nhất... ở 37˚C Đồng thơ i, cả 11 dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng làm rụng sợi lông gà nguyên Kết quả khảo sát khả năng phân hủy lông gia súc (lông heo) cho thấy 11 dòng vi khuẩn đều có khả năng làm gia m khối lượng bột lông gia súc từ 7,9 đến 32% Hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 cho thấy khả năng phân hủy cơ chất keratin tốt nhất trong 11 dòng vi khuẩn phân lập được... các dòng vi khuẩn còn lại nhưng khả năng phân hủy lông gia cầm nguyên và lông gia súc thì tốt hơn hẳn Tuy nhiên hoạt tính enzyme keratinase của hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 so với các dòng vi khuẩn còn lại thì thấp hơn rất nhiều Theo Gupta và Ramnani (2006), khả năng phân hủy keratin phụ thuộc nhiều vào enzyme keratinase do tế ba o vi khuẩn tiết ra nhưng tế ba o vi khuẩn cũng... A (%) là tỉ lệ bột lông bị thủy phân bởi vi khuẩn mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị thủy phân Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần 3.2.5 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn Chuẩn bị bột lông gia súc: lông heo được thu về từ các lò giết mổ gia súc, rửa sạch... ĐHCT hai giai đoạn là: phá hủy cầu nối disulfite và phân hủy chuỗi polypeptide, trong đó tế ba o đóng vai trò quan trọng trong vi ̣c phá hủy các cầu nối disulfite Vi vậy, để biết chính xác khả năng phân hủy chất thải lông cần tiến hành các thí nghiệm trong điều kiện có mặt của các tế ba o vi khuẩn 4.4 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn. .. ngoại ba o của các dòng vi khuẩn phân lập được Đường kính thủy phân của các dòng vi khuẩn biến thiên từ 1,6 mm đến 7,2 mm (Ba ng 5) Trong đó, hai dòng vi khuẩn CT4 và CT6 có đường kính thủy phân lớn hơn, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng vi khuẩn còn lại Hình 1 Vòng thủy phân casein của dòng vi khuẩn CT4 sau 24 giờ ủ ở 37˚C Bảng 5 Đường kính thủy phân. .. NaCl 0,5 Bột lông gia cầm 10 Agar 20 (Bo Xu et al., 2009) 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin a Phân lập Thu mẫu Mẫu đất và nước thải được thu tại các lò mổ gia súc, lò mổ gia cầm và trại nuôi gia cầm tại ba quận Ninh Kiều, Cái Răng, Ô Môn thuộc thành phố Cần Thơ Mẫu đất được thu ở nơi có lông mục, lấy cả đất và lông khoảng... những dòng vi khuẩn sao cho phù hợp Nếu muốn thu được lượng enzyme cao nên chọn dòng CT2, CT3 và CT4 Mặt khác nếu muốn ứng dụng để phân hủy lông thì chọn hai dòng vi khuẩn CT5 và CT8 là hai dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cơ chất keratin hiệu quả nhất trong số 11 dòng vi khuẩn phân lập được, khả năng phân hủy cơ chất bột lông gia cầm của hai dòng vi khuẩn này không... sóng 450 nm Một đơn vi hoạt tính enzyme được xác định bằng sự gia tăng 0,01 đơn vi hấp thụ quang phổ ở 450nm so với mẫu đối chứng sau 15 phút phản ứng Đơn vi hoạt tính enzyme = (OD mẫu – OD dc)/0,01 3.2.4 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn Bột lông gia cầm được xay từ hỗn hợp lông gà và lông vi t theo tỉ lệ 1:1 Hỗn hợp lông sau khi rửa sạch,