Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN trờng đại học s phạm h nội khoa sinh - ktnn -o0o nguyễn thị tuyền tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dỡng da khoá luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngời hớng dẫn khoa học : PGS TS đinh thị kim nhung Hà Nội - 2009 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN lời cảm ơn Trong suốt trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài này, em nhận đợc giúp đỡ bảo tận tình PGS TS Đinh Thị Kim Nhung thầy cô giáo tổ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trờng ĐHSP Hà Nội 2, giúp đỡ động viên gia đình bạn bè Vì em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc giúp đỡ quý báu Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thuỳ Vân PGS TS Đinh Thị Kim Nhung hớng dẫn em cách tìm kiến thức, tài liệu để em có hớng đắn trình nghiên cứu Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, cô bảo em cách tận tình giúp em có tài liệu giá trị hoàn thành đề tài Đồng thời em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị phòng Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện tốt sở vật chất tinh thần để em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2009 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tuyền K31 B Sinh GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN lời cam đoan Tôi xin cam đoan viết luận văn kết nghiên cứu cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu không trùng với công trình nghiên cứu tác giả khác Trong đề tài có trích dẫn số dẫn liệu số tác giả khác Tôi xin phép tác giả đợc trích dẫn để bổ sung cho phần tổng quan tài liệu khoá luận Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tuyền K31 B Sinh GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Mục lục Trang Danh mục hình v bảng biểu Danh mục từ viết tắt Mở đầu Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Lợc sử phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter 1.2.2 Lợc sử phân loại Acetobacter 1.3 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.3.3 Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter môi trờng lỏng 1.3.4 Nhu cầu dinh dỡng vi khuẩn Acetobacter 1.3.5 Con đờng chuyển hóa cacbon 1.3.6 Đặc điểm số loài Acetobacter quan trọng Chơng Vật liệu phơng pháp nghiên cứu 2.1.Vật liệu thiết bị 2.1.1 Vi sinh vật 2.1.2 Máy móc thiết bị 2.1.3 Hóa chất 2.1.4 Môi trờng 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phơng pháp vi sinh vật 2.2.2 Xác định khả tổng hợp axit axetic chuẩn độ 2.2.3 Phơng pháp hóa sinh 2.2.4 Phơng pháp toán học 2.2.5 Phơng pháp thống kê xử lý kết GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 4 5 7 8 9 10 14 14 14 14 15 15 16 16 20 20 23 28 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Chơng Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn axetic từ số nguồn nguyên liệu 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter khiết 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng mỏng, dai, bề mặt nhẵn 3.4 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum M5 3.4.1 Nghiên cứu động thái sinh trởng phát triển chủng Acetobacter xylinum M5 3.4.2 Khảo sát khả tạo màng môi trờng nuôi cấy khác 3.4.3 Khảo sát khả tạo màng điều kiện nuôi cấy khác 3.5 Bớc đầu xử lý màng BC thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da 3.5.1 Thu hoạch, xử lý thử khả kháng khuẩn màng BC 3.5.2 Thử nghiệm màng BC làm mặt nạ dỡng da 29 29 31 32 40 40 43 45 kết luận v đề nghị 49 49 51 54 ti liệu tham khảo 55 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN danh mục hình v bảng biểu hình Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình 3.1 ảnh khuẩn lạc vi khuẩn axetic mẫu phân lập Hình 3.2 Chuyển hóa rợu etylic thành axit axetic vi khuẩn axetic Hình 3.3 Khả oxy hóa axetat vi khuẩn axetic Hình 3.4 Hoạt tính catalase chủng Acetobacter Hình 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trờng khác Hình 3.6 Khả kháng khuẩn màng BC tẩm mật ong Bảng Bảng 1.1 Phân loại nhóm vi khuẩn axetic theo Frateur (1950) Bảng 2.1 Thành phần môi trờng lên men Bảng 3.1 Nguồn gốc, đặc điểm chủng vi khuẩn axetic mẫu phân lập đợc Bảng 3.2 Đặc điểm hình thành màng cellulose chủng Acetobacter Bảng 3.3 Hàm lợng axit axetic hình thành chủng Acetobacter Bảng 3.4 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Acetobacter Bảng 3.5 Đặc điểm sinh hóa chủng Acetobacter Bảng 3.6 Giá trị OD đo đợc bớc sóng 610nm chủng Acetobacter Bảng 3.7 Động thái sinh trởng tổng hợp cellulose chủng Acetobacter xylinum M5 Bảng 3.8 Khảo sát khả tạo màng môi trờng khác Bảng 3.9 ảnh hởng pH đến hình thành màng BC Bảng 3.10 ảnh hởng thời gian nuôi cấy đến hình thành màng BC GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Bảng 3.11 ảnh hởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Bảng 3.12 Đánh giá sản phẩm màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dỡng da Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi hàm lợng axit axetic theo thời gian nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum M5 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN danh mục từ viết tắt BC: Bacterial Cellulose (màng sinh học thu đợc từ trình lên men môi trờng lỏng có tham gia vi khuẩn Acetobacter xylinum) cs: cộng OD: Optical Density STT: số thứ tự CFU: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) g/l: gam lit CNSH: Công nghệ sinh học GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Mở đầu Lý chọn đề tài Trong tự nhiên có số vi khuẩn có khả sản sinh màng cellulose Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trờng chứa glucose, glycerol số nguồn cacbon hữu khác chúng có khả hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết đợc gọi màng sinh học Bacterial Cellulose (BC) Cho đến nay, Acetobacter xylinum đợc đánh giá loài vi khuẩn có khả sinh màng BC hiệu tự nhiên Loài vi khuẩn gram âm sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử loài tiến hoá nhóm vi khuẩn tía Mỗi tế bào Acetobacter xylinum chuyển hoá tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose nên khả tổng hợp cellulose lớn [17], [34] Nét cấu trúc quan trọng chế kết tinh khác hẳn với cellulose thực vật (PC) chỗ chúng kết hợp hemicellulose, lignin hay thành phần phụ khác, mà đợc cấu tạo từ sợi microfibril tạo nên bó sợi song song cấu thành mạng lới cellulose với độ bền học cao, độ tinh khiết cao, khả thấm hút nớc lớn, đờng kính sợi nhỏ, khả polymer hoá trạng thái kết tinh lớn [17], [34] Ngoài màng BC chứa nhiều dỡng chất, axit hữu đồng thời hàng rào cản oxi sinh vật khác, ngăn cản phân huỷ chất tế bào ngăn cản tác động tia UV Nhờ đặc tính độc đáo mà màng BC đợc coi nguồn polymer mới, giải pháp đờng tìm nguồn nguyên liệu Nó thu hút đợc ý nhiều nhà khoa học từ nửa sau kỷ XIX đợc ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nh: Trong công nghiệp giấy màng BC đợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất lợng cao [24]; Trong công nghệ môi trờng sử dụng màng BC làm màng GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN phân tách để xử lý nớc biến đổi độ nhớt nớc (Brown, 1989, Jonas Fonah, 1998) Ngoài màng BC đợc dùng làm chất mang đặc biệt cho sợi pin tế bào lợng (Brown, 1989) [21], làm sợi truyền quang, môi trờng chất sinh học sử dụng để cố định protêin hay cho sắc ký [25] Trong công nghệ thực phẩm ngời ta sử dụng vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi môi trờng nớc dừa tạo màng BC để sản xuất thạch dừa [33] Trong lĩnh vực mỹ phẩm dợc phẩm, lợi dụng đặc tính quý báu màng BC nh: thông thoáng, kháng khuẩn, tính tơng đồng cấu trúc với sợi collagen da nên màng BC đợc xem nguyên liệu quý giá dùng để làm mặt nạ, da nhân tạo, thay da tạm thời Việt Nam việc nghiên cứu ứng dụng màng BC đợc quan tâm gần đạt đợc kết bớc đầu Nhu cầu loại màng dùng để đắp vết thơng hở, dùng làm mặt nạ dỡng da nớc lớn phải nhập ngoại với giá thành cao Trong đó, màng BC hoàn toàn sản xuất nớc phơng pháp lên men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylinum môi trờng lỏng Việc nghiên cứu, tuyển chọn màng BC mỏng, nhẵn, dai thời gian nuôi cấy ngắn đòi hỏi cần thiết cho công nghệ sản xuất màng BC dùng làm mặt nạ dỡng da Từ lý định tiến hành đề tài nghiên cứu: Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dỡng da. Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, độ pH cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả sản xuất màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn dùng làm mặt nạ dỡng da GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 10 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Chúng bố trí thí nghiệm thành lô nh sau: Lô 1: Đắp màng BC qua xử lý bớc (BC thô) Lô 2: Đắp màng BC qua xử lý bớc Lô 3: Đắp màng BC có tẩm mật ong Sau 30 ngày quan sát cho thấy: Lô 1: Da thỏ bóng, nhẵn nhng sau ban đỏ Điều giải thích nh sau: màng xử lý bớc 1, lợng axit nhiều (pH khoảng 4,4), đắp lên da thỏ gây kích ứng da làm ban đỏ Mặt khác hàm lợng axit có màng góp phần tẩy trắng làm da thỏ, đồng thời cung cấp cho da lợng nớc làm da sáng bóng nhẵn ban đầu Lô 2: Da trắng bóng sáng hơn, tợng ban đỏ Do màng BC đợc xử lý bớc lợng axit lại màng (pH khoảng 5,5) Lô 3: Màng BC đợc bổ sung dỡng chất có mật ong (vitamin nhóm B, vitamin E ) giúp da trở nên trắng hồng, nhẵn bóng Từ kết trên, định lựa chọn màng BC tẩm mật ong bớc đầu thử nghiệm thăm dò làm mặt nạ dỡng da ngời 3.5.2.2 Thử nghiệm da ngời Màng BC tẩm mật ong sau xử lý có độ dày - 3mm, màu trắng trong, có khả thấm giữ nớc tốt có mùi thơm dễ chịu Tiến hành thử nghiệm đắp mặt nạ loại da khác 20 ngời tự nguyện sau 30 ngày kết thu đợc bảng 3.12 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 65 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Bảng 3.12 Đánh giá sản phẩm màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dỡng da Các tiêu đánh Các tiêu cụ thể giá 35 Thơm dịu hài hoà 65 Mỏng 35 Vừa Phải 65 Dầy Màng nhăn Hơi nhăn 15 Bề mặt nhẵn 76 Khả thấm màng 62 Độ bám dính màng 84 Độ dai màng 82 Phản ứng đắp Không gây kích ứng da 10 78 mặt nạ Gây kích ứng da 22 Không 25 Sạch 10 75 Thời gian trì Da không xuất nhờn sau đắp 10 67 độ bền sau đắp Da xuất nhờn sau đắp Các biến đổi Không đổi màu da, có xu hớng tốt 10 63,7 Đổi màu da, gây kích ứng 4,7 Có se 10 64 Không se hiệu cảm Hình thái quan màng Đặc tính màng ứng sau đắp mặt kết Kích thớc Phản tối đa Tỷ lệ % Không mùi Mùi vị Dấu Số điểm Độ da da sau đắp nạ Độ se lỗ chân lông Qua sử dụng thăm dò màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dỡng da cho thấy: + Màng BC có nhiều đặc tính tốt nh: độ đàn hồi cao, khả thấm hút, độ bám dính màng tốt, đặc biệt có khả kháng khuẩn cao, thích hợp cho sử dụng làm mặt nạ dỡng da 66 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN + Màng BC đợc tẩm mật ong có chứa số dỡng chất (vitamin B1, B2, B6, E, axit hữu cơ) + Có 78% ý kiến cho thấy đắp màng không gây kích ứng da, có 67% ý kiến cho thấy không xuất nhờn sau đắp có 65% ý kiến cho màng BC tẩm mật ong có mùi thơm dễ chịu cho ngời sử dụng + Bên cạnh có 22% ý kiến cho sử dụng màng gây kích ứng cho da nh: ngứa, ban đỏ, mụn trình sử dụng + Đặc biệt sử dụng cho da khô có hiệu cao màng có chứa lợng lớn nớc axit hữu có tác dụng tẩy tế bào hóa sừng làm cho da trở nên mịn màng mềm mại Trên kết bớc đầu khảo sát tác dụng màng BC dùng làm mặt nạ dỡng da, nhận thấy nguồn polymer sinh học tạo triển vọng nhiều lĩnh vực đặc biệt y học mỹ phẩm GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 67 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN kết luận v đề nghị Kết luận * Phân lập đợc chủng vi khuẩn Acetobacter sinh màng BC từ nguồn mẫu tự nhiên Tuyển chọn đợc chủng Acetobacter xylinum M5 có khả hình thành màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn * Nghiên cứu số đặc tính sinh học Acetobacter xylinum M5: động thái sinh trởng xác định thời gian sinh trởng cực đại 48 giờ, tích luỹ đợc 3,01% axit axetic, hoạt động khoảng pH từ - * Nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum M5 điều kiện thích hợp để tạo màng BC với kích thớc khác thu hồi đợc 200 màng BC với kích thớc x 6cm 20 màng với kích thớc 20 x 25cm với độ dày từ 2- 3mm Bớc đầu sử dụng màng BC để chế tạo làm mặt nạ dỡng da Đề nghị Trên kết nghiên cứu bớc đầu tuyển chọn khảo sát sơ chủng Acetobacter xylinum M5 có khả tổng hợp cellulose Để có đợc sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn cần phải giải tiếp vấn đề sau: * Tiếp tục khảo sát ảnh hởng yếu tố môi trờng dinh dỡng (Nguồn cacbon, nguồn nitơ) ảnh hởng đến hình thành màng nhằm nâng cao khả hình thành màng cellulose chủng Acetobacter xylinum M5 * Tối u hoá điều kiện dinh dỡng để thu màng BC * Nghiên cứu số tiêu đặc tính hình thành màng BC dùng làm mặt nạ dỡng da * Nghiên cứu nguồn chất bổ sung dỡng chất ứng dụng màng BC làm mặt nạ dỡng da ngời GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 68 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN ti liệu tham khảo Tài liệu tiếng việt Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị ánh (1992) Hoá sinh học Nxb Giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1978) Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nxb khoa học kỹ thuật Nguyễn Thành Đạt (1999) Cơ sở vi sinh vật học Tập 1, Nxb ĐHSP Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vơng Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh vật Nxb Giáo dục Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb ĐHQG Hà Nội Trơng Thị Ngọc Hoa, Trơng Nguyễn Quỳnh Hơng (2005) Đa dạng hoá môi trờng sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum Số 2, Tạp chí khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Đặng Thị Hồng (2007) Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học Luận văn thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội Chu Văn Mẫn (2003) ứng dụng tin học sinh học Nxb ĐHQG Hà Nội.` Nguyễn Văn Mùi (2001) Thực hành hoá sinh học Nxb ĐHQG Hà Nội 10 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006) Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Số 361, Tạp chí dợc học 11 Từ Thành Ngân, dịch giả Đoàn Nh Trác (2004) Công dụng kỳ diệu mật ong Nxb Hà Nội GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 69 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN 12 Đinh Thị Kim Nhung (1996) Nghiên cứu số đặc điểm vi khuẩn Acetobacter ứng dụng lên men axetic theo phơng pháp chìm Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội 13 Lơng Đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông nghiệp 14 Đặng Hùng Thắng (1999) Thống kê ứng dụng Nxb Giáo dục 15 Trần Linh Thớc (2006) Phơng pháp phân tích vi sinh vật Nxb Giáo dục Tài liệu tiếng anh 16 Abbas Rezaee, Sanaz Solimani, Mehdi Forozandemogadam (2005) Role of plasmid in production of Acetobacter xylinum biofilms Vol 1, N o 3, American Journal of Biochemistry and Biotechnology ISN 1553- 3468 17 Alexander Steinbuchel, Sang ki Rhee (2005) Polysaccharide and polyamides in the food industry, www.wiley.vch De 18 Alina Krystynowicz, Maria Koziolkiewicz, Agnieszka Wictorowska Jezierska, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Alexander Masny, Andrzej Plucienniczak Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum Vol 52, N o 3, http://www.actabp pl 19 Ben- Hayyim G, Ohad I, Ph.D (1965) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum : VIII On the formation and oriention of bacterial cellulose fibril in the presence of acidic polysaccharides Vol 25, The Journal of Cell Biology 20 Bergey H, John G Holt (1992) Bergeys manual of dererminativa bacteriology wolters kluwer health GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 70 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN 21 Bworm E (2007) Bacterial cellulose Thermoplastic polymer nanocomposites Master of science in chaemical engineering, washington state university 22 David R Boone, Richard W Castenholz, Don J Brenner, George M Garrity, Noel R Krieg, James T Staley (1980) Bergeys manual of systematic bacteriology 23 Hai-Peng Cheng, Pei-Ming Wang, Jech-Wei Chen, Wen-Teng Wu (2002) Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reator Vol 35, Biotechnol Appl, Biochem 24 Jay shah, Brown M R (2005) Toward electronic paper displays made from microbial cellulose Vol 66, Biotechnol Appl, Biochem 25 Jonas, R & Frarad, L F (1998) Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability 26 Neelobon Suwannapinunt, Jiraporn Burakorn, Suwanncee Thaenthanee (2007) Effect of culture conditions on bacterial cellulose (BC) production from Acetobacter xylinum TISTR976 and physical properties of BC parchment paper Vol 14, Suranaree J Sci Technol 27 Pikul Wanichapichart, Sanae Kaewnopparat, Khemmarat Buaking, Waravut Puthai (2002) Characterization of cellulose membranes produced by Acetobacter xylinum Vol 24, Songklanakarin J Sci technol 28 Saibuatong O, Sangrungraungroj W, Sanchavanakit N, Phisalaphong M Biosynthesis and characterization of bacterial cellulose Email: muenduen.p@chula.ac.th GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 71 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN 29 Thesis Homles (2004) Bacterial cellulose Department of chemical and process Engineering University of Canterbury Christchurch, New Zealand 30 Zippora Gromet-Elhanan, Shlomo Hestrin (1996) Synthesis of cellulose of Acetobacter xylinum VI Vol 85, N o 2, J Bacteriol 31 http://www.vinegarman.com/zoo_vinegar_bacteria1.shtml 32 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucn ghiemdinhten.htm 33 http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/position1.ht m-30k 34 http://www.amolf.nl/ publications/theses/diotallevi/chap6.pdf 35 http://www.vmedicalspa.com 36 http://www.esf.edu/cellulose/conferences/cel-phf/saxena.pdf GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 72 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN lời cảm ơn Trong suốt trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài này, em nhận đợc giúp đỡ bảo tận tình PGS TS Đinh Thị Kim Nhung thầy cô giáo tổ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trờng ĐHSP Hà Nội 2, giúp đỡ động viên gia đình bạn bè Vì em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc giúp đỡ quý báu Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thuỳ Vân PGS TS Đinh Thị Kim Nhung hớng dẫn em cách tìm kiến thức, tài liệu để em có hớng đắn trình nghiên cứu Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, cô bảo em cách tận tình giúp em có tài liệu giá trị hoàn thành đề tài Đồng thời em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị phòng Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện tốt sở vật chất tinh thần để em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2009 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tuyền K31 B Sinh GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 73 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN lời cam đoan Tôi xin cam đoan viết luận văn kết nghiên cứu cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu không trùng với công trình nghiên cứu tác giả khác Trong đề tài có trích dẫn số dẫn liệu số tác giả khác Tôi xin phép tác giả đợc trích dẫn để bổ sung cho phần tổng quan tài liệu khoá luận Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tuyền K31 B Sinh GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 74 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Mục lục Trang Danh mục hình v bảng biểu Danh mục từ viết tắt Mở đầu Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Lợc sử phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter 1.2.2 Lợc sử phân loại Acetobacter 1.3 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.3.3 Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter môi trờng lỏng 1.3.4 Nhu cầu dinh dỡng vi khuẩn Acetobacter 1.3.5 Con đờng chuyển hóa cacbon 1.3.6 Đặc điểm số loài Acetobacter quan trọng Chơng Vật liệu phơng pháp nghiên cứu 2.1.Vật liệu thiết bị 2.1.1 Vi sinh vật 2.1.2 Máy móc thiết bị 2.1.3 Hóa chất 2.1.4 Môi trờng 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phơng pháp vi sinh vật 2.2.2 Xác định khả tổng hợp axit axetic chuẩn độ 2.2.3 Phơng pháp hóa sinh 2.2.4 Phơng pháp toán học 2.2.5 Phơng pháp thống kê xử lý kết GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 75 4 5 8 10 10 10 11 15 15 15 15 16 16 17 17 21 21 24 28 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Chơng Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn axetic từ số nguồn nguyên liệu 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter khiết 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng mỏng, dai, bề mặt nhẵn 3.4 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum M5 3.4.1 Nghiên cứu động thái sinh trởng phát triển chủng Acetobacter xylinum M5 3.4.2 Khảo sát khả tạo màng môi trờng nuôi cấy khác 3.4.3 Khảo sát khả tạo màng điều kiện nuôi cấy khác 3.5 Bớc đầu xử lý màng BC thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da 3.5.1 Thu hoạch, xử lý thử khả kháng khuẩn màng BC 3.5.2 Thử nghiệm màng BC làm mặt nạ dỡng da 30 30 33 36 42 42 45 49 kết luận v đề nghị 53 53 56 60 ti liệu tham khảo 61 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 76 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN danh mục hình v bảng biểu hình Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình 3.1 ảnh khuẩn lạc vi khuẩn axetic mẫu phân lập Hình 3.2 Chuyển hóa rợu etylic thành axit axetic vi khuẩn axetic Hình 3.3 Khả oxy hóa axetat vi khuẩn axetic Hình 3.4 Hoạt tính catalase chủng Acetobacter Hình 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trờng khác Hình 3.6 Khả kháng khuẩn màng BC tẩm mật ong Bảng Bảng 1.1 Phân loại nhóm vi khuẩn axetic theo Frateur (1950) Bảng 2.1 Thành phần môi trờng lên men Bảng 3.1 Nguồn gốc, đặc điểm chủng vi khuẩn axetic mẫu phân lập đợc Bảng 3.2 Đặc điểm hình thành màng cellulose chủng Acetobacter Bảng 3.3 Hàm lợng axit axetic hình thành chủng Acetobacter Bảng 3.4 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Acetobacter Bảng 3.5 Đặc điểm sinh hóa chủng Acetobacter Bảng 3.6 Giá trị OD đo đợc bớc sóng 610nm chủng Acetobacter Bảng 3.7 Động thái sinh trởng tổng hợp cellulose chủng Acetobacter xylinum M5 Bảng 3.8 Khảo sát khả tạo màng môi trờng khác Bảng 3.9 ảnh hởng pH đến hình thành màng BC GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 77 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Bảng 3.10 ảnh hởng thời gian nuôi cấy đến hình thành màng BC Bảng 3.11 ảnh hởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Bảng 3.12 Đánh giá sản phẩm màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dỡng da Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi hàm lợng axit axetic theo thời gian nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum M5 GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 78 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN danh mục từ viết tắt BC: Bacterial Cellulose (màng sinh học thu đợc từ trình lên men môi trờng lỏng có tham gia vi khuẩn Acetobacter xylinum) MPA: Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định cs: cộng OD: Optical Density STT: số thứ tự CFU: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) g/l: gam lit CNSH: Công nghệ sinh học GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 79 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền [...]... và H2O Acetobacter aceti 2 Meroxydans Acetobacter xylinum Có đầy đủ các đặc điểm trên Acetobacter meroxydan 3 4 Oxydans Peroxydans Acetobacter ascendans Không có khả năng tạo các Acetobacter ransens hợp chất xeto từ rợu bậc Acetobacter lovaniens cao Không có hoạt tính catalase, Acetobacter peroxydans không Acetobacter paradoxum oxy hoá glucose thành axit gluconic 1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter. .. số loài Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum, Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nhờ đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn axetic trong họ Pseudomonadaceae Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng một số tác giả ngời Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonadaceae Theo... sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 21 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử Tế bào của chúng thờng tìm thấy trong giấm, dịch rợu, nớc ép hoa quả, trong đất [17], [19] Theo Bergey, pH tối u cho vi khuẩn Acetobacter. .. đề tài Tuyển chọn đợc 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng hình thành màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn dùng làm mặt nạ dỡng da từ nguồn nguyên liệu tự nhiên với giá thành thấp GVHD: Đinh Thị Kim Nhung 11 SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền Khóa luận tốt nghiệp K31 Khoa Sinh - KTNN chơng 1 tổng quan ti liệu 1.1 Lợc sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm, vi khuẩn axetic) Từ rất lâu trong... giữ ở -75oC trong các ống enppendof vô trùng Bảo quản theo phơng pháp này cho phép giữ giống 1 đến 3 năm 2.2.1.5 Phơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn đợc các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai, nhẵn, để chế tạo màng sinh học làm mặt nạ dỡng da. Vì vậy cần tiến hành theo các chỉ tiêu sau [7]: GVHD: Đinh Thị Kim Nhung... trình tạo giấm, càng không thể giải thích đợc vì sao rợu loãng lại có thể chuyển thành giấm Chỉ đến khi khoa học phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật đợc khám phá thì vấn đề này mới đợc sáng tỏ Ngày nay, chúng ta khẳng định đợc rằng tác nhân của quá trình tạo giấm là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn axetic Công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn. .. khoảng 40 - 45 oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (18 - 24h) nuôi 6 - 7 ngày ở điều kiện thích hợp Quan sát hiện tợng: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dơng tính, ngợc lại là âm tính 2.2.3.4 Phát hiện khả năng chuyển hóa glucose thành axit gluconic Chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn trên môi trờng thạch GCP nếu xung quanh khuẩn lạc tạo vòng phân giải canxi ,... nâu tối đến đen nhạt (Acetobacter melanogenus); sắc tố hồng (Acetobacter recens) + Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp trong khoảng 30 - 35oC (Acetobacter suboxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18 - 21oC (Acetobacter oxydans) Năm 1950, Frateur chính thức đa ra một khoá phân loại mới dựa trên các tiêu chuẩn cụ thể nh [30]: - Khả năng tạo catalase - Khả năng tổng hợp các chất xeto từ... axetic, khả năng sử dụng hợp chất vô cơ và hữu cơ - Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trờng thạch Khi nuôi cấy trên môi trờng lỏng chú ý sự biến đổi của môi trờng sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không mùi, màu sắc môi trờng có biến đổi hay không) 1.2.2 Lợc sử phân loại Acetobacter Vi c tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter đợc tiến hành... hoàn toàn các hợp chất hữu cơ tạo các hợp chất xeton hay axit hữu cơ tơng ứng 1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter Trên môi trờng đặc (thạch đĩa) chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, đều đặn, không màu, đờng kính trung bình là 3mm Một số loài nh: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum, có khuẩn lạc rất nhỏ (đờng kính d=1mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và ... chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dỡng da. Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, độ pH cho chủng vi khuẩn Acetobacter. .. nhẵn, dai thời gian nuôi cấy ngắn đòi hỏi cần thiết cho công nghệ sản xuất màng BC dùng làm mặt nạ dỡng da Từ lý định tiến hành đề tài nghiên cứu: Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn. .. hiển vi, giới vi sinh vật đợc khám phá vấn đề đợc sáng tỏ Ngày nay, khẳng định đợc tác nhân trình tạo giấm vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn axetic Công trình nghiên cứu vi khuẩn