GÓP PHẦN TÌM HIỂU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỎ LƯỠI RẮN (Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Rubiaceae) Tôn Nữ Liên Hương Bộ môn Hóa Khoa Khoa học ABSTRACT Four compounds have been isolated from the arial and root parts of Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Rubiaceae By means of IR, MS,1H and 13C NMR spectra and chemical data they were identified as stigmasterol, β-sitosterol, acid oleanolic, acid ursolic Keywords: Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Rubiaceae; stigmasterol; βsitosterol, acid oleanolic, acid ursolic ĐẶT VẤN ĐỀ Cỏ Lưỡi rắn Việt Nam có tên khoa học Hedyotis corymbosa (L.) Lam, họ Cà phê (Rubiaceae) mọc hoang dại nơi mát, đất cát, đông y sử dụng trị rắn cắn, đau gan, mụn nhọt, chứng viêm nhiễm Nghiên cứu nước Nhật, Trung quốc, Mỹ Hedyotis corymbosa diffusa cho thấy dịch trích nước chúng có hoạt tính kháng ung bướu - in vivo tế bào ung thư Sarcoma, kháng protease HIV-1 Đã có số công bố thành phần hóa học thuốc thu hái Hong kong, số chất có hoạt tính sinh học tốt Tại Việt Nam thuốc dễ tìm, dùng nhiều toa thuốc cổ truyền chưa có thông báo khảo sát hóa học khảo sát sinh học thực trường Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh Bài báo trình bày số kết khảo sát hóa học, phân lập định danh hợp chất sterol, triterpenoid có Hedyotis corymbosa, Cỏ Lưỡi rắn Việt Nam PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN Nguyên liệu Cỏ Lưỡi rắn thu hái Mỹ Tho giám định Hedyotis corymbosa L (Lam), Rubiaceae Cỏ mọc sà, thân mảnh, dài 30-40cm, có nhiều nhánh; nhỏ hẹp dài, nhọn hai đầu, gân giữa, khía, mọc đối, cuống ngắn, nhìn giống lưỡi rắn; hoa nhỏ, màu trắng, cánh, đài, nhị, thường có đến hoa với cuống phụ ngắn tụ lại thành chùm cuống dài 1-2cm mọc từ nách Việc khảo sát hóa thực vật tiến hành nguyên liệu bột khô riêng phận hoa trái, lá, thân, rễ Trước tiên, khảo sát độ ẩm cây, hàm lượng tro định tính ion vô có tro phản ứng đặc trưng Trích kiệt bột khô alcol etil eter dầu hỏa, sau khảo sát định tính cấu tử hữu phản ứng đặc trưng hợp chất sterol, triterpen, flavonoid, tanin, iridoid, glicosid PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chúng tiến hành phân lập hợp chất sterol, triterpen có Cỏ Lưỡi rắn Bằng soxhlet tiến hành trích nóng kiệt bột với dung môi eter dầu hỏa xà phòng hóa thu lấy cao eter dầu hỏa phần không xà phòng hóa sau tiếp tục trích kiệt bột dung môi cloroform thu cao cloroform Từ hai cao thực sắc ký cột nhanh khô để phân lập chất Nạp cột sắc ký dùng silica gel 60H, Merck với dung môi giải ly có tính phân cực tăng dần, từ eter dầu hỏa (6090oC), benzen, cloroform, etil acetat, alcol etil (có t ỷ lệ tăng dần từ 0-100%) Kiểm tra phân đoạn ly trích dùng sắc ký mỏng loại 25 DC- Alufolien Kieselgel 60 F 255, Merck Đối với hợp chất phân lập đem tinh chế qua sắc ký dày, Merck Định danh hợp chất sau tổng hợp kết phân tích hóa lý chuyên sâu Đo điểm nóng chảy khối maquenne Phân tích nguyên tố carbon, hydrogen máy phân tích C, H tự động Trung tâm Dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp Hồ Chí Minh Ghi phổ hồng ngoại máy IR-470 SIMADU Ghi phổ 1H RMN, phổ 13C kết hợp kỹ thuật DEPT RMN máy BRUKER AC.200, tần số cộng hưởng 200 50 MHz Phổ khối lượng ghi máy MS-Engine-5989B-HP (Viện Hóa học, Trung tâm KHTN CNQG) theo kiểu va chạm electron (EI) 70 eV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết xác định độ ẩm cỏ Lưỡi rắn: hoa trái 84,6%, laï 82,3%, thân 82,0%, rễ 77,8% Kết hàm lượng tro cỏ Lưỡi rắn: hoa trái 8,7%, 9,3%, thân 9,6%, rễ 7,0% Kết định tính ion vô có tro: có ion K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, SO42-, PO43-, ion Fe2+, Fe3+, Mn2+ Trắc nghiệm dương tính với thuốc thử Liebermann Burchard, Salkowski, Noller cho biết có sterol, triterpen Ngoài trắc nghiệm dương tính với thuốc thử khác Shibata, H 2SO4 đậm đặc; Stiasny, acetat chì, FeCl 1%; Baljet, Molish; Trim Hill, cho biết có flavonoid, tanin, glicosid, iridoid, saponin Thực sắc ký cột cao eter dầu hỏa phần không xà phòng hóa Cỏ Lưỡi rắn phân lập chất I, II IV Thực sắc ký cột cao cloroform phân lập chất III IV (vì chất IV thu hai công đoạn qua kiểm tra chất) * Chất I thu giải ly cột sắc ký cao eter dầu hỏa phần không xà phòng hóa eter dầu hỏa, tinh thể hình kim, không màu, sắc ký mỏng hình vết màu nâu đỏ với thuốc phun H2SO4 50% Chất I tan tốt cloroform, có nhiệt độ nóng chảy: 165-1660C Phân tích nguyên tố: 84,60% C; 11,20% H Phổ IR (KBr) cho hấp phụ đặc trưng nhóm -OH (3432 cm-1), C=C (1639 cm-1), C-O- (1062 cm1),-CH, -CH (2936-2866 cm -1) Phổ 1H RMN (CDCl3) cho thấy nhóm >C=CH- với (=5,35ppm (1H, d), nhóm CH=CH- với (= 5,09ppm (2H, dd), xác thực nhóm >CHOH với (= 3,51ppm (1H, m) Phổ 13C RMN định lượng kết hợp DEPT (CDCl3) cho biết phân tử chất I có 29 C gồm nhóm >C= (140,73ppm) nhóm CH= (các pic 138,29; 129,25; 121,68ppm), C tam cấp mang nhóm -OH, hai C tứ cấp, nhóm -CH 2- 13 nhóm loại -CH CH3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Các liệu phổ nghiệm so sánh với phổ chuẩn trùng khớp, cho phép kết luận chất I Stigmasterol, công thức C29H48O 29 28 CH3 21 CH3 20 22 18 11 CH3 16 CH3 10 CH3 17 13 19 25 23 CH3 12 26 24 27 15 14 HO Stigmasterol * Chất II thu giải ly cột sắc ký cao eter dầu hỏa phần không xà phòng hóa hệ dung ly (eter dầu hỏa: benzen = 7: 3) tinh thể hình kim, không màu, sắc ký mỏng hình vết màu nâu đỏ với thuốc phun H 2SO4 50% Chất II có nhiệt độ nóng chảy: 1400C, tan tốt cloroform Phân tích nguyên tố: 84,07%C, 11,67%H Phổ IR (KBr) cho hấp phụ đặc trưng nhóm -OH (3421 cm-1), C=C (1640 cm ), C-O- (1380 cm-1),-CH, -CH (2936-2868 cm -1) -1 Phổ 1H RMN (CDCl3) khác chất I cho thấy nhóm >C=CH- δ=5,36ppm (1H, d), nhóm >CHOH với pic δ=3,37ppm (1H,dd) Phổ 13C RMN định lượng (CDCl3) kết hợp DEPT chất II cho biết phân tử có 29 C gồm nhóm >C= (140,74ppm), nhóm -CH= (121,70ppm), C tam cấp mang nhóm -OH, 11 nhóm -CH 2-, hai C tứ cấp 13 C khác Các liệu phổ nghiệm so sánh với phổ chuẩn trùng khớp cho phép kết luận chất II (-Sitosterol, công thức C29H50O 29 28 21 CH3 20 12 CH3 10 HO 19 11 18 CH3 24 23 17 16 13 22 14 CH3 25 26 CH3 CH 27 15 β - Sitosterol * Chất III thu giải ly cột sắc ký cao cloroform hệ dung ly benzen: cloroform = 1: 1) tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy: 2990C, tan alcol metil, sắc ký mỏng hình vết tròn màu đỏ sen với thuốc phun H2SO4 50% Phổ IR (KBr) cho hấp phụ đặc trưng nhóm -OH (3437 cm -1), -CH, -CH3 (2943-2868 cm -1), -COOH (1694 cm-1), C-O- (1030 cm -1) Phổ 1H RMN (MeOD) cho thấy có nhóm -COOH (=11,78ppm (1H, m), nhóm >C=CH- (=5,08 ppm (1H, m), nhóm >CHOH với tín hiệu vùng 4,59 4,20ppm PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phổ 13C RMN định lượng (MeOD) kết hợp DEPT cho biết phân tử chất III có 30 C gồm nhóm -COOH (181,72ppm), nhóm =C< (145,11ppm), nhóm -CH= (123,58ppm), C tam cấp mang nhóm -OH (79,62ppm), 10 nhóm -CH2-, C tứ cấp 11 C khác Chúng nhận thấy chất III triterpen có chứa nhóm -OH, nhóm COOH, 1nối đôi đặc trưng họ β-amyrin (trên phổ 13C RMN có cặp pic vùng từ trường thấp khoảng 123ppm 145ppm) nên chọn acid Oleanolic làm mẫu chuẩn để so sánh với thấy kết trùng khớp Song song ghi phổ MS với [M]+ = 456, mảnh phân cắt phù hợp số liệu tư liệu khẳng định chất III acid Oleanolic công thức C30H48O3 29 30 H3C CH3 20 21 19 12 13 11 25 CH3 14 10 15 COOH 16 CH3 22 28 17 26 CH3 18 27 24 HO 23 H3C CH3 Acid oleanolic * Chất IV thu giải ly cột sắc ký cao cloroform cloroform, tinh thể hình kim, không màu, sắc ký mỏng hình vết tròn màu đỏ sen với thuốc phun H2SO4 50% Chất IV có nhiệt độ nóng chảy: 259 -2600C, tan alcol metil Phổ IR (KBr) cho hấp phụ đặc trưng nhóm -OH (3429 cm-1), -CH, -CH (2932-2800 cm -1), -COOH (1689 cm-1), C-O- (1040 cm -1) Phổ 1H RMN (DMSO-d6) cho thấy có nhóm -COOH δ=12,57ppm (1H, m), nhoïm >C=CH- δ=5,12 ppm (1H, m), nhóm >CHOH với tín hiệu vùng 4,14 4,10ppm Phổ 13C RMN định lượng (DMSO-d6) kết hợp DEPT RMN cho biết phân tử chất IV có 30 C gồm nhóm -COOH (178,49ppm), nhóm =C< (138,37ppm), 1nhóm CH= (124,81ppm), C tam cấp mang nhóm -OH (77,08ppm), nhóm -CH2-, C tứ cấp 13 C khác Phổ MS cho biết [M]+ = 456, thỏa công thức C30H48O3 Chúng nhận thấy chất IV triterpen có chứa nhóm -OH, nhóm -COOH, nối đôi đặc trưng họ (amyrin nên chọn acid Ursolic làm mẫu chuẩn để so sánh với thấy kết trùng khớp CH3 29 CH3 30 12 25 HO 23 H3 C H 11 19 18 13 20 17 26 22 28 CH3 CH3 14 10 H 21 15 16 COOH CH3 27 24 CH3 Acid ursolic PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Cỏ Lưỡi rắn thu hái Mỹ Tho có độ ẩm trung bình 81,68%, hàm lượng tro trung bình 8,65%, tro có ion K+, Ca 2+, Mg2+, Cl-, SO42-, PO43-, ion Fe2+, Fe3+, Mn2+, bột khô có sterol, triterpen, flavonoid, tanin, iridoid, glicosid,saponin Từ bột khô cỏ Lưỡi rắn sắc ký cột silica gel phân lập khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết: stigmasterol (hiệu suất 0,01% khô), β-sitosterol (hiệu suất 0,09%), acid oleanolic (hiệu suất 0,04%), acid ursolic (hiệu suất 0,18%) Qua tài liệu công bố stigmasterol β-sitosterol có khả chữa trị rắn cắn, acid oleanolic đặc biệt acid ursolic hợp chất chống viêm gan (đã thử nghiệm in-vivo chuột), có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư (đã thử nghiệm in-vitro tế bào ung thư phổi người A549, buồng trứng SK-OV-3, da SK-MEL-2, não XF498, ruột kết HCT-15, dày SNU-1, bệnh bạch cầu u hắc sắc tố) Các chất phân lập với hàm lượng cao từ cỏ Lưỡi rắn bước đầu góp phần chứng minh khoa học cho khả trị liệu thuốc biết đến từ thời Tuệ Tĩnh Chúng hy vọng kết nói thu hút ngày nhiều ý nhà hóa học dược học nước ta PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO o Cosimo Pizza, Zhou Zhong Liang, Nunziatina de Tomasi 1987 Journal of Natural Products Vol 50 (5) p 927-931 o Greca Marina Della, Pietro Monaco 1990 J of Nat Products Vol 53 (6) p 1430-1435 o Hong Xi Xu, Min Wan, Boon Nei Loh 1996 Screening of traditional medicines for their inhibitory activity againt HIV-1 protease Phytotherapy research Vol 10 p 207-210 o Horst Fribolin 1993 Basic one and two dimensional NMR spectrocopy p 384 o Lê Quang Toàn 1993 Tổng quan thành tựu nghiên cứu hợp chất thiên nhiên từ thực vật dùng để phòng chữa bệnh Hóa học hóa chất Số o Lim Sung Hoon, Ahn Byung Zun, Ryo Shi Yong 1998 Antiturmor effects of ursolic acid isolated from Old diffusa Phytotherapy research 12 (8) p 553-556 o Nuno A Pereira, Bettina M Ruppelt Pereira, Maria Celia Nascimento, Walter B Morst 1994 Planta Medica 60 p 90-100 o 1993 The Aldrich Liabry of 13C, 1H NMR spectra S 440-9 CAS [83-49-7] Aldrich chemical company Inc o Võ Văn Chi 1997 Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học o Walter Martz 1992 Plants with a reputation againt snakebite Toxicon 30 (10) p 1131-1142 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Bảng số liệu phổ 13C RMN (δ ppm) chất stigmasterol (I), β-sitosterol (II), acid oleanolic (III), acid ursolic (IV) phân lập Vị trí C 10 11 12 13 14 15 Chất (I) 37,23 28,91 71,78 39,66 140,73 121,68 31,63 31,87 50,13 36,49 21,08 42,27 42,19 56,84 24,35 Chất (II) 37,23 31,64 71,79 42,29 140,74 121,70 31,88 31,88 50,11 36,49 21,06 39,75 42,29 56,74 24,28 Chất (III) 39,77 27,81 79,62 40,34 56,68 19,45 33,75 40,48 48,14 38,09 24,48 123,58 145,11 42,81 29,00 Chất (IV) 34,85 27,30 77,09 38,58 55,04 18,40 33,00 39,70 47,03 36,73 23,30 124,81 138,37 41,81 28,10 Vị trí C 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Chất (I) 28,20 55,93 19,39 12,02 40,47 21,09 138,29 129,25 51,21 31,87 21,20 19,38 25,39 12,23 Chất (II) 28,90 55,93 11,84 19,37 36,00 18,60 33,90 26,10 45,69 29,10 19,70 18,96 23,04 11,84 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chất (III) 24,30 47,72 42,64 47,55 31,55 34,85 34,20 28,73 16,28 15,99 17,65 26,40 181,72 33,55 23,96 Chất (IV) 24,30 47,25 52,59 39,28 38,87 30,70 36,56 28,47 15,45 16,28 17,10 23,49 178,49 17,24 21,33