ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đào Trọng Khoa TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CẢI BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI Ở QUY MÔ NỒI LÊN MEN VÀ TẠO CÔNG THỨC BÁN THÀNH PHẨM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số chuyên ngành: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Trương Nam Hải PGS TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2015 Lời cảm ơn Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, PGS TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho thời gian học tập nghiên cứu Tiếp đến xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình giảng dạy cho suốt thời gian tham gia khóa học Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán nghiên cứu, nhân viên phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học Công ty TNHH Vắc xin Sinh phẩm số (Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam tận tình bảo động viên cho lời khuyên quý giá công việc sống Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh nói riêng toàn Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi tới gia đình, bạn bè lời cảm ơn chân thành động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội ngày 16 tháng 06 năm 2015 Học viên cao học Đào Trọng Khoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh ung thư 1.1.1 Khái niệm bệnh ung thư 1.1.2 Tình hình ung thư giới Việt Nam .8 1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư .10 1.2 Tổng quan Interleukin-2 11 1.2.1 Cấu trúc Interleukin-2 11 1.2.2 Vai trò chức sinh học Interleukin-2 .13 1.2.3 Ứng dụng Interleukin-2 điều trị ung thư .15 1.3 Hệ thống lên men nuôi cấy E coli tái tổ hợp .17 1.4 Tinh protein dạng thể vùi 19 1.4.1 Tổng quan tinh protein 19 1.4.2 Tinh protein phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 22 1.5 Công thức pha chế bán thành phẩm 24 CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Chủng giống vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Chủng vi khuẩn E coli BL21 DE3 28 2.1.2 Vector biểu 28 2.1.3 Hóa chất .29 2.1.4 Máy móc thiết bị .29 2.1.5 Các môi trường dung dịch 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Biểu protein Interleukin-2 E coli quy mô nồi lên men lít 32 2.2.2 Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2 33 2.2.3 Phương pháp tinh chế Interleukin-2 sắc ký lỏng hiệu cao 34 2.2.4 Kiểm tra sản phẩm protein điện di SDS-PAGE 35 ii 2.2.5 Phương pháp kiểm tra protein phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western Blot 36 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu lập công thức bán thành phẩm đông khô .38 2.2.7 Phương pháp xử lý kết điện di SDS-PAGE phần mềm Quantity One .40 CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .42 3.1 Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2 hệ thống lên men lớn .42 3.1.1 Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2 hệ thống lên men lít 42 3.1.2 Khảo sát thành phần dinh dưỡng 44 3.1.3 Khảo sát khả sinh trưởng chủng E coli BL21 IL-2 .46 3.1.4 Lên men chủng E coli BL21 IL-2 đợt .47 3.2 Siêu âm phá tế bào xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp 48 3.3 Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 hệ thống sắc ký HPLC 54 3.4 Xác định độ tinh khiết sản phẩm phần mềm Quantity One 57 3.5 Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .63 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin APS AU DNA Ammonium persulfate Absorbance unit Deoxyribonucleotide acid dOT E coli Dissolved oxygene tension Escherichia coli EDTA Ethylenediamin tetra-acetic acid FDA Food and Drug Administration GnHCl HIV HPLC Guanidine hydrochloride Human Immunodeficiency Virus High Performance Liquid Chromatography HSA IARC IL-2 Human serum albumin The International Agenecy for Research on Cancer Interleukin-2 IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside LAK LB LBA NK OD PBS PEG PMSF Lymphokine-Activated Killer cell Môi trường Luria-Bertani Môi trường LB có bổ sung Amp Natural Killer Optical density Phosphate buffer saline Polyethylene glycol Phenylmethylsulfonyl fluoride PVDF rhIL-2 SDS SDS-PAGE TEMED TBS TFA TMB Polyvinylidene fluoride Recombinant human Interleukin-2 Sodium dodecyl sulfate SDS-polyacylamide gel electrophoresis N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylenediamin Tris buffer saline Trifluoroacetic acid Tetramethylbenzidine TTBS WHO Dung dịch TBS bổ sung Tween-20 World Health Organization iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tiêu nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường tế bào ung thư ác tính tủy xương Hình Minh họa cấu trúc không gian chiều Interleukin-2 Hình Đích tác động Interleukin-2 Hình Tác động Interleukin-2 đến tế bào T Hình Hệ thống lên men bioreactor quy mô nhỏ Hình Hệ thống tinh protein HPLC Hình Bản đồ vector biểu pET22b(+) (Novagen) Hình Điện di protein tái tổ hợp IL-2 sau lên men hệ thống lên men lít Hình Điện di sản phẩm protein tổng số điều kiện thay đổi thành phần chất dinh dưỡng môi trường nuôi cấy Hình 10 Khảo sát khả sinh trưởng chủng tái tổ hợp so với chủng đối chứng (E coli BL21 không mang gene mã hóa IL-2) Hình 11 Lên men chủng tái tổ hợp E coli BL21 IL-2 đợt Hình 12 Điện di mẫu siêu âm phá tế bào theo thời gian Hình 13 Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau biến tính GuHCl, xử lý ly tâm thu tủa không tan Hình 14 Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau biến tính GuHCl, giảm nồng độ GuHCl để thu hồi protein dạng tủa Hình 15 Sơ đồ tóm tắt trình xử lý thô để thu hồi protein IL-2 Hình 16 Điện di kiểm tra phân đoạn trình phá tế bào xử lý thu protein thô Hình 17 Sắc ký đồ tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp nhờ hệ thống HPLC Hình 18 Điện di kiểm tra phân đoạn trình tinh chế HPLC Hình 19 Xác định thành phần độ tinh khiết protein phần mềm Quantity One Hỉnh 20 Sản phẩm hoàn nguyên sau đông khô hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm Hình 21 Điện di kiểm tra mẫu hoàn nguyên sau đông khô v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Phân biệt u lành u ác theo đặc điểm sinh học Bảng Một số oncogene tumor suppressor gene liên quan đến ung thư người Bảng Công thức cho gel SDS-PAGE (gồm lớp gel tách gel cô) Bảng Bảng công thức pha chế bán thành phẩm Bảng Bảng tiêu chuẩn đánh giá độ đục sinh phẩm Bảng Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết sản phẩm IL-2 phần mềm Quantity One Bảng Độ đục hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm vi MỞ ĐẦU Ngày nay, giới ngày nhận thức rõ mức độ nghiêm trọng bệnh không lây nhiễm nói chung bệnh ung thư nói riêng sức khỏe người Ước tính riêng Hoa Kỳ năm 2014, có 665 000 ca nhiễm ung thư phát gần 586 000 người tử vong ung thư, trung bình 1600 ca ngày [22] Theo ghi nhận Tổ chức Y tế giới (WHO), số trường hợp mắc ung thư tăng từ 12,7 triệu trường hợp năm 2008 lên 14,1 triệu trường hợp năm 2012, có xu hướng tăng lên Các quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề nước có thu nhập thấp trung bình, nước thiếu trang thiết bị cần thiết để đối phó với gia tăng trường hợp ung thư [23] Hiện có phương pháp điều trị ung thư phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, liệu pháp gene liệu pháp miễn dịch, liệu pháp miễn dịch ngày nghiên cứu sâu rộng ứng dụng rộng rãi nhờ có nhiều ưu điểm an toàn, hiệu tác dụng phụ Liệu pháp miễn dịch sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ hệ miễn dịch thể để tiêu diệt tế bào ung thư đồng thời hỗ trợ sức sống cho tế bào bình thường khác thể Một loại sản phẩm cytokine, với nhiều loại khác nhiều loại tế bào tiết Các cytokine nghiên cứu từ lâu với mục đích điều trị hỗ trợ điều trị bệnh truyền nhiễm bệnh không truyền nhiễm người, Interleukin-2 loại cytokine nghiên cứu sớm Interleukin-2 (IL-2) từ lâu chứng minh có hiệu việc hỗ trợ điều trị hai loại ung thư thận ung thư hắc tố Trước đây, IL-2 dùng cho điều trị tách chiết tự nhiên từ tế bào T từ tế bào động vật nuôi cấy, phương pháp có nhược điểm hàm lượng IL-2 tách chiết hoạt tính riêng thấp không đáp ứng yêu cầu điều trị Để khắc phục hạn chế trên, IL-2 chủ yếu sản xuất công nghệ tái tổ hợp Hiện sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp dạng thương phẩm (Proleukin®) bán rộng rãi giới Sự thử nghiệm chế phẩm Proleukin®IL-2 đối tượng động vật bệnh nhân ung thư cho thấy chúng có hoạt tính sinh học với khả làm giảm tỷ lệ di khối u, không bị kết tủa sử dụng dễ dàng nên sử dụng nhiều phương pháp miễn dịch trị liệu để điều trị ung thư [39, 45], nhiên giá thành sản phẩm cao (2532 USD/ ống 1,3mg) [19] đặc biệt so với thu nhập bình quân đầu người nước phát triển có Việt Nam Vì Nhà nước Bộ Y Tế khuyến khích việc nghiên cứu sản xuất sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp Việt Nam để hỗ trợ điều trị ung thư Đề tài nghiên cứu KC.04.21/06-10 cho kết nghiên cứu biểu Interleukin-2 tái tổ hợp vi khuẩn Escherichia coli khả quan quy mô phòng thí nghiệm hệ thống lên men lít Tuy nhiên để đảm bảo sản phẩm Interleukin-2 có cấu trúc hoàn toàn giống với sản phẩm thương mại Proleukin, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xin cấp phép sử dụng sản phẩm sau này, protein IL-2 cần cải biến để loại bỏ amino acid alanine đầu N Dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dòng tế bào E coli” giai đoạn 2012-2015 thực nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất Interleukin-2 dạng cải biến Giai đoạn đầu dự án cho kết biểu thành công IL-2 dạng cải biến quy mô phòng thí nghiệm Tuy nhiên để hướng tới sản xuất quy mô lớn có khả ứng dụng thực tiễn, tiến hành nghiên cứu biểu Interleukin-2 quy mô lớn hệ thống lên men Sau protein biểu thành công, cần có phương pháp thích hợp để tinh sản phẩm Interleukin-2 thiết lập công thức bổ sung tá chất cần thiết trước tiến hành đông khô sản phẩm để bảo quản Trên sở tiến hành thực đề tài: “Tinh chế Interleukin-2 người tái tổ hợp cải biến Escherichia coli quy mô nồi lên men tạo công thức bán thành phẩm” Mục tiêu đề tài nâng cao suất tổng hợp tinh IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để sản xuất sản phẩm IL-2 người tái tổ hợp tiêu thụ thị trường Nghiên cứu thực nhờ hỗ trợ kinh phí Dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dòng tế bào E coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, ứng dụng kết thu từ nghiên cứu triển khai đề tài: (1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007 (2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam dùng hỗ trợ điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 20092010 Đề tài thực phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Công ty Vacxin Sinh phẩm số (Vabiotech), Bộ Y tế Đường chạy M, M, M, M, M, M: Mẫu protein tủa sau ly tâm dịch GuHCl nồng độ cao pha loãng nồng độ tương ứng Kết Hình 14 cho thấy dấu hiệu tái kết tủa protein nồng độ GuHCl M M, cụ thể băng protein xuất đường chạy hai mẫu protein xử lý đưa GuHCl nồng độ Từ nồng độ GuHCl M bắt đầu có kết tủa trở lại protein IL-2, băng protein Il-2 bắt đầu xuất đường chạy M Ở nồng độ GuHCl M, hàm lượng IL-2 tái kết tủa lớn hơn, thể việc băng protein IL-2 đậm rõ nét so với đường chạy M Ở nồng độ M, lượng protein IL-2 tái kết tủa tăng không đáng kể so với nồng độ M, cụ thể băng protein IL-2 giống với đường chạy M, nhiên băng IL-2 bắt đầu xuất băng protein khác, điều chứng tỏ nồng độ GuHCl M, loại protein nội bào dịch GuHCl bắt đầu tái kết tủa Lượng protein IL-2 tái kết tủa lớn quan sát nồng độ GuHCl M, đồng thời ta thấy băng protein tạp lên rõ Điều chứng tỏ nồng độ GuHCl M, tái kết tủa protein tạp với IL-2 thành thể không tan đáng kể Vì vậy, nhằm mục đích thu lượng IL-2 lớn protein tạp bẩn phải loại bỏ tối đa, sử dụng nồng độ GuHCl M để pha loãng dịch GuHCl nồng độ cao sau hòa tan thể vùi Quá trình siêu âm phá tế bào xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp tóm tắt sơ đồ sau 52 Hình 15 Sơ đồ tóm tắt trình xử lý thô để thu hồi protein IL-2 S1, S2, S3, S4: Dịch sau bước ly tâm tương ứng P1, P2, P3, P4: Tủa sau bước ly tâm tương ứng Các phân đoạn trình xử lý protein IL-2 thô thu lại điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra Hình 16 Điện di kiểm tra phân đoạn trình phá tế bào xử lý thu protein thô Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431) Đường chạy T: Mẫu protein tổng số 53 Đường chạy S1,S2,S3,S4,P1,P2,P3,P4: Các phân đoạn tương ứng với trình xử lý Hình 15 Từ kết Hình 16 ta thấy, sau trình siêu âm phá tế bào, protein nội bào giải phóng hoàn toàn, protein tan nằm dịch sau ly tâm mẫu siêu âm, cụ thể băng protein tạp dịch loải bỏ ngày nhạt đi, với mẫu protein loại bỏ dần loại protein không quan tâm, Đường chạy P3 có xuất mờ băng protein IL-2, điều chứng tỏ gần toàn tủa protein không tan thể vùi thu hồi nhờ ly tâm sau hai bước siêu âm phá tế bào chuyển thành dạng tan hoàn toàn Đường chạy S4 tương ứng với dịch sau ly tâm mẫu protein sau pha loãng GuHCl để tái kết tủa protein IL-2, băng protein IL-2 lên rõ Điều phù hợp với kết đường chạy P4, tủa dịch sau pha loãng GuHCl, băng protein tạp mờ nhạt băng protein IL-2 đậm rõ nét Kết điện di Hình 16 cho ta kết luận quy trình xử lý phá tế bào thu hồi protein IL-2 thô xây dựng phù hợp, tạo điều kiện để tinh chế hoàn toàn IL-2 hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC công đoạn sau 3.3 Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 hệ thống sắc ký HPLC Trong trình xử lý thu protein IL-2 thô (Hình 15), sau tái kết tủa IL-2 để loại bỏ tạp chất tan GuHCl, IL-2 tái tổ hợp phải chuyển thành dạng tan trước đưa vào hệ thống cột sắc ký IL-2 tái kết tủa hòa tan dung dịch chứa 50 mM Tris, 10 mM EDTA, M GuHCl 15 mM 2mecaptoethanol, chất có tác dụng ngăn cản hình thành liên kết disulfide Quá trình hòa tan IL-2 tiến hành qua đêm điều kiện 4ºC khuấy nhẹ máy khuấy từ Tiếp đó, mẫu protein bổ sung TFA để hạ pH dung dịch xuống khoảng 2-3 Mục đích công đoạn nhằm giúp ổn định bảo vệ chất giá có chất gel silica cột sắc ký, môi trường pH thấp ngăn cản hình thành nhóm chức có khả ion hóa chất giá Hơn nữa, TFA 54 có độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại thấp nên không ảnh hưởng tới kết đo phát protein độ hấp thụ quang học Ngoài ra, TFA chất dễ bay hơi, dễ dàng loại bỏ trình đông khô, thuận tiện cho việc sản xuất chế phẩm thuốc Dịch IL-2 sau ly tâm 10000 vòng phút để loại bỏ thành phần tủa lơ lửng thu dịch để chuẩn bị cho việc đưa mẫu lên cột HPLC Quá trình tinh chế dịch IL-2 tái tổ hợp tiến hành mô tả phần phương pháp Kết tinh chế thể chi tiết sắc ký đồ HPLC kết điện di kiểm tra sản phẩm IL-2 tinh chế Hình 17 Sắc ký đồ tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp nhờ hệ thống HPLC Kết tinh chế IL-2 sắc ký đồ ta thấy xuất 02 đỉnh hấp thụ (peak) lớn tương ứng với thời điểm phút thứ phút thứ 9,5 với đỉnh hấp thụ tương ứng 325 mAU 300 mAU Kết đồng lần tinh chế cho thấy tính ổn định khả phân tách tốt mẫu xử lý cột bán điều chế Bio wide pore C5 Ngoài sắc ký đồ xuất vài peak phụ phút thứ 4, phút thứ 6,5 phút thứ 8, nhiên dựa thiết kế chương trình tinh chế 55 protein tạp cần phải loại bỏ Các phân đoạn ứng với peak thu lại điện di kiểm tra gel SDS-PAGE 12,6% Hình 18 Điện di kiểm tra phân đoạn trình tinh chế HPLC Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431); Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5: Mẫu protein tương ứng với phân đoạn 32, 33, 34, 35, 36 Hình 17 Dựa kết điện di, đường chạy số tương ứng với phân đoạn 32 (phút thứ trình tinh chế) băng protein IL-2 mà có băng mờ kích thước khác với kích thước lý thuyết IL-2, protein tạp chưa loại bỏ trình xử lý thô sau lên men thu hồi protein, protein rửa khỏi cột trước Đường chạy 2, 3, 4, xuất băng protein có kích thước khoảng 15 kDa, mẫu protein tương ứng với phân đoạn từ 33 đến 36 với đỉnh protein phút thứ 9,5 trình tinh chế, điều chứng tỏ protein IL-2 phân tách khỏi loại protein tạp khác từ mẫu xử lý thô Theo định luật Beer, độ hấp thụ ánh sáng quang học dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch [24] Độ hấp thụ quang học phân đoạn từ 33 đến 36 giảm dần (sắc ký đồ phân đoạn có xu hướng xuống), điều 56 phù hợp với kết điện di, băng protein IL-2 đường chạy (phân đoạn 33 34) đậm rõ nét nhất, băng protein IL-2 đường chạy (phân đoạn 35 36) nhạt dần Mặc dù có nồng độ khác nhau, mẫu protein phân đoạn có độ tinh cao thể việc không xuất băng protein khác băng IL-2 đường chạy mẫu Điều chứng tỏ quy trình tinh chế áp dụng phù hợp để tinh chế mẫu protein IL-2 sử dụng để tiến hành lần tinh chế 3.4 Xác định độ tinh khiết sản phẩm phần mềm Quantity One Phần mềm Quantity One BioRad phần mềm thông dụng sử dụng nhiều giới để xác định độ đậm nhạt băng protein điện di đồ Chúng sử dụng phần mềm để xác định độ tinh khiết protein sản phẩm điện di gel acrylamide kỹ thuật SDS-PAGE Kết xác định độ tinh thể Hình 19 Maker IL-2 TQ Mẫu sau tinh chế Hình 19 Xác định thành phần độ tinh khiết protein phần mềm Quantity One 57 Bảng Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết sản phẩm IL-2 phần mềm Quantity One % Độ tinh khiết protein STT băng Maker Trung Quốc Mẫu 13,37838 94,14868 98,021 19,20191 2,351318 16,52623 17,1558 11,64706 21,09062 13,37838 Tổng số 99% 96.5% 98% Nhìn Hình 19 ta thấy, mẫu IL-2 Trung Quốc (TQ), sản phẩm kiểm tra chất lượng độ tinh khiết đạt 95% Sản phẩm IL-2 TQ tồn băng kích thước 15 kDa băng cao khoảng 30 kDa, dạng IL2 kép dimer (kết kiểm tra lai Western blot kháng thể đặc hiệu kháng IL-2 phát băng này) Do băng protein 30 kDa sản phẩm IL-2 không ảnh hưởng đến độ tinh khiết sản phẩm Độ thang protein chuẩn (Fermentas) 99%, mẫu IL-2 TQ cho tỷ lệ IL-2 đạt 95% Độ tinh mẫu IL-2 sau tinh chế xác định phần mềm đạt đến 98%, cao so vói mẫu đối chứng sản phẩm IL-2 Trung Quốc bán thị trường Như vậy, sản phẩm protein tái tổ hợp IL-2 sau tinh chế đạt yêu cầu độ tinh khiết cần thiết sản phẩm dược phẩm sẵn sàng để tiến hành đông khô thử nghiệm xác định công thức pha chế phù hợp 3.5 Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2 Phương pháp đông khô phương pháp sử dụng phổ biến trình bảo quản mẫu protein Phương pháp giúp loại bỏ thành phần nước 58 chất dễ bay mẫu, chuyển protein thành dạng bột khô, thuận tiện cho việc bảo quản vận chuyển Mẫu sau đông khô hoàn nguyên trạng thái có hoạt tính cách dễ dàng sau bổ sung lượng nước cất định Protein tái tổ hợp IL-2 sau tinh chế hệ thống sắc ký lỏng cao cáp HPLC tồn dạng tan dung dịch đệm B citric acid iso-propanol hòa tan nước Tuy nhiên iso-propanol chất hữu gây độc thể người động vật nên cần phải giảm thiểu đến ngưỡng cho phép sản phẩm dược phẩm Đặc tính iso-propanol dễ bay nên loại bỏ dễ dàng phương pháp đông khô Tuy nhiên IL-2 cần pha hỗn hợp tá chất thích hợp để đảm bảo tính tan hoạt tính sau đông khô hoàn nguyên sản phẩm Kết hoàn nguyên mẫu nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm IL-2 thể hình sau Hình 20 Sản phẩm hoàn nguyên sau đông khô hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm Kết đo độ đục hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm thể Bảng Bảng Độ đục hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm Tên mẫu Sau rã Độ đục A B 5,4 C 2,6 D 1,4 59 E 5,8 F 1,8 (-) 1,6 1,1 IL-2TQ 1,4 đông Hoàn Quan sát Hơi đục Trong Trong Hơi đục Trong Trong Trong Trong Độ đục 6,5 2,2 1,2 6,2 1,4 1,3 1,1 1,4 Quan sát Hơi đục Trong Trong Hơi đục Trong Trong Trong Trong nguyên sau đông khô Kết cho thấy hỗn hợp A D có độ đục cao nhất, nguyên nhân thành phần chứa SDS, chất có khả phá vỡ liên kết bậc cao phân tử protein hòa tan phân tử protein, nhiên SDS tạo độ đục định hòa tan dung môi Các hỗn hợp lại suốt đạt tiêu chuẩn, riêng mẫu C có độ đục thấp tương đương với độ đục mẫu IL-2 Trung Quốc Như thấy thành phần PEG-400, Tween-20 hay SDS không cần thiết để làm tan dung dịch Với mục tiêu đảm bảo tính tan độ ổn định, đồng thời đơn giản hóa thành phần có thể, chọn hỗn hợp C gồm sucrose, manitol, IL-2 sau tinh chế H2O loại ion với glycine hỗn hợp pha chế cuối để tiến hành pha chế IL-2 tái tổ hợp Phương pháp đông khô có khả làm hao hụt sản phẩm trình hút chân không, phân tử nhỏ hòa tan dung dịch có khả bay bị hút với nước, sản phẩm hoàn nguyên sau đông khô cần kiểm tra lại phương pháp điện di SDS-PAGE 60 Hình 21 Điện di kiểm tra mẫu hoàn nguyên sau đông khô Đường chạy A-F: mẫu hoàn nguyên sau đông khô công thức từ A đến F Đường chạy (-): H2O Đường chạy (+): IL-2 Trung Quốc Kết điện di Hình 21 cho thấy, câc mẫu protein IL-2 hoàn nguyên sau đông khô tất công thức cho kết băng đậm tương ứng với kích thước lý thuyết IL-2 dạng đơn khoảng 15 kDa, đường chạy không xuất băng protein khác Điều chứng tỏ trình chuẩn bị công thức pha chế, đông khô hoàn nguyên sản phẩm đảm bảo tính vô trùng, không bị tạp nhiễm protein lạ, protein IL-2 giữ ổn đinh trình đông khô, không bị biến đổi hay thất thoát Điều sở để lặp lại bước tiến hành cho lần đông khô sau 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận  Đã khảo sát điều kiện lên men thích hợp hệ thống lên men quy mô lít với chủng E coli BL21 IL-2 điều kiện nhiệt độ biểu 47ºC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1 mM, thời gian thu mẫu sau Quá trình lên men bổ sung chất dinh dưỡng glucose 1% cao nấm men 0,5%  Đã xây dựng thành công phương pháp tiền tinh chế IL-2 Guanidine hydrochloride tinh chế IL-2 hệ thống sắc ký HPLC thu IL-2 có độ tinh đến 98%  Đã xây dựng công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 với thành phần sucrose 2%, manitol 1%, glycine 30 mM pha nước loại ion Kiến nghị Từ kết đạt xin đưa số kiến nghị sau:  Nghiên cứu áp dụng quy trình sản xuất quy mô nồi lên men vào điều kiện tiêu chuẩn GMP để đảm bảo tiêu chuẩn sản phẩm dược phẩm  Xác định hoạt tính sinh học IL-2 tế bào CTLL-2  Kiểm định tiêu an toàn chất lượng IL-2 thành phẩm 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng Việt Lê Thị Lan Anh, Lê Phương Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng, Phùng Thu Nguyệt, Đoàn Thị Thủy, Lưu Anh Chiến, Trương Nam Hải (2013), "Nghiên cứu tối ưu biểu gen mã hóa Interleukin-2 Escherichia coli", Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 1, p 19-23 Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), "Biểu gen Interleukin-2 người bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc cystein 125 Escherichia coli", Tạp chí công nghệ sinh học, 3(2), p 149-154 Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005), "Biểu gen mã hóa Interleukin-2 người (rh-il2MN) Eschirichia coli hệ pET32 nhận dạng protein tái tổ hợp phương pháp khối phổ", Tạp chí công nghệ sinh học 3(4), p 439-444 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2013), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội  Tiếng Anh 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Bruce Alberts (1994), Molecular biology of the cell, 3rd ed, xliii, 1294 p., Garland Pub., New York Gary J Beck, Edward D S Kerslake, Orest Olejnik (2004), Preserved cyclodextrincontaining compositions, patent US6723353 B2 Peter Boyle, Bernard Levin (2008), World Cancer Report 2008 A R Cockshott, I D L Bogle (1999), "Modelling the Effects of Glucose Feeding on a Recombinant E coli Fermentation", Bioprocess Engineering, 20, p 83-90 Council Of Europe (2004), European Pharmacopoeia 5.0 Vol 5, Edqm A L L Galesi, W M S C Tamashiro, A M Moraes (2003), "The effect of medium composition on Interleukin-2 production by murine EL-4 thymoma cells ", Brazilian Journal of Chemical Engineering, 21 (2), p 165 - 173 Maninder S Hora, Nandini Katre, Kenneth A Laderman (1992), Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers, patent US5078997 A Thomas R Malek (2003), "The main function of IL-2 is to promote the development of T regulatory cells", Journal of Leukocyte Biology, 74(6), p 961–965 Oona Mcpolin (2009), An introduction to HPLC for pharmaceutical analysis, Mourne Training Services Asada Kensuke Mikura Yasushi, Nishinomiya Toguchi Hajime (1985), Stable composition of Interleukin-2 and albumin, patent 4,645,830 Jacques Monod (1949), "The growth of bacterial cultures", Annual Review of Microbilogy, 3, p 371-394 Derek T O'hagan, ed Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols 2000 World Health Organisation (2014), World Health Statistic 2014 Italy David Plank, Daniel Lewandowski (2004), Cyclodextrin-containing compositions and methods, patent US20040180125 A1 63 19 Inc Prometheus Labs, Proleukin Rx Information, 2015 [cited 2015; Available from: http://www.empr.com/proleukin/drug/2103/ 20 S.A Rosenberg, M.T Lotze (1986), "Cancer Immunotherapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2-Activated Lymphocytes", Annual Review of Immunology, 4, p 681– 709 21 Raymond P W Scott (2003), Principles and Practice of Chromatography Chrom-Ed Book Series, LIBRARYFORSCIENCE, LLC 22 American Cancer Society (2014), Cancer Facts & Figures 2014 Atlanta 23 B W Stewart (2014), World Cancer Report 2014, ed Wild C P 24 D F Swinehart (1962), "The Beer-Lambert Law", Journal of Chemical Education, 39 (7), p 333 25 Roger Petrus Gerebern Vandecruys (2002), Mixture of drug with acid and polymer, patent US20020150616 A1 26 Robert A Weinberg (2007), The biology of cancer, xix, 796 p., [48 p.], Garland Science, New York 27 Robert Allan Weinberg (1996), "How cancer arises", Scientific American, p 275(3):62–70 28 Tracy Stewart Ze'ev Shaked, James W Thomson, Pamela Hirtzer (1991), Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes, patent US5037644 A 29 B N Ames, L S Gold (1998), "The causes and prevention of cancer: the role of environment", Biotherapy, 11(2-3), p 205-20 30 A Belldegrun, C L Tso, A Zisman, J Naitoh, J Said, A J Pantuck, A Hinkel, J Dekernion, R Figlin (2001), "Interleukin gene therapy for prostate cancer: phase I clinical trial and basic biology", Hum Gene Ther, 12(8), p 883-92 31 P Benedetti Panici, G Scambia, S Greggi, P Di Roberto, G Ragusa, L Perrone, C Sonsini, C Rumi, C Pourreau, P Palmer (1989), "Recombinant interleukin-2 continuous infusion in ovarian cancer patients with minimal residual disease at second-look", Cancer Treat Rev, 16 Suppl A, p 123-7 32 M A Caligiuri, C Murray, M J Robertson, E Wang, K Cochran, C Cameron, P Schow, M E Ross, T R Klumpp, R J Soiffer (1993), "Selective modulation of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant interleukin 2", J Clin Invest, 91(1), p 123-32 33 J H Choi, S Y Lee (2004), "Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli", Appl Microbiol Biotechnol, 64(5), p 625-35 34 A T Cockett, R S Davis, L R Cos, L L Wheeless, Jr (1991), "Bacillus CalmetteGuerin and interleukin-2 for treatment of superficial bladder cancer", J Urol, 146(3), p 766-9; discussion 769-70 35 R Devos, G Plaetinck, H Cheroutre, G Simons, W Degrave, J Tavernier, E Remaut, W Fiers (1983), "Molecular cloning of human interleukin cDNA and its expression in E coli", Nucleic Acids Res, 11(13), p 4307-23 36 S Elmore (2007), "Apoptosis: a review of programmed cell death", Toxicol Pathol, 35(4), p 495-516 37 B Fahnert, H Lilie, P Neubauer (2004), "Inclusion bodies: formation and utilisation", Adv Biochem Eng Biotechnol, 89, p 93-142 38 T A Fehniger, E M Bluman, M M Porter, E Mrozek, M A Cooper, J B Vandeusen, S R Frankel, W Stock, M A Caligiuri (2000), "Potential 64 mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy", J Clin Invest, 106(1), p 117-24 39 G Fyfe, R I Fisher, S A Rosenberg, M Sznol, D R Parkinson, A C Louie (1995), "Results of treatment of 255 patients with metastatic renal cell carcinoma who received high-dose recombinant interleukin-2 therapy", J Clin Oncol, 13(3), p 688-96 40 I Garcia-Tunon, M Ricote, A Ruiz, B Fraile, R Paniagua, M Royuela (2004), "Interleukin-2 and its receptor complex (alpha, beta and gamma chains) in in situ and infiltrative human breast cancer: an immunohistochemical comparative study", Breast Cancer Res, 6(1), p R1-7 41 G Halfmann, H Brailly, A Bernadac, F A Montero-Julian, C Lazdunski, D Baty (1993), "Targeting of interleukin-2 to the periplasm of Escherichia coli", J Gen Microbiol, 139(10), p 2465-73 42 D Hanahan, R A Weinberg (2000), "The hallmarks of cancer", Cell, 100(1), p 5770 43 G Ju, L Collins, K L Kaffka, W H Tsien, R Chizzonite, R Crowl, R Bhatt, P L Kilian (1987), "Structure-function analysis of human interleukin-2 Identification of amino acid residues required for biological activity", J Biol Chem, 262(12), p 5723-31 44 U Keilholz, C Conradt, S S Legha, D Khayat, C Scheibenbogen, N Thatcher, S H Goey, M Gore, T Dorval, B Hancock, C J Punt, R Dummer, M F Avril, E B Brocker, A Benhammouda, A M Eggermont, M Pritsch (1998), "Results of interleukin-2-based treatment in advanced melanoma: a case record-based analysis of 631 patients", J Clin Oncol, 16(9), p 2921-9 45 U Keilholz, S H Goey, C J Punt, T M Proebstle, R Salzmann, C Scheibenbogen, D Schadendorf, D Lienard, A Enk, R Dummer, B Hantich, A M Geueke, A M Eggermont (1997), "Interferon alfa-2a and interleukin-2 with or without cisplatin in metastatic melanoma: a randomized trial of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Melanoma Cooperative Group", J Clin Oncol, 15(7), p 2579-88 46 J A Kovacs, M Baseler, R J Dewar, S Vogel, R T Davey, Jr., J Falloon, M A Polis, R E Walker, R Stevens, N P Salzman (1995), "Increases in CD4 T lymphocytes with intermittent courses of interleukin-2 in patients with human immunodeficiency virus infection A preliminary study", N Engl J Med, 332(9), p 567-75 47 D.A Morgan, F.W Ruscetti, R Gallo (1976), "Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows", Science, 193(4257), p 1007-8 48 B H Nelson, D M Willerford (1998), "Biology of the interleukin-2 receptor", Adv Immunol, 70, p 1-81 49 S A Rosenberg, E A Grimm, M Mcgrogan, M Doyle, E Kawasaki, K Koths, D F Mark (1984), "Biological activity of recombinant human interleukin-2 produced in Escherichia coli", Science, 223(4643), p 1412-4 50 S A Rosenberg, J C Yang, S L Topalian, D J Schwartzentruber, J S Weber, D R Parkinson, C A Seipp, J H Einhorn, D E White (1994), "Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high-dose bolus interleukin 2", JAMA, 271(12), p 907-13 65 51 S M Singh, A K Panda (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), p 303-10 52 J R Swartz (2001), "Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins", Curr Opin Biotechnol, 12(2), p 195-201 53 T Taniguchi, H Matsui, T Fujita, C Takaoka, N Kashima, R Yoshimoto, J Hamuro (1983), "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2", Nature, 302(5906), p 305-10 54 T Taniguchi, H Matsui, T Fujita, C Takaoka, N Kashima, R Yoshimoto, J Hamuro (1992), "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 1983", Biotechnology, 24, p 304-9 55 G Unden, S Becker, J Bongaerts, J Schirawski, S Six (1994), "Oxygen regulated gene expression in facultatively anaerobic bacteria", Antonie Van Leeuwenhoek, 66(1-3), p 3-22 66 [...]... hóa cho IL -2 người dạng cải biến ở quy mô nồi lên men 5 lít nhằm tăng sản lượng IL -2 tái tổ hợp; (ii) Tối ưu quá trình tinh chế IL -2 bằng hóa chất và hệ thống HPLC nhằm thu được lượng IL -2 lớn và đạt độ tinh sạch cao; (iii) Xây dựng được công thức bán thành phẩm đối với IL -2 tái tổ hợp để đảm bảo yêu cầu của sản phẩm dược phẩm 27 CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1 Chủng giống và vật liệu... hạn bền và công thức an toàn cho dược phẩm là mục đích đầu tiên Tuy nhiên, cũng cần dựa trên bản chất và thành phần protein trong dược phẩm mà cần phải có sự điều chỉnh hợp lý về các tá dược được bổ sung thêm vào Phương pháp tạo hỗn hợp cho IL -2 tái tổ hợp sau khi tinh chế bằng HPLC được mô tả trong sáng chế US4645830 [14] Sản phẩm của quá trình tinh chế từ HPLC là IL -2 tồn tại trong dung môi iso-propanol... hiệu của gene đích trên vector biểu hiện Chính nhờ có những cải biến này mà chủng E coli BL21 trở thành đối tượng hữu hiệu trong việc biểu hiện gene ngoại lai Chủng E coli BL21 DE3 mang gene il -2 cải biến được ký hiệu là E coli BL21 IL -2 2.1 .2 Vector biểu hiện Gene mã hóa Interleukin- 2 người được cải biến loại bỏ amino acid Alanine ở đầu N và gây đột biến thay thế amino acid Cysteine ở vị trí 125 bằng... nguyên lý và quá trình lên men giữa 2 điều kiện này sẽ có những sai khác về thông số lên men Do đó cần có bước nghiên cứu tối ưu lên men trong bình lên men quy mô 5 lít nhằm tránh những rủi ro khi áp dụng vào sản xuất lên men hàng loạt 1.4 Tinh sạch protein dạng thể vùi 1.4.1 Tổng quan về tinh sạch protein Sự phân lập và tổng hợp IL -2 người trong E coli được mô tả đầu tiên bời Devos và các cộng sự năm... diễn tiến của quá trình lên men, từ đó giúp tăng hiệu quả của quá trình lên men; (ii) Hệ thống lên men đa dạng cho các quy mô khác nhau tùy vào mục đích lên men từ 18 5 lít, 10 lít, 30 lít và 100 lít Tuy nhiên, một vấn đề đáng quan tâm là tất cả các thông số tối ưu lên men ở quy mô phòng thí nghiệm nuôi cấy trong bình tam giác không thể áp dụng hoàn toàn vào quy mô bình lên men lớn vì nguyên lý và quá... sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo ra hiệu ứng không mong muốn tới sản phẩm khi sử dụng trong điều trị Hơn nữa, do hiệu suất tạo sản phẩm cũng như hiệu suất tinh chế thấp nên ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm Sản phẩm IL -2 cuối cùng tạo ra thường có giá thành khá cao Chính vì vậy, công nghệ sản xuất IL -2 trên đã được thay thế bởi công nghệ mới hơn là công nghệ DNA tái tổ hợp 16 Trong tự nhiên, IL -2. .. dược phẩm, cũng như hỗn hợp của một số loại thực phẩm nhằm làm tăng tính tan trong môi trường acid, tăng độ ổn định của dược phẩm trong môi trường có độ pH thấp như trong dạ dày Trong nội dung của các sáng chế đã đề cập ở trên, các thành phần chủ yếu được sử dụng để tạo hỗn hợp cho IL -2 tái tổ hợp gồm có cyclodextrin (22 6 hydroxylpropyl-β-cyclodextrin); albumin huyết thanh của người hoặc bò; các loại... hiện trong E coli từ các sáng chế được công bố trước đây và sản phẩm IL -2 thương mại, đề tài này thưc hiện nghiên cứu để tạo ra công thức IL -2 bán thành phẩm nhằm đảm bảo dạng tồn tại của IL -2 cũng như đạt yêu cầu của sản phẩm dược phẩm Dựa trên những phân tích trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu này với những mục tiêu như sau: (i) Tối ưu điều kiện biểu hiện chủng E coli tái tổ hợp. .. acid 121 -133) và iii) Cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105 Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt tính của IL -2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL -2 [43] Phân tích trình tự amino acid cho thấy IL -2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo. .. cứu của một số sáng chế khác cho thấy, có sự kết hợp của một lọat các thành phần tá dược khác cùng với sự bổ sung của một số loại albumin huyết thanh nhằm làm tăng cường tính tan của IL -2 trong dung dịch Ví dụ, sáng chế US5078997 của Hora M S và cộng sự năm 19 92 đã chứng minh vai trò làm 25 tăng tính tan và độ ổn định của IL -2 đông khô sau hoàn nguyên của hỗn hợp arginine và carnitine [11] Một số thành ... hành đông khô sản phẩm để bảo quản Trên sở tiến hành thực đề tài: Tinh chế Interleukin- 2 người tái tổ hợp cải biến Escherichia coli quy mô nồi lên men tạo công thức bán thành phẩm Mục tiêu đề... protein Interleukin- 2 E coli quy mô nồi lên men lít 32 2 .2. 2 Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin- 2 33 2. 2.3 Phương pháp tinh chế Interleukin- 2 sắc ký lỏng hiệu cao 34 2. 2.4 Kiểm... il -2 quy mô nồi lên men lít nhằm thu lượng IL -2 cao - Tiền xử lý tinh chế IL -2 hệ thống sắc ký HPLC - Xây dựng công thức bán thành phẩm pha chế IL -2 đông khô 3.1 Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2