Ứng dụng phương pháp MABC (marker assisted backcrossing) nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Lưu Minh Cúc, người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã dạy dỗ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam” của Viện Di truyền Nông nghiệp, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè, những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua. Học viên Trần Long MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam..................................................................................................................... 3 1.1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới ..........3 1.1.2. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam .....4 1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam ...................................................................5 1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa ..................................... 8 1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa ...............................................................8 1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn ..........................................................10 1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn ...................................10 1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn .....................................11 1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn ................................................................11 1.3. Chỉ thị phân tử .................................................................................................12 1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử ...............................................................12 1.3.2. Một số chỉ thị phân tử thường dùng .............................................................13 1.3.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) ....................................13 1.3.2.2. Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS… ..........................................................................14 1.3.2.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại ................................15 1.4. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử..............................................................17 1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................................17 1.4.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền ....................................................................17 1.4.3. Trong chọn giống cây trồng ..........................................................................18 1.4.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assited Backcrossing - MABC) ...............................................................20 1.5. Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn .......................................22 1.5.1. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới.....22 1.5.2. Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn .. 25 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................27 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................27 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................27 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................28 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số..........................................................28 2.3.1.2. Phương pháp PCR với mồi SSR ...................................................................28 2.3.1.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% ...............................................29 2.3.1.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide .............................................30 2.3.2. Phương pháp lai nhân tạo .............................................................................31 2.3.3. Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa chịu mặn ...................................................................................................................32 2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo ..........................................................33 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................36 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................37 3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số ..............................................................37 3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ..........................................................38 3.3. Phân tích các cá thể BC bằng phƣơng pháp MABC ...................................41 3.3.1. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1 (AS996/FL478 x AS996) ..........................................................................................41 3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) ................................................................................44 3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) ...................................................................45 3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc .....................................47 3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn ............................................................................................50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms APS Ammonium Persulfate BC Backcross BĐKH Biến đổi khí hậu CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence cM centiMorgan CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long ĐBSH Đồng bằng Sông Hồng dNTP Deoxynucleotide Triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization GDP Gross Domestic Product GGT Graphical Genotyper IRRI International Rice Research Institute LD-MAS Linkage Disequilibrium - MAS MABC Marker-assisted backcrossing MAS Marker-assisted selection NST Nhiễm Sắc Thể PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative trait loci RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse Ribonuclease SSR Simple Sequence Repeat STR Short Tandem Repeats STS Sequence-Tagged Sites TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 ................4 Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) ............................6 Bảng 3. Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1 ..............................................20 Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR ..............28 Bảng 5. Chương trình chạy của phản ứng PCR ......................................................29 Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) .34 Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997) .................................35 Bảng 8.. Tỷ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp thế hệ BC1F1 .........................43 Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 theo tiêu chuẩn IRRI, 1997 ...........................................................................................................................50 Bảng 10. Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội ..............................................................................................................................51 Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội ........................................................................................52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay ........................................................................................ 7 Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m ..................................................................................... 7 Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC) ....................................................................................... 36 Hình 4: Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose .................. 37 Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1................................ 38 Hình 6. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6%................ 39 Hình 7. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5%............. 39 Hình 8. Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể quần thể AS996/FL478 ............................................................................................. 40 Hình 9. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206 ............... 41 Hình 10. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793 .......... 41 Hình 11. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310 .............. 42 Hình 12. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639 ............ 42 Hình 13. Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10 ......43 Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412 .................................................................................................................... 44 Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM10793, và RM10711 .......................................................................................... 44 Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206 và RM10694 ....................................... 45 Hình 17: Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm GGT2.0 ..................................................................................................................... 46 Hình 18. Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn ....................................... 47 Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) .......................................................................................................... 48 Hình 20. Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00) ............................................................................................................. 49 MỞ ĐẦU Lúa gạo cung cấp khoảng 32% tổng sản lượng lương thực Châu Á. Mỗi năm toàn thế giới cung cấp khoảng 729 triệu tấn gạo, trong đó chỉ tính riêng khu vực Châu Á là 661 triệu tấn [15]. Biến đổi khí hậu toàn cầu là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực thế giới. Với hơn 3000km bờ biển, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển Việt Nam chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển. Theo thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha [1] và năm 2013, chỉ tính riêng trên đồng bằng song Cửu Long là khoảng 740.000 ha. Đồng bằng sông Cửu Long là vùng tạo ra 40% GDP nông nghiệp của cả nước. So với cả nước, sản lượng lương thực vùng chiếm 50%, thủy sản chiến 70%. Tuy nhiên, Đồng bằng sông Cửu Long lại được xem là vùng sẽ phải chịu tác động của biến đổi khí hậu nhiều nhất và những tác động này sẽ ảnh hưởng rất lớn đến an ninh lương thực. Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, và hệ lụy của nó là nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành. Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu. Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012, nếu mực nước biển dâng 1m, sẽ có khoảng 39% diện tích đồng bằng sông Cửu Long, trên 10% diện tích vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, trên 2,5% diện tích thuộc các tỉnh ven biển miền Trung và trên 20% diện tích Thành phố Hồ Chí Minh có nguy cơ bị ngập; gần 35% dân số thuộc các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, trên 9% dân số vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, gần 9% dân số các tỉnh ven biển miền Trung và khoảng 7% dân số Thành phố Hồ Chí Minh bị ảnh hưởng trực tiếp; trên 4% hệ thống đường sắt, trên 9% hệ thống quốc lộ và khoảng 12% hệ thống tỉnh lộ của Việt Nam sẽ bị ảnh hưởng [2]. Để giải quyết những khó khăn này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn”. 1 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại trong quy tụ gen chịu mặn Saltol đã được xác định trước trong giống lúa FL478 vào giống lúa AS996 đang được trồng phổ biến tại Việt Nam để tạo ra dòng AS996 – Saltol đáp ứng nhu cầu về giống chịu mặn trong sản xuất lúa gạo. 2 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam 1.1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí hậu toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm. Nguyên nhân của những biến đổi này là do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt trời, và gần đây có thêm hoạt động tác động của con người. Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của một khu vực mà là vấn đề toàn cầu. Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới. Nhiệt độ tăng, mực nước biển dâng cao, sẽ gây hiện tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và các hệ thống kinh tế xã hội trong tương lai (Ứng phó với biến đổi khí hậu và biển dâng, 2009). Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng quan trọng. Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất thấp hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Thái lan, Bangladesh, Ấn Độ... Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn khi mực nước biển dâng cao, cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng được cả tình trạng ngập nước lẫn độ mặn cao. Theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau [15]. Điều này là nghiêm trọng hơn kể từ khi các khu vực tưới tiêu có trách nhiệm bảo đảm một phần ba sản xuất lương thực thế giới. Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km2 rừng đước sẽ bị ngập, 10.000km2 đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn, 21,5 triệu ha đât canh tác phải đối mặt với vấn đề nhiễm mặn, và ước tính gây thiệt hại lên tới 50% đất trồng trọt toàn cầu vào khoảng giữa thế kỷ 21 [28]. Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), 6 triệu người phải di dời và 4.500km2 đất nông nghiệp bị ngập và nhiễm mặn. Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông nghiệp bị ngập, ảnh 3 hưởng đến 11% dân số. Theo ước tính của Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) mỗi năm nông dân Ấn Độ và Bangladesh bị thiệt hại tới 4 triệu tấn thóc do lũ lụt, do nhiều giống lúa chỉ chịu ngập trong vòng chưa đầy một tuần. Còn ở Maldives hơn 80% diện tích đất thấp hơn mực nước biển và có thể bị ngập, mặn khi nước biển dâng cao [39]. 1.1.2. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề do mực nước biển dâng. Nước biển dâng thì phần lớn đất màu mỡ nhất của Việt Nam sẽ bị ngập mặn. Theo đó, sản lượng lúa có thể giảm đáng kể do mực nước biển dâng cao và sự thay đổi lượng mưa làm thay đổi thủy văn ở các vùng đồng bằng. Do chúng ta có bờ biển dài hơn 3.620 km, 28 tỉnh, thành phố giáp biển nên mực nước biển dâng cao sẽ làm giảm lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển. Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 (Đơn vị tính: cm) Kịch bản nƣớc biển dâng 2020 Thấp (B1) 8-9 11-13 16-18 28-21 27-33 33-40 39-48 44-56 49-64 Trung bình (B2) 8-9 12-13 17-19 23-26 29-34 36-43 43-52 50-62 57-73 Cao (A1F1) 8-9 13-14 18-20 25-29 34-40 44-52 55-65 66-80 78-95 Các mốc thời gian của thế kỷ 21 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 (Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam)- nguồn Bộ Tài nguyên Môi trường - 2012. Các nhà khoa học chỉ ra rằng, khi nước biển dâng, tùy mức độ sẽ có những phần diện tích canh tác ở Đồng bằng Sông Cửu Long, Đồng bằng Sông Hồng, các đồng bằng duyên hải khác bị ngập mặn. Theo kịch bản A1FI, lũ sẽ gây ngập 90% diện tích trong 4,5 – 5 tháng/năm, vào mùa kiệt nước mặn (nồng độ muối 4%) xâm nhập trên 70% diện tích…Đây lại là những vựa lúa của cả nước nên khi đó chắc chắn an ninh lương thực bị đe dọa. Việt Nam là một trong những nước bị ảnh hưởng 4 nghiêm trọng nhất bởi mực nước biển dâng, dẫn đến sự xâm nhiễm mặn ngày càng gia tăng, chủ yếu là Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng Sông Cửu Long. Mặn là hiện tượng liên kết với nước biển dâng mang nước mặn tiến sâu vào đất liền, biến nhiều vùng đất trồng lúa bị mặn hóa [3]. 1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam Đất nhiễm mặn là loại đất có chứa nhiều cation Na+ hấp phụ trên bề mặt keo đất và trong dung dịch đất [1;2]. Đất chứa nhiều Na+ dưới dạng muối tan NaCl, Na2SO4 nên áp suất thẩm thấu dung dịch đất lớn làm ảnh hưởng tới quá trình hút nước và dinh dưỡng cây trồng. Hoạt động của vi sinh vật đất yếu Sự hình thành đất nhiễm mặn do 2 nguyên nhân chủ yếu là ảnh hưởng của nước ngầm hay do ảnh hưởng của nước biển mặn theo trủy triều tràn vào. Ở Việt Nam, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở 2 vùng châu thổ lớn là ĐBSH và ĐBSCL. Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông vào đất liền ở ĐBSH chỉ khoảng 15km, nhưng ở vùng ĐBSCL lại có thể xâm nhập tới 40 – 50 km (FAO, 2012) [16]. Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng sông Cửu Long: Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012 [2] dự báo khoảng 7.600km2 (tương đương 20% diện tích) ĐBSCL sẽ chìm khi nước biển dâng 75cm và ở mức 100cm thì phạm vi ngập trải rộng trên diện tích 15.116km 2, tương đương 37,8% diện tích tự nhiên toàn vùng. Dự báo vào năm 2030, khoảng 45% đất của ĐBSCL có nguy cơ nhiễm mặn cục bộ. Nhiễm mặn gây hại rất lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa, trung bình năng suất lúa có thể giảm 20-25%, thậm chí tới 50%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến canh tác 3 vụ mùa, sản lượng lương thực bị mất đi đáng kể, đe dọa an ninh lương thực quốc gia. Nước ta có khoảng 1 triệu ha đất nhiễm mặn, trong đó có 2 vùng nhiễm mặn lớn là vùng châu thổ sông Hồng và vùng lúa ĐBSCL. ĐBSCL có diện tích tự nhiên là 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, trong đó diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng 2,9 triệu ha, đất sản xuất lâm nghiệp là 430.770 ha, đất khác chiếm 277.000 ha và đất chuyên dùng khoảng 262.682 ha [3]. ĐBSCL bị chia cắt bởi hệ thống sông tự nhiên kết hợp với hệ thống sông ngòi chằng chịt đã tạo thành hệ thống thủy lợi cung cấp nước cho sản xuất nông 5 nghiệp, thau chua rửa mặn và cũng là hệ thống vận chuyển đường thủy tốt, rất thuận lợi cho vận chuyển hàng hóa, nông sản. Mùa lũ thường kéo dài 5 tháng với lượng nước chiếm khoảng 3/4 tổng lượng nước cả năm, và 7 tháng mùa khô cạn, lượng nước còn lại rất ít. Do đó, thủy triều có ảnh hưởng rất lớn đến phần lớn vùng hạ lưu sông Mekong, toàn bộ ĐBSCL vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít phụ thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng vùng. Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện cùng với kỳ triều cường trong tháng, nước biển càng mặn, càng vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và ít có nước thượng nguồn đổ về [3]. Mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm nhập của nước biển, và tùy vào mùa trong năm, cao điểm vào các tháng có lượng mưa thấp, khoảng tháng 3 – 4 dương lịch. Qua chuỗi số lượng thực đo 10 năm (1991 – 2000) ở ĐBSCL [4] đã phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặn ứng với các trị số: 0,4 g/l; 2 g/l; 4 g/l; 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô, tìm ra diễn biến mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm) của thời đoạn 10 năm trên ĐBSCL diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l chiếm 2.126.635 ha (Bảng 1.2). Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) STT Khu vực 1 Không ảnh hưởng mặn 2 Xâm nhập mặn 3 Độ mặn (g/l) Diện tích (ha) Tỷ lệ (%) 1.773.365 45,5 0,0 – 0,4 107.025 2,8 Xâm nhập mặn 0,4 – 2,0 232.816 6,0 4 Xâm nhập mặn 2,0 – 4,0 148.244 3,8 5 Xâm nhập mặn 4,0 – 16,0 1.378.550 35,3 6 Xâm nhập mặn >16,0 260.000 6,6 3.900.000 100 Tổng cộng (làm tròn) (Lê Sâm, 2003) 6 ĐBSCL có khoảng 1,8 – 2,1 triệu ha đất tự nhiên chịu ảnh hưởng mặn tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Kiên Giang, Tiền Giang, Trà Vinh và Sóc Trăng, phần lớn là đất bị nhiễm mặn kết hợp với phèn, ngập nước [3]. Hình 1. Diện tích và nồng độ mă ̣n vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng Sông Hồng Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m 7 Nước biển dâng là một quá trình liên tục, nếu chúng ta không có biện pháp ngăn chặn quyết liệt thì quá trình càng ngày càng nhanh. Ảnh hưởng của nó là khôn lường, cần có sự chuẩn bị ứng phó đúng mức và ngay từ bây giờ. Các vùng lúa nhiễm mặn ở vùng ĐBSH thuộc các tỉnh như: Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000ha ở hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ 0,3 – 0,5%, chủ yếu tập trung tại các huyện như: Kiến Thụy, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vinh Bảo,… Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương,… Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện như Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy, … Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000ha đất nhiễm mặn ở các huyện như Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung, … riêng huyện Hậu Lộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005. Các giống lúa mùa địa phương trước đây thường được gieo trồng là: Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương...năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha. Gần đây một số giống lúa chịu mặn trung bình như: Mộc Tuyền, X21, Xỉ, X19, VD97, VD920... cho năng suất khá cao nhưng có dạng hình yếu, ít chịu phân, cao cây, lá lướt [6]. 1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa 1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá là cây nhiễm trung bình với mặn. Vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước, những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa [9]. Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích luỹ quá nhiều ion Cl [11]. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, nguyên nhân gây tổn hại cho cây lúa trong môi trường mặn là do tích luỹ quá nhiều ion Na+ và ion này trực tiếp gây độc trên cây trồng, làm cho Cl- trở thành ion trơ nên phổ kháng của cây tương đối rộng (Yeo và Flower, 1996). Như vậy, sự tổn hại ở cây lúa trên đất mặn là do cây hấp thu quá dư cả ion Na+ và Cl- [42]. 8 Ảnh hưởng của Na+ là phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất. Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na - K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na - K tốt trong chồi. Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn [36]. Tuy thế việc khám phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được. Mặn gây hại trên cây trồng bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kế tiếp và cứ thế tiếp diễn. Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy trì sự sống và xanh. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá. Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại [20]. Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt thời gian nảy mầm, trở nên rất nhiễm ở giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), tiếp tục chống chịu trong giai đoạn sinh sản dinh dưỡng, kế đến nhiễm suốt trong giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [36]. Tuy thế, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trổ, cây lúa không mẫn cảm với mặn [9]. Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải được chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của lúa. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [11], [28]. Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977) Yeo và Flower (1984) đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung như sau: + Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc + Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân 9 + Chuyển vị từ rễ đến chồi - Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi + Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại + Chống chịu ở mô: Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây + Ảnh hưởng pha loãng - Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi. 1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn 1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lƣợng tính chống chịu mặn Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là tính trạng di truyền số lượng. Tính trạng số lượng được định nghĩa một cách kinh điển là tính trạng có phân bố liên tục (Continuous distribution), tính trạng này được điều khiển bởi nhiều QTL, mỗi QTL có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu. Cho đến nay trên thế giới đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu sự di truyền của tính chống chịu mặn. Theo Mishra và ctv, 1998: Tính trạng chống chịu mặn là một tính trạng di truyền đa gen, không di truyền theo dòng mẹ (không do các gen trong tế bào chất quy định) [29]. Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Gregorio và Senadrina, 2002)[19]. Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa tính trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện mặn được điều khiển bởi những gen cộng tính (Mishra và ctv, 1990)[30]. 10 1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhưng công trình nghiên cứu kinh điển về sự di truyền phân tử tính chống chịu mặn. Dựa vào bản đồ QTL trên cơ sở tính chống chịu mặn là tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển, sử dụng chỉ thị AFLP và STS các nhà khoa học đã cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn được định vị trên Nhiễm sắc thể số 1 và được gọi là gen Saltol. Bản đồ QTL được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (thí dụ như tính chống chịu mặn). Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những Locut riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng chỉ thị phủ trên toàn bộ nhiễm thể trong hệ gen cây trồng sẽ cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm thể và xác định các gen mục tiêu [7]. Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng của gen và hoạt động của những Locut bao gồm tương tác gen (Epistasis) và tương tác QTL x E (môi trường). Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những chỉ thị mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho việc ứng dụng trở nên có hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, v.v.. Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là “tách dòng” các gen điều khiển tính trạng số lượng vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật “map-based cloning”. [6] 1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh lý thực vật, hàng loạt ảnh hưởng ức chế do mặn cho thấy rằng thực vật tự bảo vệ mình khỏi những thiệt hại do mặn gây ra theo mô hình phản ứng oxy hóa, tránh thiếu hụt nước, tăng cường hấp thụ ion trong chu trình quang hợp [13]. Sự thể hiện gen chống chịu mặn xét về lĩnh vực sinh học phân tử là một khám phá vô cùng thú vị. Tín hiệu được truyền vào tế bào, các gen có chức năng chuyên môn được khởi động và hàng loạt các qúa trình phiên mã, dịch mã xảy ra [1]. 11 Các biểu hiện của cây khi gặp điều kiện mặn bao gồm những triệu chứng chính là: Trắng đầu lá sau đó cháy. Lá vàng và chết hoặc sinh trưởng còi cọc, đẻ nhánh kém, lép hạt, rễ phát triển kém… 1.3. Chỉ thị phân tử 1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu, đánh giá sự có mặt của gen kháng làm cơ sở chính xác cho chọn lọc các cá thể mang tính trạng mong muốn đã trở nên đơn giản hơn. Chỉ thị phân tử (hay chỉ thị phân tử ADN) là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN. Nó có thể là những dòng phân tử ADN có sẵn hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP...). Đặc điểm chung của chỉ thị phân tử là, cho nhiều đa hình, là chỉ thị trội hoặc đồng trội. Nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại “đơn Locut–nhiều alen”, biểu hiện đa hình 1 cách trung tính, không phụ thuộc vào mô, cơ quan (hay bộ phận cần tách chiết ADN ra để khảo sát), không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường. Bên cạnh đó, chỉ thị phân tử có số lượng vô cùng lớn. Việc sử dụng chỉ thị phân tử ADN có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh, dễ dàng tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một chỉ thị ADN liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó. Chỉ thị phân tử còn có thể đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật. Ngoài việc loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của một Locut hoặc giữa các Locut khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng, tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình, số lượng các chỉ thị phân tử còn cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các 12 alen, các chủng sinh lý gây bệnh. Đây là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm... Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính: Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Thực chất nhóm chỉ thị này cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do có bản chất là chuỗi lặp lại nên được xếp vào 1 nhóm riêng. Các chỉ thị phân tử ADN thường có tên gọi theo tên kỹ thuật tương ứng như: RFLP, STS, AFLP, CAPS, RAPD, SSR… Tuỳ vào mục đích nghiên cứu mà chỉ thị nào sẽ được sử dụng. Về cơ bản, chúng ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị phân tử nào trong nghiên cứu đa hình và lập bản đồ phân tử. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng những thông tin về trình tự ADN trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các sinh vật. Tuy nhiên một chỉ thị tối ưu cần đảm bảo sự gắn kết chặt giữa chỉ thị và tính trạng hay vùng quyết định tính trạng, phải có đa hình, có khả năng lặp lại được, phải dễ sử dụng và phải có khả năng phân tích hàng loạt số lượng lớn. 1.3.2. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng 1.3.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Các đa hình RFLP sinh ra bởi các đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ như đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc bởi sự mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN hệ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò. Như vậy nguyên lý cơ bản của chỉ thị RFLP dựa trên kỹ thuật lai Southern 13 (cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn, điện di ADN trên gel agarose, biến tính ADN, trung hòa, chuyển ADN lên màng lai, cố định ADN trên màng lai, lai với mẫu dò đã được đánh dấu) Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một Locut gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử Aa. Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị RFLP. Chỉ thị RFLP cho kết quả rất chính xác, do đó người ta sử dụng nó để kiểm tra các loại chỉ thị phân tử khác. Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh. 1.3.2.2. Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS… Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADNs) Loại chỉ thị này được sinh ra bởi phản ứng PCR để nhân những đoạn ADN hệ gen. Chỉ thị RAPD sử dụng những đoạn mồi ngẫu nhiên (random primers), dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 37o C). Lưu ý là phản ứng PCR trong trường hợp RAPD chỉ sử dụng mồi đơn lẻ, nghĩa là mỗi phản ứng chỉ sử dụng 1 mồi (vừa là mồi thuận vừa là mồi nghịch). Do mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotide, nên trên suốt chiều dài của hệ gen, trung bình cứ khoảng 410 (≈106) nucleotide lại bắt gặp 1 vị trí mà mồi ngẫu nhiên xác định có thể kết cặp được. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP (Zabeau và ctv, 1993) có thể phát hiện được sự có mặt của những đoạn cắt giới hạn thuộc bất kỳ loại ADN nào [38]. Vì thế, loại chỉ thị này được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Nguyên lý của kỹ thuật dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Nghĩa là AFLP có 2 công đoạn chính: Cắt ADN hệ gen thành những đoạn ngắn bằng enzym giới hạn Nhân bội các đoạn ADN chọn lọc bằng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị nhiều nhất so với các kỹ thuật khác, có thể áp dụng cho tất cả các thực vật, động vật. Lượng ADN tổng số tiêu tốn 14 cho kỹ thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả rất cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên, mặt hạn chế của loại chỉ thị di truyền này là ở chỗ nó thuộc loại chỉ thị trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và thể dị hợp. Ngoài ra nó có giá thành tương đối cao. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vị trí đƣợc xác định bởi trình tự) Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong hệ gen [27]. STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những Locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này. Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR. Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa. Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành dễ dàng. Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài. 1.3.2.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại Trình tự lặp lại có kế tiếp (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi. Thực ra, một số chuỗi lặp lại cũng thuộc loại chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN như chỉ thị vi vệ tinh. Tuy nhiên, do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng. Tiểu vệ tinh (Minisatellite) Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotid trở lên (thường vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3kb. Không giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour và Jeffreys). Có 2 loại ADN tiểu 15 vệ tinh. Đó là ADN đầu mút NST và ADN tiểu vệ tinh siêu biến. ADN đầu mút NST nằm ở tận cùng của vai NST, gồm một vài kilobase. ADN tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng cận đầu mút NST (subtelomeric regions) (Napvi N.I và ctv, 1995)[32]. Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates = SSR) Vi vệ tinh, hay ở thực vật còn gọi là Simple Sequence Repeates – SSR (ở người và động vật, người ta gọi “vi vệ tinh” là “Short Tandem Repeats” - STR) là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn vài chục lần. SSR đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của tất cả các Eukaryota khác. Các “vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật. Những kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở thực vật, vi vệ tinh mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lại giàu vi vệ tinh kiểu (GT)n hơn. Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau. Như vậy vùng “vi vệ tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác. Người ta lợi dụng đặc điểm này để thiết kế mồi SSR nằm ở 2 đầu gần kề với đoạn lặp lại. Ưu điểm của chỉ thị SSR: Rất nhiều đa hình Là chỉ thị đồng trội (có thể phân biệt đồng hợp tử AA, hay BB, hoặc dị hợp tử AB) Kỹ thuật đơn giản, tiện lợi Nhược điểm: Quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài. Những marker phân tử nói trên đều có thể áp dụng đánh giá sự có mặt của gen liên quan đến tính chống chịu mặn của cây lúa. Hướng ưu tiên hiện nay được người ta quan tâm là sử dụng microsatellite (SSR). 16 1.4. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử 1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Nghiên cứu đa dạng di truyền còn giúp đánh giá nguồn tài nguyên di truyền của tập đoàn giống cây trồng, vật nuôi, giúp cho việc sử dụng nguồn tài nguyên di truyền hiệu quả hơn. Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ (cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn). Một số chương trình phân tích đa dạng di truyền NTSYS: Rất phổ biến. Sử dụng các thông số “1” hay “+” (có mặt), và “0” hay “-“ (vắng mặt). Có thể dùng chương trình NTSYS cho các chỉ thị phân tử RAPD, AFLP hay các chỉ thị “trội’ khác. PopGene: Tương đối phổ biến. Sử dụng các thông số “1” (có mặt) và “0” (vắng mặt) trong trường hợp chỉ thị di truyền là “trội”, hoặc các thông số AA, BB, CC, AB, AC, BC... trong trường hợp chỉ thị di truyền là “đồng trội”. Ngoài ra, PopGene còn được sử dụng trong trường hợp cần đánh giá những mẫu vật của nhiều quần thể hoặc nhóm các quần thể. 1.4.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền Bản đồ di truyền phân tử được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP...). Trong quá trình giảm phân, các gen trên cùng NST thường được phân ly cùng nhau như một nhóm liên kết gen. Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn do kết quả của quá trình trao đổi chéo giữa các NST tương đồng. Kết quả của hiện tượng này là sự tái tổ hợp giữa các gen trong một cặp NST hay giữa các nhiễm sắc thể. Tần số trao đổi chéo giữa hai gen nào đó phản ánh khoảng cách di truyền giữa chúng và cho phép lập bản đồ di truyền của NST biểu thị vị trí tương đối của các gen [7]. Sự liên kết của những gen nằm trên cùng một NST được trình bày thành một bản đồ liên kết hay bản đồ NST thể hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng. Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên kết được coi là đơn vị bản đồ, nó được xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ 17 hợp, trong đó 1 centiMorgan (cM) tương đương với 1% tái tổ hợp. Bản đồ di truyền phân tử được lập trên cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm soát các tính trạng nghiên cứu. Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể nghiên cứu thể hiện ở kiểu hình. Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ thị liên kết gen. Khoảng cách di truyền giữa các chỉ thị và gen được thể hiện bằng tần số tái tổ hợp giữa chúng. 1.4.3. Trong chọn giống cây trồng Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection - MAS) với mục đích sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau: Kiểu gen của các Locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế. Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn. Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai. 18 Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp. Bert Collard & David Mackill đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với Locut mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN (ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy [14]. MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu điểm nổi bật là: đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình; tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc; rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt; có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3; không bị ảnh hưởng của môi trường; có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây. Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình [6]. Theo E. Francia, 2005, sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố: bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm; mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs; sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả. Có 2 kiểu chỉ thị có thể ứng dụng trong MAS. Một là chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm. Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này. Hai là nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng với gen quan tâm. Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS (Linkage Disequilibrium -MAS). Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với nhiều ưu điểm: Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong 19 quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang). Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc). Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả. Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt. 1.4.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assited Backcrossing - MABC) Trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục qua 56 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được [31]. Trong trường hợp có một giống cây trồng ưu tú nhưng cần đưa thêm một vài gen mong muốn vào giống đó, người ta sử dụng quy trình lai trở lại (trở lại) nhiều lần với giống ưu tú nhằm thu được một giống cây trồng mới mang gen mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên nền di truyền của giống ưu tú. Theo quy trình chọn giống lai trở lại truyền thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ trở lại mới thu được cây mang gen mong muốn nhưng giữ được gần 100% nền gen di truyền của giống ưu tú (bảng 3). Bảng 3. Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1 20 Số thế hệ backcross (n) Tỷ lệ % kiểu gen của dòng nhận gen 1 75 2 87,5 3 93,8 4 96,9 5 98,4 6 99,2 Gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử mới – đó là “Chọn giống trên cơ sở chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assisted BackCrossing – MABC). MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa Locut gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen mong muốn vào giống ưu tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/QTL mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên (gần 100%) nền gen di truyền của giống ưu tú với thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn giống kết thúc ở thế hệ BC3, thậm chí BC2. Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc nền di truyền của dòng cho thông qua phân tích toàn bộ hệ gen bằng chỉ thị phân tử. (Thomson và ctv., 2010)[40]. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ. Ưu điểm chính của phương pháp MABC là: (1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với Locut gen đích (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp (3) Tiến gần đến Locut quan tâm trên bản đồ liên kết (4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm. Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng [38]. Ngoài ra, thông qua phương pháp này, tốc độ của quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp 21 đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường. Chọn giống trở lại nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra. Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu hình. Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt. 1.5. Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 1.5.1. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng về năng suất, chất lượng gạo tốt, kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn. Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), từ năm 1977 - 1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3. Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm. Những giống lúa cải tiến này cho năng suất cao hơn những giống lúa cổ truyền 2 tấn/ha. Tác giả Gregorio và cộng sự (2002), báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn. Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao cây, cảm quang, yếu rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo xấu), tác giả đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởng mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali. Giống lúa TCCP226-2-49-B-B-3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều Trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [19]. Cho tới nay, rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến (Gregorio và cs, 2002; Negrao và cs, 2011). Một số giống lúa địa phương có nguồn gốc từ các vùng duyên hải Đông Á có tính kháng mặn cao như giống Nona Bokra (Ấn độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn độ), SR26B, Damodar, Cheriviruppu, Pat và Solla (Ấn độ), Ketumbar (In đô nê xi a), 22 Khao Seetha (Thái Lan), các giống thể hiện tính kháng mặn trên đều thuộc nhóm Indica. Hơn nữa theo số liệu cập nhật mới nhất, một số dòng giống thuộc nhóm Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn vượt trội cao hơn cả các giống lúa Pokkali và Nona Bokra [19, 33] Đối với nhóm Japonica, ít dòng giống thể hiện tính kháng mặn hơn nhóm Indica. Một số giống thuộc các nước ôn đới có tính chịu mặn khá như giống Harra (Tây ban Nha), Agami (Ai cập), và Daeyabyeo (Hàn quốc). Các giống Japonica nhiệt đới như giống Moroberekan mang tính kháng mặn cao, có nguồn gốc ở Guinea nơi đất canh tác ảnh hưởng ngập mặn. Giống này đã được nghiên cứu và sử dụng làm cây cho gen kháng mặn và lập bản đồ quần thể [24]. Các giống lúa thuộc họ Oryza glaberrima, phần lớn được trồng ở Tây Phi thể hiện tính kháng mặn ít hơn các giống lúa thuộc họ Oryza sativa [8]. Để hiểu sâu hơn về các tính di truyền kiểm soát khả năng chịu mặn của các giống lúa, việc xác định các QTLs liên quan đến tính kháng mặn là rất cần thiết. Danh sách các QTL liên quan đến tính chịu mặn ở lúa có thể tìm được trên trang web Gramene (http://www.gramene.org). Đặc biệt các thông tin chi tiết về các QTLs liên quan đến tính kháng mặn ở lúa có thể tra cứu tại trang dữ liệu TropGene (http://tropenesdb,cirad.fr). Phần lớn các quần thể được sử dụng để lập bản đồ QTL là sử dụng quần thể indica lai với Japonica chẳng hạn như IR64 lai với Azucena hoặc Co29 x Moroberekan. Hơn nữa phần lớn các nghiên cứu đều lập bản đồ quần thể RIL, DH hoặc F2:3. Tuy nhiên gần đây Kim và cs.. đã sử dụng quần thể lai trở lại thì quy tụ được QTL chịu mặn nhanh chóng hơn [24]. Các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa thể hiện do các gen phức hợp kiểm soát. Các QTL liên quan đã được xác định trên các nhiễm sắc thể 1, 4, 6 và 7. Hiện vẫn chưa có QTL thể hiện tính chịu mặn được tìm thấy trên nhiễm sắc thể 8 và 11, và một số ít QTL đã xác định trên nhiễm sắc thể 2, 3, 5, 9, 10 và 12 [21,37,39]. Nhờ ứng dụng các công nghệ, kỹ thuật tiên tiến như phương pháp MAS và MABC các nhà khoa học đã chuyển được các QTLs/gen liên quan đến tính chịu mặn vào các giống lúa cải tiến.[23,37]. Trong các năm từ 1969-1984, riêng các nhà khoa hoc thuộc viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã sàng lọc và đánh giá khả năng kháng mặn của hơn 100.000 giống lúa thu thập từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới. Trong đó trên 20% 23 giống có khả năng chịu mặn khá. Các giống lúa bản địa thu thập ở khu vực vùng duyên hải Nam Á có tính chịu mặn cao chẳng hạn giống Nona Bokra, Cheriviruppu, SR26B, Solla (Ấn độ), Ketumbar (Indonesia), Khao Seetha (Thái lan), hay giống Sóc nâu (Việt nam). Đặc biệt giống Hawasi nguồn gôc từ Saudi Arabia có khả năng chịu mặn lớn hơn cả các giống chịu mặn Pokkali và Nona Bokra [17, 33]. Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29. Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali vào một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp trở lại vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt. Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp lai tạo truyền thống là cần nhiều thời gian để tạo ra một giống lúa chống chịu mặn tốt. Thông thường thì 6 – 8 lần trở lại cần được thực hiện, tương đương với 3 – 4 năm lai tạo. Một khó khăn khác thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối quan hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp kéo dài 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa mới (Collard và Mackill, 2008)[12]. Việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen (QTL) của tính trạng chống chịu mặn. Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn bởi điều kiện môi trường ngoại cảnh. Theo Islam (2011) thì do hệ số di truyền của tính chống chịu mặn thấp (nhỏ hơn 19,18%), nên tính chống chịu mặn của các dòng con lai không cao như bố mẹ có gen chống chịu mặn như trường hợp của giống Pokkali [22]. Sự phát triển của chỉ thị phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Các nghiên cứu của Gregorio (1997); Bonille và ctv (2002) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40 – 65% tính chống chịu mặn của lúa [20, 10, 35]. 24 Trong số các chỉ thị phân tử thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế. Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” nằm trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn của lúa [20, 35]. 1.5.2. Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn Việt Nam mới có rất ít nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn. Một số giống lúa chịu mặn trồng ở các vùng ven biển Việt Nam như Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương... năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha. Là những giống địa phương cho năng suất thấp. Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các giống lúa CM1, CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [1]. Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm được 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện tính chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới. Một số giống lúa mới của Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như: OM5629, OM5891, OM4900 đã được phát triển năng suất có thể đạt từ 5-6 tấn/ha dưới điều kiện bất lợi do nhiễm mặn từ 6.0 đến 9.0 dS/m, các giống này hiện đang được phát triển và mở rộng qui mô. Kết quả đã tạo ra các dạng thử nghiệm tại nhiều địa điểm khác nhau trên cánh đồng trong 3 năm từ 2009 đến 2011 và những tác động ban đầu của chúng đã đang được tiếp tục khảo nghiệm, xác định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu mặn và năng suất [34]. Lã Hoàng Anh và cộng sự đã tìm ra 10 QTL liên quan đến tính chống chịu mặn trên giống Chành Trụi, nằm trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 6, 7, 9. Trong đó 25 QTL trên nhiễm sắc thể số 4 được xác định là QTL chính quy định tính chống chịu mặn của giống [25]. Đề tài “Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn” của tôi được tiến hành trong khuôn khổ của dự án hợp tác quốc tế VN-Đan Mạch nhằm “tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam”, được thực hiện chính tại Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. 26 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Giống nhận gen: là giống AS996 hạt dài, ngắn ngày, chất lượng gạo trung bình, năng suất khá cao được trồng phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Giống cho gen là: giống FL478 được nhập nội từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế, mang Locut gen chịu mặn Saltol. Vùng Locut gen Saltol ở giống FL478 với vị trí từ 10,6 đến 11,5 Mb trên NST số một gồm một số QTL quy định 45%-60% tính chống chịu mặn ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa, chúng đóng vai trò đặc biệt trong việc điều khiển tính nội cân bằng giữa tỉ lệ Na+/K+ cùng với sự có mặt của các allen khác của giống gốc Pokkali trong vùng Locut gen Saltol đã được các nhà khoa học tại IRRI chứng minh là sẽ mang phần lớn tính chống chịu mặn có thể dùng được cho các chương trình chọn tạo giống bằng sinh học phân tử [3]. Giống lúa đối chứng nhiễm (giống mẫn cảm với điều kiện mặn) trong thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn là giống IR29 nhập nội từ IRRI. Hóa chất: 500 chỉ thị SSR trải đều trên 12 NST của lúa (Hãng Bioneer – Hàn Quốc); các hóa chất cho PCR (Hãng Fermentas – Mỹ); hóa chất tách chiết AND (Hãng Sigma – Mỹ); hóa chất chạy gel (Hãng Merk – Đức) Thiết bị máy móc sử dụng thuộc bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp. Phần mềm GGT2.0 để phân tính gen của các cá thể tái tổ hợp. Thời gian thực hiện: năm 2012 -2014. 2.2. Nội dung nghiên cứu Sàng lọc chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ trên 12 nhiễm sắc thể. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết gen chịu mặn Saltol để chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn Saltol trong các thế hệ quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1. Sử dụng chỉ thị phân tử nằm về hai phía gen Saltol để chọn lọc dòng tái tổ hợp trong các thế hệ quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1. Chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn và chứa phần lớn nền di truyền của giống nhận gen AS996 bằng chỉ thị phân tử. 27 Bước đầ u đánh giá khả năng chiụ mặn nhân tạo và đặc tính nông sinh học của các dòng chọn lọc. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến (Shagai – Maroof - 1984) [26]. Lá lúa sau khi cấy 2 - 3 tuần được nghiền trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn. Mẫu được cho vào eppendorf 2ml và thêm 1ml đệm chiết (100mM Tris; 500mM NaCl; 50mM EDTA; 0,07%  - Mercaptol ethanol) sau đó thêm 50l SDS 10% rồi ủ trong 30 phút ở 650C. Hỗn hợp trên mang ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 20 phút, sau đó lấy dịch nổi rồi thêm 1ml isopropanol alcohol, để vào tủ 40C 30 phút, ly tâm tiếp ở 13500 vòng/phút trong 25 phút. Đổ hết dịch nổi, thêm 400l đệm TE (10mM Tris; 0,5 mM EDTA pH=8,0) rồi ủ trong 5 phút ở 65oC. Cho 3l RNAse (10mg/ml) vào mỗi ống và ủ ở 37oC 60 phút. Thêm 400l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút. Thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1) sau đó ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được tách riêng, thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong -200C 60 phút. Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút. Thu tủa, rửa tiếp bằng 400l cồn 70%, ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Hòa tan tủa trong TE và giữ trong -20oC để sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo. 2.3.1.2. Phƣơng pháp PCR [5] với mồi SSR Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 4. Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR TT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O cất khử trùng 8.95 2 Buffer 10X 1,5 3 MgCl2 (50mM) 0,45 28 TT Thành phần Thể tích (l) 4 dNTP (1mM) 1,0 5 Taq ADN polymeraza (5U) 0,1 6 Mồi xuôi (5M) 0,5 7 Mồi ngược (5M) 0,5 8 ADN (35ng/ l) 2,0 Tổng thể tích: 15 Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau: Bảng 5. Điều kiện của phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 1 94 5 phút 1 94 30 giây 55* 30 giây 72 45 giây 72 5 phút 2 3 35 1 10 ∞ 4 1 (*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể 2.3.1.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% Các bước tiến hành 0.8g agarose hòa vào 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0). Đun nóng đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều. Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông. Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE 29 ngập mặt gel. Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. Soi gel trên máy soi cực tím, đo ̣c và ghi nhâ ̣n kế t quả . 2.3.1.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính Lau kỹ bề mặt hai tấm kính rồi lắp ghép lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm. Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào cốc đong. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều. Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. Cài lược vào giữa hai tấm kính rồi dùng kẹp cố định lược. Để gel polyme hóa trong 1 2 giờ. Sau khi tháo lược, thực hiện lắp ráp bộ điện di, cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới. Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W. Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol), làm lạnh nhanh trong 5 phút. 5l sản phẩm PCR được tra vào các giếng, các mẫu chạy với ladder 50 bp. Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng. Phƣơng pháp nhuộm bạc Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành cố định gel. Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng (glacial acetic 10%), để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Rửa gel bằng nước cất rồi cho vào dung dịch nhuộm (1g bạc nitrat (AgNO3) trong 1 lít nước cất, bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.), lắc nhẹ trong 30 phút. Gel sau đó được lấy ra rửa sạch bằng nước cất rồi đưa vào dung dịch hiện (Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất) lắc nhẹ đến khi băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng trong 3 - 6 phút rửa lạivbằng nước cất, để khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả. 30 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide không biến tính Lau kỹ 2 tấm kính sau đó đặt tấm kính ngắn lên trên tấm kính dài sao cho không bị hở và dùng kẹp kẹp chặt hai tấm kính với nhau. Chuẩn bị dung dịch 6% acrylamide, thêm các thành phần 50l TEMED và 250l APS 20%, 2,5ml TBE 10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O, khuấy đều. Đổ từ một góc cho đến khi gel đầy tấm kính ngắn, cài lược sao cho để răng lược hướng vào trong. Sau 15 phút gel đông lại, lắp vào bể điện di sao cho không để lại bọt khí dưới tấm kính, thêm đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng 0,5cm. Rút lược ra và tra khoảng 7l mẫu cho mỗi giếng. các mẫu chạy với marker chuẩn 25bp. Điện di từ 1,5 – 5h ở 100V tùy từng kích thước cặp mồi PCR và tùy từng nồng độ gel. Sau khi điện di xong, tháo kính, lấy gel ra cho vào một hộp kín có chứa TBE 0,5X. Cho dung dịch nhuộm Syber Safe ngâm trong 30 phút. Sau đó chụp ảnh bằng máy soi UV. 2.3.2. Phƣơng pháp lai nhân tạo Phương pháp này được sử dụng trong trở lại, qui tụ gen chịu mặn từ dòng/giống cho gen vào giống lúa ưu việt. Cặp lai được lựa chọn là dòng /giống cho gen chịu mặn (donor) mang gen kháng và có đặc tính kháng cao, dòng hoặc giống nhận gen là những dòng/giống có các đặc điểm ưu việt như chất lượng gạo ngon, năng suất cao, các đặc điểm nông sinh học đáp ứng nhu cầu sản xuất. Khi gieo hạt phải tính toán thời gian sinh trưởng của các dòng/giống cho và nhận gen sao cho thời gian ra hoa phải trùng nhau. Tiến hành theo những bước sau: Gieo hạt cây bố mẹ, chăm sóc cây đến khi ra hoa. Chọn những hoa phát triển tốt, có khả năng cho hạt bình thường. Tiến hành khử đực cây mẹ khi lúa bắt đầu trổ bông. Khử đực phải tiến hành khi vách bao phấn chưa mở, nếu khử quá sớm sẽ gây tổn thương hoa, nếu khử quá muộn hạt đã được thụ phấn. Khi khử đực, cắt vát vỏ phần nửa trên của hoa, chú ý không cắt vào vòi nhị cái, sau đó dùng panh nhỏ hoặc máy thổi để loại bỏ hết nhị đực trong hạt lúa. Sau khi khử đực xong tiến hành cách ly các hoa để tránh giao phấn từ những cây khác trong quần thể bằng cách bao giấy bóng mờ hay những bao nilon để tránh 31 mưa, vừa tạo cho cây và hoa quang hợp được. Sau khi khử đực 1-2 ngày có thể cho thụ phấn. Chuẩn bị phấn của cây bố để thụ phấn cho cây mẹ, cần phải chuẩn bị luợng phấn đủ để thụ phấn cho hoa của những cây mẹ đã khử đực. Thông thường, tiến hành khử đực chiều hôm trước và cho thụ phấn vào 1012 giờ ngày hôm sau vì đó là thời gian vòi nhụy dễ dàng tiếp nhận và hạt phấn dễ nẩy mầm ở trên đầu nhụy. Cũng có thể để cây bố và mẹ cạnh nhau hay có thể rũ phấn cây bố vào cây mẹ hoặc dùng panh nhỏ gắp bao phấn đặt lên vòi nhụy. Khi thụ phấn nên dùng những hạt phấn ở trên những cây bố khoẻ, hoa tươi mới. Sau thụ phấn, tiến hành chăm sóc cây và các biện pháp chống côn trùng phá hoại hạt lai. Sau 25- 30 ngày có thể thu hạt lai. Các hạt lai F1 được trồng đến khi được 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu mặn bằng chỉ thị phân tử. Chọn lọc các cá thể dị hợp tử mang gen chịu mặn để lai trở lại với giống AS996 (làm bố) tạo quần thể BC1F1. Các cá thể BC1F1 được trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử. Chọn những cá thể mang gen chịu mặn và có nền di truyền lớn nhất của giống để lai trở lại với dòng nhận gen tạo BC2F1. Tiếp tục các công việc như từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm 1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang gen kháng, chọn được dòng mang gen chịu mặn và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây mẹ. 2.3.3. Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa chịu mặn Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và cho Locut gen Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR. Xác định các cặp mồi đa hình phục vụ phân tích di truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly BC. Lai tạo hạt F1 quần thể chọn giống: Dòng mẹ đã được lựa chọn là cây nhận AS996 (giống địa phương phổ biến) sẽ được lai tạo với dòng cho Locut gen Saltol, dòng FL478. 32 Tạo cây BC1F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể mang gen đích Saltol và cây tái tổ hợp mang nhiều nền gen của cây AS996 trong quần thể BC1F1. Cây mang nhiều nền gen nhận sẽ được lai trở lại với dòng nhận gen để tạo quần thể BC2F1. Lặp lại bước chọn lọc các thể bằng chỉ thị phân tử, chọn dòng mang gen đích và mang nhiều nền gen cây nhận. Đánh giá sơ bộ tính chống chịu mặn của dòng chọn lọc 2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá mặn nhân tạo Phương pháp thanh lọc mặn nhân tạo trong phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn của IRRI. [18] Hoá chất Muối NaCl 33 Dung dịch dinh dưỡng Yoshida Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) Nguyên tố Hoá chất Lƣợng cần (g/2L dd mẹ) Đa lượng N P Ammonium nitrate (NH4NO3) Sodium phosphate, monosasic monohydrate (NaH2PO4.H2O) 365,6 142,4 K Potassium sulfate (K2SO4) 285,6 Ca Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O) 469,4 Mg Magensium sulfate, 7- hydrate (MgSO4.7H2O) 1.296,0 Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L nước Vi lượng cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối cùng lên thể tích đầy đủ. Mn Mo Mangannuos chloride, 4-hydrate (MnCl2.4H2O) Ammonium molybdate, 4-hydrate [(NH4)6MoO24.4H2O] 6,000 0,296 Zn Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O) 0,140 B Boric acid (H3BO3) 3,736 Cu Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O) 0,124 Fe Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O) 30,800 C Citric acid, monohydrate (C6H8O7.H2O) 47,600 34 Phƣơng pháp đánh giá mặn (theo IRRI) [18] Các dòng sử dụng cho quá trình thanh lọc Vật liệu chính gồm chậu nhựa có dạng hình chữ nhật, kích thước khoảng 14x30x35cm, lưới chống muỗi, tấm xốp dầy khoảng 1,2 - 2,5cm, muối NaCl, dung dịch Yoshida. Tấm xốp nổi được cắt kích thước sao cho lọt vừa khít vào bên trong của chậu nhựa. Cắt những rãnh thẳng sao cho chứa được 20 hạt lúa nảy mầm. Mặt dưới của tấm xốp phủ bằng lưới muỗi sao cho hạt lúa không bị lọt xuống đáy chậu nhựa. Hạt lúa vô trùng, được nảy mầm và đặt vào trong rãnh chứa của tấm xốp. Trong 13 ngày đầu mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng bình thường. Từ ngày thứ 14 mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung muối và bắt đầu theo dõi tính chịu mặn của các dòng nghiên cứu, 5 ngày thay môi trường dinh dưỡng 1 lần. pH của dung dịch luôn được duy trì ở mức 5. Việc điều chỉnh pH được thực hiện mỗi ngày. Kết thúc thử mặn sau khi các dòng nhiễm (chuẩn nhiễm) đạt đến điểm 7 -9. Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997) Điểm Quan sát Mức chống chịu 1 Tăng trưởng bình thường, không lá nào bị héo vàng Kháng cao 3 Cây sinh trưởng gần như bình thường, có một vài lá hoặc dầu lá hơi trắng và bị cuộn lại. Kháng 5 Cây chậm phát triển. Hầu hết lá cuộn lại, rất ít lá phát triển dài ra được Kháng trung bình 7 Cây ngừng sinh trưởng, một số cây chết Nhiễm 9 Hầu hết cây bị chết hoặc đang chết Nhiễm cao Tính tỉ lệ % cây sống vào ngày thứ 10 sau thử mặn. Tiến hành đánh giá vào ngày thứ 7- 8 sau khi cho cây vào môi trường mặn theo bảng 2.3. 35 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được ghi nhận trong chương trình, IRRISTAT, Excel và xử lý trong chương trình GGT2.0 (Van Berloo, 2008)[41] như sau: Ghi nhận dữ liệu của từng chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận nhận gen là “A”, đồng hợp tử giống cho gen là “B” và dị hợp tử là “H”, số % alen của cây nhận gen là “R”. (Giống nhận gen x giống cho gen) F1 x Giống nhận gen BC1F1 (700 cá thể) Sàng lọc gen kháng Chỉ thị liên kết với gen kháng BC1F1 mang gen kháng (150 – 350 cá thể) Sàng lọc tái tổ hợp Chỉ thị nắm về hai phía gen kháng BC1F1 tái tổ hợp (15 – 25 cá thể) Sàng lọc nền di truyền giống nhận gen Chỉ thị nằm trên 11 NST còn lại Cá thể BC1F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen BC2F1 (100-200 cá thể) Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen Chỉ thị liên kết chặt, nằm về hai phía gen kháng và trên 11 NST khác Cá thể BC2F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen BC3F1 (100-200 cá thể) Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen Khẳng định kết quả bằng chỉ thị liên kết chặt, nằm hai phía gen kháng và trên 11 NST khác BC3F2 (400 cá thể) Cá thể BC3F1 tốt nhất Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen Các dòng mang gen chịu mặn có nền di truyền của giống nhận gen Hình 3. Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC) 36 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổ ng số Để tiế n hành kiể m tra các cây lai của vu ̣ trước chúng tôi tiế n hành thu mẫu lá lúa khi cây lúa cấy được 20 ngày tuổi về tách chiết ADN. Đây là bước rấ t quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu được thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN được minh hoạ ở hình 3.1. 1 2 3 4 5 6 7 32 33 34 35 36 37 38 8 9 10 11 12 13 14 15 39 40 41 42 43 44 45 46 16 17 18 19 20 21 22 23 47 48 49 50 51 52 53 54 24 25 26 27 28 29 30 31 55 56 57 58 59 60 61 Hình 4. Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose. Giếng 1, 33: ADN chuẩn nồng độ 100ng/l. Giếng 2-31; 34-61: ADN của các cá thể trong quần thể nghiên cứu. Trên hình 3.1 cho thấy, kết quả tách chiết tinh sạch ADN của các cây trong quần thể nghiên cứu có đủ độ tinh sạch và nồng độ trong khoảng từ 100 ng/l để có thể tiến hành thí nghiệm. Các cá thể ở các thế hệ tiếp theo cũng được tách chiết ADN tương tự như vậy để phục vụ cho bước tiếp theo trong thí nghiệm phân tích. 37 3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với chỉ thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng chỉ thị phân tử nhằm phát hiện sự có mặt của gen kháng trong các cá thể con lai. Để lựa chọn gen đích (Saltol) chúng tôi tiến hành khảo sát một nhóm chỉ thị nằm ở vị trí của gen và về hai phía của gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Vị trí xác định của các chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 1 được thể hiện trên hình. Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1(IRRI, 2012) [24] Giống FL478 có mang gen chịu mặn Saltol. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng để phát hiện gen chịu mặn trong các cá thể con lai chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa FL478 và AS996. Tổng số 500 chỉ thị SSR trên 12 NST của lúa đã được sàng lọc để xác định các chỉ thị cho đa hình giữa các cây bố mẹ cho và nhận gen kháng. Trong số đó, có 52 chỉ thị nằm ở vùng gen Saltol đã được phân tích. Kết quả có 63 chỉ thị cho băng đa hình giữa giống 38 FL478 và AS996 (phụ lục 1). Kết quả này cho thấy tần số cho đa hình của các chỉ thị SSR đã phân tích với 2 giống AS996/FL478 là khá thấp (12,6%). Tất cả các chỉ thị này đã được sử dụng để phân tích sàng lọc các cá thể con lai ở những thế hệ BC1F1, BC2F1 và BC3F1. 1 4 8 12 16 17 20 24 28 32 34 38 41 Hình 6. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6% Thứ tự giếng theo chỉ thị: 1.Q5; 2.Q5; 3.OM5472; 4.FL478; 5.IR64SUB1; 6.AS996; 7.KDDB; 8.BT Chỉ thị: 1-8 SO7053; 9-16 G11; 17-24 AP3206; 25-32 S12055; 34-41 RM228; M: 42 25bp ladder Hình 6 cho thấy, hai giống FL478 và AS996 (giếng thứ tư và thứ sáu ở mỗi phần gel đối với từng chỉ thị) cho đa hình với các chỉ thị SO7053, G11, AP3206, S12055. 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 12 34 5 6 7 Hình 7. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5% Thứ tự giếng theo chỉ thị:1.Q5; 2.Q5; 3.OM5472; 4. IR64SUB1; 5. FL478; 6.KDDB; 7.AS996; Chỉ thị: RM18; RM118; RM152; RM223; RM284 Hình 3.4 đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide cho thấy hai giống FL478 và AS996 cho đa hình với các chỉ thị RM18 và RM152. 39 Hình 8. Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể quần thể AS996/FL478 40 3.3. Phân tích các cá thể BC bằng phƣơng pháp MABC 3.3.1. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1 (AS996/FL478 x AS996) Trên cơ sở bản đồ vùng QTL Saltol, những chỉ thị tốt nhất trong vùng QTL Saltol là AP3206 và RM3412, chỉ thị hữu ích nhất là chỉ thị nằm rải rác 2 phía của Saltol là RM10694 và RM493, RM10793, trong khi các chỉ thị nằm gần đó có thể sử dụng cho phép chọn lọc âm tính là RM490 nằm phía trên Saltol và RM7075 ở phía dưới, các chỉ thị Microsatellite không liên kết với Saltol bao phủ cả NST này cho đa hình giữa 2 giống cho nhận gen cũng có thể được sử dụng cho sàng lọc các cá thể tái tổ hợp di truyền và cho chọn lọc nền gen thể nhận. Có 42 chỉ thị SSR đã được phân tích cho sàng lọc thế hệ BC1F1. Việc sàng lọc gen đích đã tiến hành nhờ phân tích các cá thể với 3 chỉ thị AP3206, RM3412 và RM10793. Sau đó, các chỉ thị nằm 2 phía gần vùng Saltol đã được phân tích trong sàng lọc xác định các cây tái tổ hợp. Tổng số 500 cá thể đã được phân tích. Đã xác định được 245 cây mang gen đích Saltol. 1 2 25 AS FL Hình 9. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206. Làn gel 1: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478 Sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị AP3206 cho thấy có 26/46 cá thể trên gel là dị hợp tử với locut AP3206. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ được ghi nhận lại để phân tích. (Hình 3.6) 12 25 50 Hình 10. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793. Làn gel 25, 50: 25bp ladder, 1-24 và 26-47: các cá thể BC1F1, 48:AS996, 49: FL478 41 Hình 10 cho thấy kết quả sàng lọc với chỉ thị RM10793, hầu hết các cá thể BC1F1trên gel là dị hợp tử với locut RM10793. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ được ghi nhận lại để phân tích. Sau đó phân tích xác định cây tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về 2 phía của gen đích trên nhiễm sắc thể số 1. Sau khi xác định các cá thể tái tổ hợp có chứa gen đích, tiếp tục bước phân tích các cây đã chọn ra bằng các chỉ thị nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa đã được sử dụng để phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận. 1 25 51 Hình 11. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310. Làn gel 1, 25, 51: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478 1 2 25 A FL Hình 12. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639. Làn gel 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: Các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50:FL478 Hình 11, 12 cho thấy kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM310, RM5639 cho phép lựa chọn các cá thể trên gel mang băng của cây nhận gel AS996 để chọn lựa tối đa nền gen cây nhận gen. Số liệu ghi nhận được phân tích trên trong Excel. Hai cây mang nhiều nền gen cây nhận gồm cá thể P284 và P307 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36% (bảng 3.1). Trong trường hợp chỉ sử dụng các phương pháp chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen của cây nhận gen trong thế hệ này chỉ đạt được 75%, thấp hơn trong nghiên cứu này từ 16-19%. 42 Bảng 8. Tỉ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp ở thế hệ BC1F1 Cây số 5 49 28 38 81 84 05 07 11 01 26 11 A 55.26 51.43 60.53 44.74 56.25 78.13 66.67 75.76 63.64 73.68 66.67 63.64 H 34.38 37.93 36.36 34.38 15.63 21.88 33.33 21.21 36.36 80.00 33.33 36.36 R 72.45 70.39 78.71 61.92 64.06 89.06 83.33 86.36 81.82 73.68 83.33 81.82 Số liệu kiểu gen của các cá thể có chứa tái tổ hợp tại vị trí gen Saltol được phân tích trên phần mềm GGT2.0. Kết quả thể hiện trên hình 3.10. Hình vẽ thể hiện bản đồ vị trí các chỉ thị SSR được sử dụng để sàng lọc NST số 1, 3, 4 và 10, các kí hiệu A: là kiểu gen cây mẹ, B: là kiểu gen cây bố; H: là dị hợp tử và K: là số liệu nghi ngờ. Nhìn vào hình vẽ có thể thấy rõ các locut phân tích với các kiểu gen đặc trưng cho giống cho hoặc nhận gen kháng. RM10694 1.0 RM5639 8.1 B B AP3206e 2.0 0 Legend . A G11A 0.0 Legend . A 0 K K RM10711A 3.0 H H SO3065 12.8 SO3068 14.8 SO3072 15.4 RM3412A 4.0 25 RM493 5.0 RM3867 31.5 Legend . A 0 RM518 2.0 Group 3 [chrom3] Legend . A cM 0 Group 1 [chrom1] 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 cM RM6329 28.7 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 RM10793 6.0 RM5626 24.7 B RM171 2.6 H RM 25022 3.6 B K R10M10 4.9 H R4M13 7.9 K R4M17 11.5 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 R4M30 17.9 cM cM 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 R10M17 8.6 Group 10 [chrom10] Group 4 [chrom4] Hình 13: Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10. 43 3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) Hai cá thể P284 và P307 của thế hệ BC1F1 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36%. Hai cây này đã được sử dụng để phát triển quần thể thế hệ BC2F1. 500 cá thể của quần thể BC2F1 thuộc phép lai (AS996/FL478/AS996/ AS996) đã được trồng và phân tích ADN. Tương tự như các bước phân tích trên các cá thể thuộc thế hệ BC1F1, các bước phân tích sự có mặt của gen đích, phân tích xác định cây tái tổ hợp rồi phân tích toàn bộ nền gen sử dụng các chỉ thị nằm trên 12 nhiễm sắc thể đã được tiến hành. Bước phân tích gen đích sử dụng chỉ thị AP3206, RM3412, RM10793, RM10711 (Hình 3.11; 3.12). Các cá thể có mang hai băng đối với cả bốn chỉ thị này sẽ được chọn lựa cho bước phân tích tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về hai phía của vùng Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Trong tổng số 250 cây dị hợp tử đã xác định được 26 cây tái tổ hợp trên vùng gen Saltol. 1 FL AS 10 20 30 40 50 59 Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412. Làn gel từ 1 đến 57: các cá thể BC2F1; 58: FL478, 59: AS996 Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM10793 (bên trái), và RM10711 (bên phải). 44 Bước phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận đã được tiến hành với tổng số 48 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy các cây P307-322, P284-112 and P307-305 là những cây tốt nhất, mang từ 93.18% đến 94.03% nền gen cây nhận AS996. Ba cây này đã được sử dụng trong phép lai trở lại để tạo thế hệ BC3F1 tiếp theo. Mỗi cây sử dụng một nửa số bông cho lai trở lại và một nửa tự thụ tạo thế hệ BC2F2. Trong trường hợp sử dụng chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen cây nhận đạt cao nhất là 87.5% trong thế hệ BC2F1, nhưng ở nghiên cứu này, tỉ lệ nền gen cây nhận thu được cao hơn từ 5.7- 6.5% so với chọn giống truyền thống. 3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) Từ kết quả phân tích cá thể thế hệ BC2F1, 3 cá thể mang tỉ lệ nền gen nhận cao nhất đã được lai trở lại tạo lập quần thể BC3F1 của tổ hợp AS996 mang Saltol. A B C D E Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412 (A), RM10711 (B), RM10793 (C), AP3206 (D) và RM10694 (E). Làn gel 1: AS996, Làn gel 2: FL478. Tổng số 371 cá thể đã được phân tích với các chỉ thị định vị trên vùng gel Saltol. Phát hiện 94 cá thể mang gen đích được phân tích tái tổ hợp. Sàng lọc các 45 thể BC3F1(AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206, và RM10694 trên hình 3.13. Phân tích ADN các cá thể tái tổ hợp mang gen đích với 63 chỉ thị phân tử SSR. Số liệu về kiểu gen của 14 cá thể được đưa vào phân tích bằng phần mền GGT2.0, đã xác định cá thể P284112-291 của quần thể BC3F1 là tốt nhất trong 5 cá thể tái tổ hợp P284-112-291, P307-305- 21, P284-112-195, P284-112-198, P284-112-213 mang nhiều nền di truyền cây nhận gen, cả 5 cây này đã được chọn cho quá trình chọn giống SALTOLAS996 ở các thế hệ sau. Hình 17 Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm GGT2.0 Sơ đồ nền gen của cá thể P284-112-291 thể hiện trên hình 3.14.: Tại các locut nằm ở vị trí của gen Saltol, cây P284-112-291 có băng màu xanh nhạt, thể hiện là mang locut dị hợp tử. Đối với các locut còn lại trên các NST, cây P284-112291 đều có các locut màu đỏ, thể hiện băng của locut cây nhận gen hay là nền gen của giống AS996. Như vậy, với 63 chỉ thị rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa, đã xác định được cây mang gen đích và mang tới 100% nền gen cây nhận gen. Ngoài 46 ra các dòng mang nền gen của giống nhận gen cao như P307-305- 21, P284-112195, P284-112-198, P284-112-213 cũng được giữ lại để chọn dòng và phát triển trong chọn giống. Những dòng này đã được thu hạt, đánh giá tính chống chịu mặn và một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất để chọn ra những dòng triển vọng năng suất cao và có tính chịu mặn tốt. 3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc Thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn ở thế hệ BC3F2, BC3F3 đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp theo như đã mô tả ở phần “2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo”. Các dòng được đánh giá mặn tại nồng độ muối bằng EC=12dSm, tương đương mức nhiễm mặn NaCl = 60/00. Các dòng BC3F2 tham gia thí nghiệm đều có mức độ kháng tương đương giống FL478 mang vùng gen Saltol. Các dòng này được đưa ra ruộng gieo trồng để theo dõi đánh giá và thu hạt cho lần thí nghiệm tiếp theo. Ở thế hệ BC3F3, các dòng chọn lọc được đưa vào đánh giá tính chịu mặn. Hình 18 Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn 47 Hình 18 là hình ảnh các dòng lúa chọn lọc BC3F3có mang gen kháng được gieo trong khay và nuôi bằng môi trường dinh dưỡng Yoshida trước khi được thanh lọc mặn. Sau khi bổ sung muối vào môi trường, có thể ghi nhận triệu chứng về mặt hình thái của các dòng/giống. Đối với FL478, sau khi bổ sung muối thì dấu hiệu đầu tiên là hiện tượng cháy đầu lá nhưng mức độ ít nghiêm trọng hơn so với giống IR29, và sau đó là hiện tượng quăn đầu lá và 1-2 lá già nhất ở một số cây có hiện tượng chết. Trong quá trình thanh lọc, các cây chịu mặn phát triển bình thường. Những cây nhiễm mặn bị héo quăn lá và phát triển chậm (giống IR29). Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ). Trên mỗi khay thử: hàng 1: FL478; hang 10: IR29; Các hàng 2-9: Các dòng BC3F3 mang vùng gen Saltol 48 Hình 20: Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00). Trên mỗi khay thử: hàng 1: AS996; hàng 2: FL478; hàng 10: IR29; Các hàng 3-9: Các dòng BC3F3 mang vùng gen Saltol Ở hình 3.17, sau 14 ngày thanh lọc mặn, có sự khác biệt rõ ràng giữa giống bố mẹ: giống gốc AS996 nhiễm mặn bị héo quắt, cây chết và giống FL478 vẫn sinh trưởng tốt. Giống chuẩn nhiễm IR29 chết hết. Các dòng chọn ra từ dòng B291 cho phản ứng chống chịu tốt với mặn. Kết quả đánh giá ở bảng 2 cho thấy, mức chống chịu mặn của các dòng cho thấy dòng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dòng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa. Kết quả đánh giá được ghi nhận lại ở bảng 3.2 49 Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 (AS996xFL478) theo tiêu chuẩn IRRI, 1997 STT Dòng Điểm Mức chống chịu 1 B291-1-1 3 KC 2 B291-1-2 3 KC 3 B291-1-3 3 KC 4 B291-1-4 3 KC 5 B291-1-5 3 KC 6 B291-1-6 3 KC 7 B291-1-7 3 KC 8 B291-1-8 3 KC 9 B291-1-9 5 NV 10 B291-1-10 3 KC 11 B291-1-11 3 KV 12 B291-1-12 3 KC 13 FL478 (ĐC kháng) 3 KC 14 AS996 7 N 15 IR29 (ĐC nhiễm) 7 N Kết quả đánh giá mức chống chịu mặn của các dòng cho thấy dòng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dòng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa. 3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn Các dòng lúa chọn lọc được gieo trồng trên ruộng để đánh giá các đặc tính nông sinh học: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số bchiều dài lá đòng, chiều dài 50 cổ bông và các yếu tố cấu thành năng suất như số khóm/bông, số hạt/bông, tỉ lệ số hạt chắc/bông; khối lượng 1000 hạt, năng suất. Các số liệu được ghi nhận lại và tiến hành theo phương pháp hệ thống đánh giá chuẩn của IRRI. Số liệu được phân tích và xử lý bằng chương trình tính Excel và IRRISTART 5.0. Bảng 10. Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội Chiều TT Tên dòng Chiều dài TGST Chiều cao dài lá (ngày) cây(cm) đòng (cm) 88,2±4,7 34,4±2,7 3,6 ± 1,4 23,6±0,9 23,2±2,7 7,2±1,2 20,4±0,8 cổ bông(cm) Chiều dài bông(cm) 1 B291-1 125 2 B291-2 125 3 B291-13 125 81,0±3,0 25,1±2,6 7,0±1,4 21,9±1,4 4 B291-2-5 125 86,0±1,6 22,5±3,5 5,3±0,6 19,1±0,6 5 B291-1-10 125 99,6±2 26,1±2,5 4,7±0,4 25,8±1,4 6 B291-1-3 125 98,9±1,7 28,5±4,8 7,7±2,8 24,1±1,5 7 B291-2-2 125 104±3,1 31,2±2,6 6,2±1,6 24,1±1,3 8 B291-2-8 125 89,3±2,2 22±3,6 8,0±1,3 19,8±0,8 9 B291-2-7 125 96,3±2,3 27,1±4,8 5,8±1,9 22,5±0,6 10 B291-1-1 128 87,3±3,1 23,1±3,7 5,2±1,4 23,6±1,0 11 B291-2-15 125 89,8±5,0 22,7±3,2 3,6±0,9 20,3±1,6 12 B291-2-1 125 87,8±3,3 25,8±3,1 6,3±1,8 23,5±1,5 13 B291-2-3 125 85,8±1,7 23,2±3,9 5,5±2,2 20,1±0,9 14 B291-16 125 88,5±1,2 23,3±4,0 4,3±1,1 21,5±1,5 15 B291-1-9 130 92,7±1,5 26,2±2,1 5,2±1,3 23,8±0,9 83,4±3,6 51 16 B291-2-10 125 84,6±0,8 24,4±3,3 5,3±1,3 20,3±0,7 17 B291-14 125 85,4±1,1 26,7±3,3 5,1±1,1 20,8±0,9 18 B291-1-3 125 104,2±1,0 26,0±2,5 4,0±0,8 24,0±1,1 19 AS996 125 91,0±0,8 28,6±0,7 5,9±0,6 22±0,8 20 FL478 132 87,3±2,2 33,1±4,8 3,6±1,1 21±0,7 Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội TT Tên dòng Số Số hạt/ Tỉ lệ P1000 NSLT NSTT bông/khóm bông lép(%) hạt(g) tạ/ha (tạ/ha) 1 B291-1 5,1 ± 0,7 147,2±36,1 3,27 27,03 88,20 53,37 2 B291-2 5,5±0,5 148,7±20,1 19,3 28,30 84,22 61,0 3 B291-13 5,4±0,5 144,8±23,4 25,3 26,60 70,01 58,0 4 B291-2-5 4,8±0,5 154,7±24,9 20,9 27,54 72,93 64,2 5 B291-1-10 5,0±0,7 171,1±34,4 18,16 25,50 64,23 51,13 6 B291-1-3 4,8±0,8 172,2±49,5 3,5 26,80 96,08 65,71 7 B291-2-2 5,8±0,9 155,7±51,5 4,2 24,28 94,09 63,26 8 B291-2-8 5,1±0,8 111,0±26,8 20,9 29,65 65,53 48,17 9 B291-2-7 4,0±0,9 129,2±60,6 1,9 26,13 59,52 43,12 10 B291-1-1 4,6±0,9 144,6±40,2 2,9 28,05 81,75 59,43 11 B291-2-15 4,3±0,5 133,3±20,7 23,2 27,30 53,95 40,21 12 B291-2-1 4,3±0,5 144,2±15,1 14,5 26,98 64,27 47,31 13 B291-2-3 4,5±0,5 160,2±25,4 25,1 29,00 69,61 49,23 14 B291-16 4±0,4 118,2±30,4 8,7 29,10 56,43 42,81 15 B291-1-9 4,1±0,7 154±35,3 15,9 29,98 71,63 66,32 52 16 B291-2-10 4,3±0,5 160,3±29 19,2 28,50 71,29 66,00 17 B291-14 4,4±0,8 110,7±30,4 13,5 28,40 53,99 40,62 18 B291-1-3 4,9±0,8 123,9±21,6 6,4 30,78 78,77 67,20 19 AS996 4,7±0,6 145,2±21,9 23,6 26,60 62,32 51,30 20 FL478 4,6±0,5 140,7±24 9,0 28,63 75,50 60,45 CV% 1,50 LSD0,5 2,22 Kết quả ở bảng 3.4, 3.5 cho thấy thời gian sinh trưởng của các dòng biến động từ 125 ngày đến 132 ngày trong vụ xuân 2013. Chiều cao cây thay đổi từ 81,0 đến 104 cm. Chiều dài bông thay đổi từ 19,1 đến 25,8 cm. Số bông/khóm thay đổi từ 4,1 đến 5,8 bông/khóm. Số hạt/bông biến động từ 110,7 đến 193,3 hạt/bông. Tỉ lệ lép biến động từ 2,5% đến 25,94%. Năng suất thực tế của các giống tham gia thí nghiệm nói chung là khá, trong khoảng 40,21 đến 67,2 tạ/ha.Trong đó, các dòng có năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-25 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ tiếp theo. 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Sàng lọc đa hình giống cho gen và nhận gen đã được tiến hành trên 500 chỉ thị SSR, trong đó đã được xác định 63 chỉ thị. Kết quả này cho thấy tỉ lệ đa hinh ADN của hai giống AS996/FL478 là rất thấp khi sử dụng các chỉ thị phân tử SSR. Hai cá thể của thế hệ BC1F1 là P284 và P307, có hàm lượng nền gen cây nhận cao nhất từ 89.06 đến 86.36% tương ứng, cao hơn so với chọn giống MAS và chọn giống truyền thống 16-19%. Hai cá thể này đã được sử dụng cho việc thiết lập thế hệ BC2F1. Trong thế hệ BC2F1, ba các thể có hàm lượng hệ gen giống nhận gen là đến 93,18 đến 94,03 % đã được xác định bằng cách sàng lọc ADN và đã được sử dụng cho việc thiết lập quần thể BC3F1 Cá thể P284-112-291 tốt nhất của thế hệ BC3F1 đã được sàng lọc mang gần 100% hàm lượng hệ gen cây nhận gen khi khảo sát 63 chỉ thị cho đa hình. Đánh giá tính chịu mặn nhân tạo thế hệ BC3F2 và BC3F3 cho thấy các dòng phát triển từ cá thể P284-112-291 có tính chịu mặn tương đương giống cho gen kháng FL478. Đánh giá đặc tính nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất cho thấy các dòng phát triển từ cá thể P284-112-291, có năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-2-5 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ tiếp theo. Đề nghị Các dòng có tính chịu mặn cao, chứa locut gen Saltol và có đặc tính nông sinh học tốt sẽ tiếp tục được nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh giá mặn nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996-Saltol góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa chiụ mặn cho các vùng đồng bằng thường xuyên bi ̣ xâm nhập mặn góp phần tạo giống lúa chịu mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa chịu mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học và Công nghệ Hạt nhân, 4/2005, Tr. 28-30. 2. Bộ Tài nguyên Môi trường (2012), Kịch bản Biến đổi khí hậu nước biển dâng cho Việt Nam. 3. Tăng Thị Hạnh, Dương Thị Hồng Mai, Trần Văn Luyện, Phạm Văn Cường, Lê Khả Tường, Phan Thị Nga (2011), “Nghiên cứu khả năng chịu mặn của một số nguồn gen lúa lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia”. 4. Lê Sâm (2003), Xâm nhập mặn ở đồng bằng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp. 5. Lê Duy Thành (1999), “Kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Tr. 156-158. 6. Nguyễn Thị Tâm và cs (2008), “Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa OM4498, VND 95-20, IR64, CR203 ở mức độ mô sẹo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 7. Lê Thị Thu Trang (2011), “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam”, Tạp chí Khoa hoc Công nghệ. Tài liệu tiếng Anh 8. Awala, S.K., Nanhapo P.I., Sakagami, J., Kanyomeka, L., and Iijima, M. (2010), “Differential salinity tolerance among Oryza glaberrima, Oryza sativa and their Interspecies including NERICA”, Plant Prod. Sc. 13 (1), pp. 3-10. 9. Aslam, M., Qureshi R. H., and Ahmad (1993), “Mechanisms of salinity tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Department of soil science and physiology, University of Agriculture, Pakistan. 10. Bonille P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K. and Gregorio G.(2002), “RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of rice (Oryza sativa L.) using recombinant inbred lines”, Philipp. Agric. Sci, 85, pp. 64–76. 11. Akbar M, GS Khush, D HilleRisLambers (1985), “Genetics of salt tolerance”, Rice Genetics, IRRI Philippines, pp. 399-409. 55 12. Collar BCY, amd DJ Mackill (2008), “Marker-aided selection: an approach for precision plant breeding in the twenty first century”, Philos. Trans. R. Soc. Lond.B. Biol.Sci. 363, pp. 557-572. 13. Dat J, S Vandenabeele, E Vranova, M Van Montagu, D Inze, F Van Breusegem (2000) “Dual ction of the active oxygen species during plant stress responses”, Cell Mol Life Sci 57, pp. 779-795. 14. Bert Collard & David Mackill (1998), “Conserver AND drives polymorphirm(CDDP): A simple and novel method for generating AND marker in plant”, Journal plant Biology (27), pp. 558-562. 15. FAO (Food and Agriculture Organization) (2010), “Report of salt affected agriculture. Link access”, (http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/, latest veriﬁed 8 October 2011). 16. FAO (2012), “FAO says rice production outpacing consumption”, (http://www.fao.org/news/story/en/item/164713/icode/. Accessed on 17 Nov. 2014.) 17. Glenn Gregorio (2010), “Rice breeding and genetics for salinity and problem soils tolerance for Asia and Africa”, October 2010- present. 18. Glenn B. Gregorio, Dharmawansa Senadhira, and Rhulyx D. Mendoza, “Screening Rice for Salinity Tolerance”, IRRl DISCUSSION PAPER SERIES No. 22 19. Gregorio G.B, Senadhira D., Mendoza R.D, NL Manigbas, JP Rosxas, CQ Guerta (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and associated abiotic stresses in rice”, Field crio Research. Elsevier 20. Gregorio GB (1997), “Tagging salinity tolerance gene in rice (Oryza sativa) using amplified fragment length polymorphism (AFLP)”, PhD dissertation, University of the Philippines Los Banos 21. Haque QA, D HilleRisLambers, NM Tepora, QD de la Cruz (2010), “Inheritance of submergence tolerance in rice”, Euphytica 41, pp. 247-251. 22. Islam, M.R., Salam, M.A., Hassan L., Collard B.C.Y. singh R.K. and Gregorio G.B. (2011). “QTL mapping for salinity tolerance at seedling stage in rice”, Emir.J.Food Agric, 23 (2): pp. 137-146. 56 23. Jena KK, Mackill DJ (2008), “Molecular markers and their use in marker-assisted selection in rice”, Crop Sci 48, pp. 1266-1276. 24. Kim, D. M., Ju, H. G., Kwon, T. R., Oh, C. S., and Ahn, S. N. (2009), “Mapping QTLs for salt tolerance in an introgression line population between japonica cultivars in rice”, J. Crop Sci. Biotech. 12, pp. 121–128. 25. La Hoang Anh, Nguyen Kien Quoc, Hoang Thi Hue and ,La Tuan Nghia (2014), "Dentification of QTLS Tolerance to salinity in rice (ORYZA SATIVA L.)”, International Journal of Development Research. Vol. 4, Issue, 10, pp. 2113-2118. 26. M. A. Saghai-Maroof, K. M. Soliman, R. A. Jorgensen, and R. W. Allard (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics,”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 81, no. 24, pp. 8014–8018. 27. M.Olson M., Hood L., Cantor C., Botstein D. (1989), “A common language for physical mapping of the human genom”, Science 245, pp 1434–1435. 28. Maas EV, GJ Hoffman. (1977), “Crop assessment”, ASCE J Irrig and 29. salt tolerance current Drainage Div 103, pp 115-134. Mishra B, M Akbar, DV Seshu, D Senadhira (1998), “Genetics of salinity tolerance and ion uptake in rice”. IRRN 21, pp 38-39. 30. Mishra, B., M. Akbar and D.V. Sashu (1990), “Genetic studies on salinity tolerance in rice towards better productivity in salt-affected soils”, Proceedings of the Rice Research Seminar, Jul. 12-12, IRRI, Los Ba Laguna, pp: 25-25. 31. Mohan, M., S. Nair, A. Bhagwat, T.G. Krishna, Y. Masohiro, C.R. Bhatia and T. Sasaki. (1997), “Genome mapping, molecular markers and marker assisted selection in crop plants”, Mol. Breed., 3, pp 87-103. 32. Napvi N..I., Bonman J.M., Mackil D..J., Nelson F..J. .and Chattoo B..B. (1995), “Identification of RAPD markers linded to a major blast resistance gene in rice”, Mol. Breed. 1, pp 341 – 348. 57 33. Negrao S., Courtois B., Ahmadi N., Abreu I., Saibo N. and Oliveira M.M. (2011), “Recent updates on salinity stress in rice: from physiological to molecular response”, Crit Rev. Plant Sci, 30, pp 329-377. 34. Nguyen thi Lang, Bui Chi Buu, Ismail A.M (2011), "Enhancing and stabilizing the productivity of salt - affected areas by incoporating nenes for tolerance of abiotics stresses in rice", Omonrice 18, pp 41-49. 35. Niones JM (2004), “Fine mapping of the salinity tolerance gene on chromosome 1 of rice (Orysa sativa) using near-isogenic lines”, MSc thesis, University of the Philippines Los Banos. 36. Ponnamperuma, F. N. (1984), “Role of cultivar tolerance in increasing rice production on saline lands. Strategies for crop improvement”, John Wiley and sons, New York, pp 443. 37. Ranawake, A., & Nakamura, C. (2013), “Assessment Of Salinity Tolerance In An Inbred Population Of Rice (Oryza Sativa L) Derived From A Japonica X Indica Cross”, Tropical Agricultural Research and Extension [Online] 15:3 38. Sarkar P, Bosneaga E, Auer M (2009), “Plant cell walls throughout evolution: towards a molecular understanding of their design principles”, J Exp Bot 60, pp 3615–3635. 39. Shahbaz a & M. Ashrafa (2013), “Improving Salinity Tolerance in Cereals”, Department of Botany, University of Agriculture, Faisalabad, Pakistan 27. Published online: 20 Feb 2013. Plant Sciences, pp 237-249. 40. Thomson MJ., Ocampo M., Egdane J., Rahman M.A., Saiise AG., Adorada DL., Raiz E.T. (2010), “Characterizing the Saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice”, Rice, 3, pp. 148-160. 41. Van Berloo R (2008), GGT 2.0: versatile software for visualization and analysis of genetic data,. J Hered 99, pp 232–236. 42. Yeo A.R. and Flowers, T.J. (1996), “Salinity resistance in rice and a pyramyding approach to breeding varieties for saline soils. In: Plant growth, Drought and salinity”, ED. By NC Tuner and JB Passioura. CSIRO, pp 161-173. Melbourn, Australia 58 PHỤ LỤC Danh sách trình tự các chỉ thị cho đa hình giữa giống FL478 và AS996 Tt Tên mồi Ch Mb 1 RM10287 1 5 2 G11A 1 9.3 3 RM10694 1 11 4 AP3206 1 11.2 5 RM3412 1 11.5 6 RM10711 1 11.2 7 RM493 1 12.3 8 RM10793 1 12.5 9 RM562 1 14.6 10 RM7075 1 15.1 11 RM11125 1 20.5 12 RM7643 1 31.1 13 SO1132A 1 32 14 RM3482 1 39.7 15 RM300 2 13.2 16 M13197 2 16.5 17 RM341 2 19.2 18 RM6318 2 24.4 Mồi xuôi Mồi ngƣợc GTATTCCTTGCTGCTGCTG GACTGGAGATGTGAT ATGG CGGAAACC AGCTGGTAGGAAGGCTGA TGCCAGCAGCTCAGTAG AAG AAG TTTCCCTGGTTTCAAGCTTA AGTACGGTACCTTGAT CG GGTAGAAAGG GGAGGAGGAGAGGAAG GCAAGAATTAATCCA AAG TGTGAAAGA TGATGGATCTCTGAGGT TGCACTAATCTTTCTG GTAAAGAGC CCACAGC GCTTCGATCGATGAGAA GAATCTCCCATCCTTC AGTAGAGG CCTTCC GTACGTAAACGCGGAAG CGACGTACGAGATGC GTGACG CGATCC GACTTGCCAACTCCTTCA TCGTCGAGTAGCTTCC ATTCG CTCTCTACC GGAAAGGAAGAATCAGA GTACCGTTCCTTTCGT CACAGAGC CACTTCC GCGTTGCAGCGGAATTT CCCTGCTTCTCTCGTG GTAGG CAGTCG CCAAGAACCCTAGCTCC TCGACGAGATCCTCCT CTCTCC CGTAAACC AAACCGCCGTCCTCCTAT CTTGAGCGCACCAAC TCG GAAATACC CAATGACGACGCATGTA TGCTTGAATGTTTTTC TGT GAGGA GCCGCTAATGTTGTTGTC CGAAGCCAACGTAGT AAGC CCAATCC GGGCTTAAGGACTTCTG AGCGATCCACATCATC CGAACC AAATCG AAACCCTCCGGCTCATTC ACTCGAATCGTATCGG TTGC CTTGAGG CAAGAAACCTCAATCCG CTCCTCCCGATCCCAA AGC TC AAGTGCCTCGAATTACA GCTGCTTCTGTCCAGT 59 Kích thƣớc To 184 60 250 57 195 60 180 60 215 55 173 60 178 55 124 60 126 55 376 55 212 60 178 55 180 55 173 55 162 55 183 60 200 55 188 55 Tt Tên mồi Ch Mb 19 RM13628 2 25.1 20 RM231 3 2.5 21 RM3297 3 13.4 22 SO3065 3 15 23 SO3068 3 17 24 SO3072 3 19 25 RM7097 3 26.7 26 RM518 4 2 27 RM5639 4 8.1 28 R4M17 4 11.5 29 RM307 4 12.9 30 RM5626 4 31 RM6329 4 32 RM3867 4 33 RM127 4 34 RM437 5 3.8 35 RM122 5 6.3 36 RM249 5 10.7 4.7 8.7 1.5 4.8 Mồi xuôi Mồi ngƣợc CATCTCC GAGACC TATGCCACGAATGACCC CTCCATATGCAGCGAC TAACC AATCG CCAGATTATTTCCTGAGG CACTTGCATAGTTCTG TC CATTG TGCACGTGATCTCTTGTA GGAGAGGGCCTTGTT ACCTAGC CTTGAGG TTTCGTGCGGGGATATA GCAAGATAACTCAAA GAG ATCAAAAGC TTGACAAGTTTTGGAAAT TTGTTGTGCCATTGGA TGGA GAAA TTTCGTGCGGGGATATA GCAAGATAACTCAAA GAG ATCAAAAGC GGCCATTATGTGCATCTC GGATCGATCGACATC TCAGC AATCTTGG AAGACACAAGCAAACAG AAGCTTGCTTGGTTCA CTCAACC AGAGAGG AGGAGGAAGGAAGAAC CTGAGTGCGTGCCATT AGAGTTGC TATTTCC AGTGCTCGGTTTTGTTTT GTCAGATATAATTGAT C GGATGTA GTACTACCGACCTACCGT CTGCTATGCATGAACT TCAC GCTC GGACGCCACCTTCCTCTT 2 CGGTCATAAACGCCA CTGC TTAGACCAAGC CAGCAGAGACTATAGAC 2 TGCCTAGCTACTCTAG ACTCAAGC GTGAAACC TCCTCCTCACTCGATCAT 3 TTCTCCTACTTGACTG AATGC GAACATCG CGAAGCTTTCGGTGGGA 3 ACCTTGAGCGAGTCCT TAGC TGAACG ATCCCTCCTCTGCTCAAT TCAGGGAGGGTCCTA GTTGG GCTACTGG GAGTCGATGTAATGTCA GAAGGAGGTATCGCT TCAGTGC TTGTTGGAC GGCGTAAAGGTTTTGCA TGT ATGATGCCATGAAGG TCAGC 60 Kích thƣớc To 200 60 170 55 298 55 180 55 195 55 167 55 177 55 193 55 139 55 220 55 290 55 97 55 344 55 187 55 195 55 183 55 200 55 135 55 Tt Tên mồi Ch Mb 37 RM163 5 18.9 38 RM18877 5 23.5 39 RM510 6 2.8 40 RM585 6 3.2 41 SO6065A 6 16.5 42 RM3635 7 11.1 43 SO 7053 7 15.3 44 RM455 7 22.3 45 RM337 8 0.1 46 RM152 8 0.6 47 RM310 8 5 48 RM547 8 5.5 49 RM23877 9 6.5 50 R9M30 9 14.6 51 RM215 9 20.9 52 RM171 10 2.6 53 RM 25022 10 3.6 54 R10M10 10 4.9 55 RM25271 10 10.7 Mồi xuôi Mồi ngƣợc CGCCTTTATGAGGAGGA AAACTCTTCGACACGC GATGG CTTGC ACCACTGCTGCAAAGAA GCGAGAATAAGATGA CATTGG GACACAAGAGG GTTTGACGCGATAAACC ATGAGGACGACGAGC GACAGC AGATTCC CTAGCTAGCCATGCTCTC CTGTGACTGACTTGGT GTACC CATAGGG CCCCTTCATCATTGCAAC AGTCTCTCCATCACCC TT GTCT GAGAGACAGTGGAAGGG GTTCCCTCCCTCCTCC AAGACG TAGTTCG CGAAACTTTGGGACGAA CGTCCACCATTCACTG ATG TCAC CCACAAATTAATCCGGA AGCATTGTGCAATCAC TCACACC GAGAAGG GTAGGAAAGGAAGGGCA CGATAGATAGCTAGA GAG TGTGGCC AAGGAGAAGTTCTCGCC GCCCATTAGTGACTGC CAGTGC TCCTAGTCG GACTTGTGGTTGTTGCTT ACTGCCATATGCATTT GTTGG CCCTAGC TTGTCAAGATCATCCTCG GTCATTCTGCAACCTG TAGC AGATCC TGCCACATGTTGAGAGT TACGCAAGCCATGAC GATGC AATTCG CTCACCTACCTAAAACCC CCACCCAAATCTGATA AAC CTG GAGCAGCAAGAGCAGCA CATGCTCGACTTCAGA GAGG AGCTTGG AACGCGAGGACACGTAC ACGAGATACGTACGC TTAC CTTTG ACATTCCGCGTTTGTGTG GCTTGGTAGTTGGGCT TAGC GATGG GAATACAACCCCCTAAA ATGGACCGTTGAGGA AAC GAC AGACGCTACTCCCACCT ATATCATTGCCGCAAC GTAACC ACAAGC 61 Kích thƣớc To 179 55 191 60 193 5 174 55 1 5 90 5 90 55 210 55 175 55 200 55 160 55 176 55 283 55 328 60 170 55 174 55 360 55 200 60 200 55 186 60 Tt Tên mồi Ch Mb 56 RM21 11 19.1 57 RM206 11 21.8 58 RM224 11 27.1 59 S11117C 11 60 RM7102 12 13.3 61 S12055 12 15.2 62 RM28746 12 26.4 63 RM17 12 26.9 9.5 Mồi xuôi Mồi ngƣợc ACAGTATTCCGTAGGCA GCTCCATGAGGGTGG CGG TAGAG ATCGATCCGTATGGGTTC GTCCATGTAGCCAATC TAGC TTATGTGG ATCGATCGATCTTCACGA TGCTATAAAAGGCATT GG CGGG 2 CAACCATGTCTATGATCG ATGT GGCTGTCTCCATGTTG AGGT GGGCGTTCGGTTTACTTG GGCGGCATAGGAGTG GTTACTCG TTTAGAGTGC AAACGGATTAGAGGGGA TCG GAAGAAAGAAGACGCCA AAGAAAGTTCCTTCAT GAGGCTAT CATTCCATTCCCTTCC AGAAACG TCTTCG TGCCCTGTTATTTTCTTC GGTGATCCTTTCCCAT TCTC TTCA 62 Kích thƣớc To 160 55 200 55 220 55 180 60 212 55 160 55 160 55 300 55 [...]... chống chịu mặn của lúa [20, 35] 1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn Việt Nam mới có rất ít nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn Một số giống lúa chịu mặn trồng ở các vùng ven biển Việt Nam như Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha Là những giống địa phương cho năng suất thấp Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng. .. phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali vào một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp trở lại vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp lai tạo truyền... 6, 7, 9 Trong đó 25 QTL trên nhiễm sắc thể số 4 được xác định là QTL chính quy định tính chống chịu mặn của giống [25] Đề tài Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn của tôi được tiến hành trong khuôn khổ của dự án hợp tác quốc tế VN-Đan Mạch nhằm tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam”, được thực hiện... bằng cách phân tích kiểu hình Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt 1.5 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 1.5.1 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng về năng suất,... gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali Giống lúa TCCP226-2-49-B-B-3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều Trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [19] Cho tới nay, rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến (Gregorio và cs, 2002; Negrao và cs, 2011) Một số giống lúa địa phương có... mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử mới – đó là Chọn giống trên cơ sở chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assisted BackCrossing – MABC) MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa Locut gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen mong muốn vào giống ưu tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/QTL... Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống Các giống lúa CM1, CM5, là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [1] Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long từ... này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp kéo dài 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa mới (Collard và Mackill, 2008)[12] Việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen (QTL) của tính trạng chống chịu mặn Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn bởi điều kiện môi trường ngoại... giới Trong đó trên 20% 23 giống có khả năng chịu mặn khá Các giống lúa bản địa thu thập ở khu vực vùng duyên hải Nam Á có tính chịu mặn cao chẳng hạn giống Nona Bokra, Cheriviruppu, SR26B, Solla (Ấn độ), Ketumbar (Indonesia), Khao Seetha (Thái lan), hay giống Sóc nâu (Việt nam) Đặc biệt giống Hawasi nguồn gôc từ Saudi Arabia có khả năng chịu mặn lớn hơn cả các giống chịu mặn Pokkali và Nona Bokra [17,... sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), từ năm 1977 - 1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm Những giống lúa cải tiến này cho năng ... chống chịu mặn giống [25] Đề tài Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn tiến hành khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế VN-Đan Mạch nhằm tạo giống lúa chịu ngập chìm chịu mặn thích... việc chọn tạo giống lúa chịu mặn cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, tiến hành đề tài: Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Sử dụng phương pháp. .. MABC) .20 1.5 Một số kết chọn tạo giống lúa chịu mặn .22 1.5.1 Một số kết thành tựu chọn tạo lúa chịu mặn giới 22 1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn Việt Nam tình hình chọn giống lúa chịu

Ứng dụng phương pháp MABC (marker assisted backcrossing) nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn

Thông tin tài liệu

Từ khóa liên quan

Mục lục

Hình 1. Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay 7

Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m 7

Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen

kết hợp lai trở lại (MABC) 36

Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 38

Hình 18. Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn 47

Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) 48

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam

1.1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới

1.1.2. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam

Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999

(Đơn vị tính: cm)

1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam

Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000)

Hình 1. Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay

Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng Sông Hồng

Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m

1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa

1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa

1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn

1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn

1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn

1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn

1.3. Chỉ thị phân tử

1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử

Trích đoạn

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan