Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Do gia tăng liên tục giá thành dầu thô-nguồn lượng giới nay, nhiều đề tài nghiên cứu gần quan tâm đến việc phát triển nguồn nhiên liệu có giá trị mặt kinh tế môi trường Có thể nói nhiên liệu sinh học nguồn nhiên liệu đầy tiềm hứa hẹn thay cho nguồn xăng dầu cạn kiệt tương lai, đặc biệt nhiên liệu sản xuất thông qua trình lên men từ nguồn nguyên liệu tái tạo, điển hình butanol Hiện butanol thương mại sản xuất chủ yếu từ đường hóa dầu kết nghiên cứu cho thấy trình lên men từ vi sinh vật để thu nhận butanol có nhiều triển vọng Quá trình lên men sản xuất butanol hay gọi trình lên men Ethanol-Butanol-Acetone (ABE) thực giống vi khuẩn Clostridium, đặc biệt loài Acetobutylicum (Lin Blaschek, 1983) Loài vi sinh vật xem lâu đời nghành công nghiệp lên men kỵ khí bắt buộc Nó xếp vị trí thứ hai sau lên men ethanol từ nấm men Saccharomyces cerevisiae quy mô sản xuất Quá trình lên men ABE thực rộng rãi công nghiệp đến nửa đầu kỷ 20 với 66% sản lượng tiêu thụ toàn giới butanol sản xuất từ phương pháp sinh học (Dürre, 2008) Tuy nhiên, với đời Thế chiến thứ hai phát triển leo thang ngành công nghiệp hóa dầu, sản xuất butanol từ phương pháp sinh học nhanh chóng giảm dần Đến năm 1960, hiệu thấp trình lên men ABE so ngành công nghiệp hóa dầu với chi phí cao sử dụng nguồn carbohydrate làm chất dẫn tới kết việc xoá bỏ hoàn toàn hoạt động công nghiệp từ trình lên men Tuy nhiên, giá dầu bắt đầu tăng từ đầu năm 1970 "cuộc khủng hoảng dầu thô" với suy giảm dần nguồn dầu thúc đẩy xã hội toàn giới nhận thức vấn đề môi trường tình trạng cấp cứu, làm cho người quan tâm đến ngành công nghiệp sinh học (Dürre, năm 1998; Dürre, 2008) Kể từ đó, nỗ lực nghiên cứu đáng kể trình lên men ABE sản xuất butanol thực nhiều lĩnh vực, cụ thể ngành công nghệ vi sinh vật, tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng dung môi, nghiên cứu thay đổi điều kiện lên men nhằm cải thiện suất thấp nồng độ butanol dịch lên men Giống trình sinh học khác, trình lên men ABE thể số hạn chế kinh tế khả cạnh tranh so với trình sản xuất phương pháp hóa học tinh khiết Những bất lợi trường hợp liên quan đến đường trao đổi chất phức tạp vi khuẩn sản xuất butanol Trong chu trình lên men ABE tiêu biểu từ nguồn carbohydrate: axit butyric, propionic acetic trước hết sinh tổng hợp C acetobutylicum (acidogenesis) giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân tế bào Khi vi sinh vật bước vào giai SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn đoạn ổn định bắt đầu giai đoạn tạo thành acetone, butanol ethanol theo tỷ lệ 3:6:1 tương ứng (solventogenesis) (Fond et al, 1985.) Quá trìnhchuyển pha từ acidogenesis sang solventogenesis điều khiển cách thay đổi làm giảm pH ( gl -1) (Gottschalk Morris, 1981; Gottwald Gottschalk, 1985; Monot etal., 1984) Tuy nhiên, trình lên men thực tế phức tạp cần phải kiểm soát chặt chẽ điều kiện lên men để đạt hiệu cao (Chauvatcharin et al., 1998) Trong trình lên men ABE truyền thống, mật độ tế bào vi sinh vật thấp môi trường lên men làm hiệu suất sinh tổng hợp butanol từ glucose nói chung thấp thường khoảng 15% (w / w) vượt 25% (w / w) Ngoài ra, việc sinh tổng hợp butanol bị giới hạn nhiều yếu tố ức chế khác, butanol yếu tố gây ức chế ngược lên tăng trưởng tế bào làm ngừng trình lên men Trong thực tế, vi khuẩn khó trì hoạt tính nồng độ butanol dịch lên men xấp xỉ 10 gl-1 Kết nồng độ butanol dịch lên men ABE thường xấp xỉ 13 gl-1 Do đó, việc sản xuất butanol từ trình lên men ABE truyền thống cho hiệu kinh tế thấp (Maddox, 1989) Nội dung viết giới thiệu chung butanol ứng dụng thực tiễn Dựa nghiên cứu gần trình lên men tĩnh sản xuất butanol trình bày số chủng Clostridium phân lập có khả sinh tổng hợp chịu nồng độ butanol cao Giới thiệu nguồn chất khác mà vi sinh vật sử dụng để lên men yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men tạo butanol, qua so sánh hiệu suất sinh tổng hợp butanol Trình bày số kết nghiên cứu đạt lên men sử dụng tế bào vi khuẩn cố định số chất mang Các phương pháp tách chiết butanol từ dịch sau lên men giới thiệu viết SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 2: BUTANOL 2.1 Giới thiệu chung Butanol (danh pháp IUPAC, 1-butanol; CAS no.71-36-3) gọi rượu butylic, n-butanol methylolpropane, rượu gồm cacbon có công thức phân tử C4H9OH (KLPT = 74,12 g.mol-1) Butanol chất lỏng không màu, dễ cháy, kỵ lỏng, có mùi thơm chuối hương có mùi cồn mạnh Khi tiếp xúc trực tiếp gây kích ứng mắt da.Hơi có tác dụng kích thích vào niêm mạcmàng có khả gây mê hít phải nồng độ cao.Butanol hòa tan hoàn toànvới dung môi hữu phổ biến, lại hòa tan nước (Lee cộng sự, 2008a) Hình 1: Cấu trúc không gian butanol Bảng 1: Tính chất vật lý n- butanol 74.12 g mol-1 Dung dịch lỏng màu vàng 0.810– 0.812 −90 °C, 183 K, -130 °F 118 °C, 391 K, 244 °F 9.0 ml/100 ml (7.7 g/100 ml 20°C) 35–37 oC 343–345 oC 25–29 oC 43.8 kJ mol-1 198.2 kJ mol-1 0.63 kPa Khối lượng phân tử Dạng tồn Tỷ trọng Nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ sôi Độ tan nước Nhiệt độ đánh lửa Nhiệt độ tự bốc cháy Flash point Nhiệt hóa Nhiệt đốt cháy Áp suất 20oC SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 2.2 Ứng dụng butanol thực tiễn Một ứng dụng ưu việt lớn biobutanol (butanol sinh học) sử dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu cho động Trong ethanol nhận nhiều quan tâm nguồn nhiên liệu hỗ trợ nhiều lý (Hansen et al., 2005 Niven, 2005) butanol lại cho thấy lựa chọn tốt hơnso với ethanol có tính chất hóa học vật lý phù hợp Bảng 2: Bảng so sánh tính chất butanol với xăng ethanol Tính chất Nhiệt độ sôi (oC) Tỷ trọng 20°C (g/ml) Khả tan 100g nước Mật độ lượng (MJ.l-1) Nhiệt bay (MJ/kg) Nhiệt dung riêng (kJ/kmol.ºK) Chỉ số Octane Độ nhớt (10-3 Pa.s) Butanol 117–118 0.8098 Không tan Xăng 27–221 0.7–0.8 Không tan Ethanol 78 0.7851 Tan 27–29.2 0.43 178 32 0.36 160–300 19.6 0.92 112.3 96 2.593 91–99 0.24–0.32 129 1.078 Theo Shapovalop Ashkinazi, (2008) Dürre, (2007) butanol thể nhiều ưu điểm vượt trội so với ethanol việc thay nguồn nhiên liệu xăng dầu, cụ thể: - Giá trị lượng butanol 29.2 MJ/L giá trị lượng ethanol 19.6 MJ/L xăng 32 MJ/L lượng butanol nhiều ethanol khoảng 25% - Dựa vào áp suất thấy butanol sử dụng an toàn so với ethanol butanol bay ethanol xăng - Butanol gây ăn mòn so với ethanol, không ảnh hưởngđến thiết bị chứa đựng bể chứa, đường ống, máy bơm… sử dụng lâu dài - Khả hòa tan thấp nước butanol cho phép pha xăng dầu nồng độ cao loại nhiên liệu sinh học mà không sợ bị tách pha làm xuất nước, ethanol pha thêm vào xăng khoảng 25% vàchỉ giữ thời gian ngắn để sử dụng Áp suất butanol (4 mmHg 20°C) thấp so với ethanol 11 lần (45 mmHg 20°C) cho phép pha trực tiếp vào xăng mà không cần quan tâm đến bay - Trong trình đốt cháy, butanol không thải hợp chất khí chứa sulphur oxit nitơ, ưu điểm vượt trội môi trường so với nguồn nhiên liệu khác SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Với ưu điểm với nguồn chất phong phú sử dụng trình lên men ABE, biobutanol tiềm lớn việc thay nguồn nhiên liệu xăng dầu cạn kiệt góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính Bên cạnh vai trò nhiên liệu sinh học cho động cơ, butanol thực hóa chất quan trọng sử dụng với lượng lớn ngành công nghiệp Gần nửa sản lượng butanol sản xuất toàn giới sử dụng làm dung môi dạng butyl acrylate este methacrylate sản xuất loại sơn nhưenamel,nitrocellulose; keo dán, chất đàn hồi, công nghệ dệt may, sản xuất sợi, nhựa, sản xuất kính an toàn, chất tẩy rửa Các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từ butanol butyl ete glycol, butylacetate,amin butyl,nhựa amin chất dẻo Nó sử dụng làm dung môi ngành công nghiệp mỹ phẩm nước hoa, sản phẩm trang điểm cho mắt, sơn móng tay…và dùng cho việc sản xuất loại thuốc kháng sinh, vitamin hormone SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SẢN XUẤT BUTANOL – CLOSTRIDIUM 3.1 Đặc điểm hình thái Clostridium giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes Đây vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả sinh nha bào môi trường sống bất lợi Đại diện tiêu biểu loài Clostridium acetobutylicum có dạng hình que thẳng, kích thước khác từ 0,5-1,5 × 1,5-6 μm (Robinson, 2000) Clostridium acetobutylicum vi khuẩn Gram dương phát triển giai đoạn logarite canh trường,và chuyển thành Gram âm bước sang giai đoạn ổn định sinh bào tử, lên men dị dưỡng, di động roi Trong trình hình thành bào tử, tế bào phình lên rõ rệt tích trữ hạt, polysaccharide cung cấp nguồn carbon lượng giai đoạn solventogenesis Bào tử hình thành có dạng bầu dục Các vi sinh vật thuộc giống Clostridium lên men thường xếp thành bốn nhóm khác dựa đặc tính sinh hóa di truyền chúng (Woods, 1995) bao gồm: Clostridium acetobutylicum, C.beijerinckii,C.saccharobutylicum, C saccharoperbutylacetonicum Hai loài biết đến với nhiều ưu điểm vượt trội C acetobutylicum C beijerinckii (trước gọi C butylicum) hầu hết tài liệu nghiên cứu lên men ABE dựa hai loài Hình 2: Hình ảnh C.acetobutylicum C.beijerinckii kính hiển vi điện tử (SEM) 3.2 Đặc điểm sinh lý vi khuẩn Clostridium 3.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng - Nguồn Carbon: Quá trình tổng hợp acetone, butanol, and ethanol từ loài thuộc giống Clostridium bắt nguồn từ chất carbohydrate Nhóm vi sinh vật có khả sử dụng nguồn dinh dưỡng đa dạng, sử dụng gần hoàn toàn loại đường glucose, fructose, mannose, sucrose, lactose sử dụng phần đường xylose, SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn galactose, arabinose, raffinose… Nhiều nghiên cứu cho thấy glucose loại đường tốt cho Clostridium sử dụng - Nguồn Nitơ: Nitơ thành phần quan trọng protein enzyme, cung cấp vào môi trường nhân giống lên men cho vi sinh vật sử dụng dạng muối NH 4+ NO3hay hợp chất hữu phức tạp từ chất chiết nấm men, sản phẩm thủy phân từ đậu nành… Việc bổ sung nitơ cần thiết cho việc tạo sinh khối vi sinh vật, nhiên bổ sung nhiều làm ức chế việc sinh tổng hợp sản phẩm - Khoáng: Sự phát triển tế bào vi khuẩn phụ thuộc vào muối khoáng môi trường Mg2+, Fe2+, Mn2+ K+ Chúng cung cấp dạng muối MgSO 4, MnSO4, FeSO4, KCl, KH2PO4 K2HPO4;…Nếu nồng độ Mg2+ Mn2+ môi trường cao gây ức chế đến sinh trưởng tế bào - Yếu tố sinh trưởng: Cũng giống loài vi khuẩn khác, trình sinh trưởng phát triển Clostridium đòi hỏi cung cấp số yếu tố sinh trưởng biotin, thiamine hydrochloride, p-aminobenzoic, resazurin… Các yếu tố diện môi trường nồng độ tương đối thấp từ 0.1-1 mg/L, ảnh hưởng nhiều đến hoạt động trao đổi chất vi khuẩn trình lên men Các loại môi trường thường sử dụng để nuôi cấy nhân giống vi khuẩn Clostridium: - Môi trường P2: môi trường tối ưu cho tất loài Clostidium phát triển, sử dụng làm môi trường giữ giống lên men với nồng độ glucose khác Thành phần Glucose MgSO4.7H2O MnSO4.H2O FeSO4.7H2O KCl KH2PO4 K2HPO4 Ammonium acetate p-aminobenzoic acid Thiamin Biotin Dịch trích nấm men SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Hàm lượng (g/L) 60 20 1 50 50 220 0.1 0.1 0.001 Đồ án chuyên ngành - GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Môi trường Tryptone-yeast extract-sucrose(TYS): Thành phần Sucrose Na2SO4 K2HPO4 Dịch trích nấm men Biotin p-aminobenzoic acid Tryptone Antifoam C - Hàm lượng (g/L) 60 0.18 3.48 5.0 0.01 0.01 1.0 0.5 ml Môi trường CAB: môi trường sử dụng làm môi trường giữ giống lên men tối ưu cho loài Clostridium acetobutylicum Thành phần Glucose Dịch trích nấm men Tryptone K2HPO4 KH2PO4 DL-asparagine MgSO4.7H2O MnSO4.H2O NaCl FeSO4.7H2O resazuin Hàm lượng (g/L) 50 0.7 0.7 0.5 0.1 0.1 0.1 0.015 0.002 3.2.2 Điều kiện nuôi Nhiệt độ hoạt động Clostridium nằm khoảng từ 29-37oC, tùy thuộc vào loài mà có nhiệt độ tối thích khác nhau.Clostridium acetobutylicum có nhiệt độ tối thích nằm khoảng 35-37 oC, loài Clostridium beijerinckii lại 31-32 oC Clostridium saccharobutylicum 30 oC Đa số trình nhân giống lên men sử dụng vi khuẩn Clostridium acetobutylicum trì 35 oC pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng tạo sản phẩm Clostridium Khoảng pH tối thích loài thuộc giống Clostridium nằm khoảng từ 5.0-6.5, thay đổi làm giảm pH 4.5 có khả gây ức chế sinh trưởng vi khuẩn Đa số môi trường ban đầu chỉnh pH=6.5, nhiên với trình sinh trưởng vi khuẩn lại sinh hợp chất SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn axit butyric, propionic acetic làm giảm pH môi trường Vì vậy, cần kiểm soát điều chỉnh pH suốt trình sinh trưởng vi khuẩn 3.3 Các loài vi sinh vật dùng sản xuất butanol Như giới thiệu trên, loài có khả sinh tổng hợp butanol bao gồm bốn loài là: Clostridium acetobutylicum, C beijerinckii, C saccharobutylicum Clostridium saccharoperbutylacetonicum Clostridium acetobutylicum loài có đặc tính di truyền khác biệt liên quan đến ba loài lại Những chủng thuộc loài phát triển tốt môi trường chất từ dịch thủy phân tinh bột nên sử dụng phổ biến quy mô công nghiệp để sản xuất dung môi Clostridium acetobutylicum loài nghiên cứu sản xuất dung môi nhiều nhất, nhiều chủng phát triển từ loài cho khả tổng hợp butanol cao Cho đến nay, số kết lên men tốt từ chủng C acetobutylicum PCSIR-10 có khả kháng butanol, sử dụng chất rỉ đường mía thực Syed (1994) Theo đó, tổng nồng độ dung môi đạt 19.2 g/L với hiệu suất 34% Loài Clostridium beijerinckii liên quan nhiều đến hai loài C saccharobutylicum C saccharoperbutylacetonicum Cả ba biết đến vi sinh vật saccharolyticsử dụng loại đường làm chất lên men hầu hết chủng lên men đường quy mô công nghiệp thuộc loài C beijerinckii Mặc dù C.acetobutylicum nghiên cứu nhiều sản xuất dung môi C beijerinckii lại cho thấy nhiều ưu điểm có tiềm việc ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp C beijerinckii có khoảng pH tối thích rộng việc sinh trưởng tạo dung môi Bên cạnh C beijerinckii đối tượng tiềm việc ứng dụng kĩ thuật chuyển gene nhằm tạo chủng có khả sử dụng đa dạng nguồn carbohydrate (Ezeji, et al., 2004) Với C beijerinckii, người ta cho chủng có khả chịu tác động acid nồng độ cao nên thích hợp trình lên men liên tục so với chủng từ C.acetobutylicum (theo Grube & Gapes, 2002; Zverlov cộng sự, 2006) Trong nghiên cứu Ezeji cộng (2004), chủng C beijerinckii BA101 sử dụng linh hoạt nhiều nguồn chất khác cho nồng độ dung môi đạt từ 14.8-26.1 g/L với suất từ 37-50% Có nghiên cứu hai loài C saccharobutylicum C saccharoperbutylacetonicum sử dụng để lên men ABE Shaheen cộng (2000) tập hợp chủng sử dụng để lên men nhận thấy chúng phát triển tốt môi trường glucose rỉ đường mía so với môi trường dịch ngô Kết lên men tốt thực chủng C saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S), SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn sử dụng mật rỉ mía với nồng độ dường lên men 6.5% Nồng độ trung bình đạt 19.6g/L với hiệu suất 30% Bảng 3: So sánh khả lên men số chủng phân lập Chủng Môi trường/cơ chất ( 6% đường lên men) C acetobutylicum PCSIR-10b Rỉ đường PCSIR-5b Rỉ đường a ATCC 4259 Rỉ đường a ATCC 824 Rỉ đường d ATCC 824 Glucose BA 101c BA 101c NCP P260a NCP P260a Glucose Rỉ đường Rỉ đường* Rỉ đường Nồng độ dung môi (g/L) Hiệu suất (%) 19.2 15.2 9.5 7.8 20.6 34.0 30.0 15.8 13.0 42.0 C beijerinckii 24.2 42.0 22.8 39.0 21.9 33.4 18.9 31.5 C saccharobutylicum 19.6 30.0 BAS/B3/SW/ Rỉ đường* a 336(S) NCP P108a Rỉ đường* 18.6 a NCP P258 Rỉ đường 18.3 C saccharoperbutylacetonicum N1-504a Rỉ đường 15.6 *: 6.5% loại đường lên men a: Shaheen cộng (2000) b: Syed (1994) c: Ezeji cộng (2004) d: Roffler cộng (1987) SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 10 Năng suất ( g/L.h ) A:B:E 0.42 0.24 0.58 1.8:95.3:2.9 5.3:79:15.7 20.6:66.5:26.2 0.34 0.19 - 17.8:81:1.2 18.4:80.3:1.3 - - - 28.6 30.5 - - 26.0 - - Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn b Nhiệt độ Tương tự điều kiện pH, giá trị nhiệt độ lên men phục thuộc nhiều vào chủng vi sinh vất sử dụng Tùy vào loài có nhiệt độ tối thích khác mà ta lựa chọn nhiệt độ lên men thích hợp Khoảng nhệt độ tối thích loài Clostridium nằm vùng từ 30-40oC, nhiều thí nghiệm loài Clostridium acetobutylicum C beijerinckii thực nhiệt độ trung bình 35 oC Shamsudin cộng (2006) nghiên cứu loài C.Saccharoperbutylacetonicum lại cho thấy khả tổng hợp butanol cao 30oC Hình 15: Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả lên men tổng hợp dung môi C.Saccharoperbutylacetonicum Ở 30oC, khả tổng hợp dung môi vi khuẩn đạt cao (15g/L) Trong đó, 40oC vi khuẩn bị ức chế làm khả tổng hợp dung môi Như thấy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất lên men tổng hợp dung môi, cần kiểm soát trì ổn định nhiệt độ suốt trình lên men c Nồng độ muối môi trường tổng hợp Ngoài đường pentose hexose chất Clostridium sử dụng để lên men tổng hợp butanol, môi trường lên men chứa nhiều loại muối khoáng (Fe 2+, Mn2+, K+, Mg2+, NH4+ ) giúp cho vi sinh vật sinh trưởng tạo sản phẩm Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ muối ban đầu môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng tổng hợp sản phẩm vi khuẩn F Monot cộng (1982) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ hợp chất môi trường tổng hợp đến trình lên men ABE sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Các thí nghiệm tiến hành cách thay đổi SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 28 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn nồng độ ban đầu muối MgSO4, FeSO4, KCl, ammonium acetate môi trường tổng hợp - KCl: Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối KCl, thí nghiệm tiến hành với nồng độ KCl ban đầu 0, 3, 6, 9, 15, 30, 60, 120, 360, 600 mg/l 1.2, 2, 4, 8, 12 g/l Kết nồng độ dung môi thu thí nghiệm cho bảng sau: Bảng 9: Ảnh hưởng nồng độ KCl ban đầu tới trình lên men ABE Nồng Nồng Buta Aceto Etha Tổng độ (mg/l) độ tế nol (g/l) ne (g/l) nol (g/l) ABE (g/l) bào* 0.8 0 0 0.59 0.48 0.48 0.72 0.78 0.78 0.88 4.22 1.39 0.23 5.84 15 1.28 4.26 1.28 0.25 5.79 30 1.88 4.26 1.05 0.28 5.59 602.60 4.32 1.03 0.50 5.85 600 0.6-8 2.94 4.72 0.81 0.48 6.01 (g/l) 12 3.10 3.89 0.90 0.37 5.16 *: Nồng độ tế bào tính theo mật độ quang Kết cho thấy trình lên men ABE chịu ảnh hưởng lớn nồng độ muối K+ Nồng độ tế bào môi trường lên men tăng liên tục nồng muối tăng từ đến 60 mg/l giữ ổn định nồng độ muối tiếp tục tăng từ 60-600 mg/l Nồng độ dung môi bắt đầu tăng nhanh nồng độ muối đạt mg/l, khoảng nồng độ muối từ 0.6-8 g/l nồng độ dung môi trì không đổi 6.01 g/l Khi nồng độ muối tăng cao 12 g/l gây ức chế làm giảm hiệu suất tổng hợp dung môi vi khuẩn (nồng độ dung môi đạt 5.16 g/l) - Ammonium acetate: Muối ammonium acetate khảo sát nồng độ 1.1, 2.2, 3.3, 4.4, 5.5, 6.6 g/l Kết cho bảng sau: SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 29 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Bảng 10: Ảnh hưởng nồng độ ammonium acetate ban đầu tới trình lên men ABE Ammonim acetate Nồng độ (g/l) 1.1 2.2 3.3 4.4 5.5 6.6 Nồng độ tế bào Butano l (g/l) Aceton e (g/l) Ethano l (g/l) 2.14 1.83 1.84 1.80 1.86 1.80 3.11 2.78 2.04 1.48 1.04 1.04 0.99 1.10 0.65 0.47 0.35 0.35 0.12 0.12 0.09 0.09 - Tổng ABE (g/l) 4.22 4.00 2.78 2.04 1.39 1.39 Kết cho thấy ammonium acetate có ảnh hưởng lớn đến khả phát triển vi sinh vật Nồng độ ammonium acetate 1.1 g/l cho kết tốt nồng độ khác, nồng độ cao vi sinh vật bị ức chế Do việc tổng hợp dung môi bị ảnh hưởng tăng nồng độ muối lên cao 1.1 g/l Tại nồng độ ammonium acetate 1.1 g/l tổng lượng dung môi đạt thấp 4.22 g/l - MgSO4: Muối MgSO4 khảo sát nồng độ 0, 50, 100, 200, 350 500 mg/l Kết cho bảng sau: Bảng 11: Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 ban đầu tới trình lên men ABE MgSO4 Nồng độ (mg/l) 50-200 350-500 Nồng độ tế bào* 0.65 2.99 2.64 Butanol (g/l) 2.22 5.28 4.48 Acetone (g/l) 0.87 1.48 1.28 Ethanol (g/l) 0.14 0.74 0.61 Tổng ABE (g/l) 3.23 7.5 6.37 Có thể thấy nồng độ tế bào vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào diện Mg2+ dịch lên men Khi mặt Mg2+ môi trường, sinh trưởng vi khuẩn bị ức chế tổng hợp dung môi với nồng độ thấp 3.23 g/l Khi có mặt MgSO4 môi trường (50-200 mg/l), vi khuẩn phát triển tốt đồng thời khả tổng hợp dung môi cho hiệu suất cao (7.5g/l) Có thể kết luận nồng độ muối MgSO4 tối ưu cho vi khuẩn phát triển nằm khoảng 50-200 mg/l Khi tăng nồng độ lên 350-500 mg/l, tế bào vi khuẩn bắt đầu bị ức chế khả tổng hợp dung môi giảm rõ (6.37 g/l) - FeSO4: Sự diện Fe2+ môi trường lên men ảnh hưởng đến khả phát triển vi sinh vật Khi môi trường tổng hợp chứa mg FeSO 1L dung dịch, tế bào vi khuẩn phát triển tốt, vi khuẩn sử dụng hết chất (glucose) tổng hợp SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 30 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 5.5 g/l dung môi Không có khác biệt đáng kể khả sinh trưởng tổng hợp sản phẩm tăng nồng độ FeSO từ 1-50 mg/l Tuy nhiên, môi trường không cung cấp FeSO4, phát triển vi khuẩn bị yếu đi, tổng lượng dung môi đạt 2.08 g/l d Sự ức chế ngược butanol trình lên men Trong trình lên men ABE, butanol sinh với tỉ lệ cao xem sản phẩm trình lên men Tuy nhiên, butanol alcohol khác có ảnh hưởng xấu đến thành tế bào vi khuẩn Ở nồng độ cao, butanol ngăn chặn vận chuyển chất dinh dưỡng qua thành tế bào, phá hủy chức thành tế bào Trong nghiên cứu thực Bowles Ellefson (1985) để khảo sát ảnh hưởng butanol đến khả sử dụng đường glucose loài Clostridium acetobutylicum Khả sử dụng đường vi khuẩn đánh giá thông qua số µg glucose tiêu thụ mg protein từ tế bào vi khuẩn thời điểm trình lên men Thí nghiệm tiến hành nồng độ butanol ban đầu 0, 139, 167, 208, 236, 278 mM Hình 16: Ảnh hưởng butanol lên khả sử dụng glucose C acetobutylicum mM butanol(●),139 mM butanol (○), 167 mM butanol (□), 208 mM butanol (■), 236 mM butanol (▲), 278 mM butanol ( ) Kết cho thấy rõ ức chế butanol lên khả sử dụng chất vi khuẩn Nguyên nhân butanol làm cho tế bào khả trì pH bên tế bào làm rối loạn chức phân giải chất, ATPase màng tế bào bị ức chế, ATP nội bào giảm SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 31 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Trong nghiên cứu khác Zhijie.S Shijie.L (2010) tiến hành khảo sát ảnh hưởng butanol đến khả lên men ABE chủng C acetobutylicum ATCC 824 Quá trình lên men ABE thực 37oC, nồng độ glucose ban đầu 50 g/l, nồng độ butanol ban đầu dịch lên men 3, 6, 9, 12 g/l Hình 17: Ảnh hưởng nồng độ butanol lên trình lên men ABE sử dụng chủng C acetobutylicum ATCC 824 HAB: tổng acid acetic butylic Từ kết thấy nồng độ butanol ban đầu ảnh hưởng đến nồng độ acid dung môi dịch sau lên men Khi nồng độ butanol ban đầu tăng lên, nồng độ acid tăng lên nồng độ dung môi lại giảm xuống Khi nồng độ butanol ban đầu lớn g/l, vi khuẩn sử dụng glucose chủ yếu để tổng hợp acid làm cho hiệu suất tổng hợp acid tăng mạnh đạt cực đại 0.23 g/g hiệu suất tổng hợp butanol giảm nhanh chóng Như việc tăng nồng độ butanol ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng vi sinh vật làm cho vi sinh vật trở giai đoạn solventogenic chủ yếu sản sinh acid Có thề thấy butanol có ảnh hưởng lớn đến hoạt động vi sinh vật trình lên men, để đạt hiệu suất lên men cao cần có biện pháp tách butanol trình lên men giảm ức chế butanol đến vi sinh vật Các phương pháp tách butanol trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất lên men đề cập chương sau SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 32 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 4.3 Ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định lên men sản xuất butanol Trong năm gần đây, kỹ thuật cố định tế bào chất mang ứng dụng trình lên men nghiên cứu rộng rãi Ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định lên men sản xuất butanol mang lại nhiều ưu điểm vượt trội như:  Chất mang đóng vai trò tác nhân bảo vệ tế bào chống lại ảnh hưởng bất lợi từ môi trường nồng độ chất cao, thay đổi pH, nhiệt độ làm giảm ức chế tế bào sản phẩm cuối (butanol)  Mật độ tế bào đơn vị thể tích bình phản ứng sinh học cao hơn, từ dẫn đến suất thể tích cao hơn, rút ngắn thời gian lên men  Tăng khả sử dụng chất tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm, từ cải thiện hiệu suất lên men  Có thể sử dụng cho trình sản xuất liên tục  Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt công đoạn phân riêng canh trường sau lên men, giảm chi phí thiết bị lượng  Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần đảm bảo hoạt tính sinh học ổn định Những nghiên cứu tế bào cố định lên men sản xuất butanol dựa hai kỹ thuật hấp thụ nhốt tế bào vi khuẩn Clostridium lên chất mang R Sallam cộng (2003) tiến hành nghiên cứu cố định tế bào C acetobutylicum lên chất mang Ca-alginate than hoạt tính qua so sánh khả lên men sản xuất butanol tế bào cố định tế bào tự Sau ngày lên men thu kết sau: Bảng 12: Kết lên men từ tế bào tự cố định Ca-alginate than hoạt tính Tự Cố định Ca-alginate Cố định than hoạt tính Thời gian lên men (ngày) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Nồng độ đường (kg/m3) 70.0 46.3 35.0 23.0 14.0 70.0 45.0 30.0 20.0 9.3 70.0 30.0 19.5 13.0 12.0 33 Acetone (kg/m3) 0.0 1.7 1.9 3.6 6.3 0.0 1.9 3.4 6.3 8.4 0.0 1.0 1.2 2.0 2.9 Butanol (kg/m3) 0.0 3.3 4.3 8.5 15.7 0.0 3.3 8.0 15.0 20.5 0.0 2.3 3.0 4.6 6.9 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Kết từ bảng 12 cho thấy nồng độ chất dịch lên men giảm nhanh chóng giai đoạn đầu trình lên men Tế bào vi khuẩn hấp thụ than hoạt tính có tốc độ sử dụng chất cực đại đạt r sm= 100 kg/m3.ngày, tế bào tự tế bào cố định Ca-alginate 50 80 kg/m 3.ngày Tuy nhiên, tế bào cố định Ca-alginate lại có khả tổng hợp butanol cao 20.5 kg/m đạt hiệu suất 0.34 Trong tế bào cố định than hoạt tính lại cho khả tổng hợp butanol thấp tế bào tự (6.9 kg/m < 15.7 kg/m3) Như vậy, Ca-alginate thể chất mang có nhiều ưu điểm vượt trội so với than hoạt tính Việc nhốt tế bào vi khuẩn C acetobutylicum gel alginate giúp cho tế bào bị ảnh hưởng yếu tố ức chế từ môi trường so với tế bào tự làm tăng hiệu suất tổng hợp butanol Trong nghiên cứu khác S Shamsudin cộng (2006) thực cố định loại chất mang khác bao gồm : stainless steel scrubber, nylon scrubber, hạt polyurethane có kích thước mao quản nhau, hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng fruit bunch fiber Sử dụng chủng C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4 để cố định, lên men môi trường TYS chứa 40 g glucose Tiến hành khảo sát ảnh hưởng loại chất mang khác lên nồng độ dung môi thu sau trình lên men, hiệu suất tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm môi trường lên men TYA 30oC Kết thu từ trình lên men thể đồ thị sau: Hình 18: Nồng độ sản phẩm thu từ trình lên men ABE sử dụng tế bào vi khuẩn cố định loại chất mang 1, stainless steel scrubber 2, nylon scrubber 3, hạt polyurethane có kích thước mao quản giống 4, hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng 5, fruit bunch fiber 6, tế bào tự SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 34 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Tiến hành so sánh trình lên men ABE thực tế bào vi khuẩn cố định với tế bào vi khuẩn tự sau 24 lên men Kết qủa cho thấy tế bào vi khuẩn cố định hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng có khả tổng hợp dung môi cao (26.679 g/l dung môi) sau 24 lên men với 19.228 g/l butanol Chất mang stainless steel scrubber cho kết lên men cao thứ hai với 16.243 g/l dung môi, fruit bunch fiber với 15.650 g/l dung môi, hạt polyurethane có kích thước mao quản giống cho kết 10.606 g/l dung môi cuối nylon scrubber cho kết thấp với 3.863 g/l Tổng nồng độ acid thu từ trình lên men sử dụng hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng cho kết thấp với 1.373 g/l acetate 0.235 g/l butyrate Điều hoàn toàn phù hợp trình lên men sử dụng hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng cho nồng độ dung môi cao Hiệu suất tốc độ sinh tổng hợp dung môi trình lên men sử dụng tế bào cố định so với tế bào tự biểu diễn đồ thị hình 19: Hình 19: Hiệu suất tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm sau 24 lên men ABE 30oC môi trường TYA 1, stainless steel scrubber 2, nylon scrubber 3, hạt polyurethane có kích thước mao quản giống 4, hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng 5, fruit bunch fiber 6, tế bào tự Kết cho thấy tốc độ sinh tổng hợp dung môi đạt từ loại chất mang khác 1.084, 0.648, 0.633, 0.406 0.122 g/l.h tương ứng hạt polyurethane có kích thước không đồng đều, stainless steel scrubber, fruit bunch fiber, hạt polyurethane có kích thước giống nylon scrubber Từ kết trên, kết luận trình lên men từ tế bào vi khuẩn cố định chất mang hạt polyurethane có kích thước không đồng cho kết tốt So với trình lên men từ vi khuẩn tự do, hạt polyurethane có kích SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 35 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn thước không đồng giúp cho trình lên men tăng hiệu suất gấp 1.9 lần tăng tốc độ sinh tổng hợp dung môi 3.9 lần Điều có cấu tạo hạt polyurethane có cấu trúc xốp rỗng, bao gồm nhiều mao quản nhỏ có đường kính từ 20-900 µm (hình 20) Nhờ tế bào vi khuẩn dễ dàng nhốt mao quản, tiếp xúc trao đổi chất dễ dàng với môi trường Bên cạnh đó, polyurethane có nhiều ưu điểm so với loại chất mang khác giá rẻ, trình cố định đơn giản nhanh chóng, không cần sử dụng thêm hóa chất hỗ trợ Do đó, polyurethane thể chất mang tiềm việc ứng dụng để cố định vi khuẩn sử dụng lên men quy mô công nghiệp Hình 20: Cấu trúc mao quản hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 36 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 5: CÁC KĨ THUẬT PHÂN TÁCH BUTANOL TỪ DỊCH LÊN MEN Trong trình lên men sản xuất butanol quy mô công nghiệp, trình phân tách butanol từ dịch sau lên men trình phức tạp tiêu tốn nhiều lượng Chưng cất phương pháp truyền thống sử dụng để thu hồi butanol từ dịch sau lên men Tuy nhiên, nồng độ nồng độ dung môi dịch sau lên men thấp khoảng từ 18-33 g/l butanol có khoảng 13-18 g/l Ngoài nồng độ dịch lên men thấp, butanol có điểm sôi cao so với nước (118 oC) Tất yếu tố làm cho trình chưng cất thu hồi butanol đòi hỏi phải tiêu tốn nhiều lượng, chiếm tới 40% giá thành sản phẩm Philips Humphrey (1985) cho nồng độ butanol dịch sau lên men tăng từ 10 g/l lên 40 g/l trình tách chiết butanol phương pháp chưng cất tiết kiệm nhiều chi phí Theo đó, nồng độ 10 g/l butanol, tỷ lệ nhiên liệu dầu cần tiêu tốn để thu hồi 100% butanol 1.5, nồng độ 40 g/l tỷ lệ 0.25 Điều cho thấy, chi phí tiết kiệm nhiều nồng độ butanol dịch sau lên men tăng gấp ba Để cải thiện hiệu suất thu hồi giảm chi phí, nhiều kỹ thuất nghiên cứu ứng dụng như: gas stripping, pervaporation, hấp thụ, trích ly lỏng-lỏng thẩm thấu ngược Hình 21: Đồ thị so sánh lượng cấn thiết dùng kỹ thuật tách chiết butanol Thẩm thấu ngược cho phương pháp đem lại hiệu kinh tế cao nhiên lại có nhược điểm khó khắc phục dễ bị tắc nghẽn trình hoạt động Quá trình trich ly lỏng-lỏng thể tính chọn lọc cao khả tách chiết SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 37 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn tốt trình thực lại tốn nhiều chi phí Vì vậy, cần phân tích rõ ưu nhược điểm phương pháp cụ thể để đạt hiệu cao a Gas stripping: phương pháp đơn giản hiệu để thu hồi butanol từ dịch lên men Nguyên tắc phương pháp sục khí qua môi trường lên men, khí lôi kéo dung môi dịch lên men vào thiết bị thu hồi dung môi Khí sau thu hồi lại tiếp tục dẫn vào bình lên men tiếp tục trình đến chất môi trường lên men sử dụng hết Việc áp dụng phương pháp gas stripping giúp cho trình lên men ABE thực nồng độ đường cao (Qureshi Blaschek, 2001) làm giảm ức chế butanol vi sinh vật trình lên men (Maddox cộng sự, 1995) Trong nghiên cứu Ezeji cộng (2003), gas stripping sử dụng để tách chiết dung môi trình lên men sử dụng chủng C beijerinckii BA101 Kết thúc trình lên men, 161,7 g/l đường vi sinh vật sử dụng thu 75.9 g/l dung môi Trong nghiên cứu khác Ezeji cộng (2004), trình lên men có bổ sung chất tích hợp với trình gas stripping nhằm làm giảm ức chế nồng độ đường lên men cao giúp tăng mật độ vi sinh vật canh trường lên men Trong hệ thống lên men này, 500 g glucose vi sinh vật tiêu thụ hết 233 g dung môi thu hồi Hiệu suất trình lên men đạt 0.47 g/g với tốc độ thu hồi dung môi đạt 1,16 g/l.h Hình 22: Sơ đồ hệ thống tách chiết butanol từ trình lên men ABE phương pháp gas stripping A: bơm điều chỉnh tốc độ khí vào bình lên men, B: bình lên men có thiết bị sục khí, C: thiết bị ngưng tụ, D: ABE ngưng tụ ra, E: thiết bị làm mát SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 38 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn b Trích ly lỏng-lỏng: phương pháp hiệu khác để tách dung môi từ dịch lên men Phương pháp sử dụng dung môi hữu để tách chiết butanol từ dịch lên men Ưu điểm phương pháp butanol có khả hòa tan tốt dung môi hữu so với nước dịch lên men Phương pháp trích ly lỏng-lỏng thường sử dụng dung môi rượu decanol oleyl (Evans Wang, 1988) Trong trình lên men tĩnh theo chu kỳ, phương pháp trích ly lỏng-lỏng thường kết hợp với trình chưng cất để tách chiết dung môi thành riêng biệt.Theo Korbinian Kraemer cộng (2010) trình tách chiết sử dụng phương pháp kết hợp biểu diễn theo mô hình sau: Hình 23: Sơ đồ hệ thống tách chiết butanol từ dịch sau lên men ABE phương pháp trích ly lỏng-lỏng kết hợp chưng cất Theo sơ đồ này, sử dụng oleyl alcohol làm dung môi trích ly lưu lượng dịch sau lên men vào cột trích ly đạt 738 kg/h với 87.5% dung môi trích ly Tổng lượng tiêu tốn cho toàn trình 15MJ/kg butanol Như vậy, so với lượng mà butanol tạo (36 MJ/kg) trình tách chiết mang lại lợi ích lớn mặt lượng Tuy nhiên, phương pháp có nhiều mặt hạn chế áp dụng để tách dung môi từ trình lên men liên tục, dung môi trích ly có khả gây ức chế đến tế bào vi sinh vật trình lên men tạo thành hệ nhũ tương dịch lên men hạn chế trao đổi chất vi sinh vật Những vấn đề khắc phục dịch lên men dung môi trích ly ngăn cách màng bán thấm để trao đổi butanol hai pha, phương pháp gọi perstraction (Ezeji cộng sự, 2007) c Pervaporation: xem kỹ thuật tách chiết butanol từ dịch lên men tốt so với phương pháp nêu Pervaporation thể ưu điểm vượt trội mặt không gây ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật dịch lên men, chi phí cho trình tách chiết thấp Nguyên lý kỹ thuật sử dụng màng SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 39 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn membrane xốp, dịch lên men tiếp xúc với mặt membrane, tạo chân không mặt đối diện Dung môi qua membrane theo dòng permeate chuyển thành pha sau ngưng tự để thu hồi Hình 24: Nguyên lý tách cấu tử hỗn hợp phương pháp pervaporation Các loại membrane sử dụng kỹ thuật làm từ vật liệu rắn silicalite–silicone, polypropylene, zeolite Ngoài ra, số nghiên cứu sử dụng membrane lỏng để tách chiết butanol, dung môi lỏng oleyl alcohol giữ mao quản polypropylene hình thành nên loại membrane lỏng đặc biệt oleyl- polypropylene Tính ổn định màng, khả chọn lọc cao lưu lượng dòng qua màng yếu tố quan trọng trình tách chiết butanol phương pháp pervaporation Trong nghiên cứu Matsumura cộng (1988), sử dụng membrane lỏng oleyl- polypropylene để tách butanol từ dịch lên men nồng độ thấp Kết cho thấy membrane oleyl- polypropylene thể tính chọn lọc tốt so với membrane silicone Nhu cầu lượng 10 lần so với phương pháp chưng cất Tuy nhiên, tính ổn định membrane lỏng oleyl- polypropylene lại tương đối thấp Để phát triển loại membrane giữ tính ổn định nâng cao mức độ chọn lọc membrane, Qureshi cộng (1999) nghiên cứu tổng hợp loại membrane từ phức hợp silicon-silicalite SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 40 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Hình 25: Sơ đồ trình lên men tĩnh có bổ sung chất kết hợp trình tách chiết dung môi phương pháp pervaporation sử dụng membrane silicon-silicalite 1: bồn chứa nước thải, 2: bồn chứa chất, 3: bồn lên men, 4: membrane, 5: bồn làm lạnh ngưng tụ, 6: bơm chân không Khi kết hợp phương pháp pervaporation sử dụng membrane silicon-silicalite với trình lên men ABE sử dụng chủng C beijerinckii BA101, Qureshi cộng (1999) nhận thấy tổng nồng độ dung môi đạt tăng gấp hai lần ( từ 24.2 g/l với trình lên men thường lên 51.5 g/l kết hợp với trình pervaporation) Tốc độ sinh tổng hợp dung môi tăng từ 0.35 lên 0.98 g/l.h, trình pervaporation không ảnh hưởng tới phát triển C beijerinckii BA101 Tính chọn lọc membrane từ phức hợp silicon-silicalite cao gấp 2.2 lần so với membrane lỏng oleyl- polypropylene Từ kết cho thấy, kết hợp phương pháp tách chiết dung môi từ dịch lên men ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp sản phẩm vi khuẩn canh trường lên men.Khi dung môi tách phần khỏi môi trường trình lên men, ức chế dung môi lên vi sinh vật giảm dần làm tăng khả hoạt động vi khuẩn từ làm tăng hiệu suất trình lên men Tùy vào quy mô điều kiện từ trình lên men ABE, việc lựa chọn sử dụng phương pháp tách chiết dung môi mang lại hiệu cao so với trình lên men thông thường SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 41 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Chương 6: Kết Luận Các nghiên cứu trình lên men ABE đa số tập trung sử dụng hai loài vi khuẩn Clostridium beijerinckii Clostridium acetobutylicum Các chủng đột biến từ hai loài thể ưu điểm vượt trội khả sinh tổng hợp dung môi nồng độ cao Cả hai loài lên men nhiệt độ pH tối thích tương ứng 35 oC 5.5 Trong đó, loài C.Saccharoperbutylacetonicum lại lên men tốt điều kiện 30oC ph 6.0 Tuy nhiên khả sinh tổng hợp dung môi C.Saccharoperbutylacetonicum lại xa so với hai loài C acetobutylicum C beijerinckii Khi sử dụng loại đường pentose hexose làm chất cho trình lên men glucose thể chất ưa thích loài Clostridium Nồng độ dung môi cao đạt sử dụng glucose làm chất chủng C acetobutylicum P260 21.37 g/l (hiệu suất 0.36), chủng C beijerinckii BA101 17.8 g/l (hiệu suất 0.30) Mức độ ưa thích loại đường khác loài Clostridium beijerinckii theo thứ tự glucose>xylose>arabinose>mannose loài Clostridium acetobutylicum glucose>arabinose>xylose>galactose Các nghiên cứu sử dụng nguồn chất carbohydrate rẻ tiền có sẵn tự nhiên cho kết khả quan Quá trình lên men ABE từ bột sắn sử dụng chủng C beijerinckii BA101 đạt nồng độ butanol dịch lên men cao 20.81 g/l, tốc độ sinh tổng hợp butanol 0.22 g/l.h Ngoài ra, nguồn chất rẻ tiền khác xơ bắp, bã nho, dịch thủy phân bo bo… cho kết lên men tốt Việc cố định tế bào vi khuẩn nghiên cứu loại chất mang khác như: Ca-alginate, than hoạt tính, stainless steel scrubber, nylon scrubber, hạt polyurethane, fruit bunch fiber… Trong đó, Ca-alginate hạt polyurethane thể chất mang tốt, mang lại hiệu cao so với trình lên men vi khuẩn tự Kết hợp với phương pháp tinh chiết dung môi từ dịch lên men, trình lên men ABE cho hiệu suất cao hơn, giúp làm giảm ức chế dung môi lên hoạt động vi khuẩn Có thể thấy trình lên men sản xuất butanol từ vi sinh vật nghiên cứu nhiều cho thấy tiềm lớn để ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 42 [...]... làm cho vi sinh vật trở về giai đoạn solventogenic chủ yếu sản sinh acid Có thề thấy butanol có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình lên men, để đạt hiệu suất lên men cao cần có các biện pháp tách butanol ngay trong quá trình lên men giảm sự ức chế của butanol đến vi sinh vật Các phương pháp tách butanol trong quá trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất lên men sẽ được đề cập trong... giờ lên men và đạt tối đa 100 đến 120 mM butanol sau 120 giờ lên men ( không hiển thị trên hình) Trong khi đó ở môi trường được duy trì pH ở 6.8, có thể tổng hợp dung môi sau 2 giờ lên men và nồng độ butanol đạt tối đa là 90 mM sau 120 giờ lên men Việc kiểm soát pH của môi trường lên men đã làm giảm khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn, trong khi đó nồng độ của các acid (acetate) trong dịch lên men. .. khi lên men cũng như nồng độ cơ chất ban đầu sử dụng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp butanol của vi khuẩn Khi thủy phân bằng phương pháp acid, các tạp chất lẫn trong dung dịch HCl có thể gây ức chế khả năng hoạt động của vi khuẩn làm giảm hiệu suất tổng hợp butanol Nồng độ butanol trung bình đạt 20.81 g/L sau 96h lên men, tốc độ sinh tổng hợp butanol tương ứng là 0.22 g/L.h c Lên men. .. trình lên men hỗn hợp đường gồm glucose, mannose, arabinose và xylose bổ sung vào dịch lên men với tỉ lệ tương ứng là 5:1:2:4 Sau 84h lên men (khi quá trình lên men dừng lại), nồng độ dung môi ABE đạt được là 17.9 g/L với nồng độ butanol đạt tối đa là 13.9 g/L ( hình 6) Mặc dù lượng butanol và tổng lượng ABE được tạo ra xấp xỉ như trong quá trình lên men từ đường glucose nhưng thời gian lên men lại dài... của butanol đến khả năng lên men ABE của chủng C acetobutylicum ATCC 824 Quá trình lên men ABE được thực hiện ở 37oC, nồng độ glucose ban đầu là 50 g/l, nồng độ butanol ban đầu trong dịch lên men lần lượt là 3, 6, 9, 12 g/l Hình 17: Ảnh hưởng của nồng độ butanol lên quá trình lên men ABE sử dụng chủng C acetobutylicum ATCC 824 HAB: tổng acid acetic và butylic Từ kết quả trên có thể thấy nồng độ butanol. .. môi trường P2 điều chỉnh pH về 6.0 bằng dung dịch NaOH 1.0M Quá trình lên men được thực hiện trong thiết bị lên men yếm khí 2-L chứa 1500ml dịch lên men ở 37 oC Các thông số trong suốt quá trình lên men được biểu diễn trên đồ thị hình 10: Hình 10: Các thông số của quá trình lên men từ dịch bo bo do chủng C.beijerinckii JCM 1390 thực hiện Từ đồ thị có thể thấy sau 60 giờ lên men, khả năng sử dụng cơ chất... bởi sản phẩm cuối (butanol)  Mật độ tế bào trên mỗi đơn vị thể tích của bình phản ứng sinh học cao hơn, từ đó dẫn đến năng suất thể tích cao hơn, rút ngắn thời gian lên men  Tăng khả năng sử dụng cơ chất và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm, từ đó cải thiện hiệu suất lên men  Có thể sử dụng cho quá trình sản xuất liên tục  Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt công đoạn phân riêng canh trường sau lên men, ... trường tổng hợp Ngoài các đường pentose và hexose là cơ chất chính được Clostridium sử dụng để lên men tổng hợp butanol, môi trường lên men còn chứa nhiều loại muối khoáng (Fe 2+, Mn2+, K+, Mg2+, NH4+ ) giúp cho vi sinh vật có thể sinh trưởng và tạo sản phẩm Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ các muối ban đầu trong môi trường lên men có thể ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm... Duy Nguyên 32 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 4.3 Ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định trong lên men sản xuất butanol Trong những năm gần đây, kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang ứng dụng trong các quá trình lên men đã được nghiên cứu rộng rãi Ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định trong lên men sản xuất butanol có thể mang lại nhiều ưu điểm vượt trội như:  Chất mang đóng vai trò như một tác nhân bảo... quá trình lên men ABE từ dịch thủy phân xơ bắp bằng enzyme Tổng nồng độ ABE đạt được là 8.6 ± 1.0 g/L trong đó butanol đạt 6.5 g/L tương ứng với tốc độ sinh tổng hợp 0.1 ± 0.011 g/L.h và hiệu suất 0.35 Kết quả đã cho thấy phương SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 20 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn pháp thủy phân xơ bắp bằng enzyme đã hạn chế các chất ức chế so với phương pháp thủy phân bằng acid ... PHÂN TÁCH BUTANOL TỪ DỊCH LÊN MEN Trong trình lên men sản xuất butanol quy mô công nghiệp, trình phân tách butanol từ dịch sau lên men trình phức tạp tiêu tốn nhiều lượng Chưng cất phương pháp truyền... thấy butanol có ảnh hưởng lớn đến hoạt động vi sinh vật trình lên men, để đạt hiệu suất lên men cao cần có biện pháp tách butanol trình lên men giảm ức chế butanol đến vi sinh vật Các phương pháp. .. b Trích ly lỏng-lỏng: phương pháp hiệu khác để tách dung môi từ dịch lên men Phương pháp sử dụng dung môi hữu để tách chiết butanol từ dịch lên men Ưu điểm phương pháp butanol có khả hòa tan