ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------- NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------- NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Đức Minh PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đức Minh cùng PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, là những người đã trực tiếp hướng dẫn và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thầy cô đã cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên môn cũng như bồi đắp niềm đam mê, tính sáng tạo trong quá trình nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo của Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong quá trình học tập tại bộ môn, đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Đồng thời tôi cũng gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ thuộc Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội; cùng các bạn đồng nghiệp đã giúp tôi thu thập, phân loại các mẫu vật quý giá để sử dụng trong nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 06 năm 2015 Học viên Nguyễn Văn Thành MỤC LỤC: DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Tổng quan về nhóm Mang 2 1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới 2 1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam 4 2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử 8 2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài Mang sử dụng trong nghiên cứu 8 2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh 10 2.3. Phân tích thời gian tiến hóa 13 2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích 13 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu 16 16 1.1. Mẫu vật nghiên cứu 16 1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 16 1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 17 1.4. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: 23 2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.1. Tách chiết ADN tổng số 23 2.2. Phản ứng PCR 24 2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen 26 2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 31 2. Kết quả khuyếch đại gen bằng phản ứng PCR 32 3. Kết quả giải trình tự 34 4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại 35 4.1. Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ 36 4.2. Nhánh B 36 5. Kết quả phân tích thời gian tiến hóa KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 45 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 47 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 47 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribo nucleic acid Axit deoxyribonucleic bp base pair Cặp bazơ nitơ EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit ethylen diamin tetraaxetic kb kilobase(=1000bp) Kilo bazơ ML Maximum Likelyhood Hợp lý tối đa MP Maximum Parsimony Tiết kiệm tối đa mtDNA mitochondrial DNA Hệ gen ty thể OD Optical Density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối nR Number of root tree Số cây có gốc nU Number of unroot tree Số cây không gốc unweighted pair group with unweighted pair group with arithmetic mean arithmetic mean UPGMA i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis) 4 Hình 2. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) 6 Hình 3. Mang Trường Sơn (M truongsonensis) 7 Hình 4. Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu 22 Hình 5. Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu xương trên gel Agarose 1%, Marker 1kb Hình 6. Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu da khô trên gel Agarose 1%, Marker 1kb Hình 7. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 8. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-2 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 9. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 10. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen G-fib (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2 Hình 12. Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng giải trình tự Hình 13. Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên dữ liệu gen cytochrome b (1140bp) sử dụng phương pháp Bayesian Hình 14. 31 31 32 32 33 33 33 34 38 Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 3 gen ty thể và 1 gen nhân (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị 41 thông tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML Hình 15. Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của nhóm Mang ii 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Danh sách các loài Mang trên thế giới 3 Bảng 2. Số lượng cây không gốc và có gốc với số lượng taxa 10 từ 2 - 10 Bảng 3. Danh sách và thông tin mồi sử dụng cho nghiên cứu 17 Bảng 4. Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự cùng tên 18 mẫu, địa điểm thu mẫu Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang 40 Roosevelt dựa trên dữ liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4, 16S, G - fibrinogen Bảng 8. Khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn 42 Bảng 9. Địa điểm thu các mẫu Mang lớn 42 Bảng 10. Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến 43 hóa iii MỞ ĐẦU Việt Nam được biết đến là một đất nước đa dạng cao về hệ sinh thái, sông ngòi, cũng như hệ thống các loài động thực vật. Các vùng tự nhiên của Việt Nam có nhiều loài và nhiều trong số đó không tìm thấy ở nơi khác trên thế giới. Các nghiên cứu nhằm tìm kiếm các loài mới, đánh giá chi tiết về mức độ đa dạng của hệ thống động thực vật ở Việt Nam đã và đang được tiếp tục thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều loài ở Việt Nam chưa được nghiên cứu chi tiết bởi nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình nghiên cứu. Cụ thể, trong 15 năm trở lại đây, năm loài Mang (Muntiacus) đã được tìm thấy ở Việt Nam dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có ở trong nước [7 , 12 , 42]. Mặc dù vậy, vẫn chưa có các nghiên cứu chi tiết, đánh giá phân bố, đa dạng di truyền cũng như quan hệ tiến hóa giữa các loài Mang trên lãnh thổ Việt Nam. Điều này một phần do tính quý hiếm, khó bắt gặp cùng tập tính nhút nhát của các loài Mang. Ngoài ra, chúng đã được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu, sắp nguy cấp và nguy cấp trong sách đỏ thế giới. Do đó, việc điều tra sử dụng các phương pháp truyền thống có thể không đánh giá được chính xác mức độ đa dạng trong nhóm này, vì những mẫu thu được từ điều tra thực địa hầu như không cho phép thực hiện những nghiên cứu so sánh kỹ lưỡng về mặt hình thái. Trong khi đó, với sự phát triển của sinh học phân tử trong những năm gần đây, những phương pháp sử dụng ADN đã dần trở thành những công cụ hữu hiệu để điều tra tổng thể những loài khó bắt gặp và có thể giúp làm sáng tỏ những mối quan hệ tiến hóa của những loài được nghiên cứu. Trong hoàn cảnh này, việc nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu không trực tiếp dựa, và các chỉ thị phân tử ADN đối với các mẫu Mang hứa hẹn có hiệu quả cao. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài Mang (Muntiacinae) ở Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn” với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, cũng như phân bố, cùng mối quan hệ tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nhóm Mang 1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới Mang là một nhóm các loài thú móng guốc thuộc họ hươu nai Cervidae, phân họ Muntiacinae, giống Muntiacus; nhóm này hiện nay trên thế giới cho đến nay, dựa theo dữ liệu thu được của sách đỏ thế giới (The IUCN red list of threatended species) được xác định có 13 loài (Bảng 1). Mang có cơ thể nhỏ, sống đơn độc hoặc theo các nhóm nhỏ, môi trường sống của chúng thường là các khu rừng xanh nhiệt đới ở châu Á với độ cao tương đối lớn. Rất nhiều loài Mang hiện đang bị đe dọa bởi tình trạng săn bắn bất hợp pháp, cũng như tình trạng mất dần môi trường sống của chúng [20 , 30]. Hiện nay, một vài loài Mang như Mang đen (Muntiacus crinifrons), Mang Reeve (Muntiacus reevesi) đang được tập trung nghiên cứu, đánh giá [11 , 31 , 35]. Tuy nhiên, phần lớn các loài Mang khác đều chưa có các nghiên cứu cụ thể. Do đó, thông tin về các loài này còn rất ít, thậm chí một số loài Mang đã không được phát hiện cho đến cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21 (như Mang Roosevelt ở Việt Nam - Lào, Mang Ghongshan ở tây nam Trung Quốc, Mang lớn ở vùng biên giới Việt Nam Lào) [30]. Loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) từ sau khhi được mô tả năm 1932 rất hiếm khi được bắt gặp, cho đến năm 1999 được tái phát trở lại tại hiện tại Lào, mặc dù vậy các mẫu tìm thấy chỉ là các mẩu xương nhỏ sọ [7]; và từ thời điểm 1999 cho đến nay chưa có công bố của nghiên cáo nào cho thấy sự xuất hiện của loài này. Loài Mang Putao (M. putaoensis) được mô tả năm 1999 [6] có vùng phân bố ở phía Bắc Myanmar có quan hệ rất gần với 2 loài Mang khác có khu phân bố ở trong dãy Trường Sơn là Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) và Mang Roosevelt (M. rooseveltorum). Ba loài này có hình thái nhỏ và nhiều đặc điểm khá giống nhau kể cả về quan hệ di truyền [6 , 23]. Mang vàng Borneo (Muntiacus 2 atherodes) là loài đặc hữu ở Borneo. Trong suốt một thời gian dài, đã có sự nhầm lẫn giữa loài Mang vàng Borneo và loài Mang thường [30]. Bảng 1. Danh sách các loài Mang trên thế giới STT Tên loài Phân bố 1 Muntiacus atherodes Đảo Borneo (Brunei, Indonesia và Malaysia) 2 Muntiacus crinifrons Trung Quốc 3 Muntiacus feaes Myanmar, Thái Lan 4 Muntiacus gongshanensis Trung Quốc, Myanmar 5 Muntiacus montanus Indonesia 6 Muntiacus muntjak Bruine, Indonesia, Malaysia, Thái Lan 7 Muntiacus vaginalis 8 Muntiacus puhoatensis Việt Nam 9 Muntiacus putaoensis Ấn độ, Myanmar 10 Muntiacus reveesi Trung Quốc, Đài Loan 11 Muntiacus rooseveltorum Lào, Việt Nam 12 Muntiacus truongsonensis Lào, Việt Nam 13 Muntiacus vuquangensis Lào, Việt Nam Campuchia, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc. Nhóm Mang hiện được các nhà tiến hóa rất quan tâm bởi sự đa dạng trong số lượng nhiễm sắc thể giữa các loài Mang. Cụ thể, ở Mang thường, đây là cũng là loài thú có số lượng nhiễm sắc thể ít nhất với 2n = 6 ở giống cái và 2n = 7 ở giống đực; Mang Trung Quốc (M. reevesi) có 2n = 46 ở cả hai giới, M. crinifrons 2n = 8 ở giống cái và 2n = 9 ở giống đực, M. feae 2n = 13 ở giống cái và 2n = 14 ở giống đực [44]. Tuy nhiên, cho đến nay, nguyên nhân của hiện tượng này còn chưa được biết rõ. 3 1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam Hiện nay, Việt Nam được thống kê có 5 loài Mang sinh sống [7 , 12 , 42] bao gồm: Mang Ấn Độ (M. vaginalis) [42], Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) [10], Mang Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) [36], Mang Vũ Quang hay Mang lớn (Megamuntiacus vuquangensis hay Muntiacus vuquangensis) [40 , 43]. Sau đây là một số mô tả về 5 loài Mang được xác định là có thể có mặt ở Việt Nam. 1.1.2.1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis) Hình 1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis) Mang Ấn Độ (M. vaginalis) hay Mang thường (common muntjac) là tên gọi thông thường của loài Mang này (Hình 1). Loài này, con đực có sừng nhỏ dài khoảng 15cm và chỉ có duy nhất 1 nhánh. Mang Ấn Độ đôi lúc còn được gọi là “Mang sủa” bởi tiếng kêu đặc trưng của nó khi có nguy hiểm. Những bằng chứng cổ sinh vật học cho thấy Mang Ấn Độ đã xuất hiện ít nhất là từ cuối kỷ Pleistocene cách đây 12.000 năm. Loài này thường bị săn bắn để lấy da và thịt. Mang Ấn Độ là loài có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang. Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet, Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy loài này có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân loài đã được mô tả dựa trên vùng phân bố về địa lý [16]. 4 1.1.2.2. Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) Loài Mang này được mô tả một cách ngẫu nhiên trong một bài báo phổ thông [10] dựa trên cơ sở các mẫu gạc và một phần trán được Lê Trọng Trải và Đỗ Tước thu được từ khu vực Pù Hoạt, Quế Phong, Nghệ An, Việt Nam vào năm 1997 [41]. Tuy vậy, loài Mang này chưa từng được nghiên cứu chi tiết về mặt hình thái cũng như chưa từng được đưa vào những nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loại để đánh giá tính xác thực về mặt di truyền. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiến hành phân tích di truyền cho loài này dựa trên các mẫu được xác định về mặt hình thái là của loài Mang Pù Hoạt. 1.2.3. Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) Loài Mang Roosevelt được mô tả vào năm 1932 bởi Osgood [33] và trong suốt 60 năm tiếp theo không có bất kỳ mẫu vật nào được ghi nhận. Loài này được ghi nhận tại 3 địa điểm ở Lào, và các mẫu thu được từ thợ săn đều là các mẫu vật không nguyên vẹn. Cụ thể, vào tháng 2 năm 1995, hai mẫu xương sọ gần như nguyên vẹn và 6 phần xương sọ khác đã được tìm thấy tại Lào [7]. Loài này hiện nay được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu trong danh sách đỏ thế giới (IUCN). Hiện nay phân loại cho loài này còn khá nhiều tranh cãi. Về mặt hình thái, loài này rất khó phân biệt với các loài Mang có quan hệ gần khác như Mang Putao và Mang Trường Sơn. Nguyên nhân của vấn đề này là bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật cho đến nay rất ít [42]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào, chúng tôi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này. Khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng tôi đã xác nhận sự có mặt của loài Mang này. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định loài này có khu vực phân bố ở Việt Nam [28]. Ngoài ra, chúng tôi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di 5 truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn Xuân Liên, kết quả cho thấy, trong loài này có những nhánh tiến hóa riêng biệt. Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu bảo tồn. Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể trong hai khu bảo tồn [4]. Hình 2. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) 1.2.4. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) hay còn được gọi là Mang lớn (Giant muntjac hay Megamuntiacus vuquangensis) (Hình 2). Vào năm 1994 nhóm nghiên cứu của Tổ chức Bảo tồn Động vật Hoang dã (Wildlife Conservation Society) đã tìm thấy một số mẫu sừng có kích thước lớn bất thường của nhóm Mang tại các ngôi làng thuộc dãy Trường Sơn ở phía Đông trung tâm Lào, gần với biên giới VN và họ cũng tìm thấy một con đực có sừng Mang các đặc điểm tương tự bị nhốt ở một gánh xiếc vào tháng 3 năm 1994. Với kích thước lớn và có nhiều đặc điểm hình thái khác biệt với các loài đã mô tả, các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết về khả năng đây là một loài mới [17 , 40]. Trong giai đoạn này, các mẫu sừng và hộp sọ có các đặc điểm tương tự cũng được tìm thấy xung quanh khu bảo tồn Vũ Quang ở Việt Nam [38], và ở một số khu vực khác cùng địa bàn trên [12]. Vì vậy, loài Mang lớn (Megamunticus vuquangensis) đã được mô tả vào năm 1994. Chúng đã được chứng minh là một loài mới dựa trên cơ sở về kích thước và sự sai khác của trình tự 6 ADN của các gen ty thể giữa Mang lớn, Mang Ấn Độ, Mang Trung Quốc (Muntiacus reevesi) [19]. Vncreatures W. Robichaud Hình 3. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) 1.2.5. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) Về mặt hình thái, Mang Trường Sơn (Hình 3) được mô tả có kích thước cơ thể nhỏ hơn Mang Ấn Độ. Chúng có màu đen, trọng lượng xấp xỉ 15kg; đuôi rộng và ngắn, đen ở đỉnh đồng thời có dải trắng bên dưới. Hộp sọ của Mang Trường Sơn nhỏ hơn so với Mang thường, gạc chính ngắn [36]. Trình tự ADN của 6 mẫu có đặc điểm nhận dạng của Mang Trường Sơn cho thấy đây là loài Mang khác với các loài đã biết. Với phát hiện mới này, đây là loài móng guốc thứ 3 được xác nhận là loài mới ở Việt Nam trong vòng 5 năm. Mang Trường Sơn là loài Mang thứ hai được tìm thấy và mô tả ở dãy Trường Sơn là loài mới sau Mang Vũ Quang (M. vuquangensis). Các mô tả này dựa trên hình thái xương sọ, trình tự ADN và thông qua phỏng vấn người dân [36]. Trong các loài trên, ngoại trừ loài Mang Ấn Độ, bốn loài Mang còn lại đều được tìm thấy trong vòng 15 năm trở lại đây hoặc dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có mặt trong nước. Những loài Mang cho đến nay vẫn được coi là không có ở Việt Nam nhưng phân bố ở gần biên giới , như loài M. reevesi có thể có mặt ở nước ta nếu có những điều tra chi tiết hơn ở khu vực phía Bắc. Đồng thời loài Mang 7 Pù Hoạt được mô tả vào năm 1997 cho đến nay vẫn chưa có bất cứ nghiên cứu nào ở cấp độ phân tử để đánh giá tính xác thực của loài này. Hơn nữa, Việt Nam có thể còn có những loài ẩn sinh chưa được biết đến. Để hiểu rõ hơn mức độ đa dạng của nhóm này ở nước ta, xác định những thông tin cơ bản như vùng phân bố và số lượng chính xác của các loài thuộc nhóm Mang cần có những nghiên cứu chi tiết hơn đặc biệt cần có những nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa dạng di truyền [2]. 2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử 2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử dụng trong nghiên cứu Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu hiệu hình thái bên ngoài, tập tính, cấu trúc tế bào. Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu hình thái cho thấy một số hạn chế, cụ thể như ở các loài rất xa nhau nhưng do hiện tượng đồng hình nên có hình thái giống nhau, hay ở một số trường hợp, đặc điểm kiểu hình rất khó quan sát như ở các vi sinh vật [1]. Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một số phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử [1]. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) để giúp xây dựng cây phát sinh chủng loại. Trong đó, việc sử dụng chỉ thị là trình tự ADN cho hiệu quả và độ tin cậy cao trong các nghiên cứu [25]. Trong trường hợp này, các dấu hiệu phân tử (chủ yếu là nucleotide) có thể khắc phục những khó khăn của phương pháp phân loại dựa trên hình thái [1]. Hiện nay có một số phương pháp cơ bản sử dụng chỉ thị ADN để xác định các mối quan hệ di truyền như: Microsatellites, RFLP (restriction fragment length polymorphisms), giải trình tự ADN (DNA sequence). Với phương pháp giải trình tự (DNA sequence) các vùng gen cần thiết được nhân lên bằng phản ứng PCR để tiến hành xác định chính xác trình tự các nucleotide trên đoạn gen mong muốn. Dựa vào 8 tốc độ biến đổi của các nucleotide trên các vùng gen, chúng ta có thể xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Cụ thể, mức độ thay thế các nucleotide tại mỗi vùng ADN của hệ gen là khác nhau và phụ thuộc áp lực chọn lọc tự nhiên trên mỗi locut và chức năng của sản phẩm gen. Tuy vậy, ở các locut có áp lực chọn lọc tương đương thì tốc độ thay đổi trong các trình tự ADN là ổn định, khi xét trong quãng thời gian tiến hóa lâu dài. Quan hệ di truyền giữa tất cả các dạng sống đều có thể được xác định dựa trên việc so sánh các chỉ thị phân tử giữa chúng với nhau. Có nhiều phương pháp được thiết lập nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Một trong nhưng phương pháp cơ bản nhất là xây dựng sơ đồ hình cây dựa trên các chỉ thị di truyền để mô tả mối quan hệ giữa các loài, gọi là cây phát sinh chủng loại hay cây tiến hóa (Phylogenetic tree). Ngoài việc khắc phục được một số hạn chế của phân loại học truyền thống, nó cũng có nhiều ưu điểm khác như: kết quả thí nghiệm thường khách quan, chính xác, không phụ thuộc vào chủ quan của người quan sát như trong phân loại học dựa trên hình thái [25]. Cơ sở phân loại của phương pháp này chủ yếu dựa trên trình tự ADN được xây dựng từ bốn nucleotide là giống nhau ở mọi sinh vật do đó tiện so sánh, nghiên cứu ngay cả ở những sinh vật khác xa nhau [25]. Sự sai khác trong các trình tự ADN được xem là kết quả của quá trình tiến hóa phân tử theo thời gian. Do vậy, các nhà khoa học xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng việc so sánh các trình tự ADN và phân tích sử dụng các thuật toán xác suất. Cây phát sinh chủng loại thể hiện đa dạng di truyền, mối quan hệ và tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Dựa trên loại thuật toán xác suất được sử dụng để phân tích dữ liệu, người ta chia thành nhiều phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại khác nhau. Phân tích phát sinh chủng loại sử dụng trình tự ADN là một phần quan trọng trong các nghiên cứu như: sinh học phân tử, sinh học phát triển, di truyền học quần thể, tiến hóa và đa dạng sinh học [25]. Mỗi cây phát sinh chủng loại thường chỉ là một phần của cây tiến hóa xuất phát từ một tổ tiên chung. Tận cùng của mỗi cây phát sinh chủng loại thường là một hoặc một số taxon. Điểm nằm giữa phân nhánh (node) đại diện cho tổ tiên chung của các nhóm loài riêng biệt trước khi phân li tiến hóa. Chiều dài mỗi nhánh thể hiện mức 9 độ khác biệt giữa các taxon. Các cây tiến hóa có điểm xác định tổ tiên chung gọi là các cây tiến hóa có gốc (root trees), ngược lại, các cây tiến hóa không gốc (unroot trees) chỉ phản ánh mối quan hệ và sự sai khác giữa các taxon. Số lượng cây tiến hóa tăng lên cùng với số lượng taxon nghiên cứu (Bảng 2) [1]. Cụ thể, số cây phát sinh chủng loại có gốc (NR) và không gốc (NU) tương ứng là: NR = (2n-3)!/[2n-2(n-2)!] với n ≥ 2 (Phương trình 2.1) NU = (2n-5)!/[2n-3(n-3)!] với n ≥ 3 (Phương trình 2.2) Dù vây, việc xây dựng cây tiến hóa nào cũng đều cần đến nhóm ngoài, hay còn gọi là các taxon đối chứng [1 , 34]. Bảng 2. Số lượng cây không gốc và có gốc với số lượng taxon từ 2-10 Số Số lượng Số lượng taxon cây không gốc cây có gốc 2 1 1 3 1 3 4 3 15 5 15 105 6 105 945 7 945 10395 8 10395 135135 9 135135 2027025 10 2027025 34459425 2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh Để xác định được cây loài phát sinh, các dữ liệu ADN thường được phân tích bằng các thuật toán xác suất. Hiện nay nhiều dạng thuật toán khác nhau được dùng trong các phần mềm máy tính là cơ sở của nhiều phương pháp xây dựng cây loài phát sinh khác nhau như: ma trận khoảng cách (Distance Matrix), neighbour joining, tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) và Bayesian. Trong nghiên này, chúng tôi sử dụng đồng thời 3 phương 10 pháp là tiết kiệm tối đa (MP), hợp lý tối đa (ML) và Bayesian nhằm so sánh các kết quả thu được để tăng độ tin cậy cho kết quả cuối cùng. Ba phương pháp kể trên đều đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu tiến hóa và đã cho kết quả với độ tin cậy tốt ở các nghiên cứu trước đây [1 , 25 , 34]. 2.2.1. Ma trận khoảng cách (Distance matrix) Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu tiến hóa. Trong số đó, thuật toán UPGMA (unweighted pair group with arithmetic mean) phân tích tất cả các dấu hiệu, qua đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp nhóm từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền ngắn nhất. Thuật toán này coi tốc độ tiến hóa của các nucleotide là như nhau ở mọi nhánh tiến hóa. Tuy nhiên, điều này không phải lúc nào cũng đúng, bởi vì tốc độ tiến hóa tại các vùng gen khác nhau có tốc độ khác nhau phụ thuộc sản phẩm chúng mã hóa và áp lực chọn lọc đối với vùng gen đó [1]. Do vậy, ưu điểm của thuật toán này là có tốc độ phân tích nhanh và đơn giản, UPGMA sẽ phù hợp nhất khi sử dụng với cây tiến hóa có tốc độ tiến hóa ở các nhánh là như nhau. Thuật toán này cũng sẽ dùng phù hợp để xử lý một lượng lớn dữ liệu, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài, nhưng không phản ánh được tiến hóa ở mỗi gen [1]. 2.2.2. Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony) Phương pháp này được đề xuất vào năm 1963 bởi Edwards và Cavalli-Sforza [15]. Tích phân tiến hóa là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên hệ dữ liệu là các trình tự ADN, so sánh các vị trí giữa các nucleotide tương ứng trong hệ dữ liệu ADN này. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi phương pháp này dựa trên nguyên tắc sinh học “đột biến hiếm khi xảy ra”. Thuật toán này cho rằng cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có số đột biến thấp nhất trong tất cả các cây có thể tìm được giữa các taxon được phân tích [1 , 34]. Thuật toán của tích phân tiến hóa đầu tiên sẽ xác định tất cả các vị trí có giá trị thông tin bằng cách so sánh tất cả các trình tự nucleotide tại mỗi vị trí, rồi từ xác định ra cây cần ít đột biến nhất tại mỗi vị 11 trí. Cây phát sinh nào cần ít đột biến nhất khi xét tại tất cả các vị trí được gọi là cây tiến hóa phỏng đoán. Đây là cây được cho là gần với cây tiến hóa đúng nhất. Với phương pháp này, chúng ta có thể dự đoán tổ tiên của mỗi nhánh tiến hóa. Tuy nhiên, tốc độ biến đổi giữa các nucleotide là không như nhau, ví dụ như các đột biến đồng hoán có tỷ lệ xảy ra cao gấp 3 lần các đột biến dị hoán. Bởi vậy đôi khi phương pháp tiêt kiệm tối đa có thể không phản ánh đúng về thời điểm xảy ra sự tách ly tiến hóa giữa các loài vì tốc độ tiến hóa của các nucleotide giữa các nhánh là khác nhau [1]. 2.2.3. Hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) Phương pháp hợp lý tối đa là một phương pháp xác suất thuần túy. Phương pháp này đánh giá một giả thuyết tiến hóa bằng việc xây dựng tất cả cây tiến hóa có thể có dựa trên mô hình tiến hóa và cơ sở dữ liệu đưa vào, rồi từ đó xác định cây có xác suất xảy ra cao nhất. Phương pháp này thường được xem là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn các phương pháp khác [1]. Tuy nhiên, khi dữ liệu đưa vào lớn thì số cây phát sinh chủng loại thu được sẽ trở nên rất lớn (với số taxa > 30 thì số cây phát sinh chủng loại thu có thể có > 5x1038 [1]) từ đó khiến khả năng tính toán rất chậm. Do vậy, phương pháp này bước đầu sẽ chỉ được áp dụng với một số lượng dự liệu nhỏ và với các mẫu có đủ số liệu. 2.2.4. Bayesian Trong phân tích Bayesian, kết quả về phát sinh chủng loại dựa trên xác suất hậu nghiệm thu được qua cây phát sinh chủng loại. Bayesian là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng Markov Chain Monte Carlo (MCMC) có kết hợp của mô hình tiến hóa và dữ liệu đưa vào, từ đấy tính toán ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây. Xác suất hậu nghiệm là xác suất có điều kiện mà cây nhận được khi đưa các mô hình vào, cơ sở dữ liệu. Phương pháp Bayesian với MCMC đã được được chấp nhận và sử dụng rộng rãi như là một phương pháp tin cậy trong xây dựng cây phát sinh chủng loại [22]. 12 2.3. Phân tích thời gian tiến hóa Phân tích xác định thời gian phân tách của các nhóm Mang được thực hiện dựa trên phần mềm BEAST. Trên thực tế, đây là một gói phần mềm, bao gồm các chương trình BEAST, BEAUti do đó gọi tắt là BEAUti & BEAST. Gói phần mềm này sử dụng thuật toán thống kê Bayesian và do đó sẽ cần cung cấp các giá trị tiền nghiệm kết hợp với các thông tin có được từ hệ dữ liệu phân tử. Để chạy phân tích, chúng tôi đưa vào hai hệ dữ liệu. Hệ dữ liệu thứ nhất là dữ liệu ADN chúng tôi thu được, hệ dữ liệu thứ hai là mốc thời gian phân tách (calibration point ) của loài Mang và các tham số tiền nghiệm (prior) [5]. Cả hai hệ dữ liệu này được đưa vào chương trình BEAUti, để từ đó, với phần mềm này chúng tôi lựa chọn các tùy chỉnh phù hợp cho hai hệ dữ liệu trên, cuối cùng sẽ tạo ra file định dạng mà chương trình BEAST có thể hiểu và sử dụng để chạy phân tích [14]. Kết quả thu được qua phần mềm BEAST là cây phát sinh chủng loại đi kèm với mốc thời gian phân tách của các nhánh nhờ việc mô phỏng mô hình tốc độ tiến hóa phân tử của các nhánh này trên cây. Ở mức độ đơn giản nhất, điều này có thể thống nhất một tỷ lệ về thời gian trên toàn bộ cây phát sinh chủng loại dựa trên các thông tin hiệu chỉnh (calibration) đã có [14]. Do vậy, BEAST là phần mềm đầu tiên cho phép suy luận để xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện được mô hình đồng hồ phân tử giữa các loài [13]. 2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích Hiện nay, rất nhiều các chỉ thị phân tử được xác định với các vai trò khác nhau, phụ thuộc các mục đích và đối tượng trong các nghiên cứu. Trong đó, hệ gen ty thể, so với hệ gen nhân, có phương thức sao chép và di truyền khá khác biệt. Bởi vậy, tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những sai khác nhất định so với hệ gen nhân. Đồng thời, mỗi loại chỉ thị đều có các ưu điểm và nhược điểm riêng. Các gen được lựa chọn vào việc xây dựng cây phát sinh chủng loại tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và thời gian tiến hóa của nhóm loài cần quan tâm. Thông thường, những nghiên cứu tập trung vào nhóm loài có thời gian tiến hóa ngắn đòi 13 hỏi cần có những gen có tốc độ tiến hóa nhanh và ngược lại những nhóm loài có thời gian tiến hóa dài cần có những gen có tốc độ tiến hóa chậm hơn [1 , 8]. Hệ gen ty thể ở nhóm thú và người chứa một phân tử ADN (ký hiệu là mtADN) có dạng sợi kép, mạch vòng, dài khoảng 15000 bp. Tỷ lệ đột biến đồng nghĩa của hệ gen ty thể ở người vào khoảng 5,7x10-8 mỗi năm, gấp 10 lần so với đột biến đồng nghĩa trung bình trong vùng mã hóa của gen nhân [1 , 45]. Tỉ lệ đột biến khác nghĩa ở các gen mã hóa protein ở hệ gen ty thể rất khác nhau, nhưng trong mọi trường hợp, tỷ lệ này vẫn cao hơn rất nhiều so với đột biến ở hệ gen nhân. Cơ chế dẫn đến mtADN có tốc độ đột biến cao như thế có thể do sai sót trong quá trình sửa chữa mtADN. Một lý do khác là áp lực của chọn lọc tự nhiên đối với hệ gen ty thể cao hơn sao với gen nhân, bởi vì mỗi tế bào chứa hàng chục tỷ ty thể và trung bình mỗi ty thể chứa 2 bản sao mtADN. Một khác biệt cơ bản nữa của hệ gen ty thể là gen ty thể nằm ở tế bào chất, di truyền theo dòng mẹ (không xảy ra trao đổi chéo do không giảm phân). Do đó, các đột biến xảy ra trên hệ gen ty hầu hết là đột biến thay thế chứ không phải do tái tổ hợp. Với kích thước nhỏ, cùng với tốc độ đột biến thay thế cao, hệ gen ty thể là một công cụ hiệu quả cho nghiên cứu tiến hóa, đa dạng di truyền giữa các loài, và các quần thể [1]. Các vùng gen trong hệ gen ty thể, tùy thuộc vào tốc độ biến đổi khác nhau được sử dụng với các mục đích nghiên cứu khác nhau. Ví dụ, với gen cytochrome b (Cyt-b) đã đươc sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại ở động vật. Tốc độ biến đổi của gen Cyt-b phù hợp với mục đích so sánh các loài ở mức độ giống và họ. Kết quả của rất nhiều nghiên cứu phát sinh chủng loại cho thấy, gen Cyt-b cho các kết quả cây phát sinh chủng loại khá chính xác. Xa hơn nữa, sử dụng gen Cyt-b có thể hỗ trợ việc xác định giống đối với các loài mới [36]. Dựa trên các lý do tương tự, các vùng gen khác như Cytochrome c Oxidase subunit I (COI), NADH dehydrogenase 4 (ND4) được dùng cho di truyền quần thể, quan hệ phát sinh chủng loại ở mức độ loài và phân loài của lớp thú [24]. Hệ gen nhân có tốc độ, thời gian biến đổi chậm hơn rất nhiều so với hệ gen ty thể. Do đó, hệ gen nhân phù hợp với việc phân tích, làm rõ các nhánh có thời gian 14 tiến hóa lâu hơn. Tuy nhiên, hệ gen nhân cũng có các hạn chế nhất định. Với các mẫu có tuổi mẫu lớn (các mẫu của chúng tôi có tuổi mẫu xấp xỉ 10 năm kể từ khi mẫu được thu bởi người dân) hay điều kiện bảo quản mẫu không tốt, việc nhân dòng hệ gen nhân gặp khá nhiều khó khăn bởi số lượng bản sao ít hơn rất nhiều so với hệ gen ty thể. Ngoài ra, kích thước lớn khiến hệ gen nhân dễ bị biến đổi, phá hủy [1 , 8]. Từ các ưu và nhược điểm riêng của từng loại chỉ thị, chúng tôi lựa chọn sử dung cả hệ gen ty thể và hệ gen nhân để có thể có được các kết quả tốt nhất. Cụ thể, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn 3 gen ty thể là gen Cytochrome b, ND4 (NADH dehydrogenase subunit 4), gen 16S và 1 gen nhân là gen G-fibrinogen (G-fib). Ngoài các lý do như đã nêu, chúng tôi lựa chọn các gen trên còn bởi vì các gen này đã được sử dụng thành công ở các nghiên cứu trên nhóm Mang trước đây. Thậm chí, cho đến nay, một số loài Mang chỉ có trình tự duy nhất của 1 gen (Mang Ghongsang hiện nay chỉ có duy nhất 1 trình tự gen ND4 (AF190678)). Do vậy, khi lựa chọn các gen kể trên, chúng tôi hi vọng sẽ cho kết quả tốt và có thể kết hợp với các nghiên cứu trước đây nhằm đưa ra các kết luận phù hợp nhất [7 , 36] [23]. Với gen Cyt-b chúng tôi quyết định nhân lên toàn bộ chiều dài đoạn gen này là 1140bp đối với tất cả các mẫu. Gen 16S và G-fib có kích thước khoảng 600bp, gen ND4 có kích thước khoảng 700bp. Số lượng chi tiết của các gen được chúng tôi tiến hành giải trình tự và các gen từ GenBank sử dụng cho nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 4. 15 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu 1.1. Mẫu vật nghiên cứu Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu bởi các chuyên gia thuộc Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Quy hoạch Lâm Nghiệp. Tổng cộng 78 mẫu gồm 43 mẫu xương và 35 mẫu da khô được thu thập tại 12 khu bảo tồn trên cả nước (Hình 4), nơi được ghi nhận là có sự xuất hiện của các loài Mang. Thông tin chi tiết về các địa điểm thu mẫu được thể hiện trong Bảng 4. 1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu  Kít tách chiết DNeasy blood and tissue của Qiagen  Ethanol của Merk  PCR Mastermix của Fermentas  Hotstart Taq Mastermix của Qiagen – Đức  Kit GeneJET PCR Purification – Thermo  Agarose của Invitrogen  Tris-Base của Sigma  Boric axit của Merk  EDTA của Merk  Ethidium bromide của Invitrogen 16  Marker 100bp, 1kb của Fermentas  Dye 6X của Fermentas 1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đã được sử dụng và cho kết quả tốt trong các nghiên cứu về nhóm Mang cũng như các nhóm thú khác trong các nghiên cứu trước. Ngoài ra, trình tự mồi cho phản ứng nhân phân đoạn gen ND4 được chúng tôi tự thiết kế trong nghiên cứu này. Các mồi được đặt tại hãng IDT – Mỹ. Trình tự các cặp mồi này được thể hiện ở dưới đây (Bảng 3). Bảng 3. Danh sách và thông tin mồi sử dùng trong nghiên cứu Phân Tên đoạn mồi gen Cyt-b-1 Cyt-b-2 ND4 Kích thước phân Trình tự mồi đoạn gen 5’-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’ Irwin et al 1991 5’-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’ Irwin et al 1991 5’-GCAAGCTTCTACCATGAGGACAAATATC-3’ Irwin et al 1991 5’-GGAATTCATCTCTCCGGTTTACAAGAC-3’ Irwin et al 1991 5’-CTCATRCCYCTGACCTGACTAT-3’ Le et al 2013 5’-GCTATAAATTCGGTAAGTGGATT-3’ Le et al 2013 5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’ Palumbi BR 5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’ Palumbi GL1 5’-AGAHAAYTGCTGCATCTTAGATG-3’ Gatesy et al 1997 5’-TTCRTATTTCATAATTTCTTC-3’ Gatesy et al 1997 L14724 H15149 L15162 H15915R ND4-F ND4-R 450 750 700 AR 16S G-fib Tác giả 600 GR1 590 17 et al et al 1991 1991 Bảng 4. Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự, cùng tên mẫu, địa điểm thu mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu. Tất các trình tự được nhân lên trong nghiên cứu này đánh dấu “xxxxxx”, các đoạn gen không có trình tự được đánh dấu “-” Cyt-b ND4 Panolia eldi HM138200 HM138200 HM138200 - - - Kong and Li (unpublished) Elaphodus cephalophus NC008749 NC008749 NC008749 - - - Pang và cộng sự, 2008 Muntiacus crinifrons NC004577 NC004577 NC004577 - - - Li và cộng sự, 2003 Muntiacus crinifrons AY239042 AY239042 AY239042 - - - Li và cộng sự, 2003 Muntiacus crinifrons EF523660 - - - - - James (unpublished) Muntiacus crinifrons EF523661 - - - - - James (unpublished) Muntiacus crinifrons EF523664 - - - - - James (unpublished) Muntiacus feae FJ556561 - - - - - Tungsudjaivà cộngsự(unpublished) Muntiacus feae AF042721 - - - - - Giao và cộng sự, 1998 Muntiacus gongshanensis G-fib Tên mẫu Tài liệu tham khảo AF190678 - - - - Wang and Lan, 2000 Muntiacus putaoensis EF523665 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus putaoensis EF523666 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus putaoensis EF523667 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus putaoensis KJ425280 KJ425299 - M4.1 Myanmar Muntiacus reevesi EF035447 EF035447 - - - - Wang và cộng sự(unpublished) Muntiacus reevesi AF527537 AF527537 AF527537 - - - Zhang và cộng sự, 2002 - Amato và cộng sự, 1998 Muntiaucs rooseveltorum - 16S Địa điểm thu mẫu Tên loài - KJ425290 - AF108031 - Muntiacus rooseveltorum KJ425278 - KJ425271 - Muntiacus rooseveltorum KJ425279 KJ425298 KJ425272 Muntiacus rooseveltorum KJ425281 KJ425300 KJ425273 Muntiacus rooseveltorum KJ425282 KJ425301 KJ425274 Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - - Le và cộng sự, 2014 M2.18 KBTTN Xuân Liên Le và cộng sự, 2014 KJ425289 M2.20 KBTTN Pù Hoạt Le và cộng sự, 2014 KJ425291 M6.3 KBTTN Pù Hoạt Le và cộng sự, 2014 KJ425292 M6.4 KBTTN Pù Hoạt Le và cộng sự, 2014 X22 KBTTN Xuân Liên - X44 KBTTN Xuân Liên - 18 Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - X8 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - X33 KBTTN Xuân Liên - - - - - - Amato và cộng sự, 1999 Muntiacus truongsonensis AF042718 - - - - - Giao và cộng sự, 1998 Muntiacus truongsonensis xxxxxx - - - M1.2 KBTTN Sông Thanh Muntiacus truongsonensis KJ425276 KJ425296 - Muntiacus truongsonensis xxxxxx xxxxxx - Muntiacus truongsonensis AF108033 Muntiacus truongsonensis xxxxxx - - Muntiacus truongsonensis KJ425277 KJ425297 - Muntiacus truongsonensis xxxxxx M1.9 KBTTN Sao La Le và cộng sự, 2014 - M6.20 KBTTN PNKB - - M1.8 KJ425287 KJ425288 - M2.4 KBTTN Sao La KBTTN Sao La Le và cộng sự, 2014 - - M2.7 NC004563 - - - Shi và cộng sự (unpublished) - - - - - Giao và cộng sự, 1998 - - - - - Giao và cộng sự, 1998 AF042717 - - - - - Giao và cộng sự, 1998 Muntiacus vaginalis EF523655 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus vaginalis EF523656 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus vaginalis EF523657 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus vaginalis EF523658 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus vaginalis EF523659 - - - - - James và cộng sự, 2008 Muntiacus vaginalis JN861030 - - - - - Suresh và cộng sự (unpublished) Muntiacus vaginalis JN861033 - - - - Suresh và cộng sự (unpublished) Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - Mu5.11 KBTTN Na Hang - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - Mu1.6 KBTTN Sông Thanh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - Mu1.7 KBTTN Sông Thanh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - Mu5.14 Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X1 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X11 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X31 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx xxxxxx - xxxxxx Mu6.5 KBTTN Pù Hoạt - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X39 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.16 KBTTN Pù Hoạt - Muntiacus vaginalis NC004563 Muntiacus vaginalis AF042715 Muntiacus vaginalis AF042716 Muntiacus vaginalis - - NC004563 - 19 - - - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X3 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X45 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M5.7 KBTTN Na Hang - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M6.17 KBTTN Ngọc Linh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X26 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M1.3 KBTTN Sông Thanh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.14 KBTTN Sao La - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M6.19 KBTTN Ngọc Linh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.8 KBTTN Sao La - Muntiacus vaginalis xxxxxx xxxxxx - xxxxxx M2.10 KBTTN Ngọc Linh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M6.11 KBTTN Kon Chư Răng - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M3.6 KBTTN Sốp Cộp - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M3.7 KBTTN Ngọc Linh - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X17 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.2 KBTTN Pù Hoạt - Muntiacus vaginalis xxxxxx xxxxxx - xxxxxx M2.21 KBTTN Pù Hoạt - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X6 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X9 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.1 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.19 KBTTN Pù Hoạt - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X5 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X15 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.5 KBTTN Mường Nghé - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M2.11 KBTTN Sao La - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M3.5 KBTTN Sốp Cộp - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M3.8 KBTTN Sốp Cộp - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X19 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X37 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - X43 KBTTN Xuân Liên - Muntiacus vuquangensis NC016920 NC016920 NC016920 - - - Hassanin và cộng sự, 2012 Muntiacus vuquangensis AF042720 - - - - - Giao và cộng sự, 1998 20 Muntiacus vuquangensis KJ425275 KJ425295 - Muntiacus vuquangensis KJ425293 - - M1.1 KBTTN Dakrong Le và cộng sự, 2014 - M6.21 KBTTN Sao La Le và cộng sự, 2014 - KJ425286 Muntiacus vuquangensis xxxxxx - - M1.5 KBTTN Sao La Muntiacus vuquangensis KJ425283 KJ425302 - KJ425293 M6.9 KBTTN Kon Chư Răng Le và cộng sự, 2014 Muntiacus vuquangensis KJ425284 KJ425303 - KJ425294 M6.13 KBTTN Kon Chư Răng Le và cộng sự, 2014 21 - Hình 4. Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu. 22 1.4. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: Các thiết bị chúng tôi sử dụng thuộc phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Phương pháp nghiên cứu Với mục đích thu nhận trình tự các đoạn gen chỉ thị, từ đó sử dụng để phân tích, đánh giá đa dạng di truyền, cũng như tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam, quá trình nghiên cứu của chúng tôi được chia ra gồm 4 bước chính: (1) tách chiết ADN tổng số, (2) khuyếch đại các phân đoạn gen quan tâm bằng phản ứng PCR, (3) tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quan tâm, (4) phân tích đa dạng di truyền dựa trên trình tự thu được bằng phần mềm tin sinh học. 2.1. Tách chiết ADN tổng số Các mẫu của chúng tôi bao gồm các mẫu xương và da khô thu được qua người dân bản địa, do vậy điều kiện bảo quản các mẫu này không tốt, dẫn đến chất lượng ADN tổng số lưu dữ được rất ít, và đứt gãy rất nhiều. Ngoài ra, chúng tôi cũng lấy các mẫu bảo tàng được bảo quản trong điều kiện tốt, nhưng tuổi mẫu đã khá cao, (khoảng xấp xỉ vài chục năm). Do vậy, chúng tôi tách chiết ADN tổng số sử dụng bộ kit Dneasy Blood and tissue, với các quy trình đã mô tả trong nghiên cứu của Lê Đức Minh và cộng sự năm 2013 [3] . Quy trình này của chúng tôi đã được tối ưu để nhằm phục vụ tách chiết các mẫu có chất lượng ADN thấp. Đầu tiên, mẫu được tiền xử lý rửa bề mặt bằng phương pháp ngâm trong dung dịch Clorox 10% . Bước này giúp loại bỏ các thành phần bề mặt không cần thiết, các loại nấm mốc, vi sinh vật. Tiếp đó, mẫu đựơc lấy ra, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, cuối cùng để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, chúng tôi sử dụng bộ kít DNeasy blood and tissues với protocol được chỉnh lý [3] để tách chiết ADN tổng số từ các mẫu xương và da khô đã được làm sạch. 23 Mẫu đã khô được chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung 180µl dung dịch đệm ATL và 20µl proteinase K. Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong 72 giờ. Proteinase K được bổ sung tiếp tục sau mỗi 24 tiếp theo (tổng cộng lượng proteinase K sử dụng là 60µl). Sau 72 giờ, dung dịch và mẫu được lấy ra khỏi bể ổn nhiệt, vortex nhẹ trước khi bổ sung 200µl dung dịch đệm AL. Hỗn hợp mới này lại tiếp tục được ủ ở 70°C trong 7 phút, sau đó đựơc lấy ra bổ sung thêm 200µl dung dịch Ethanol 100. Dung dịch trong hỗn hợp thu được sẽ chuyển qua cột lọc 2ml, ly tâm với tốc độ 6000 rcf trong 1 phút. Cột lọc sau ly tâm được chuyển sang ống 2ml mới. Dung dịch sau ly tâm được loại bỏ. Bổ sung 500 µl dung dịch đệm AW1 vào cột lọc mới và ly tâm ở 6000 rcf trong 1 phút. Tương tự bước trên, lần này, cột lọc cũng được chuyển vào ống 2ml mới và loại bỏ dung dịch sau ly tâm. Đồng thời, dung dịch AW2 được bổ sung 500µl vào cột lọc và ly tâm ở 20000 rcf trong 3 phút. Cuối cùng, cột lọc được chuyển sang ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung vào cột lọc 90 µl dung dịch đệm AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ống eppendorf và cột lọc được ly tâm ở 6000 rcf trong 1 phút. Lần này, dung dịch thu được chứa ADN tổng số nên được giữ lại trong ống eppendorf và bảo quản ở âm 4°C. 2.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR sử dụng máy PCR Systerm 9700, với tổng thể tích một phản ứng là 20µl bao gồm 10µl HotstarTaq mastermix (Qiagen, Đức), 5µl nước, 2µl mồi mỗi chiều xuôi và chiều ngược, 1µl ADN khuôn (Bảng 5). 24 Điều kiện phản ứng PCR cụ thể : 95C trong 15 phút để hoạt hoá loại Taq polymerase này, 40 chu kỳ gồm; 95C trong 30 giây, 45C trong 45 giây, 72C trong 60 giây, và bước kéo dài cuối cùng trong 6 phút. Chúng tôi sử dụng HotStar Taq là loại Taq polymerase hiệu quả trong việc nhân gen với nồng độ ADN khuôn thấp, và có tính đặc hiệu cao. Đối với các mẫu có nồng độ ADN quá thấp, chúng tôi tiến hành thêm phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng ADN khuôn là sản phẩm PCR lần thứ nhất. Lần PCR thứ hai, chúng tôi sử dụng Taq polymerase (Fermentas). Với loại Taq polymerase chúng tôi thực hiện phản ứng với các điều kiện tương tự như với HotStar Taq, ngoại trừ thời gian hoạt hoá cho Taq Polymerase là 95C trong 5 phút. (Bảng 6) Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích 1 ADN khuôn 1-1.5 µl 2 Mồi xuôi 2 µl 3 Mồi ngược 2 µl 4 Nước cất 5 µl 5 Taq Master mix 10 µl Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước Nhiệt độ (°C) Hoạt hóa 95 Biến tính 95 Thời gian (phút) Taq polymerase: 5 Hot Start Taq: 15 Chu kỳ (vòng) 1 0.5 1 0.5 35 Cyt-b-1,2: 45 Gắn mồi ND4, 16S: 50 G-fib: 52 25 Kéo dài 72 1 1 Ổn định 72 6 1 Bảo quản 4 ∞ 2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen Sản phẩm sau khi tách chiết ADN tổng số và sau phản ứng PCR đều được tiến hành điện di trên gel Agarose 1% để xác định sự có mặt của phân tử ADN. Với ADN tổng số, điện di sử dụng gel Agarose 1%, chạy trong môi trường đệm TBE 1X (Tris base, axit Boric, EDTA, H2O), marker 1kb. Điện di sản phẩm PCR sử dụng gel Agarose, chạy trong môi trường đệm TBE 1X, marker 100bp. Các sản phẩm PCR thành công (xác định nhờ điện di) được tiến hành tinh sạch bằng bộ kit sạch sản phẩm PCR của Thermo trước khi gửi giải trình tự hai chiều tại FirstBase - Malaysia. Các bước tinh sạch cụ thể như sau: Bước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:1 của Buffer Binding vào hỗn hợp PCR để được một dung dịch hoàn chỉnh (ví dụ cho mỗi 100µl của hỗn hợp phản ứng, thêm 100µl Buffer Binding). Trộn kỹ và đều hỗn hợp dung dịch. Kiểm tra màu sắc của dung dịch: màu vàng thể hiện pH tối ưu cho việc cố định ADN. Nếu màu sắc của dung dịch có màu cam hoặc tím, thêm 10µl dung dịch acetate 3M, pH 5.2 và trộn đều, màu sắc của hỗn hợp sẽ trở thành màu vàng. Bước 2: Chuyển tối đa 800µl dung dịch từ bước 1 vào cột GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ các dung dịch thông qua cột. Lưu ý: nếu tổng khối lượng vượt quá 800µl, dung dịch có thể được thêm vào các cột thành từng giai đoạn. Sau khi bổ sung 800µl dung dịch, ly tâm cột 30-60s và loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc. Lặp lại cho đến khi toàn bộ dung dịch đã được thêm vào màng cột. Bước 3: Thêm 700µl Wash Buffer (đã được thêm Ethanol) vào cột lọc GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc và đặt các cột lọc trở lại vào ống thu. 26 Bước 4: Ly tâm cột GeneJET ™ thêm 1 phút để hoàn toàn loại bỏ phần đệm rửa còn sót lại. Lưu ý: bước này là điều cần thiết vì đệm rửa còn sót lại trong mẫu DNA có thể ức chế các phản ứng sau đó. Bước 5: Chuyển cột GeneJET ™ tới một ống 1,5 ml sạch (không kèm theo trong bộ kit). Thêm 50µl Elution buffer đến trung tâm màng của cột GeneJET ™ và ly tâm trong 1 phút. Kết quả giải trình tư hai chiều nhận được sẽ được đối chiếu với nhau để nhận được 1 trình tự duy nhất dựa trên phần mềm Geneious ver 8.0. Trình tự thu được sẽ được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) nhằm đảm bảo tính xác thực qua công cụ Blast. 2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa Với các trình tự gen thu được, chúng tôi tiến hành sắp xếp thẳng hàng cùng với các đoạn gen chuẩn lấy từ ngân hàng gen bằng phần mềm BioEdit v5 để xây dựng dữ liệu để tiến hành phân tích cây phát sinh chủng loại. Cơ sở dữ liệu của chúng tôi bao gồm: - Nhóm ngoài (out group): Trình tự gen của hai loài Panolia eldii và Elaphodus cephalophus được chúng tôi sử dụng làm nhóm ngoài. Hai loài trên có quan hệ khá gần gũi với nhóm Mang. Trong đó Elaphodus cephalophus thuộc cùng tông Muntiacini cùng với nhóm Mang. Đồng thời, 2 loài trên cũng được sử dụng rất nhiều làm nhóm ngoài trong các nghiên cứu trước về nhóm Mang [6 , 7 , 36]. - Nhóm trong (in group): 45 trình tự có được từ ngân hàng gen của 9 loài Mang (loài Mang M. antherodes, M. montanus và M. muntjak hiện nay chưa có dữ liệu gen); và 86 trình tự của 5 loài Mang thu được qua nghiên cứu này. Sau đó, các dữ liệu về gen được sắp xếp thẳng hàng và đưa vào tập tin định dạng nexus (.nex) để từ đó có thể đưa vào các phần mềm tin sinh và tiến hành phân tích. Thông tin về các cơ sở dữ liệu các gen chi tiết ở Bảng 4. Tập tin chứa cơ sở dữ liệu về gen này được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên 3 27 phương pháp: phương pháp Tiết kiệm tối đa (MP) và phương pháp Hợp lý tối đa (ML) có trong phần mềm PAUP ver 4 beta 10 [39], phương pháp Bayesian có trong phần mềm Mr.Bayes (ver 3.4) [22]. Việc sử dụng cả ba phương pháp cho phép chúng tôi so sánh và đối chiếu các kết quả thu được nhằm đưa ra các kết luận đáng tin cậy cho nghiên cứu. 2.4.1. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony – MP) Sử dụng phần mềm PAUP ver 4b10, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tiết kiệm tối đa với các tùy chỉnh bước đầu với 100 taxa ngẫu nhiên lặp lại nhờ thuật toán phân cắt và nối chéo các nhánh của cây phân tích (Tree-bisection and reconnection - TBR), không chọn giới hạn trên cho số cây được ghi nhớ. Đánh giá khả năng xảy ra của các nhánh, phân tích với chỉ số tin cậy bootstrap (BP) được áp dụng là 1000 vòng lặp [18 , 27 , 29]. Chúng tôi chạy phần mềm PAUP với phương pháp tiết kiệm tối đa sử dụng dữ liệu kết hợp của cả 4 gen chỉ thị. Giá trị độ tin cậy của nhánh tiến hóa sau phân tích được coi là có độ tin cậy cao khi đạt giá trị lớn hơn 70% và được coi là thấp khi nhỏ hơn 70% [21]. 2.4.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp hợp lý tối đa (Maximum Likelihood - ML) Với phương pháp ML, để xác định mô hình tiến hóa phù hợp, chúng tôi sử dụng phần mềm Modeltest v3.7 [37]. Dữ liệu đầu vào cho phần mềm này là file định dạng nex, chúng tôi đã sử dụng để tiến hành phân tích MP. Sau khi có được mô hình tiến hóa, chúng tôi tiến hành xây dựng file định dạng nex cho phân tích ML dựa trên cơ sở là dữ liệu ADN tương tự như với phân tích MP, các tùy chỉnh, câu lệnh mặc định dựa theo hướng dẫn của phần mềm PAUP. Phân tích ML được thực hiện nhờ phần mềm PAUP. Phân tích ban đầu được tiến hành với các tùy chỉnh cụ thể: cây cộng thêm theo từng bước, với một taxon được thêm vào mỗi vòng lặp (simple taxon addition) và sử dụng thuật toán hoán đổi nhánh (TBR). Để đánh giá độ tin cậy (BP) của nhánh, phân tích bootstrap được lặp 28 lại 100 vòng với một taxon được thêm vào mỗi vòng lặp. Với các nhánh có giá trị BP ≥ 70% được coi là có độ tin cậy cao, ngược lại các nhánh có giá trị BP < 70% được coi là có độ tin cậy thấp [21] 2.4.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Bayesian Tương tự, mô hình tiến hóa cho phân tích Bayesian cũng giống với phân tích ML, có được nhờ phần mềm Modeltest v3.7, hai phân tích này sử dụng chung mô hình tiến hóa. Phân tích Bayesian được thực hiên nhờ phần mềm MrBayes v3.1 [22]. Phân tích được thực hiện với việc bắt đầu từ một cây ngẫu nhiên và chạy trong 10x106 thế hệ. Bốn chuỗi Markov, một nóng và ba lạnh (giá trị mặc định) được lấy mẫu sau mỗi 1000 thế hệ. Hai phân tích đồng thời sẽ được tiến hành song song. Sau phân tích, cần xác định các điểm lấy mẫu, mà tại đó giá trị của chuỗi Markov bắt đầu ổn định, các cây ở trước thời điểm lấy mẫu này sẽ được loại bỏ. Chúng tôi tiến hành phân tích, xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng cả dữ liệu kết hợp trình tự cả 4 gen thành một tổ hợp chung (combined); và phân tích riêng từng gen trong tổ hợp (partitioned) của cả 4 gen nhằm xác định sự sai khác về tốc độ biến đổi của các nucleotide trong các mã bộ ba (codon) [9 , 32]. Xác suất hậu nghiệm (PP) của nhánh tiến hóa được xác định là cao khi giá trị đạt lớn hơn 95% và ngược lại. 2.4.4. Phân tích thời gian tiến hóa Để xác định thời gian tiến hóa, phân tách của các loài Mang, chúng tôi sử dụng phần mềm BEAST v 1.8 [14]. Phần mềm này hiện nay đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong các nghiên cứu về tiến hóa, và đã cho nhiều kết quả khả quan [14 , 26]. Với dữ liệu đầu vào cho phần mềm BEAUti, chúng tôi sử dụng file định dạng nex, tương tự như với phân tích MP, ML. Dữ liệu ADN này đã được lựa chọn, chỉ dữ lại các taxa đại diện cho các nhánh tiến hóa tương ứng của các loài Mang. Chúng tôi sử dụng phương pháp “relaxed-clock” để đánh giá thời gian phân tách [13]. Chúng tôi sử dụng một mốc thời gian là 7.4 triệu năm, đây là thời điểm tông Muntiacini đã tách thành một nhánh riêng biệt [5]. Cho các tham số tiền nghiệm, 29 chúng tôi sử dụng các tùy chỉnh “Tree prior” là “Coalescent-Constant size”. Phân tích chạy trong 10x106 thế hệ, lấy mẫu sau 1000 thế hệ. Sau cùng, BEAUti tạo ra file dữ liệu dựa trên các thông tin chúng tôi khai báo, file này sử dụng cho phần mềm BEAST để chạy phân tích. 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN tổng số thành công của 58 mẫu bao gồm 35 mẫu xương và 23 mẫu da khô. Với ADN của các mẫu xương sau khi kiểm tra kết quả tách chiết thông qua điện di, cho thấy có băng khá rõ, tương ứng với vị trí của chỉ thị (marker) có kích thước lớn, tuy nhiên, các băng này vẫn tạo thành các vệt mờ dài (smear), cho thấy vẫn có sự đứt gãy khá nhiều của ADN tổng số (Hình 5). Trong khi đối với các mẫu da khô, trên bản điện di, không cho băng với kích thước lớn (dù có cũng khá mờ nhạt) mà tạo thành vệt smear dài, cho thấy, trong các mẫu này, Hình 5. Ảnh điện di ADN tổng số Hình 6. Ảnh điện di ADN tổng số của của một số mẫu xương trên gel Agarose 1%, Marker 1kb một số mẫu da khô trên gel Agarose 1%, Marker 1kb ADN dường như bị đứt gãy rất nhiều; thậm chí ở một số mẫu không thể quan sát thấy sản phẩm của ADN tổng số (Hình 6). Kết quả thu được cho thấy, các mẫu xương có khả năng giữ ADN tốt hơn so với các mẫu da. Tiếp theo, ADN tổng số được tiến hành đo mật độ quang phổ (OD) ở bước sóng 260nm và 280nm để xác định hàm lượng ADN tổng số. Tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1.5-2, nồng độ ADN dao động trong khoảng 20-300 µg/ml. Cụ thể hơn, đối với các mẫu xương nồng độ ADN nằm trong khoảng 80-300 µg/ml, trong khi đối với các mẫu da khô, nồng độ ADN là 20-100 µg/ml. Qua đó cho thấy, đối với các mẫu có tuổi lâu năm, 31 các mẫu xương có khả năng bảo quản, giữ ADN tốt hơn so với các mẫu có bản chất là da khô. Kết quả thu được cho thấy, phương pháp tách chiết đã thu được ADN tổng số đủ tinh sạch để tiến hành phản ứng PCR, tuy nhiên, nồng độ ADN tổng số ở một số mẫu thấp, đứt gãy nhiều, do đó có thể sẽ dẫn tới khó khăn trong quá trình tiến hành nhân gen. 2. Kết quả khuyếch đại gen bằng phản ứng PCR Do nồng độ ADN khuôn thấp nên Hotstar Taq của Qiagen đã được chúng tôi sử dụng để nhân lên các phân đoạn cần thiết. Hotstar Taq là loại Taq chuyên dụng sử dụng cho các phản ứng PCR với nồng độ khuôn thấp, bởi loại Taq này có độ nhạy cũng như tính đặc hiệu cao. Đồng thời, do ADN tổng số có tỷ lệ đứt gãy cao, nên 450bp 750bp Hình 7. Ảnh điện di một số sản phẩm Hình 8. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp nhân phân đoạn gen cyt-b-2 (750bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen Cyt-b dài 1140bp bằng 2 phân đoạn ngắn là Cyt-b-1 (450bp) và Cyt-b-2 (750bp) để tăng khả năng nhân gen thành công. Với các phân đoạn gen ND4, 16S, G-fibriniogen được nhân lên với kích thước từ 600bp – 800bp. Với một số mẫu có nồng độ ADN quá thấp, dẫn đến kết quả phản ứng PCR (chúng tôi tạm gọi là PCR lần 1 sử dụng Hot Start Taq) có thể kém (băng điện di mờ) hoặc không cho kết quả PCR (không có băng điện di), chúng tôi tiến hành dùng 32 sản phẩm PCR này làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR sử dụng Taq Polymerase (chúng tôi tạm gọi là PCR lần 2). Sau khi thực hiện lần thứ 2 này, băng điện di của 600bp 600bp Hình 9. Ảnh điện di một số sản phẩm Hình 10. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4 (600bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bpA nhân phân đoạn gen G-fib (600bp) trên gel garose 1%, marker 100bp phản ứng PCR trên gel Agarose sáng rõ hơn. Thậm chí 1 số mẫu ở lần PCR thứ nhất không cho băng điện di thì ở lần PCR thứ 2 cho kết quả băng điện di sáng rõ (Hình 11). Kết quả, với tổng cộng 58 mẫu ADN tổng số, chúng tôi đã nhân thành công 58 mẫu với gen Cyt-b. Dựa trên dữ liệu của 58 gen Cyt-b thu được, chúng tôi đã có kết quả bước đầu về phân loại các loài Mang ở Việt Nam. Qua kết quả bước đầu thu (a) (b) Hình 11. Điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2 (a). Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 nhân phân đoạn gen Cytb-2 (600bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp. (b). Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 2 nhân phân đoạn gen Cytb-2 (600bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp. được (sẽ được bàn kỹ hơn ở mục 4), chúng tôi lựa chọn và tiến hành nhân gen thành công 13 mẫu đối với phân đoạn gen ND4, 4 mẫu đối với gen 16S, 12 mẫu đối với gen G-fib (Bảng 4). Tiêu chí lựa chọn các mẫu để nhân các đoạn gen ND4, G-fib là 33 các mẫu đại diện cho nhánh mà nó đại diện, và sản phẩm PCR của gen Cyt-b cho kết quả tốt. Tuy vậy, trong 13 mẫu lựa chọn để tiến hành nhân gen, có 1 mẫu chúng tôi không nhân gen thành công đối với gen G-fib. Đối với gen 16S, gen này phục vụ mục đích là xác định các mẫu thu được là của loài Mang Roosevelt (loài này cho đến thời điểm chúng tôi tiến hành nghiên cứu chỉ có 1 trình tự gen 16S duy nhất trên ngân hàng gen NCBI là AF108031), do đó, đối với gen này, chúng tôi chỉ nhân lên với 4 mẫu Mang được cho là loài Mang Roosevel; các gen 16S của các loài khác chúng tôi sử dụng gen chuẩn của loài có được qua ngân hàng gen NCBI. Kết quả sản phẩm PCR cho băng điện di lên đúng kích thước của gen cần nhân, độ sáng các băng tương đối tốt, đủ để thực hiện phản ứng giải trình tự (Hình 7,8,9,10). 3. Kết quả giải trình tự Kết quả giải trình tự được chúng tôi kiểm tra nhằm đảm bảo tín hiệu rõ ràng, ít xảy ra sự chồng lên nhau của các tín hiệu. Khoảng 20-30 nucleotide đầu tiên và cuối cùng của trình tự, tín hiệu thường bị nhiễu, các đỉnh có thể bị chồng lên nhau (Hình 12). Hiện tượng này xảy ra ở tất cả các mẫu, do ở những nucleotide đầu, máy giải trình tự chưa thể đọc tốt bởi phản ứng giải trình tự chưa diễn ra ổn định, đây cũng là hạn chế của phản ứng giải trình tự hiện nay. Đoạn trình tự bị nhiễu này sẽ được chúng tôi sử dụng phần mềm chuyên dụng để loại bỏ, tránh gây nhầm lẫn khi xây dựng cây phát sinh chủng loại. Việc loại bỏ đoạn trình tự ở hai đầu này hoàn toàn không làm ảnh hưởng tới độ dài của đoạn gen chúng tôi cần bởi các đoạn mồi sử dụng đã được thiết kế để có thể nhân lên trình tự dài hơn phân đoạn gen mong muốn. Hình 12. Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng giải trình 34 Hai chiều của đoạn gen sau khi được xác định là đủ tin cậy để sử dụng, chúng tôi tiến hành đối chiếu với nhau để thu được trình tự tin cậy nhất của đoạn gen. Chúng tôi sử dụng phần mềm Genenious v8.0 để thực hiện quá trình đối chiếu này. Hình ảnh của tín hiệu và trình tự của mỗi chiều sẽ được sắp xếp thẳng hàng với nhau, khi tín hiệu và tại từng nucleotide của mỗi chiều đều tốt và trình tự nucleotide ở cả hai chiều trùng nhau thì nucleotide đấy chúng tôi chấp nhận (Phụ lục 5,6,7,8,9). Trình tự sau cùng chúng tôi thu được sẽ được kiểm tra lại bằng cách so sánh với ngân hàng gen của hệ thống NCBI để xác nhận đã nhân đúng đoạn gen, đúng loài mong muốn thông qua công cụ BLAST có sẵn trên hệ thống này. Kết quả cuối cùng, chúng tôi đã thu được trình tự của 58 gen Cyt-b, 13 trình tự gen ND4, 12 trình tự gen G-fib và 4 trình tự gen 16S. 4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại Bước đầu, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Bayesian của tất cả các gen Cyt-b có được sử dụng dữ liệu gen tổ hợp chung (combined) và dữ liệu từng gen trong tổ hợp (partitioned). Sở dĩ chúng tôi lựa chọn phương pháp Bayesian vì với hệ dữ liệu gồm tất cả các trình tự của nghiên cứu và các trình tự thu được qua ngân hàng gen, khi phân tích bằng phương pháp MP, ML sẽ mất tới hàng tuần để phân tích do số liệu của nhiều mẫu không đầy đủ. Phân tích Bayesian lại không bị phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ số liệu còn thiếu và có thể hoàn thành trong vài ngày. Đối với phân tích MP, ML sẽ xây dựng riêng các cây phát sinh chủng loại cho số lượng taxon nhỏ hơn và số liệu đầy đủ. Với phương pháp Bayesian, bước đầu tiên phân tích cần tiến hành là xác định mô hình tiến hóa phù hợp với hệ dữ liệu của chúng tôi nhờ phần mềm Model Test (Phụ lục 4,5). Cụ thể, chúng tôi thu được cây phát sinh chủng loại như trên hình 13. Cây này cho thấy các loài Mang ở Việt Nam phân thành 2 nhánh lớn, tạm gọi là nhánh A và nhánh B. Trong đó, đối với nhánh A, nhánh này tương ứng với loài Mang thường (Mang Ấn Độ). Cụ thể, trong nhánh này gồm các mẫu có trình tự từ ngân hàng gen ở các nghiên cứu trước đây đã được khẳng định thuộc về loài Mang thường, đồng 35 thời nhánh này cũng bao gồm các mẫu của chúng tôi đã được nhận định sơ bộ ban đầu về hình thái là Mang thường. Nhánh B có số lượng loài đa dạng hơn so với nhánh A. Bước đầu kết luận được có 4 loài Mang có quan hệ gần gũi về mặt di truyền ở trong nhánh này: Mang Trường Sơn, Mang Putao, Mang Roosevelt và Mang lớn. Sau đó, chúng tôi tiến hành chọn các mẫu (hay taxa) có thể đại diện cho các nhánh và đồng thời có đầy đủ các gen để tiến hành chạy 3 phân tích Bayesian, MP, ML. Kết quả được thể hiện ở hình 15. 4.1. Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ Qua cây phát sinh chủng loại cho thấy, loài Mang Ấn Độ có sự đa dạng rất lớn về mặt di truyền tuy nhiên các nhánh của loài Mang này phân tách không rõ ràng và chỉ số tin cậy cho các nhánh còn chưa cao. Các mẫu của chúng tôi và mẫu từ ngân hàng gen có nguồn gốc từ nhiều nơi trên lục địa châu Á, như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan. Tuy các quần thể này sống ở những khu vực địa lý khá tách biệt, nhưng kết quả phân tích di truyền cho thấy chúng chưa có sự phân tách rõ ràng về mặt địa lý. Nguyên nhân dẫn tới hiện tượng này có thể do tập tính của loài Mang này. Đây là loài Mang có thể sống ở những vùng bìa rừng hoặc rừng tái sinh là hệ sinh thái khá phổ biến trong khu vực [33]. Do không bị giới hạn phân bố như những loài Mang chỉ sống trong rừng nguyên sinh, loài này có thể đã phát tán rất nhanh trong một thời gian ngắn. Ngoài ra, do đặc điểm dễ phát tán, sự trao đổi gen thường xuyên giữa các quần thể khác nhau vẫn diễn ra và ngăn cản sự phân tách di truyền giữa các quần thể. 4.2. Nhánh B Đối với nhánh B, nhánh này được chia làm 4 nhánh riêng biệt, tương ứng với 4 loài Mang: Mang Trường Sơn (Muntiacus truongsonensis), Mang putao (Muntiacus putaoensis), Mang Roosevelt (Muntiacus rooseveltorum), Mang lớn (Muntiacus vuquangensis). 36 4.2.1. Nhánh Mang Roosevelt, Mang Trường Sơn, Mang Putao Đối với nhánh Mang này, chúng tôi kết hợp với cây phát sinh chủng loại thu được từ nghiên cứu của Amato và cộng sự [6]. Qua kết quả, chúng tôi nhận thấy ở nhánh này có 3 loài Mang là Mang Roosevelt, Mang Trường Sơn, Mang Putao. Cụ thể, nhánh Mang Roosevelt gồm các mẫu chúng tôi thu tại 2 khu bảo tồn có chung ranh giới tự nhiên với nhau ở miền Trung nước ta, Khu Bảo tồn Thiên nhiên (KBTTN) Pù Hoạt thuộc tỉnh Nghệ An và KBTTN Xuân Liên thuộc tỉnh Thanh Hóa. Các mẫu được nhận định hình thái là Mang Roosevelt và Mang Pù Hoạt. Trong đó, Mang Pù Hoạt gồm 2 mẫu là M 2.18 và M 2.20 được xác nhận về mặt hình thái bởi chuyên gia Đỗ Tước là người đã tìm thấy các mẫu được xác nhận là của loài Mang này. Cho đến nay vẫn chưa có các bằng chứng phân tử cũng như hình thái chứng minh tính xác thực của loài này bởi tập tính sống (chỉ sống trong vùng rừng nguyên sinh) cũng như số lượng cá thể nhỏ của loài này. 37 A B Hình 13. Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên hệ giữ liệu kết hợp gen cytochrome b (1140bp), sử dụng phương pháp Bayesian, theo mô hình GTR (General Time Reversible) chọn mẫu cách 1000 thế hệ, chạy trong 5x106 thế hệ. Các chỉ số trước và sau “/” lần lượt là các chỉ số xác suất hậu nghiệm (PP) của phân tích Bayesian sử dụng dữ liệu gen tổ hợp chung (combined) và dữ liệu từng gen trong tổ hợp (partitioned). Ký hiệu * tương ứng với giá trị đạt 100%. Nhánh A bao gồm các mẫu mang thường (M. vaginalis); nhánh B gồm các mẫu của 4 loài mang M. truongsonensis, M. putaoensis, M. rooseveltorum, M. vuquangensis. 38 Kết quả nghiên cứu này một lần nữa khẳng định loài Mang Roosevelt có phân bố tại Việt Nam như những công bố trước đây của chúng tôi [4 , 28]. Cụ thể, với kết quả nghiên cứu, chúng tôi xác nhận Mang Roosvelt có khu vực phân bố tại 2 khu bảo tồn là KBTTN Xuân Liên và KBTTN Pù Hoạt. Các mẫu này của chúng tôi chỉ vừa được thu cách đây 2,3 năm và còn có khá nhiều báo cáo về việc quan sát thấy loài này từ người dân bản địa [28]. Bên cạnh đó, dựa trên nghiên cứu đánh giá chi tiết về yếu tố di truyền của các loài Mang trong KBTTN Xuân Liên của chúng tôi cho thấy, loài này đã có sự phân tách về yếu tố di truyền mặc dù các mẫu sử dụng cho nghiên cứu chỉ thu thập ở 2 KBTTN Xuân Liên và Pù Hoạt [4]. Nguyên nhân của hiện tượng này đến nay còn chưa được làm rõ. Có thể sự phân tách này được tạo ra bởi các ranh giới tự nhiên trong khu vực này. Vì vậy, trong tương lai cần có các nghiên cứu chi tiết, cụ thể hơn để đánh giá về tình trạng các quần thể loài Mang này tại hai KBTTN kể trên. Kết quả nghiên cứu qua hình 13 đồng thời cũng cho thấy, loài Mang Pù Hoạt được Đỗ Tước và cộng sự nhận định trước đây [41] rất có thể là loài Mang Roosevelt. Do vậy, để củng cố thêm cho nhận định, chúng tôi đã xây dựng bảng khoảng cách di truyền của 2 loài Mang này dựa trên hệ dữ liệu là 4 gen Cyt-b, ND4, 16S và G-fib (Bảng 7). Với bảng khoảng cách di truyền thu được, sự khác biệt về mặt di truyền hoàn toàn không lớn, chỉ số cao nhất xấp xỉ 0.8%. Chỉ số cho thấy sự khác biệt về mặt di truyền giữa loài Mang Pù Hoạt và Mang Roosevelt là rất thấp. Kết quả này rất tương đồng với kết quả thu được từ cây phát sinh chủng loại. Như vậy, loài Mang trước đây được cho là loài Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) đã có thể có sự nhầm lẫn, vậy nên loài Mang này và loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) rất có thể chỉ là một loài. Ngoài ra, khi chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho nhánh Mang Roosevelt, Mang Trường Sơn và Mang Putao với hệ dữ liệu ADN chỉ sử dụng gen 16S là gen chuẩn mô tả loài Mang Roosevelt (Phụ lục 1) và hệ dữ liệu ADN gồm 2 gen ty thể Cyt-b, ND4 và 1 gen nhân G-gib (Hình 14) sử dụng cả 3 phương pháp 39 MP, ML và Bayesian. Kết quả của cây sử dụng cả 3 gen cho thấy, 3 loài nay thuộc cùng 1 nhánh với các chỉ số tin cậy cao ở cả 3 phân tích (chỉ số BP ở MP và ML lần lượt là 100 và 98, chỉ số PP là 100), trong khi chỉ số xác suất hậu nghiệm của gốc Bảng 7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang Roosevelt dựa trên dữ liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4, 16S, G-gibrinogen Taxa 1 2 3 4 5 6 7 8 1. M 2.18 - 2. M 2.20 0.000 - 3. M 6.3 0.000 0.041 - 4. M 6.4 0.078 0.247 0.165 - 5. X 22 0.721 0.730 0.730 0.729 - 6. X 24 0.789 0.804 0.804 0.710 0.000 - 7. X 8 0.088 0.000 0.078 0.157 0.721 0.877 - 8. X 33 0.000 0.000 0.000 0.078 0.721 0.789 0.088 - nhanh giữa Mang Trường Sơn và Mang Putao lại thấp PP là 65 (Hình 14). Kết quả cho thấy 3 loài Mang này có mối quan hệ di truyền rất gần nhau, mặc dù Mang Putao chỉ có vùng phân bố ở Ấn Độ và Burma. Kết quả này của chúng tôi tương đồng với kết quả của Amato và cộng sự [6]. Điều này có thể giải thích bởi vì trong quá khứ đã có sự hình thành cùng lúc 3 loài này trong thời gian ngắn, nên tuy rằng đã có sự phân tách, hình thành nên 3 loài nhưng khoảng cách di truyền giữa 3 loài lại không lớn, hoặc giữa 3 loài trên trong quá khứ vẫn có sự lai tạo. 4.2.2. Nhánh Mang lớn (Muntiacus vuquangensis) Trong nhánh B còn cho thấy, Mang lớn cũng có mối quan hệ gần với 3 loài Mang Trường Sơn, Roosevelt và Putao. Qua cây phát sinh chủng loại chúng ta có thể thấy, các chỉ số tin cậy cho nhánh Mang lớn rất cao ở cả 3 phương pháp (chỉ số BP và PP đều là 100). Đồng thời cho thấy loài này có sự tách biệt thành 2 nhóm riêng biệt. Các chỉ số tin cậy cho sự tách biệt này đều rất cao (BP thấp nhất là 89 và PP đều là 100) (Hình 14). Ngoài ra, chúng tôi cũng xây dựng bảng khoảng cách di 40 truyền cho loài Mang lớn (Bảng 8). Kết quả cũng cho thấy có sự tách biệt về khoảng cách di truyền giữa 2 quần thể Mang lớn miền Trung và miền Nam Việt Nam tương tự với kết quả thu được ở cây phát sinh chủng loại. Hình 14. Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 2 gen ty thể ( Cyt-b và ND4 )và 1 gen nhân (G-fib) (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị thông tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML. Các chỉ số phía trên nhánh lần lượt là giá trị bootstrap của phân tích MP và ML, chỉ số phía dưới là giá trị xác suất hậu nghiệm thu được ở phương pháp Bayesian. Dấu * tương ứng với giá trị đạt 100%. Với các thông tin của cây MP như sau: chiều dài cây = 524, chỉ số chắc chắn = 0.82, chỉ số duy trì = 0.84. 41 Bảng 8. Bảng khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn. Taxa 1 2 3 4 5 6 7 1. NC016920 - 2. M 1.1 0.970 - 3. M 6.21 0.963 0.089 - 4. AF042720 2.200 1.587 1.674 - 5. M 1.5 2.265 1.476 1.494 0.969 - 6. M 6.9 2.112 1.280 1.555 0.790 0.498 - 7. M 6.13 2.032 1.421 1.462 0.695 0.404 0.083 - Sự tách biệt này khi so sánh với địa điểm thu mẫu của Mang lớn (Bảng 9) cho thấy có sự tương ứng với miền phía Bắc và phía Nam của đèo Hải Vân. Qua đó, chúng ta có thể tạm thời kết luận là nhóm này bị chia cắt bởi dãy Trường Sơn và cụ thể là đèo Hải Vân. Kết quả này cho thấy đây có thể là biên giới tự nhiên của hai quần thể có sự khác biệt di truyền do cách ly về mặt địa lý. Bảng 9. Địa điểm thu các mẫu Mang lớn: Mẫu Thông tin địa điểm thu mẫu NC016920 - M 1.1 KBTTN Dakrong – Quảng Trị M 6.21 KBTTN Sao La – Huế AF042720 - M 1.5 KBTTN Sao La – Quảng Nam M 6.9 KBTTN Kon Chư Răng – Gia Lai M 6.13 KBTTN Kon Chư Răng – Gia Lai 5. Kết quả phân tích thời gian tiến hóa Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng cây tiến hóa, xác định thời gian phân tách giữa các loài Mang. Từ đó có thể liên hệ và đưa ra các giả thiết về sự hình 42 thành các loài Mang, cũng như có thêm thông tin về thời gian phân tách giữa các loài Mang. Cây tiến hóa thể hiện thời gian phân tách của các loài Mang được thể hiện trong Hình 15. Bảng 10 gồm thông tin chi tiết về thời gian phân tách giữa các loài Mang. Qua cây tiến hóa, ta có thể thấy, nhóm Mang được hình thành cách đây khoảng 7,1 triệu năm; trong đó loài Mang cổ nhất, hay tách ra sớm nhất trong nhóm Mang là loài Mang reevesi (M. reevesi), loài này hình thành cách đây khoảng 3,65 triệu năm. Trong các loài Mang có vùng phân bố ở nước ta, loài Mang lớn (M. vuquangensis) hình thành từ cách đây khoảng 2,41 triêu năm còn loài Mang hình thành muộn nhất là Mang Trường Sơn cách đây khoảng 1,02 triệu năm. Các loài Mang ở nước ta được không liên quan đến thời điểm hình thành địa chất ở Việt Nam. Bảng 10. Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến hóa Node Tuổi (triệu năm) 95% HPD 1 7.79 6.17-9.98 2 7.10 6.02-8.41 3 3.65 2.50-5.02 4 3.03 1.96-4.08 5 2.41 1.49-3.35 6 2.33 1.47-3.28 7 1.51 0.77-2.27 8 1.35 0.75-2.05 9 1.21 0.69-1.76 10 1.02 0.58-1.53 11 0.72 0.38-1.12 12 0.57 0.25-0.95 43 Hình 15. Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của nhóm Mang phân tích bởi phần mềm BEAST. Các chỉ số phía trên các nhánh lần lượt là giá trị bootstrap của phương pháp MP, ML; các chỉ số phía dưới các nhánh lần lượt là các chỉ số xác suất hậu nghiệm của phân tích Bayesian sử dụng dữ liệu gen tổ hợp chung (combined) và dữ liệu từng gen trong tổ hợp (partitioned). Các gốc nhánh được đánh số theo thời gian phân tách giảm dần. Các chỉ số tại gốc nhánh thể hiện thời gian phân tách tính theo triệu năm. Vị trí gốc kí hiệu C là vị trí của mốc thời gian dùng làm chuẩn (Calibration point). 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Bước đầu xác nhận loài Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) và loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) rất có thể chỉ là 1 loài, đồng thời qua đó nghiên cứu đã xác nhận sự có mặt của 4 loài Mang ở Việt Nam là: Mang Ấn Độ (M. vaginalis), Mang Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) và Mang lớn (M. vuquangensis). Đặc biệt, việc tái phát hiện loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) tại hai địa điểm là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt có ý nghĩa quan trọng vì kể từ khi được mô tả cách đây hơn 80 năm loài này chưa từng được tìm thấy tại Việt Nam. 2. Ba loài Mang: Mang Putao (M. putaoensis), Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) và Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) có mối quan hệ về mặt di truyền rất gần nhau, mặc dù Mang Putao (M. putaoensis) chỉ có vùng phân bố ở Ấn Độ và Burma. 3. Loài Mang lớn (M. vuquangensis) có sự tách biệt về mặt di truyền giữa các quần thể ở miền Trung và miền Nam Việt Nam, điều này xảy ra có thể do sự phân cách bởi đèo Hải Vân. 4. Trong 4 loài Mang ở Việt Nam, loài Mang lớn (M. vuquangensis) hình thành sớm nhất cách đây xấp xỉ 3,79 triệu năm; loài Mang Ấn Độ (M. vaginalis), Mang Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) có thời gian hình thành loài lần lượt là khoảng 2,33 triệu năm, 1,21 triệu năm và 1,02 triệu năm. 45 KIẾN NGHỊ 1. Cần có thêm các nghiên cứu đánh giá số lượng, tình trạng phân bố các quần thể và đa dạng di truyền của loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) tại 2 khu bảo tồn Xuân Liên và Pù Hoạt, để từ đó đưa ra các chiến lược bảo tồn cần thiết cho loài Mang quý hiếm này. 2. Cần có thêm các nghiên cứu về quần thể của loài Mang Ấn Độ (M. vaginalis) bởi tính phức tạp về yếu tố di truyền của loài này. 3. Cần có thêm nghiên cứu về loài Mang Vũ Quang để xác nhận sự tách biệt di truyền giữa các quần thể miền Bắc và miền Nam Việt Nam. Ngoài ra, việc nhân nuôi nhằm bảo tồn loài mang này cần chú ý tới việc tách riêng các cá thể của hai nhánh tiến hóa riêng biệt này để tránh hiện tượng giao phối gần làm giảm đa dạng di truyền. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. 2. 3. 4. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009) Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. Lê Đức Minh (2008), “Thuyết trình đề cương cơ bản : Nghiên Cứu Tiến Hóa và Bảo Tồn của các Loài Mang (Cervidae: Muntiacinae) ở Việt Nam bằng Phương Pháp Sinh Học Phân Tử”, pp. 1-15. Lê Đức Minh, Dương Thúy Hà, Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Mạnh Hà, Đinh Đoàn Long, Đỗ Tước, Nguyễn Đình Hải (2013), “Phương pháp chiết tách và nhân dòng DNA từ các mẫu mô động vật có chất lượng DNA thấp phục vụ nghiên cứu đa dạng sinh học. ”, Tạp chí Sinh học 35 pp. 116 - 124. Lê Đức Minh, Nguyễn Văn Thành, Dương Thúy Hà, Nguyễn Mạnh Hà, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Đình Hải, Phạm Anh Tám, Đỗ Trọng Tước (2014), “Đánh giá đa dạng di truyền các loài mang (Cervidae: Muntiacus) tại khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30(4S), pp. 117-123. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Alexandre, H., Frederic, D., Anne, R., Catrin, H. (2011), “Pattern and timing of diversification of Cetartiodactyla (Mammalia, Laurasiatheria), as revealed by a comprehensive analysis of mitochondrial genomes”, Biologies, 335, pp. 32-50. Amato, G., Egan, M. G., Rabinowitz, A. (1999), “A new species of muntjac, Muntiacus putaoensis (Artiodactyla: Cervidae) from northern Myanmar”, Animal Conservation, 2, pp. 1-7. Amato, G., Egan, M. G., Schaller, G. B., Barker, R. H., Rosenbaum, H. C., and Robichaud, W. G. (1999), “Rediscovery of Roosevelts's Barking Deer (Muntiacus roosevelttorum)”, Journal of Mammalogy, 80, pp. 639-643. Birks, S. M. and Edwards, S.V. (2002), “A phylogeny of the megapodes (Aves: Megapodiidae) based on nuclear and mitochondrial DNA sequences”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 23(3), pp. 408-421. Brandley, M.C., Schmitz, A., Reeder, T.W. (2005. ), “Partitioned Bayesian analyses, partition choice, and the phylogenetic relationships of scincid lizards. ”, Syst. Biol. , 54, , pp. 373–390. Chau, B. (1997), “Another new discovery in Vietnam”, Vietnam Economic News, 47, pp. 46-47. Chen, M., Guo, G. P., Wu, P. J., Zhang, E. D. (2007), “Identification of black muntjac (Muntiacus crinifrons) in Tibet, China, by cytochrome b analysis”, Conservation Genetics. 47 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. Do, T., D, Vu., Dawson, S., Arctander, P., Mackinnon, J. (1994), “Introduction of a new large mammal species in Vietnam”, Science and Technology News, 1994, pp. 4-13. Drummond, A. J., Ho, S. Y., Phillips, M. J., Rambaut, A. (2006), “Relaxed phylogenetics and dating with confidence”, PLoS Biol, 4(5), pp. e88. Drummond, A. J., Rambaut, A. (2007), “BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees”, BMC Evol Biol, 7, pp. 214. Edwards A. W. F., Cavalli, S. L. L. (1963), “The reconstruction of evolution. ”, Heredity 18:553. Egan, M. G. (2000), “The identification of species by diagnostic molecular characters and the phylogenetic relationships of muntjac”, Ph.D. Dissertation, Fordham University, New York. Evans, T. (1995), “Spotlight on Laos”, Wildlife Conservation, 98, pp. 52-57. Felsenstein, J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap”, Evolution 39, pp. 783-791. George, B. S., Elisabeth, S. V. (1996), “Description of the giant muntjac (Megamuntiacus vuquangensis) in Laos”, Journal of Mammalogy, 77, pp. 675-683. Gilbert, C., Ropiquet, A., Alexandre, H. (2006), “Mitochondrial and nuclear phylogenies of Cervidae (Mammalia, Ruminantia): Systematics, morphology, and biogeography”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 40, pp. 18. Hillis, D. M., Bull, J. J. (1993), “An Empirical Test of Bootstrapping as a Method for Assessing Confidence in Phylogenetic Analysis”, Systematic biology, 42(2), pp. 182-192. Huelsenbeck, J. P., Ronquist, F. (2001), “MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees”, Bioinformatics, 17(8), pp. 754-755. James, J., Ramakrishnan, U., Datta, A. (2007), “Molecular evidence for the occurrence of the leaf deer Muntiacus putaoensis in Arunachal Pradesh, north-east India”, Conservation Genetics, 9(4), pp. 927-931. Jose, C. (2001), “Cytochrome b Phylogeny and the Taxonomy of Great Apes and Mammals”, Molecular Biology and Evolution, 18(4), pp. 465-471. Kumar S., A. J. F. (2001), “Molecular Phylogeny Reconstruction”, Encyclopedia of life sciences,(Macmillan Publishers). Le, M., Duong, T. H., Dinh, D. L., Nguyen, Q. T., Pritchard, P.C.H. (2014), “A phylogeny of softshell turtles (Testudines: Trionychidae) with reference to the taxonomic status of the critically endangered, giant softshell turtle, Rafetus swinhoei”, Organisms Diversity & Evolution, 14(3), pp. 279-293. Le, M., Mccord, W.P., and Iverson, J. B. (2007), “On the paraphyly of the genus Kachuga (Testudines: Geoemydidae)”, Mol Phylogenet Evolution, 45(1), pp. 398-404. Le, M., Nguyen, V. T., Duong, T. H., Nguyen, M. H., Dinh, D. L., Do, T., Nguyen, D. H., and Amato, G. (2014), “Discovery of the Roosevelt’s 48 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. Barking Deer (Muntiacus rooseveltorum) in Vietnam”, Conservation Genetics, 15(4), pp. 993-999. Le, M., Raxworthy, C.J., Mccord, W.P., and Mertz, L. (2006), “A molecular phylogeny of tortoises (Testudines: Testudinidae) based on mitochondrial and nuclear genes”, Mol Phylogenet Evolution, 40(2), pp. 517-531. Mattioli, S., Family Cervidae (Deer), in Hoofed Mammals. 2011. Mc Cullough, D. R., Pei, K. C. J., Wang, Y. (2000), “Home range, activity patterns, and habitat relations of Reeves' muntjacs in Taiwan”, Journal of Wildlife Management, 64, pp. 430-441. Nylander, J. A., Ronquist, F., Huelsenbeck, J. P., and Nieves-Aldrey, J. L. (2004), “Bayesian phylogenetic analysis of combined data”, Systematic biology, 53(1), pp. 47-67. Osgood, W.H. (1932), “Mammals of the Kelley-Roosevelts and Delacour Asiatic expeditions. Field Museum of Natural History Publications 312”, Zoological Series, 18, pp. 192-339. Page, R. D. M., Holmes, E. C. (1998), Molecular Evolution: Aphylogenetic Approach, Blackwell Publishing Ltd. Pei-Yi Chang, C. C. L., Shu-Ju Liao, Lie-Jiau Hsieh, Shuan-Yow Li, MingChieh Chao, Yueuh-Chun Li (2004), “Genetic analysis of two subspecies of Reeves's Muntjac (Cervidae: Muntiacus reevesi) by karyotyping and satellite DNA analyses”, Zoological Studies, 43, pp. 749-758. Pham, M. G., Do, T., Vu, V. D., Geoge, A. (1998), “Description of Muntiacus truongsonensis, a new species of muntjac (Artiodactyla: Muntiacidae) from central Vietnam and implication for conservation”, Animal Conservation, 1, pp. 61-68. Posada D. and Crandall, K. (1998), “MODELTEST: testing the model of DNA substitution”, Bioinformatics, 14(817-818). Scott, K. (1994), “Vietnam explosion”, BBC wildlife, 12, pp. 12. Swofford, D. L. (2001), “Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other methods), version 4”, Sinauer Associates, Massachusetts. Evans, T., Timmin, R. J. (1994), “News from Laos”, Oryx, 29, pp. 3-4. Timmins, R. J., Duckworth, J. W. (2012), “Muntiacus. In: 2012 IUCN Red List of Threatened Species[...]... và thịt Mang Ấn Độ là loài có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet, Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy loài này có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân loài đã được mô tả dựa trên vùng phân bố về địa lý [16] 4 1.1.2.2 Mang Pù Hoạt (M puhoatensis) Loài Mang. .. dựa trên các chỉ thị phân tử 2.1 Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử dụng trong nghiên cứu Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu hiệu hình thái bên ngoài, tập tính, cấu trúc tế bào Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu hình thái cho thấy một số hạn chế,... Bayesian nhằm so sánh các kết quả thu được để tăng độ tin cậy cho kết quả cuối cùng Ba phương pháp kể trên đều đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu tiến hóa và đã cho kết quả với độ tin cậy tốt ở các nghiên cứu trước đây [1 , 25 , 34] 2.2.1 Ma trận khoảng cách (Distance matrix) Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu tiến hóa Trong số đó,... cả các mẫu Gen 16S và G-fib có kích thước khoảng 600bp, gen ND4 có kích thước khoảng 700bp Số lượng chi tiết của các gen được chúng tôi tiến hành giải trình tự và các gen từ GenBank sử dụng cho nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 4 15 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu nghiên cứu 1.1 Mẫu vật nghiên cứu Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu bởi các chuyên gia thuộc Trung tâm Nghiên. .. Fermentas 1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đã được sử dụng và cho kết quả tốt trong các nghiên cứu về nhóm Mang cũng như các nhóm thú khác trong các nghiên cứu trước Ngoài ra, trình tự mồi cho phản ứng nhân phân đoạn gen ND4 được chúng tôi tự thiết kế trong nghiên cứu này Các mồi được đặt tại hãng IDT – Mỹ Trình tự các cặp mồi này được thể hiện ở dưới đây (Bảng... điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu 22 1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: Các thiết bị chúng tôi sử dụng thuộc phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2 Phương pháp nghiên cứu Với mục đích thu nhận trình tự các đoạn gen chỉ thị, từ đó sử dụng để phân tích, đánh giá đa dạng di truyền, cũng như tiến hóa của các loài Mang. .. loại thể hiện được mô hình đồng hồ phân tử giữa các loài [13] 2.4 Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích Hiện nay, rất nhiều các chỉ thị phân tử được xác định với các vai trò khác nhau, phụ thuộc các mục đích và đối tượng trong các nghiên cứu Trong đó, hệ gen ty thể, so với hệ gen nhân, có phương thức sao chép và di truyền khá khác biệt Bởi vậy, tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những... kết quả cho thấy, trong loài này có những nhánh tiến hóa riêng biệt Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu bảo tồn Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể trong hai khu bảo tồn [4] Hình 2 Mang Vũ Quang (M vuquangensis)... Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng tôi đã xác nhận sự có mặt của loài Mang này Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định loài này có khu vực phân bố ở Việt Nam [28] Ngoài ra, chúng tôi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di 5 truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn. .. bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật cho đến nay rất ít [42] Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào, chúng tôi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này Khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt ... NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN... dụng số thị phân tử nghiên cứu tiến hóa loài Mang (Muntiacinae) Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, phân bố, mối quan hệ tiến hóa loài Mang Việt Nam CHƯƠNG... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 16 16 1.1 Mẫu vật nghiên cứu 16 1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 17 1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: 23