ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồ ng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồ ng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội-2015 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn kính trọng sâu sắc thầy, PGS TS Trịnh Hồng Thái, người tận tình hướng dẫn em suốt trình học tập thực luận văn Thầy mở cho em vấn đề khoa học lý thú, hướng em vào nghiên cứu lĩnh vực thiết thực vô bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Em học hỏi nhiều Thầy phong cách làm việc, phương pháp nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng cảm ơn đến TS Đỗ Minh Hà thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình giảng dạy dìu dắt suốt thời gian học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị tận tình giúp đỡ bảo suốt trình học tập thực luận văn Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, bạn học viên cao học em sinh viên làm việc phòng, người làm tôi, bên lúc thất bại hay lúc thành công Trong trình thực đề tài, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi PTNTĐ Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học KHTN, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bê ̣nh , bệnh viện K, Hà Nội việc cung cấp mẫu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Luận văn thực phạm vi nội dung kinh phí củađề tài cấp nhà nước (mã số KC.04.10/11-15) Tôi xin chân thành cảm ơn Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố , Mẹ người đã v ất vả nuôi khôn lớn và dạy những bài học làm người đầ u tiên , cảm ơn ông bà, cô chú…những người thân con, người dành tình cảm lời động viên Và cuối xin cảm ơn bạn bè , những người ủng hộ và giúp đỡ Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Hồng Nhung DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic APS Ammonium persulfate ARN Acid Ribonucleic ATP Adenosine Triphosphate AcN Acetonitrile Bp Base pair (cặp bazơ) cs cộng EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HCC Ung thƣ biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) MT/mt Mitochondria (ti thể) mtADN ADN ti thể (mitochondrial DNA) nADN ADN nhân (nuclear DNA) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) Smac/DIABLO Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp protein gắn trình apoptosis điều kiện pI thấp (Second mitochondria-derived activator of inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI) TEA Triethylamine TEAA Triethylammonium acetate tARN ARN vận chuyển (transfer RNA) rARN ARN ribosome (RNA ribosome) caspase/direct DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu Bảng Thành phần hóa chất chạy HPLC Bảng Thành phần phản ứng PCR Bảng Thành phần phản ứng PCR thể tích 15 µl Bảng Công thƣ́c đổ gel polyacrylamide 10% 7cm Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng 10 Bảng 11 Số liệu phân tích HPLC với mẫu có tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp khác Số liệu phân tích HPLC với mẫu có tỉ số lƣợng mt/ACTB khác Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thƣ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú phƣơng pháp ImageJ Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thƣ vú phân tích phƣơng pháp ImageJ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Phân bố gen ADN ti thể Hình Sơ đồ quy trình thí nghiệm Hình Chƣơng trình chạy HPLC Hình Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB Hình ảnh điện di ADN t số tách chiết t mô vú của bê ̣nh nhân Hình ung thƣ vú (điê ̣n di gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide) Hình Hình Hình Hình Hình 10 Kết phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và 200_400bp Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR đoạn mt và ACTB gel agarose 1,7% Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR đa mồi chu kì khác gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB 28 chu kì mẫu khác Hình ảnh khu ẩn lạc sau plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5α Hình 11 Hình ảnh điê ̣n di sau tách plasmid Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB Hình 13 Kết giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt Hình 14 Kết giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB Hình 15 Hình ảnh phân tích HPLC và Biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp Hình 16 Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số mt/ACTB Hình 17 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu Hình 18 Hình 19 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi bệnh nhân ung thƣ vú Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thƣớc khối u bệnh nhân ung thƣ vú Hình 20 Hình 21 Hình ảnh gel phân tích phầm mềm ImageJ Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích phƣơng pháp ImageJ MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ TI THỂ 1.1.1 Cấu trúc và chức ti thể 1.1.2 Những biến đổi ti thể và bệnh ung thƣ TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÚ 11 1.2 1.2.1 Phân loại ung thƣ vú 11 1.2.2 Các giai đoạn ung thƣ vú 12 1.2.3 Các yếu tố nguy 14 1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN TI THỂ Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG 15 16 19 19 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Dụng cụ 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 21 21 2.2.2 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lƣợng: 22 2.2.3 Định lƣợng ADN HPLC và phần mềm ImageJ 26 2.2.4 Tính toán thống kê 28 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ 29 29 3.2 THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 29 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH IMAGEJ 36 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 PHỤ LỤC 60 Tuổi 0,05) Qua so sánh phƣơng pháp phân tích HPLC và ImageJ, kết phân tích có sai khác nhƣng tuân theo xu hƣớng biến đổi (ví dụ, tỉ số mt/ACTB mẫu mô lân cận u cao so với mẫu mô u, máu cao mô u xơ , nhóm tuổi 50 thấp nhóm dƣới 50, …) 49 Nhƣ thấy, phƣơng pháp phân tích ImageJ không cho kết xác HPLC, nhiên, phƣơng pháp này có ƣu điểm là phƣơng pháp đơn giản, cho kết nhanh, chi phí thấp Vì vậy, kết hợp phƣơng pháp sử dụng ImageJ với HPLC PCR định lƣợng để đánh giá số mtADN Phƣơng pháp này thích hợp để áp dụng sở không đƣợc trang bị thiết bị đắt tiền nhƣ HPLC thiết bị PCR định lƣợng Trong nghiên cứu này, tiến hành phân tích 46 bệnh nhân ung thƣ vú và 20 bệnh nhân u xơ vú để nghiên cứu biến đổi số lƣợng mtADN Kết cho thấy bệnh nhân ung thƣ vú, số lƣợng mtDNA mô u thấp đáng kể so với mô lân cận u tƣơng ứng Chứng tỏ biến đổi số lƣợng mtADN dẫn đến khiếm khuyết chức ti thể dẫn đến hình thành khối u ác tính Số mtADN giảm mô u so với mô lân cận u đƣợc tìm thấy bệnh ung thƣ biểu mô gan [38], bệnh ung thƣ dày [33] Bên cạnh đó, giảm số lƣợng mtADN có liên quan với nhóm tuổi bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên Kết này phù hợp với quan sát trƣớc giới nhƣ nghiên cứu năm 2007 Yu và cs, 59 trƣờng hợp bệnh nhân ung thƣ vú có 46 (78%) mẫu có tƣợng giảm số lƣợng mtADN mô u so mô lân cận u tƣơng ứng, tƣợng này thấy xuất thƣờng xuyên nhóm cao tuổi ≥ 50 tuổi (63%) so với nhóm tuổi < 50 (33%) [39] Tuy nhiên, nghiên cứu bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Trung Quốc, Xia và cs (2009) lại không tìm thấy mối liên quan số ADN ti thể với nhóm tuối bệnh nhân [35] Trong nghiên cứu này, tìm thấy số lƣợng mtADN tăng nhóm có kích thƣớc khối u từ 5cm trở lên so với nhóm có kích thƣớc khối u nhỏ 5cm Nhƣ vậy, ngƣợc với trình hình thành khối u, giảm số lƣợng ADN dẫn đến khiếm khuyết chức trình trao đổi lƣợng, ảnh hƣởng đến hoạt động hô hấp tế bào, hay thay đổi chức trình apoptosis dẫn đến việc hình thành tế bào đột biến và cho chúng khả trở thành khối u ác tính việc tiến triển khối u đòi hỏi nhiều lƣợng để đáp ứng nhu cầu tế bào tăng sinh vô hạn, dẫn đến việc tăng số lƣợng mtADN 50 Dựa mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di và giai đoạn bệnh không tìm thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm Điều này không tƣơng đồng với kết mà Xia và cs (2009) có tƣợng biến đổi số lƣợng mtADN giai đoạn bệnh với p < 0,05 [35] Ở bệnh nhân u xơ vú, không tìm thấy khác biệt đáng kể nào số lƣợng mtADN mẫu máu và mẫu mô bệnh nhân Cũng sai khác mẫu mô u xơ và mẫu mô ung thƣ Hiện nay, Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào biến đổi số lƣợng ADN ti thể ung thƣ vú nói riêng và loại ung thƣ khác nói chung, là hƣớng có tiềm cho việc tìm thị sinh học bệnh ung thƣ Bên cạnh đó, cần tăng số lƣợng mẫu nghiên cứu và kết hợp với phƣơng pháp định lƣợng khác nhƣ PCR định lƣợng, kết hợp điều tra với mẫu mô khác nhƣ mẫu máu để khẳ ng đinh ̣ kế t quả nghiên cƣ́u và tăng khả ứng dụng thực tiễn 51 KẾT LUẬN Qua kết thu đƣợc từ phân tích biến đổi số ADN ti thể bệnh nhân ung thƣ vú nguyên phát, rút số kết luận sau: Đã tách chiết thành công 132 mẫu ADN tổng số 46 bệnh nhân ung thƣ vú (gồm mẫu u và mẫu lân cận u) và 20 bệnh nhân u xơ vú (mẫu mô và máu) Sự giảm số lƣợng ADN ti thể có liên quan tới hình thành khối u và có liên quan đến tuổi bệnh nhân ung thƣ vú Ngƣợc lại, số lƣợng ADN ti thể tăng theo kích thƣớc khối u Bằng kỹ thuật HPLC và ImageJ phân tích đƣợc biến đổi số lƣợng ADN ti thể mẫu, HPLC là kỹ thuật định lƣợng xác, ImageJ là kỹ thuật định lƣợng nhanh, hiệu và tốn 52 KIẾN NGHỊ Từ trình nghiên cứu thực tế đƣa số kiến nghị sau: Tiếp tục phân tích tƣợng biến đổi số lƣợng ADN ti thể với mẫu ADN tách từ mô bệnh nhân ung thƣ vú với số lƣợng mẫu lớn Tiến hành phân tích tƣợng biến đổi số lƣợng ADN ti thể với mẫu ADN tách từ máu và mô vú c bệnh nhân ung thƣ vú nhằm tìm mối tƣơng quan chúng, phục vụ cho chẩn đoán bệnh dựa vào mẫu ADN máu Kết hơ ̣p với các phƣơng pháp đ ịnh lƣợng khác đ ể khẳng định kế t quả , góp phầ n tìm các chỉ thi ̣sinh ho ̣c cho chẩ n đoán và điề u tri ̣bê ̣nh ung thƣ vú 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh: Alonso A, Martin P, Albarran C, Aquilera B, Garcia O, Guzman A, Oliva H, Sancho M (1997), “Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis”, Electrophoresis, 18, pp.682-685 Anderson S., Bankier A T., Barrell B G., de Bruijn M H L., Coulson A R., Drouin J., Eperon I C., Nierlich D P., Roe B A., Sanger F., Schreier P H., Smith A J H., Staden R & Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp.457-465 Bassam B J., Caetano-Anollés G and Gresshoff P M (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Anal Biochem, 196 (1), pp.80-83 Bianchi M., Bianchi N and Bailliet G (1995), “Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients”, Cytogenet Cell Genet, 71, pp.99-103 Carew J and Huang P (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mol Cancer, 12, pp.1-12 Chester K.A., Robson L., Begent R.H., Pringle H., Primrose L., Talbot I.C., Macpherson A.J., Owen S.L., Boxer G., Malcolm A.D (1990), “In situ and slot hybridization analysis of RNA in colorectal tumours and normal colon shows distinct distributions of mitochondrial sequences”, J Pathol, 162, pp.309-315 Dimauro S (2007), “Mitochondrial DNA medicin”, Biosci Rep, 27 (1–3), pp.5-9 DiMauro S and Schon E (2001), “Mitochondrial DNA mutations in human disease”, Am J Med Genet, 106, pp.18-26 Hileman E.O., Achanta G., Huang P (2001), “Superoxide dismutase: an emerging target for cancer therapeutics”, Expert Opin Ther Targets, 5, pp.697-710 54 10 Hockenbery D (2002), “A mitochondrial achilles heel in cancer?”, Cancer Cell, 2, pp.1-2 11 Jerónimo C., Nomoto S., Caballero O.L., Usadel H., Henrique R., VarzimG., OliveiraJ., Lopes C., Fliss MS Sidransky D (2001), “Mitochondrialmutations in earlystageprostatecancer and bodily fluids”, Oncogene, 20, pp.5195-5198 12 King MP., Attardi G (1989), “Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation”, Science , 246, pp.500503 13 Kornburg H (1987), "Tricarboxylic acid cycles," Bioessays , 7, pp 236-238 14 Lightowlers R.N., Chinnery P.F., Turnbull D.M & Howell N (1997), “Mammalian mitochondrial genetics, heredity, heteroplasmy and disease”, Trends Genet, 13, pp.450–455 15 Lin C.S., Wang L.S., Tsai C.M., and Wei Y.H (2008), “Low copy number and low oxidative damage of mitochondrial DNA are associated with tumor progression in lung cancer tissues after neoadjuvant chemotherapy” Interact Cardiovasc Thorac Surg., (6), pp.954-958 16 Liu V.W., Shi H.H., Cheung A.N., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C., Ngan H.Y (2001), “ High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas”, Cancer Res, 61, pp.5998-6001 17 Liu X., Kim C., Yang J., Jemmerson R and Wang X (1996) , "Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c", Cell , 86, pp.147-157 18 Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D & Poulton J (1998), “Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease”, Am J Hum Genet, 63, pp.769–775 19 Modica-Napolitano J.S., Singh K.K (2002), “Mitochondria as targets for detection and treatment of cancer”, Exp Rev Mol Med, (9), pp 1-19 55 20 Montoya J., Ojala D., Attardi G (1981), “Distinctive features of the 5'terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs”, Nature, 290 (5806), pp.465-70 21 Parrella P., Xiao Y., Fliss M., Sanchez-Cespedes M., Mazzarelli P., Rinaldi M., Nicol T., Gabrielson E., Cuomo C., Cohen D., Pandit S., Spencer M., C Rabitti., Fazio VM., Sidransky D (2001), “Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates”, Cancer Res, 61, pp.7623-7626 22 Pinz KG & Bogenhagen DF (1998) “Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes”, Mol Cell Biol, 18, pp.1257–1265 23 Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J.K., Markowitz S.D., Trush M.A., Kinzler K.W., Vogelstein B (1998), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet, 20, pp.291293 24 Sharp M.G., Adams S.M, Walker R.A., Brammar W.J., Varley J.M (1992) “Differential expression of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II in benign and malignant breast tissue” J Pathol, 168, pp.163-168 25 Shuster R.C., Rubenstein A.J & Wallace D.C (1988), “Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells” Biochem Biophys Res, 155, pp.1360-1365 26 Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G (1999), “Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor” Nature, 397, pp.441-446 27 Staniek K., Gille L., Kozlov A.V., Nohl H (2002), “Mitochondrial superoxide radical formation is controlled by electron bifurcation to the high and low potential pathways” Free Radic Res, 36, pp.381- 387 28 Taanman J.W., Street R H., and L Nw (1999), “The mitochondrial genome : structure, transcription, translation and replication”, Biochim Biophys Acta, 1410 (2), pp.103-123 56 29 Tan D.J., Bai R.K., Wong L.J (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res, 62, pp.972976 30 Thyagarajan B., Wang R., Nelson H., Barcelo H., Koh W and Yuan J (2013), "Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk" PLoS One, 8(6), e65968 31 Wang Y, Liu V.W., Xue W.C., Cheung A.N., Ngan H.Y (2006), “Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression”, Br J Cancer, 95, pp.1087-91 32 William L.D., John S.S (2002) “Cancer of the breast”, Elsevier Health Sciences, pp.169-179 33 Wu C.W., Yin P.H., Hung W.Y., Li A.F., Li S.H., Chi C.W., et al (2005), “Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer”, Genes Chromosomes Cancer, 44, pp.19–28 34 Warburg O (1956), “On the origin of cancer cells”, Science, 123, pp.309314 35 Xia P., An H., Dang C., Radpour R., Kohler C., Fokas E., Engenhart-Cabilic R., Holzgreve W and Zhong X (2009), “Decreased mitochondrial DNA content in blood samples of patients with stage I breast cancer”, BMC Cancer, 9, pp.454 36 Yamada S., Nomoto S., Fujii T., Kaneko T., Takeda S., Inoue S., et al (2006), "Correlation between copy number of mitochondrial DNA and clinico-pathologic parameters of hepatocellular carcinoma", Eur J Surg Oncol, 32, pp.303–7 37 Ye C., Shu X., Wen W., Pierce L., Courtney R., Gao Y., Zheng W and Cai Q (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Res Treat, 108 (3), pp.427–34 38 Yin P.H., Lee H.C., Chau G.Y., Wu Y.T., Li S.H., Lui W.Y., Wei Y.H., Liu T.Y., and Chi C.W (2004), “Alteration of the copy number and deletion of 57 mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma”, Br J Cancer, 90 (12), pp.2390–6 58 39 Yu M., Zhou Y., Shi Y., Ning L., Yang Y., Wei X., N Zhang, X Hao, and Niu R (2007), “Reduced mitochondrial DNA copy number is correlated with tumor progression and prognosis in Chinese breast cancer patients”, IUBMB Life, 59 (7), pp 450–457 Tài liệu trang web 40 http://benhvienk.com/ (20.05.2014) 41 http://breastcancer.about.com/od/types/a/bc_types.htm (30/1/2015) 42 http://www.cancerresearchuk.org/ (12.05.2014) 43 http://www.cancer.org/cancer/breastcancer/detailedguide/breast-cancer-riskfactors 44 http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/breast-new.asp 59 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân u xơ số liệu phân tích ImageJ, HPLC LOẠI MẪU PHƢƠNG PHÁP STT Mã BN MẪU MÁU ImageJ Tên HPLC MẪU MÔ ImageJ HPLC Tỉ số Tỉ số mt/ACTB mt/ACTB 13477 Nguyễn Hải M 1.3 1.3 2.1 1.9 27215 Trần Thị T 3.8 3.6 5.5 5.1 27222 Trƣơng Nguyệt M 2.7 2.5 3.7 3.4 27236 Lê Hƣơng T 4.5 5.1 3.3 3.0 27237 Nông Thị Thùy L 2.2 2.1 27241 Đoàn Bích H 2.7 2.6 0.8 0.8 27253 Nguyễn Thùy C 2.0 2.0 1.3 1.5 27257 Nguyễn Hoàng Nhƣ N 4.7 4.4 2.9 2.5 27263 Trƣơng Hoàng L 2.4 2.1 2.6 2.5 10 27269 Nguyễn Thị Tuyết M 1.7 1.2 2.5 2.0 11 27896 Trần Phƣơng T 2.8 3.1 6.4 6.7 12 27901 Trần Thị Thu H 3.8 3.8 2.4 2.0 13 27905 Phạm Thị T 5.5 5.1 2.1 2.2 14 27907 Vƣơng Thị C 5.0 6.0 2.3 3.6 15 27908 Đặng Thị H 0.9 0.9 2.8 3.9 16 27913 Nguyễn Thị T 2.8 3.2 0.7 0.6 17 27921 Trần Thị R 2.1 1.9 0.7 0.9 18 27927 Phạm Thị H 3.9 4.4 1.2 1.4 19 27931 Trƣơng Thị T 3.3 3.6 2.9 2.9 20 27936 Phạm Thị Đ 2.5 2.0 1.2 1.3 60 Phụ lục Danh sách bệnh nhân ung thƣ vú số liệu phân tích ImageJ, HPLC LOẠI MẪU MÔ LÂN CẬN U PHƢƠNG PHÁP S TT Mã BN Tên Tuổi ImageJ Kích Số Phân Mức thƣớc hạ loại độ biệt u(cm) ch TNM hóa HPLC MÔ U ImageJ HPLC Tỉ số Tỉ số mt/ACTB mt/ACTB 8239 Phạm Thị X 51 17 T2N0M0 - 2.3 3.2 0.9 1.1 8304 Nguyễn Thị H 42 T2N0M0 - 3.1 3.0 2.8 3.0 8625 Nguyễn Thị Ƣ 74 15 T2N1M0 - 1.7 2.3 1.7 2.2 10073 Nguyễn Thị P 56 T2N0M0 - 1.9 1.0 1.9 1.1 10106 Đoàn Thị B 63 T2N0M0 - 1.3 2.1 1.4 1.3 10193 Ngô Ngọc O 54 T2N0M0 - 2.1 1.4 1.3 1.0 25366 Chu Thị T 50 T2N1M0 rõ 0.5 0.5 1.5 1.5 25766 Lê Thị N 43 1,2 T1N2M0 vừa 0.9 1.0 1.3 0.9 26136 Ngô Thị C 59 T4N1M0 vừa 1.4 1.3 2.1 1.7 10 26137 Đào Thị L 55 5,5 22 T3N1M0 3.7 4.0 1.4 2.8 11 26300 Bùi Thị C 45 T2N2M0 1.8 1.8 2.2 2.7 12 26301 Vũ Thị L 51 T2N1M0 vừa 2.6 2.7 2.5 2.5 13 26452 Nguyễn Thị T 51 2,5 T2N1M0 vừa 1.3 1.6 1.9 1.9 14 26454 Trƣơng Hồng T 40 4,5 T3N0M0 vừa 2.0 1.9 2.1 1.9 15 26661 Nguyễn Thị Kim A 41 2,5 T2N0M0 vừa 1.4 1.2 3.1 1.8 16 26671 Vũ Thi X 50 2,5 T2N0M0 vừa 2.8 2.2 3.8 1.6 17 26708 Nguyễn Thị S 64 2,8 T2N1M0 vừa 2.4 3.3 1.1 1.1 18 27054 Nguyễn Thị T 75 T4N1M0 6.9 7.8 2.9 3.2 19 27136 Vũ Thị L 54 3,5 T3N0M0 4.9 4.5 2.7 2.8 20 27398 Nguyễn Thị L 61 1,5 13 T1N0M0 vừa 4.1 5.2 2.4 2.1 21 27400 Phạm Thị L 60 T1N1M0 vừa 5.9 5.4 3.9 4.7 22 31249 Hoàng Thị L 54 3,5 T4N1M0 rõ 3.6 3.8 2.2 2.2 23 31250 Vũ Thị D 47 6,5 T3N0M0 vừa 7.1 6.8 2.1 2.2 24 31371 Nguyễn Thị B 59 15 T2N0M0 - 4.3 4.2 3.2 1.9 25 31403 Nguyễn Thị H 34 14 28 T3N1M0 vừa 7.2 6.0 3.0 2.4 26 31404 Vũ Thị L 50 15 T2N0M0 vừa 1.4 1.7 3.2 2.1 27 31420 Nguyễn Thị N 50 20 10 T2N2M0 3.0 3.2 2.7 2.6 28 31646 Phạm Thị T 60 20 19 T4N1M0 3.1 3.2 3.0 3.1 29 31654 Hoàng Thị M 67 15 T3N1M0 vừa 2.7 6.1 4.5 4.1 30 31716 Ngô Thị Diệp H 30 14 T2N0M0 vừa 5.6 5.4 2.7 3.7 31 31720 Hà Thị C 47 16 T2N0M0 vừa 4.8 4.1 2.7 2.9 32 31755 Nguyễn Thị T 46 1,5 T1N2M0 vừa 5.5 4.3 2.0 2.1 33 32009 Dƣơng Thị N 60 16 11 T3N2M0 3.5 6.2 3.2 5.2 34 32427 Vũ Thị P 64 14 T2N0M0 vừa 6.3 6.5 4.3 5.2 35 33190 Nguyễn Thị N 24 7 T2N0M0 4.0 3.3 3.7 4.7 36 33286 Lê Thị T 49 T1N0M0 vừa 4.0 4.3 3.8 3.6 37 33354 Trần Thị Ánh H 40 14 T2N1M0 vừa 4.4 4.4 4.1 3.7 38 33538 Phan Thị V 46 14 15 T2N1M0 vừa 5.2 5.4 4.9 3.1 39 33696 Trƣơng Thị T 41 15 T2N0M0 vừa 5.5 5.5 3.7 3.1 40 34115 Vũ Thị T 43 2.5 T2N1M0 vừa 4.7 4.5 3.5 3.6 41 34695 Ngô Thị Thanh T 32 16 T2N0M0 6.0 7.8 3.5 3.6 42 35670 Phạm Thị Bích L 36 18 T1N1M0 vừa 1.7 1.5 5.0 6.0 43 36235 Nghiêm Thị L 47 16 T2N1M0 2.5 3.0 2.7 2.6 44 19320 Nguyễn Tố H 55 3,3 T2N0M0 vừa 1.4 1.1 0.8 0.5 45 - Thái Thị Hồng L 40 11 T2N1M0 - 1.3 1.3 2.4 2.5 46 9956 Đoàn Thị M 48 4,5 13 - - 2.8 4.3 1.6 1.7 [...]... trong mô u ở một số bệnh nhân so với mô bình thƣờng [24] 1.1.2.2 Biến đổi số lượng bản sao gen ti thể và bệnh ung thư Nhƣ đã nêu ở trên, mỗi tế bào chứa hàng trăm, ngàn ti thể, trong mỗi ti thể lại chứa 2-10 bản sao mtADN, tuy nhiên số lƣợng bản sao mtADN tƣơng đối ổn định trong diều kiện sinh lí Nhiều nghiên cứu ở bệnh nhân ung thƣ nguyên phát đã chỉ ra rằng thay đổi số lƣợng bản sao mtADN là một... tố ảnh hƣởng đến hoạt động của ti thể và có liên 9 quan đến sự hình thành và phát triển ở nhiều loại ung thƣ Biến đổi số lƣợng bản sao mtADN liên quan đến bệnh ung thƣ đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi bằng nhiều phƣơng pháp ti p cận Năm 2004, Yin và cs đã nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN và ti thể ở bệnh nhân ung thƣ biểu mô gan (HCC) Ở bệnh nhân HCC số lƣợng bản sao mtADN giảm ở mô u so... nhiều nghiên cứu về biến đổi số lƣợng bản sao ADN ti thể, nhƣng ở Việt Nam đây là một hƣớng nghiên cứu rất mới Cho đế n nay, chúng tôi vẫn chƣa tìm thấy một công bố chính thƣ́c về nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN đố i với bê ̣nh ung thƣ nói chung và ung thƣ vú nói riêng ở Việt Nam 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN TI THỂ Nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN đang là một hƣớng nghiên. .. biến đổi số lƣợng bản sao mtADN đối với bệnh nhân ung thƣ nói chung và bệnh nhân ung thƣ vú nói riêng, qua đó đánh giá đƣợc vai trò và mức độ liên quan của biến đổi đó đối với bệnh 18 Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là mô vú tại vị trí khối u và mô vú lân c ận ở rìa vị trí u của bệnh nhân ung thƣ vú Mẫu mô vú sử dụng trong nghiên. .. số lƣợng bản sao mtADN có thể đóng vai trò trực ti p là tác nhân gây ung thƣ Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự thay đổi số lƣợng bản sao mtADN có liên quan đến hình thành và ti n triển của nhiều loại ung thƣ nhƣ ung thƣ hạch bạch huyết (Non-Hodgkin lymphoma), ung thƣ phổi, ung thƣ dạ dày, ung thƣ thận, ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ đại trực tràng và ung thƣ vú, Ung thƣ vú là bệnh ung thƣ phổ biến. .. với những bệnh nhân ung thƣ vú nguyên phát mắc dƣới 3 năm có số lƣợng bản sao mtADN trong máu ngoại vi cao Không có mối liên quan giữa số lƣợng bản sao mtADN và nguy cơ ung thƣ vú ở phụ nữ đã cung cấp mẫu máu trên 3 năm trƣớc khi chẩn đoán ung thƣ vú Nghiên cứu này cho thấy ti m năng giữa số lƣợng bản sao mtADN và nguy cơ ung thƣ vú phụ thuộc vào thời gian lấy máu và chẩn đoán ung thƣ vú [30] Hiện... khác Số lƣợng bản sao mtADN giảm đƣợc tìm thấy trong nhóm bệnh nhân ung thƣ trong giai đoạn mãn kinh Không có sự khác biệt về số lƣợng bản sao mtADN liên quan đến tuổi, số hạch, ER, PR, Her-2 / neu Trong nghiên cứu này, số lƣợng bản sao mtADN giảm trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thƣ vú đƣợc gắn liền với giai đoạn I Việc sử dụng mtADN có thể có giá trị chẩn đoán và nghiên cứu sâu hơn, có ti m... năng trở thành một chỉ thị để phát hiện sớm ung thƣ vú [35] Năm 2013, Thyagarajan và cs đã nghiên cứu mối liên quan giữa số lƣợng bản sao mtADN trong máu ngoại vi và nguy cơ ung thƣ vú ở 184 bệnh nhân ung thƣ vú và 529 mẫu đối chứng Số lƣợng bản sao mtADN đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR định lƣợng Các phân tích đã cho thấy rằng có mối liên hệ giữa số lƣợng bản sao mtADN và nguy cơ ung thƣ vú Nguy... xơ gan Bệnh nhân HCC có hàm lƣợng mtADN thấp hơn thƣờng có ti n lƣợng xấu hơn và thời gian sống ngắn hơn [36] Đối với bệnh nhân ung thƣ phổi NSCLC, tìm ra mối liên hệ giữa giảm số lƣợng bản sao mtADN đƣợc gắn liền với sự phát triển của khối u Tƣơng tự, sự giảm hàm lƣợng mtADN phổ biến hơn ở các bệnh nhân ung thƣ dạ dày [33] Một số nghiên cứu khác cho thấy số lƣợng bản sao mtADN trong mô ung thƣ... nhân bản của mtADN là không đồng bộ với quá trình nhân bản nADN, số lƣợng tổng thể của ti thể trong mỗi tế bào vẫn tƣơng đối ổn định trong các loại tế bào cụ thể trong quá trình tăng sinh, cho thấy rằng quá trình tạo ti thể quyết định phần lớn bởi các tín hiệu ngoài ti thể Sự sinh tổng hợp của ti thể có thể ti p tục ngay cả khi mất mtADN Nhƣ vậy, việc nhân bản ti thể không cần sự có mặt của mtADN ... loại mẫu bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thƣ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú phƣơng... ung thƣ vú 12 1.2.3 Các yếu tố nguy 14 1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN TI THỂ Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN... u số bệnh nhân so với mô bình thƣờng [24] 1.1.2.2 Biến đổi số lượng gen ti thể bệnh ung thư Nhƣ nêu trên, tế bào chứa hàng trăm, ngàn ti thể, ti thể lại chứa 2-10 mtADN, nhiên số lƣợng mtADN