ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ SAO MAI NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN TRONG THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ SAO MAI NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Cán bộ hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Khánh Trâm 2. TS. Lê Quang Hòa HÀ NỘI, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của tập thể các nhà khoa học hƣớng dẫn luận án. Các số liệu và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2015 NGHIÊN CỨU SINH Trần Thị Sao Mai LỜI CẢM ƠN Hoàn thành Luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thầy hướng dẫn: Thầy thuốc nhân dân, PGS.TS. BS. Nguyễn Thị Khánh Trâm, Cục An toàn Thực phẩm, Bộ Y tế, TS. Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình định hướng, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện Luận án. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà và các thầy cô giáo, các cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học, các thầy cô giáo của Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình trang bị kiến thức cho tôi trong suốt những năm qua. Tôi xin được cảm ơn tới các thầy cô lãnh đạo và cán bộ, nghiên cứu viên Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện giúp tôi cơ sở vật chất để thực hiện các thí nghiệm cho Luận án này. Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hỗ trợ và động viên của các thầy cô giáo lãnh đạo và cán bộ viên chức của Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, tạo điều kiện cho tôi về thời gian và vật chất, tinh thần để tôi hoàn thành khóa học, tôi xin được cảm ơn sự giúp đỡ quí báu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, Phòng Sau đại học và Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp tôi hoàn thành các hồ sơ trong suốt quá trình học tập và bảo vệ luận án. Trong suốt những năm qua, tôi luôn nhận được sự động viên, giúp đỡ về vật chất và tinh thần của gia đình, những người thân, sự đồng cảm của bạn bè, đồng nghiệp, đây là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành khóa học và Luận án này. Tôi xin được trân trọng biết ơn sự giúp đỡ quí báu đó. Hà Nội, ngày tháng 04 năm 2015 NGHIÊN CỨU SINH Trần Thị Sao Mai MỤC LỤC MỤC LỤC.................................................................................................................................1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................5 DANH MỤC HÌNH ẢNH......................................................................................................7 DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................9 CHƢƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................14 1.1.TỤ CẦU KHUẨN ................................................................................................................14 1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu vàng.......................................................... 14 1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu ................ 15 1.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu .................................................. 17 1.1.3.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới...................17 1.1.3.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam.........................................................18 1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU .......................................................................................20 1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu ......... 20 1.2.2. Cấu trúc phân tử của độc tố ruột tụ cầu ................................................... 23 1.2.3. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu .......................................... 24 1.2.3.1. Hoạt tính siêu kháng nguyên...............................................................................25 1.2.3.2. Hoạt tính gây nôn.................................................................................................26 1.2.3.3. Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu................................................27 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU ...............................29 1.3.1. Phép thử sinh học .................................................................................... 29 1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................................ 29 1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch ........................................................................... 30 1.3.3.1. Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion ) ................30 1.3.3.2. Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay) ....................30 1.3.3.3. Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA) ........31 1.3.3.4. Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA ......................................................31 1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG .......................... 33 1.4.1. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch........................................................................ 33 1.4.1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch................................................34 1.4.1.2. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký miễn dịch................................................37 1.4.1.3. Phân loại que thử nhanh ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch........................37 1 1.4.2. Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm ................................................................................................................. 40 1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA IGY..........42 1.5.1. Kháng thể lòng đỏ trứng IgY .................................................................. 42 1.5.2. Sản xuất kháng thể IgY ............................................................................ 45 1.5.3. Các phƣơng pháp tinh chế kháng thể IgY ............................................... 47 1.5.4. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán miễn dịch ........................................ 48 1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU ................................49 1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S. aureus .................................... 49 1.6.2. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu bằng phƣơng pháp tái tổ hợp ....................... 50 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................................53 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................................................54 2.2.1. Vi sinh vật và plasmid ..............................Error! Bookmark not defined. 2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm ............................................................................. 54 2.2.3. Máy, thiết bị ............................................................................................. 55 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................................56 2.3.1. Phƣơng pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp ....................... 56 2.3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S. aureus .................................................56 2.3.1.2. Khuế ch đại gen sec 1 bằng kỹ thuật PCR ...........................................................57 2.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ....................................................................................58 2.3.1.4. Xây dựng vector biểu hiện mang gen sec1 ........................................................58 2.3.1.5. Biến nạp plasmid pGS-21a-sec1 vào tế bào E. coli BL 21..............................59 2.3.1.6. Biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp.....................................................................60 2.3.1.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEC1 .....................................................................60 2.3.1.8. Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE) .....................................61 2.3.1.9. Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang ..............................61 2.3.1.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot........................................................................................................................62 2.3.2. Phƣơng pháp sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) ...................................................................... 62 2.3.2.1. Gây miễn dịch.......................................................................................................63 2 2.3.2.2. Tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng .........................................................65 2.3.3. Chế tạo que thử phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu ..................... 67 2.3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của tụ cầu.............................................................................................................67 2.3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử ................................70 2.3.4. Sử dụng que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE ....................Error! Bookmark not defined. 2.3.5. PHƢƠNG PHÁP Xử LÝ Số LIệU............................................................................72 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .......................................73 3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP ..........73 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ S. aureus ...................................................... 73 3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR ................................................. 74 3.1.3. Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec1 ............................... 75 3.1.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp..................... 77 3.1.5. Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E.coli ........... 80 3.1.6. Tinh sạch protein SEC1 tái tổ hợp............................................................ 83 3.1.7. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng phản ứng Western Blot ...................................................................................................... 85 3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IgY .....................................................86 3.2.1. Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà .................................................... 86 3.2.2. Cách gây miễn dịch và thu hoạch trứng .................................................. 87 3.2.3. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY ........................................ 88 3.3. CHẾ TẠO QUE THỬ.........................................................................................................90 3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) .................................................................................. 90 3.3.3.1. Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng.......................90 3.3.3.2. Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm .......................91 3.3.3.3. Tối ưu hóa lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng..................................92 3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử .................. 94 3.3.2.1. Xác định giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE........................................................................................................................94 3.3.2.2. Xác định tính ổn định của que thử......................................................................99 3 3.4. SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM .....................................................99 3.4.1. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm ............................ 99 3.4.1.1. Xác định độ pha loãng sữa để thử nghiệm .......................................................99 3.4.1.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm ............................................................... 100 3.4.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt đƣợc gây nhiễm thực nghiệm .......................... 104 3.4.2.1. Xác định độ pha loãng thịt để thử nghiệm...................................................... 104 3.4.2.2. Kết quả phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt được gây nhiễm thực nghiệm ........................................................................................ 105 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .................................................................................. 108 KẾT LUẬN.......................................................................................................................... 108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU..................................................... 110 LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN......................................................................................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 112 4 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT {tc "DANH M?C CÁC KÝ HI?U, CÁC CH? VI?T T?T" \f C \l 1} Ký hiệu Tên đầy đủ tiếng Anh Tên đầy đủ tiếng Việt - APC - Antigen Presenting Cell - Tế bào trình diện kháng nguyên - BSA - Bovine Serum Albumin - Albumin huyết thanh bò - CFU - Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc - CNS - Coagulase negative staphylococci - Tụ cầu không sinh coagulase - ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ gắn enzym - Fab - Fragment of antigen binding - Mảnh gắn kháng nguyên - Fc - Fragment crystalizable - Mảnh kết tinh - FCA - Freud’s Complete Adjuvant - Tá dƣợc Freud hoàn toàn - FIA - Freud’s Incomplete Adjuvant - Tá dƣợc Freud không hoàn toàn - GALT - Gut Associated Lymphoid Tisue - Mô limpho ở ruột - GI - Gastrointestinal - Dạ dày-ruột - GST - Glutathione-S-Transferase - HPLC - High-Performance Liquid - Sắc ký lỏng cao áp Chromatography - HLA-DR1 - Human Leukocyte Antigen serotype DR1 - HTSKMD - Hệ Thống Sắc Ký Miễn Dịch - IPTG -IsoPropyl-β-D-ThioGalactopyranoside - kDa - Kilo Dalton - MCP-1 - Monocyte Chemoattractant Protein 1 5 - MHC-II - Major histocompatibility complex - NĐTP - Phức hợp tƣơng thích mô chính - Ngộ độc thực phẩm - PBS - Phosphate Buffered Saline- - Muối đệm phosphate - PCR - Polymerase Chain Reaction - PEG - Polyetylen Glycol - RNA - Ribonucleic acid - Axit ribonucleic - RPLA -Reversed Passive Latex Aggulutination - Kỹ thuật ngƣng kết hạt latex - SE - Staphylococcal Enterotoxin - Độc tố ruột tụ cầu - SPA - Staphylococcus aureus Protein A - Protein A của tụ cầu - TCR - T-Cell antigen Receptor - Thụ thể của tế bào T - TNF - Tumor Necrosis Factor - Yếu tố hoại tử khối u - TSST - Toxic Shock Syndrome Toxin - TSST-1 - Toxic Shock Syndrome Toxin-1 - VSATTP - Độc tố gây hội chứng sốc do độc - Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm 6 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. S. aureus dƣới kính hiển vi ..................................................................................15 Hình 1.2. S. aureus nuôi cấy trên môi trƣờng Baird Parker .............................................15 Hình 1.3. Tác nhân trong các vụ NĐTP từ năm 2007 đến năm 2012 ..............................20 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các độc tố ruột SEA, SEB, SEC2, SED ...................23 Hình 1.5. Mô hình tƣơng tác của SE với thụ thể tế bào T và với phân tử MHC II ....... 26 Hình 1.6 . Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu ..............................................28 Hình 1.7. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch ..................................................34 Hình 1.8. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi ......................................................................................39 Hình 1.9. Sắc ký miễn dịch cạnh tranh .................................................................................40 Hình 1.10. Sự hình thành kháng thể IgY..............................................................................44 Hình 1.11. Cấu trúc phân tử của IgG thỏ và IgY gà ...........................................................45 Hình 2.1. Sơ đồ vector biểu hiện pGS-21a...........................................................................53 Hình 2.2. Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu........................................68 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quy trình chế tạo que thử .......................................72 Hình 3.1. Điện di đồ DNA tổng số tách từ S. aureus..........................................................73 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2%..............................................74 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch .......................................................75 Hình 3.4. Ảnh điện di plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn ..............76 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen sec1 ...................................................77 Hình 3.6. Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E.coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp........................................................................................................................................77 Hình 3.7. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau ..................................................81 Hình 3.8. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các điều kiện IPTG khác nhau......................................81 Hình 3.9. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau ................82 Hình 3. 10. Điện di đồ khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 tan của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở 30oC.................................................................................84 Hình 3.11. Điện di đồ protein SEC1 tinh sạch ở các nồng độ imidazol khác nhau ..........84 Hình 3.12. Kết quả chất lƣợng protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot ....86 7 Hình 3.13. Điện di đồ kháng thể IgY sau mỗi bƣớc tinh sạch ...........................................88 Hình 3.14. Lựa chọn lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng. ..............................91 Hình 3.15. Lựa chọn lƣợng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm ................................92 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của lƣ ợng kháng nguyên cộng hợp đế n cƣờng đô ̣ tin u vạch thƣ̉ ̣ ́ hiê nghiê ̣m......................................................................................................................................93 Hình 3.17. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA ......................................................94 Hình 3.18. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB ......................................................95 Hình 3.19. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 .....................................................96 Hình 3.20. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED ......................................................97 Hình 3.21. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE ......................................................97 Hình 3.22. Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cần sử dụng .............................................. 100 Hình 3.23. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên sữa .................................... 101 Hình 3.24. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên sữa..................................... 101 Hình 3.25. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên sữa ................................... 102 Hình 3.26. . Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên sữa .................................. 103 Hình 3.27. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên sữa ..................................... 103 Hình 3.28. Lựa chọn nồng độ pha loãng thịt cho que thử ............................................... 105 Hình 3.29. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên thịt..................................... 105 Hình 3.30 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên thịt ..................................... 106 Hình 3.31. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên thịt.................................... 106 Hình 3.32. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên thịt..................................... 107 Hình 3.33. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên thịt ...................... 104 8 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thống kê các vụ NĐTP từ năm 2009 đến năm 2013 ở Việt Nam ..................19 Bảng 1.2. Những đặc điểm và vị trí di truyền của các gen mã hóa của các SE ...............22 Bảng 1.3. Phân loại độc tố dựa vào việc so sánh trình tự axit amin .................................24 Bảng 1.4. Các bộ sinh phẩm thƣơng ma ̣i đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ngể đphát hiện các SE .................32 Bảng 1.5. So sánh kháng thể IgG ở thỏ và IgY ở gà ..........................................................43 Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA ..........................................................64 Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên các SE .......................................................64 Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA.................................................94 Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB .................................................95 Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1................................................96 Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED.................................................96 Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE .................................................97 Bảng 3.6. Tính ổn định của que thử phát hiện SE(A+B+C1+D+E) ..................................99 Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên sữa ............................... 101 Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên sữa................................ 101 Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên sữa .............................. 102 Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên sữa ............................. 102 Bảng 3.11. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên sữa.............................. 103 Bảng 3.12. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên thịt ............................. 105 Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên thịt.............................. 106 Bảng 3.14. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên thịt ............................ 106 Bảng 3.15. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên thịt ............................. 107 Bảng 3.16. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt .............................. 107 9 MỞ ĐẦU Việc đảm bảo chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe con ngƣời. Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) là một trong những mối lo ngại lớn trên toàn thế giới. Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Mỹ ƣớc tính mỗi năm tại Mỹ xảy ra khoảng 76 triệu ca NĐTP với 325 nghìn ngƣời phải nhập viện và khoảng 5 nghìn ngƣời chết. Các tác nhân chính gây NĐTP bao gồm hóa chất, vi sinh vật, độc tố tự nhiên, ... Tuy nhiên, ghi nhận từ thực tế các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy tác nhân vi sinh vật khá phổ biến, trong đó Staphylococcus aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu, cho đến nay vẫn còn là một vấn đề nan giải. Nguyên nhân của NĐTP do tụ cầu là ngƣời bị ngộ độc đã tiêu thụ các độc tố ruột tụ cầu (staphylococcal enterotoxin - SE) tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên. Cho đến nay, 21 loại độc tố ruột tụ cầu (SE) đã đƣợc thống kê, trong số đó, 5 loại SE bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE đƣợc biết là nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm. Các vụ NĐTP do độc tố tụ cầu là một trong những mối nguy cơ thƣờng trực đối với ngƣời tiêu dùng. Các loại thực phẩm dễ bị nhiễm độc do S. aureus bao gồm các thực phẩm giàu đạm nhƣ thịt, sữa, thủy sản, trứng, phô mai, rau, củ, quả, bánh kẹo ... Theo các số liệu thống kê chƣa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế, trong những năm gần đây ở nƣớc ta mỗi năm có hàng trăm vụ NĐTP với hàng nghìn ngƣời mắc, trong đó có nhiều ca nặng phải nhập viện và không ít các trƣờng hợp đã tử vong. Bên cạnh đó, còn nhiều trƣờng hợp NĐTP không đƣợc thống kê vì những lý do khác nhau. NĐTP có thể xảy ra ở tất cả các nƣớc trên thế giới, các vùng miền trong mỗi nƣớc. Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới, nóng, ẩm, nguồn thực phẩm lại dồi dào nên là môi trƣờng tốt cho vi khuẩn phát triển, trong đó có S. aureus. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, để phát hiện độc tố ruột tụ cầu, ngƣời ta thƣ ờng sử dụng các sinh phẩ m thƣơng m ại dựa trên kỹ thuâ ̣t ELISA nhƣ RIDASCREEN SET (R-Biopharm, Darmstadt, Đức) và VIDAS (BioMérieux, Marcy L´Etoile, Pháp). Quy trình phân tích 10 khi sử dụng các bộ sinh phẩm này cũng khá phức tạp, chỉ phù hợp với các phân tích tại phòng thí nghiệm. Những sinh phẩ m này thƣờng s ử dụng kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng từ thỏ hoặc từ chuột. Tuy nhiên, vùng Fc của kháng thể IgG từ thỏ và chuột phản ứng mạnh và không đặc hiệu với protein A của S. aureus nên có thể gây ra hiê ̣n tƣơ ̣ng dƣơng tính gi ả khi sƣ̉ du ̣ng các bô ̣ sinh phẩ m này . Mă ̣t khác , giá thành b ộ sinh phẩ m cao, thời gian xét nghiệm thƣờng kéo dài từ 2 đến 3 giờ và yêu cầu kỹ thuật viên có trình đô ,̣ đó cũng là các yếu tố hạn chế sự ứng dụng của các b ộ sinh phẩ m này ở Việt Nam. Do vâ ̣y, cần phát triển một phƣơng pháp phân tić h sàng lọc m ới, có giá thành thấ p, thời gian phân tích ngắn, thực hiện đơn giản và tránh đƣơ ̣c hiê ̣n tƣơ ̣ng dƣơng tính giả. Sắc ký miễn dịch là một trong những kỹ thuật có triển vọng nhất để tạo ra những bộ sinh phẩm đáp ứng đƣợc những yêu cầu trên. Theo sự hiểu biết của chúng tôi, cho đến thời điểm này, trên thế giới vẫn chƣa có que thử thƣơng mại nào phát hiện nhanh cả 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE). Vì thế, việc phát triển một hệ thống sắc ký miễn dịch có khả năng phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm là rất cấp thiết, giúp đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các sản phẩm lƣu hành trong nƣớc và sản phẩm thực phẩm xuất khẩu. Từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm”. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trong thực phẩm. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Sản xuất và tinh sạch độc tố ruột tụ cầu tái tổ hợp SEC1 và ứng dụng để phát triển que thử; - Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA và kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) và ứng dụng để tạo que thử; 11 - Tối ƣu hóa lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng, vạch thử nghiệm của que thử và lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng trên que thử; - Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của que thử; - Xây dựng quá trình chuẩn bị mẫu của một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt); - Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của que thử trên một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt) đƣợc gây nhiễm thực nghiệm. Điểm mới của luận án Đã có nhiều nghiên cứu về S.aureus và các độc tố của chúng nhƣng việc nghiên cứu, chế tạo thành công que thử để phát hiện nhanh các độc tố của S.aureus trong thực phẩm ở nƣớc ta thì đây là một kết quả mới, cụ thể nhƣ sau: - Sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp SEC1; sản xuất đƣợc kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) làm nguyên liệu tạo que thử phát hiện các SE. - Đã xây dựng và hoàn thiện đƣợc quy trình tạo que thử dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để phát hiện nhanh 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên một số nhóm thực phẩm (sữa và thịt) ở trong phòng thí nghiệm. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài Việc xác định S. aureus trong thực phẩm ở nƣớc ta hiện nay chủ yếu dựa vào việc phát hiện và định lƣợng vi khuẩn S. aureus có phản ứng coagulase dƣơng tính. Phƣơng pháp này cần nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm với thời gian để trả lời kết quả khoảng 3- 4 ngày nhƣng chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm có vi khuẩn S. aureus hay không mà không phát hiện đƣợc độc tố ruột tụ cầu do vi khuẩn này tiết ra, là nguyên nhân gây NĐTP. Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án giúp giải quyết hạn chế nói trên. Sử dụng các que thử đã phát hiện đƣợc các độc tố ruột tụ cầu với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ sử dụng, không cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền. Mặt khác, các nguyên liệu chính để sản suất que thử (kháng nguyên cộng hợp và các kháng thể) đều đƣợc nhóm nghiên cứu 12 chủ động tạo ra, do đó làm hạ giá thành sản phẩm nhiều lần so với giá thành các bộ kít nhập ngoại hiện nay. Kết quả của đề tài luận án tạo sản phẩm mới, ứng dụng xác định nhanh ô nhiễm độc tố staphylococcus trong thực phẩm, phục vụ trong kiểm soát an toàn thực phẩm. Cấu trúc của luận án Luận án ngoài phần mở đầu, kết luận, kiến nghị và phần phụ lục, phần chính gồm 3 chƣơng với 23 bảng; 47 hình: - Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu - Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu - Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận 13 CHƢƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1.TỤ CẦU KHUẨN Tụ cầu khuẩn (Staphylococci) là một trong những vi khuẩn gây bệnh đƣợc ghi nhận sớm nhất, từ đầu những năm 1880. Tụ cầu phân bố rộng rãi trong tự nhiên và thƣờng ký sinh trên da và các hốc tự nhiên của ngƣời, động vật (ở bò, cừu, gà, thỏ, chó, lợn,..) [2]. Cho tới nay, đã có 50 loài tụ cầu đƣợc phát hiện [44]. Trong đó nhiều loài là những tụ cầu khuẩn cộng sinh và một vài loài là những vi khuẩn gây bệnh giới hạn. Trên phƣơng diện gây bệnh, tụ cầu đƣợc chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase [113]. Các đại diện quan trọng của tụ cầu có coagulase là: tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Staphylococcus intermedius. Trong các vi khuẩn Gram dƣơng, S. aureus là loài vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp nhất và kháng lại kháng sinh mạnh nhất, đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc thức ăn, gây nhiễm trùng bệnh viện, … Ngƣợc lại, tụ cầu không có coagulase là thành phần của hệ vi khuẩn bình thƣờng của da và niêm mạc. Hai đại diện có vai trò quan trọng trong y học của nhóm này là S. epidermidis (tụ cầu da) gây nhiễm khuẩn cơ hội và S. saprophyticus gây nhiễm khuẩn tiết niệu [7]. 1.1.1. Đặc điểm sinh học{tc "I.2.1.1. Đ?c đi?m sinh h?c" \f C \l 4} của tụ cầu vàng * Hình dạng và kích thước: Tụ cầu vàng là những cầu khuẩn có đƣờng kính từ 0,8 - 1,0 μm, xếp lại với nhau thành hình chùm nho, bắt màu Gram dƣơng (Hình 1.1), không có lông, thƣờng không có vỏ, không sinh bào tử [1]. * Nuôi cấy: Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, chúng phát triển đƣợc ở nhiệt độ từ 7 - 48,5°C, (khoảng tối ƣu từ 30-37°C), pH từ 4,2- 9,3, (khoảng tối ƣu từ 7 7,5), thích hợp đƣợc ở cả điều kiện hiếu và kỵ khí, phát triển tốt ở nồng độ muối cao tới 10%, thậm chí ở nơi nồng độ muối tới 20% vi khuẩn vẫn có thể sinh trƣởng chậm [44]. Trên môi trƣờng BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trƣng của tụ cầu vàng có màu đen nhánh, bóng, lồi, đƣờng kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng từ 2- 5 mm (Hình 1.2). 14 Hình 1.1. S. aureus dưới kính hiển vi Hình 1.2. S. aureus nuôi cấy trên môi trường Baird Parker (Nguồn:glogster.com) (Nguồn:microbiologyinpictures.com) * Đặc tính sinh hóa: Tụ cầu vàng có hệ thống enzym phong phú, những enzym đƣợc dùng trong chẩn đoán là coagulase, catalase, deoxyribonuclease, phosphatase...[1, 7, 56]. Trong đó coagulase có khả năng làm đông huyết tƣơng ngƣời và động vật khi đã đƣợc chống đông. Đây là đặc tính quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác. 1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu Sự sản sinh độc tố ruột của tụ cầu đã đƣợc nghiên cứu trong điều kiện thí nghiệm và trong nhiều loại thực phẩm khác nhau. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh SE gồm: nhiệt độ, hoạt độ nƣớc (aw), nồng độ muối, độ pH, glucose, sự cạnh tranh của vi sinh vật, tùy từng loại thực phẩm và sự biểu hiện của gen agr. Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh SE là 10oC và nhiệt độ tối đa là 48oC. Khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sản xuất độc tố của tụ cầu là 35-40oC, nhiệt độ 37oC thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy [73]. Đối với hoạt độ nƣớc, aw thích hợp cho tụ cầu sản sinh ra độc tố là từ 0,87 đến 0,99; tối ƣu là 0,98 [73]. 15 Nồng độ muối cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và khả năng sản xuất độc tố của tụ cầu. Độ thẩm thấu thấp là một trong những nguyên nhân làm tăng sự sản xuất độc tố. Nồng độ muối tối đa cho sự sản xuất độc tố là dƣới 12%, nhƣ vậy nếu nồng độ muối từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố tụ cầu sẽ bị ức chế [73]. Nếu pH trung tính là điều kiện thích hợp nhất cho quá trình hình thành các SE thì ở điều kiện pH axit, sự hình thành SE sẽ bị giảm hay bị ức chế. Khoảng pH để sản xuất độc tố từ 5,1 đến 9,0 và thông thƣờng sự sản xuất SE bị ức chế ở pH nhỏ hơn 5 [70]. Tại một pH nhất định, các chất đƣợc sử dụng để axit hóa môi trƣờng có thể có tác dụng nhiều hơn hoặc ít hơn đến việc sản xuất độc tố của tụ cầu. Ví dụ, axit axetic có tác dụng ức chế hơn so với axit lactic trong việc sản xuất SE [77]. Ngoài ra, glucose cũng là một trong những thành phần ức chế sự tạo ra độc tố, đặc biệt là sự tạo độc tố SEB và SEC, do sự chuyển hóa glucose làm giảm độ pH [107 ]. S. aureus rất nhạy với vi sinh vật cạnh tranh. Khi trong thực phẩm có mặt các sinh vật cạnh tranh khác, vi khuẩn này chỉ sinh trƣởng mà không sinh độc tố. Genigeorgis (1989) đã chứng minh rằng khi trong sữa có các vi sinh vật cạnh tranh với mật độ cao thì sẽ ức chế sự sinh trƣởng cũng nhƣ tạo độc tố của tụ cầu [Trích theo 107]. Sự cạnh tranh với các vi khuẩn sinh axit lactic cũng đƣợc nghiên cứu ở phomat, sữa và xúc xích lên men [81, 95]. Điều này có thể liên quan tới sự hình thành axit lactic làm giảm độ pH, sự hình thành peroxide và đôi khi do sự tổng hợp một số kháng sinh đã ức chế quá trình sinh trƣởng của S. aureus. Các độc tố thƣờng đƣợc tụ cầu tạo ra nhiều hơn trong các thực phẩm giàu protein nhƣ thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa [Trích theo 68]. Những thực phẩm này đều có nhiều yếu tố tƣơng đối phù hợp với sự sinh trƣởng và phát triển của tụ cầu nhƣ độ pH, các chất dinh dƣỡng, muối, nồng độ ôxy và nhiệt độ môi trƣờng. Tụ cầu cần có những axit amin khác nhau cho quá trình sinh trƣởng và sản sinh độc tố [107]. Ví dụ: Valine cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của S. aureus, Arginine và Cystine cần cho cả quá trình sinh trƣởng phát triển lẫn việc sản sinh độc tố [77, 107]. 16 Gen agr điều hòa hầu hết các yếu tố độc lực của tụ cầu. Khi nồng độ glucose và độ pH thấp thì có tác dụng ức chế sự biểu hiện của gen agr. Ngoài ra, ở điều kiện độ pH kiềm cũng làm giảm biểu hiện của gen agr dẫn đến việc giảm sự sản sinh ra các độc tố SEB, SEC và SED [74, 77, 89]. Khi các chủng vi khuẩn tụ cầu vốn mang gen mã hóa các độc tố ruột SE phát triển đến một số lƣợng nhất định trong thực phẩm (khoảng 106 CFU/g, ml), chúng có thể tiết ra một lƣợng độc tố đủ để gây ra hiện tƣợng ngộ độc cho ngƣời tiêu dùng [Theo 51, 107]. 1.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu 1.1.3.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới Tính đến năm 2003, có khoảng 250 loại bệnh truyền qua thực phẩm đã đƣợc xác định và vi khuẩn là tác nhân gây ra 2/3 các vụ NĐTP [107]. Trong số đó, tụ cầu là một trong những tác nhân gây ngộ độc phổ biến nhất. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đƣợc định nghĩa là sự tiêu thụ các SE, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên [78]. Một số vụ ngộ độc trên thế giới: vụ NĐTP lớn đầu tiên đƣợc ghi nhận do sử dụng phomai bị nhiễm độc tố ruột tụ cầu, đã xảy ra vào năm 1884 ở Michigan, Mỹ. [45]. Sau đó là vụ NĐTP ở Pháp vào năm 1894 do dùng thức ăn là thịt bò bị nhiễm độc tố này. Các thống kê về dịch tễ học tại Pháp trong hai năm 1999-2000 chỉ ra rằng S. aureus là tác nhân gây NĐTP đứng hàng thứ hai, chỉ sau Salmonella [42]. Năm 2000, mô ̣t vụ ngộ độc thực phẩm do sử dụng thịt lợn và thịt hun khói nhiễm độc tố tụ cầu đã xảy ra ở Đức làm 297 ngƣời phải nhâ ̣p viê ̣n [16]. Tại Nhật Bản, một vụ ngộ độc với quy mô lớn làm ảnh hƣởng đến 13.420 ngƣời đã xảy ra do tiêu thụ sữa nƣớc tách béo và sữa chua đƣợc chế biến từ sữa bột có nhiễm SEA vào tháng 6 năm 2000 [14]. Theo thống kê năm 2011 của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh Mỹ ƣớc tính hàng năm tại nƣớc này có khoảng 240.000 trƣờng hợp mắc bệnh với 1000 ca nhập viện và 6 trƣờng hợp tử vong có liên quan đến NĐTP do tụ cầu [54]. Ƣớc tính mỗi ca NĐTP do tụ cầu tiêu tốn 695 USA, nâng tổng số thiệt hại ở Mỹ lên tới 167.597.860 USA mỗi năm do các vụ NĐTP [54]. 17 Ngưỡng gây ngộ độc: Ngƣỡng gây ngộ độc của các SE ở ngƣời hiện nay vẫn chƣa đƣợc xác định một cách chính xác. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều gây ngộ độc ở ngƣời của SEA là khoảng 1 µg, ở một số trƣờng hợp chỉ cần 20 – 100ng cũng đủ để gây ra hiện tƣợng ngộ độc [49]. Đặc biệt, trong một vụ ngộ độc do uống sữa sôcôla có chứa SEA, lƣợng độc tố đƣợc xác định chỉ có 0,5 ng/ml [38]. Loại độc tố, 5 loại SE bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE đƣợc biết là nguyên nhân chủ yếu gây NĐTP. Theo thống kê ở Anh từ năm 1969 đến 1990, 79% các ca ngộ độc có nguyên nhân gây ngộ độc do SE: chỉ riêng độc tố SEA (56,9%), cả hai độc tố SEA và SED (15,4%), SEB (3,4%), SEC (2,5%), cả SEB và SED (1,1%) [111]. Thống kê từ các nghiên cứu khác cũng cho thấy độc tố ruột SEA cũng là loại độc tố phổ biến nhất: Pháp (69,7%) [57], Mỹ (77,8%) [22] và Hàn Quốc (90%) [23]. Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc: các loại thực phẩm liên quan tới các vụ ngộ độc do S. aureus bao gồm các sản phẩm thịt, cá, trứng và sữa vốn đều là các thực phẩm giàu đạm. Tại Anh, 75% các vụ NĐTP do S. aureus gây ra gắn liền với các sản phẩm từ thịt; 8% do các sản phẩm từ sữa; 7% từ các sản phẩm cá và 3,5% từ trứng [107]. Tại Pháp, các sản phẩm sữa lại là nguyên nhân chính gây ra ngộ độc, chiếm tới 32%; các loại thịt 31%; xúc xích và các loại bánh 15%; các sản phẩm cá và hải sản khác 11%; trứng 11% [107]. Một nghiên cứu năm 2001 cho thấy 15% các trƣờng hợp NĐTP tụ cầu tại 8 nƣớc phát triển do đã sử dụng các sản phẩm từ sữa, đặc biệt, ở Pháp tỷ lệ này là 85% [31]. Tại Mỹ, 47% các vụ ngộ độc gắn liền với các sản phẩm thịt; 12% do các loại rau; 5% do mỳ ống và chỉ có 1,4% do các sản phẩm sữa và hải sản [69]. 1.1.3.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam Theo các số liệu thống kê, các vụ NĐTP trong vòng 5 năm gần đây ở Việt Nam của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế (Bảng 1.1), số vụ NĐTP trên cả nƣớc dao động từ 148-175 vụ, với 4700-5676 ngƣời mắc, từ 3663- 4700 ngƣời nhập viện, số ca tử vong từ 27- 51 ca [112]. Trong báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 vừa đƣợc Bộ Y tế công bố, điều đáng chú ý là số ngƣời chết do NĐTP tăng cao. Tính đến ngày 30/6/2014, toàn quốc ghi nhận có 90 vụ NĐTP với 2636 ngƣời mắc, 2035 ngƣời nhập 18 viện và 28 trƣờng hợp tử vong. Tuy nhiên, các số liệu này chỉ thống kê tới những vụ NĐTP với quy mô lớn hoặc những trƣờng hợp ngộ độc nặng phải nhập viện. Số ca NĐTP trong thực tế có thể lớn hơn nhiều lần số lƣợng trên. Bảng 1.1. Thống kê các vụ NĐTP từ năm 2009 đến năm 2013 ở Việt Nam Năm Số vụ NĐTP Số ngƣời mắc Số ngƣời nhập viện 4137 Số ca tử vong 2009 152 5212 35 2010 175 5676 3978 51 2011 148 4700 3663 27 2012 168 5541 4335 34 2013 160 5238 4700 28 Nguồn [112] Về các tác nhân gây NĐTP: theo thống kê của Cục An toàn Thực phẩm từ năm 2007 đến 2012, các tác nhân chính của các vụ NĐTP bao gồm: vi sinh vật (chiếm từ 7,8% đến 45,8%), hóa chất (chiếm từ 0,5% đến 10,8%), độc tố tự nhiên (19,1% đến 27,1%) và không rõ tác nhân (21,4% đến 71,1%) (Hình 1.3). Số liệu này cho thấy trong các vụ NĐTP ở nƣớc ta thì tác nhân do vi sinh vật chiếm gần một nửa. Những loại vi khuẩn thƣờng gây ra các vụ ngộ độc ở nƣớc ta bao gồm Salmonella, Streptococcus, E. coli và S. aureus [112]. Các vụ NĐTP xảy ra ở tất cả các vùng, chiếm tỷ lệ cao nhất là miền núi phía Bắc, với trung bình 19,8 -36,3% số vụ/năm, số vụ xảy ra tại bếp ăn gia đình là cao nhất với 48,6 - 60,6% số vụ/năm. Những thức ăn là nguyên nhân gây NĐTP đƣợc xác định là: thực phẩm hỗn hợp, thịt và các sản phẩm từ thịt, thủy sản, rau, củ quả, bánh kẹo, … [112]. 19 Hình 1.3. Tác nhân trong các vụ NĐTP từ năm 2007 đến năm 2012 [112] Tuy chƣa có một nghiên cứu có hệ thống nào về tình hình nhiễm các độc tố SE trong các thực phẩm ở nƣớc ta nhƣng với điều kiện khí hậu nóng ẩm và ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của ngƣời dân chƣa cao thì có thể một phần không nhỏ các trƣờng hợp NĐTP là do nhiễm các SE. Trƣớc tình hình đó, bên cạnh các biện pháp tuyên truyền nhằm nâng cao ý thức của ngƣời dân về vệ sinh an toàn thực phẩm, việc kiểm tra phát hiện nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm SE trên thị trƣờng đóng vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. 1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU 1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu Cho đến nay, ngƣời ta đã thống kê đƣợc có ít nhất 21 loại SE, bao gồm: các SE từ SEA đến SEE, SEG đến SEI, SER đến SET có hoạt tính gây nôn, các protein giống độc tố ruột của tụ cầu (Staphylococcus Enterotoxin like - SEl) không có hoạt tính gây nôn khi thử trên linh trƣởng (SElL và SElQ) hoặc chƣa đƣợc kiểm tra (SElJ, SElK, SElM đến SElP, SElU, SElU2 và SElV). Các SE và SEl đƣợc chia thành nhóm cổ điển (SEA đến SEE) và nhóm mới (SEG đến SElU2) [65]. 20 Các SE có bản chất là những chuỗi protein đơn có khối lƣợng phân tử thấp (khoảng từ 22 đến 29 kDa). Mỗi loại SE đều có những yếu tố quyết định kháng nguyên chuyên biệt. Các độc tố này dễ tan trong nƣớc và trong các dung dịch muối. Đặc biệt, các SE đƣợc mô tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và không bị protease thông thƣờng nhƣ pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain,… thủy phân, vì thế chúng giữ nguyên đƣợc cấu trúc trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời [107]. Ví dụ: SEA có thể không bị bất hoạt ở 121°C trong 10 phút với nồng độ lớn (> 100 ng/g nấm ăn) [39]. Khả năng chịu nhiệt cao này của các SE là một trong những tính chất đáng lƣu ý nhất góp phần làm tăng nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Trong quá trình chế biến thực phẩm, nếu nguyên liệu bị nhiễm một chủng S. aureus có khả năng sinh độc tố và các điều kiện chế biến có lợi cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn cũng nhƣ sự sản sinh độc tố của vi khuẩn này thì một lƣợng lớn SE sẽ đƣợc tích tụ trong thực phẩm đó, ngay cả khi sản phẩm đƣợc xử lý với nhiệt độ để tiệt trùng trƣớc khi sử dụng thì thực phẩm đó vẫn có nguy cơ gây ngộ độc. Các gen mã hóa SE có vị trí rất khác biệt trên thể gen của S. aureus. Bảng 1.2 dƣới đây thể hiện điều này một cách chi tiết. Tất cả các gen se và sel mã hóa lần lƣợt các SE và SEl đều có đặc điểm quan trọng là nằm trên các yếu tố di truyền phụ, bao gồm các plasmid, prophage và các vùng gây bệnh nhỏ của S. aureus (SaPIs), vùng gen vSa hoặc bên cạnh các vùng nhiễm sắc của tụ cầu (Bảng 1.2). Hầu hết trong số chúng là các yếu tố di truyền di động, do đó chúng có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của tác nhân gây bệnh này. Đối với S. aureus, hai loại plasmid đặc trƣng mang se và sel đã đƣợc liệt kê (Bảng 1.2) là plasmid pIB485 và pF5. Các SaPI là những vùng gây bệnh có kích thƣớc từ 15-17 kb, ngoại trừ SaPIbov2 (27 kb) và một SaPI bị thoái hóa (3.14 kb) [65]. 21 Bảng 1.2. Những đặc điểm và vị trí di truyền của các gen mã hóa của các SE Khối lƣợng (kDa) Cấu trúc bậc ba Hoạt tính gây nôn 1 1 SEA 27,1 + + sea 2 1 SEB 28,4 + + 1 SEC seb 27,5-27,6 + + 1 SED sec 26,4 + + 1 SEE sed 26,4 Nd + 1 SEG see 27,0 + + 1 SHE seg 25,1 + + seh 24,9 + + sei 9 1 SEI 1 SElJ 28,5 Nd Nd selj 10 1SElK 26,0 + Nd selk 11 SElL 26,0 Nd -a 1SElM sell 24,8 Nk Nd selm SElN 26,1 Nd Nd seln 14 1SElO 26,7 Nd Nd selo 15 SElP 27,0 Nd nda 1SElQ selp 25,0 Nd - selq SER 27,0 Nk + ser 18 SES 26,2 Nd + ses 19 SET 22,6 nd + 20 SElU 26,7-27,1 nd Nd 21 SElV 25,0 nd Nd pF5 S egc2 (vSaß III); egc3 selu egc4 S egc4 selv TT 3 4 5 6 7 8 12 13 16 17 Loại S tố độc 22 Gen set Yếu tố di truyền phụ S S S S ØSa3ms, ØSa3mw, Ø252B, ØNM3, ØMu50a, pZA10, SaPI3 SaPIn1, SaPIm1, SaPImw2, SaPIbov1 pIB485-like S ØSab S egc1 (vSaß I); egc2 (vSaß III); egc3; egc4 S MGEmw2/mssa47 6 seh/∆seo S egc1 (vSaß I); egc2 (vSaß III) ); egc3 S pIB485-like; pF5 FSa3mw, S SaPI1,FSa3ms, SaPI3, SaPIbov1, SaPI5 S SaPIn1, SaPIm1, SaPImw2, SaPIbov1 S egc1 (vSaß I); egc2 (vSaß III) S egc1 (vSaß I); egc2 (vSaß III); egc3; egc4 egc1 (vSaß I); egc2 (vSaß S III); egc3; egc4; MGEmw2/mssa476 seh/∆seo S FN315, FMu3A S FSa3ms, FSa3mw, SaPI1, SaPI3, SaPI5 S pIB485-like; pF5 S pF5 S Chú thích: +: có; - : không; nd: chưa xác định; a: hoạt động nôn xác định ở thỏ (SElL) hoặc ở chuột chù nhà (SElP) mà không phải ở linh trưởng; b: vị trí giả định [65]. 1.2.2. Cấu trúc phân tử của độc tố ruột tụ cầu Các nghiên cứu về cấu trúc của SE đã chỉ ra rằng phân tử của chúng có cấu trúc bậc 3 giống nhau [36]. Hình 1.4 dƣới đây minh họa cấu trúc của các độc tố tụ cầu SEA, SEB, SEC2 và SED. Chúng có một đuôi nhỏ N, xoắn anpha kết nối với một nếp gấp β đƣợc gọi là miền B hoặc nếp gấp liên kết oligosaccharide (O/B). Nếp gấp O/B nối với nếp gấp β bởi một vùng A có dạng xoắn anpha chéo ở trung tâm [64]. Tất cả các siêu kháng nguyên đều có đặc điểm này. Tuy nhiên, một số siêu kháng nguyên có cấu trúc sai khác nhƣ có thêm các nếp gấp nhỏ. Điều đáng chú ý nhất trong cấu trúc của độc tố là nếp gấp cystein đƣợc tìm thấy trong nhiều độc tố ruột cũng nhƣ trong độc tố ruột A gây sốt của liên cầu (SPE A). Vai trò của nếp gấp cystein chƣa đƣợc biết rõ nhƣng ngƣời ta đã chứng minh đƣợc chính những nếp gấp cystein này giúp ổn định cấu trúc phân tử và có thể góp phần vào việc kháng sự phân giải protein [35, 47]. Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các độc tố ruột SEA, SEB, SEC2, SED [36] Trình tự các nucleic của gen seg của tụ cầu, gen ssa của độc tố liên cầu (siêu kháng nguyên liên cầu) và gen speA (độc tố A gây sốt liên cầu) có mức tƣơng đồng 23 cao. Sự tƣơng đồng này chỉ ra rằng rất có thể độc tố của S. aureus và của liên cầu đã tiến hóa từ một gen độc tố tổ tiên chung, hoặc đã có sự trao đổi vật liệu di truyền giữa hai vi sinh vật này [40]. Gần đây, các protein SEI, SElK, SElL, SElQ đã đƣợc xác định rằng đều có vòng cystein. Chúng có các đặc điểm nhƣ các siêu kháng nguyên, nhƣng hoạt tính gây nôn giảm đáng kể ở SEI và thiếu ở SElK và SElQ [64]. Các độc tố SEA, SEB, SEC, SED, SEE và SEH có khả năng gây nôn ít hoặc nhiều, tùy thuộc vào loại độc tố. Các SE đƣợc phân loại thành 5 nhóm dựa vào việc so sánh trình tự axit amin giữa chúng (Bảng 1.3). Sự tƣơng đồng giữa các SE thể hiện ở 15% axit amin đƣợc hoàn toàn bảo tồn và hầu hết chúng nằm trên vùng trung tâm và đầu C của các độc tố. Nhóm 1 bao gồm: SEA, SED, SEE, SElJ, SElN, SElO, SElP và SES. Nhóm 2 bao gồm SEB, SEC1, SEC2 và SEC3, SEG, SER, SelU và SelU2. Nhóm 3 bao gồm SEI, SElK, SElL, SElM, SElQ và SElV. Nhóm 4 và nhóm 5, mỗi nhóm chỉ có duy nhất một độc tố, lần lƣợt là SET và SEH [65]. Bảng 1.3. Phân loại độc tố dựa vào việc so sánh trình tự axit amin [65] Nhóm Các độc tố ruột của tụ cầu Nhóm 1 SEA, SED, SEE SElJ, SElN, SElO, SElP, SES Nhóm 2 SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SEG, SER , SElU, SElU2 Nhóm 3 SEI, SElK, SElL, SElM, SElQ, SElV Nhóm 4 SET Nhóm 5 SEH 1.2.3. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu Các SE thuộc họ độc tố gây sốt có nguồn gốc từ các loài tụ cầu và liên cầu. Các độc tố gây sốt này bao gồm các SE và độc tố gây sốt liên cầu A và B [63]. Mặc dù các độc tố này liên quan tới các tác nhân gây bệnh khác nhau nhƣng chúng có chung hoạt tính sinh học: gây sốt, kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lƣợng tế bào T không chuyên biệt. Những hoạt tính này đƣợc gọi là hoạt tính siêu kháng nguyên (superantigen). Bên cạnh những đặc điểm chung này, chỉ riêng các SE có hoạt tính gây 24 nôn [107]. Hoạt tính siêu kháng nguyên và hoạt tính gây nôn đƣơ ̣c quyế t đinh ̣ bởi 2 vùng protein ri êng biệt nhƣng sự liên hệ giữa hai hoạt tính này vẫn chƣa đƣợc làm rõ [43]. Tuy nhiên, trong hầu hết trƣờng hợp, hai hoạt tính này tồn tại song song nhau, những đột biến làm mất hoạt tính siêu kháng nguyên cũng làm mất hoạt tính gây nôn [53]. 1.2.3.1. Hoạt tính siêu kháng nguyên Năm 1960, Bergdoll và cộng sự là những ngƣời đầu tiên đã phát hiện đƣợc hoạt tính siêu kháng nguyên ở vi khuẩn [Trích theo35]. Dựa vào các đặc tính của độc tố ruột gồm hoạt tính siêu kháng nguyên và hoạt tính gây nôn, họ đã phân lập đƣợc một độc tố tiết ra bởi S. aureus và gọi là độc tố ruột tụ cầu A (SEA) [35]. Tuy nhiên, thuật ngữ siêu kháng nguyên chỉ đƣợc sử dụng từ năm 1989, khi Marrack và cộng sự quan sát, các tế bào T phát triển tràn lan khi các độc tố này đƣợc nhận diện bởi các chuỗi Vß chuyên biệt của thụ thể thuộc tế bào T [63]. Các siêu kháng nguyên là những chất gây phân bào, nhất là đối với tế bào T [86]. Với các kháng nguyên thông thƣờng, sự xuất hiện phức hợp MHC II (major histocompatibility complex- II) trên các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen presenting cell - APC) cần đƣợc tạo ra bởi 5 yếu tố khác nhau của thụ thể tế bào T (T- cell receptor- TCR) là Vβ, Dβ, Jβ, Vα và Jα [10, 104]. Ngƣợc lại, các siêu kháng nguyên đƣợc nhận ra chủ yếu bởi phần Vβ của TCR. Các SE liên kết trực tiếp với các phân tử MHC II ở các rãnh liên kết kháng nguyên peptit bên ngoài các APC (Hình 1.5). Các SE liên kết với các MHC II, sau đó chúng có thể liên kết với các tế bào T thông qua TCR một cách "không đặc hiệu", chỉ qua vùng biến đổi Vβ trên TCR, chúng tạo một liên kết chéo giữa vùng biến đổi Vβ và protein MHCII. Phức hợp này không phụ thuộc vào liên kết peptit với thụ thể tế bào T. Sự tƣơng tác giữa ba phân tử: MHCII - SE - TCR dẫn đến một sự giải phóng không kiểm soát các chất cytokine nhƣ: IFN- γ, TNF-α, IL-1ß, IL-6 và IL-8, là nguyên nhân chính gây viêm cấp tính và sốc [19, 104]. Thông thƣờng, các tế bào T chỉ đƣợc hoạt hóa một cách đặc hiệu với kháng nguyên nhƣng khi các tế bào này tƣơng tác với các SE thì đã xảy ra sự phát triển quá độ, chủ yếu là Th1 và Th17 [21, 102], cả hai đều có liên quan đến phản ứng viêm cấp tính. Thêm vào đó là sự chết tế bào và thiếu hụt các đáp ứng từ 25 tế bào T [43], hệ quả là có một phản ứng miễn dịch yếu đối với độc tố. Sự ức chế miễn dịch của tế bào T và tế bào B dẫn tới sự suy giảm đáp ứng miễn dịch với các tác nhân xâm nhập khác [18, 104]. Do đó, cơ thể có thể sẽ không phản ứng với một chất hoặc yếu tố gây bệnh mà cơ thể đã có đáp ứng miễn dịch trƣớc đó. Các siêu kháng nguyên có thể kích thích khoảng 20% tổng số các tế bào lympho T, trong khi kháng nguyên thông thƣờng chỉ hoạt hóa 0,1% các tế bào này [13]. Mặt khác, sự tổng hợp và giải phóng quá mức cytokin là phản ứng gây ra các hậu quả nghiêm trọng nhất của các siêu kháng nguyên, dẫn đến sốc, hạ huyết áp, ngừng hoạt động của các cơ quan khác nhau và có thể dẫn đến tử vong [66, 67]. Tử vong ở ngƣời lớn khỏe mạnh là hiếm (0,03%) nhƣng tỷ lệ tử vong là cao hơn ở trẻ em, ngƣời già và ngƣời lớn suy giảm miễn dịch và cũng có thể phụ thuộc vào nồng độ của các độc tố tiêu hóa [36]. Hình 1.5. Mô hình tương tác của SE với thụ thể tế bào T và với phân tử MHC II Ghi chú: SE một mặt gắn với Vβ của TCR, một mặt gắn với MHC-II nên có thể kích hoạt cả tế bào APC và tế bào T, dẫn tới việc sản xuất các cytokine của cả hai loại tế bào [104]. 1.2.3.2. Hoạt tính gây nôn Hoạt tính gây nôn không đƣợc mô tả rõ nhƣ hoạt tính siêu kháng nguyên do thiếu mô hình động vật phù hợp. Linh trƣởng là động vật lý tƣởng để nghiên cứu hiệu ứng nôn của các SE, nhƣng do chi phí nghiên cứu là khá cao và tồn tại một số vấn đề về đạo đức sinh học nên khó đƣợc thực hiện. Trong một nghiên cứu về ảnh hƣởng của 26 SE gây viêm ruột ở khỉ Macaca mulatta, ngƣời ta nhận thấy 0,9 μg độc tố/kg cơ thể đã đạt đƣợc 50% liều gây độc dẫn tới nôn ở loài khỉ này [100]. Bên cạnh đó, khi lợn sữa sử dụng ống thông cho độc tố SEA vào ruột thì sau 90 đến 180 phút, lợn này xảy ra các triệu chứng nhƣ buồn ngủ, bồn chồn, mất tạm thời của các phản xạ thăng bằng, bỏ ăn và nôn. Liều gây nôn 50% là 40-50 μg cho lợn sữa 4,1 đến 9,1 kg và 20 μg cho lợn sữa từ 0,9 đến 2,3 kg [98]. Ngoài ra, một loài động vật khác đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu là chuột chù xạ hƣơng (chuột chù nhà). Sau hai giờ cho chuột uống hoặc tiêm các độc tố ruột vào màng bụng thì chuột có phản ứng nôn [48]. Các nghiên cứu của Hu và các cộng sự cho thấy: ruột non là vị trí kích thích nôn khi thí nghiệm với độc tố SEA và dƣờng nhƣ liên quan đến hội chứng serotonin (hydroxytryptamine – 5, 5-HT) [49]. Serotonin là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng, đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa và có thể kích hoạt tế bào thần kinh ruột, tăng nhu động ruột và tăng sự bài tiết. Một nghiên cứu gần đây cho thấy amino acid ở vị trí 227 (Aspartic) của SEA đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính gây nôn. Khi thay thế Aspartic bởi Alanine ở vị trí này thì SEA bị mất hoạt tính gây nôn [50]. 1.2.3.3. Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu Lớp tế bào biểu mô đƣờng ruột tạo thành hàng rào bảo vệ cơ thể khỏi sự tác động của một lƣợng lớn các kháng nguyên từ thức ăn, vi khuẩn và virus. Các phản ứng miễn dịch với các SE gây ra viêm dạ dày ruột. Điều này dẫn đến sự tăng tính thấm của biểu mô đƣờng ruột và giảm sự biểu hiện của các protein khác. Các SE có thể vƣợt qua hàng rào biểu mô nguyên vẹn, tăng tiếp xúc với các tế bào T. Đại thực bào (tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt) cũng đƣợc kích hoạt bởi các SE để giải phóng các yếu tố hoạt hóa bạch cầu trung tính và các cytokine [32, 33]. Đối với các tế bào mô xơ hóa (tế bào trình diện kháng nguyên không chuyên biệt) trên biểu mô ruột, khi chúng đƣợc kích hoạt bởi các SE gắn trên MHC – II cũng sản xuất các cytokine tiền viêm nhƣ IL-6, IL-8 và TNF-α [85]. Nghiên cứu của Victor E.Reyes năm 2010 đã cho rằng SEA có thể vƣợt qua một lớp đơn của các tế bào biểu mô đƣờng ruột và liên kết với MHC-II ở trên các mô xơ hóa của biểu mô ruột, sản xuất MCP-1 cùng với các cytokine tiền viêm đề cập ở trên [104]. Các kết quả từ nghiên cứu 27 này cũng cho thấy rằng MCP-1 có thể đƣợc tham gia vào hóa hƣớng của tế bào lympho nhƣ minh họa trên Hình 1.6. Hình 1.6 . Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu [104] Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu thực hiện thông qua các hiệu ứng siêu kháng nguyên của SE khi chúng gắn trên MHC lớp II đƣợc trình diện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên, nhƣ các đại thực bào, các tế bào tua (các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt), các tế bào mô xơ hóa (tế bào trình diện kháng nguyên không chuyên biệt - myofibroblast) và TCR biểu hiện bởi các tế bào T CD4+ [104]. Các SE có thể vƣợt qua hàng rào biểu mô đƣờng ruột ở dạng nguyên vẹn và liên kết với các phân tử MHC lớp II ở trên myofibroblast. Các quá trình này sẽ dẫn đến sự sản xuất mạnh mẽ của các cytokine tiền viêm và chemokine, bao gồm IL - 6, IL - 8 và MCP - 1, làm tăng tính hƣớng hóa của các tế bào miễn dịch chuyên biệt (CD4 +, tế bào T, đại thực bào) từ mô bạch huyết ruột – GALT (gut asociated lymphoid tisue) tới các vị trí viêm dạ dày - ruột (GI) do độc tố tụ cầu. Sự tƣơng tác với MHC lớp II của các SE - TCR có thể gây kích hoạt mạnh đối với các APC và các tế bào T, dẫn đến sự gia 28 tăng quá mức của các tế bào T và sự giải phóng không kiểm soát các cytokine tiền viêm và các chemokine khác, gây ra viêm và sốc cấp tính [104, 18]. 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU Để phát hiện SE trong thực phẩm, có thể sử dụng phép thử sinh học, phƣơng pháp sinh học phân tử hoặc các phƣơng pháp miễn dịch. 1.3.1. Phép thử sinh học Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng gây các triệu chứng điển hình nhƣ nôn , tiêu chảy trên các động vật thí nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào . Thông thƣờng, các SE sẽ đƣợc tách chiết từ thƣ̣c phẩ m bằ ng các dung dịch đệm thích hơ ̣p , trải qua bƣớc tinh chế bằ ng phƣơng pháp sắc ký, sau đó cho dịch chiết độc tố này vào dạ dày động vật hoặc tiêm vào màng bụng: cho vào dạ dày khỉ bằng đƣờng ống thông , cho chuột chù nhà và mèo uống hoặc tiêm vào màng bụng chúng [48, 100]. Tiếp theo, tiế n hành theo dõi các triê ̣u chƣ́ng lâm sàng của động vật thí nghiệm. Nế u thấ y xuất hiện các biểu hiện điể n hin ̀ h nhƣ tiêu chảy, nôn thì có thể kế t luâ ̣n là thƣ̣c phẩ m bi ̣nhiễm các SE . Tuy nhiên, liều lƣợng SE tối thiểu cần sử dụng trong các phép thử sinh học là khoảng 200 ng [104], cao hơn nhiề u so với liều gây ngộ độc thực phẩm ở ngƣời (20 – 100ng) [51]. Vì vậy, phƣơng pháp phát hiện độc tố tụ cầu bằng phép thử sinh học không đủ nhạy để kiểm nghiệm thực phẩm đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Ngoài ra, vì lý do đạo đức sinh họ c, hiện nay việc sử dụng các động vật để thí nghiệm đang bị hạn chế. 1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử Các phƣơng pháp sinh học phân tử thƣờng sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen mã hóa các độc tố SE trong thực phẩm dựa trên các trình tự mồi chuyên biệt cho các gen mã hóa độc tố SE. Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần đây là real-time PCR [25, 12, 110]. Các phƣơng pháp này có ƣu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện nhanh Staphylococcus tạo độc tố với một lƣợng mẫu nhỏ. Hơn nữa, có thể phát hiện đƣợc cả những tế bào sinh độc tố đã chết, điều này rất quan trọng trong việc phân tích các mẫu thực phẩm đã xử lí nhiệt liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm. Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của loại phƣơng pháp này là nó chỉ cho biết sự có mặt hay không của các gen mã hóa SE 29 trong thực phẩm mà không cho biết sự biểu hiện của các gen này. 1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch Hiện nay, phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất để phát hiện SE trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch , nhờ tƣơng tác đă ̣c hiê ̣u giƣ̃a kháng nguyên và kháng thể. 1.3.3.1. Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion ) Phƣơng pháp khuếch tán trên gel dựa vào các tƣơng tác đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể là phƣơng pháp đầu tiên trong phòng thí nghiệm có thể xác định các SE. Từ những năm 1950, các phƣơng pháp khuếch tán trên gel đƣợc phát triển nhƣ phƣơng pháp khuếch tán trên gel đơn [80], phƣơng pháp ống khuếch tán gel khép [75], phƣơng pháp đĩa [79] và phƣơng pháp khuếch tán trên gel microslide [29]. Phƣơng pháp microslide là phƣơng pháp nhạy nhất trong các phƣơng pháp khuếch tán trên gel. Áp dụng kỹ thuật khuếch tán trên gel microslide để phát hiện các SE cần nồng độ độc tố tối thiểu là 30-60 ng SE trong mỗi gam thực phẩm [90]. Do đó, tinh sạch bằng sắc ký và cô đặc mẫu phân tích đƣợc áp dụng để đạt đƣợc nồng độ SE có thể phát hiện đƣợc bởi kỹ thuật này. Phƣơng pháp khuếch tán trên gel đƣợc Hiệp hội các nhà phân tích (Asssociation of Analytical Communities - AOAC) coi là tiêu chuẩn cho việc đánh giá các phƣơng pháp mới [90]. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là ít nhạy khi lƣợng độc tố cần phát hiện ở mức tối thiểu và đòi hỏi ngƣời đọc kết quả phải có kinh nghiệm. 1.3.3.2. Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay) Kĩ thuật miễn dịch phát phóng xạ (RIA) là phƣơng pháp đầu tiên có độ nhạy cao (0,6 – 6 ng kháng thể/ml) đƣợc sử dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm. Trong phƣơng pháp này, độc tố đƣợc đánh dấu bằng 125 I [91]. Dịch chiết thực phẩm đƣợc cho vào cùng với kháng thể chuyên biệt trong một ống nhựa nhỏ trƣớc khi thêm độc tố đƣợc đánh dấu. Sau đó, xác định lƣợng độc tố trong dịch chiết thực phẩm bằng cách đo tính phóng xạ của chất kết tủa [103, 91]. Hiện nay, phƣơng pháp này không còn đƣợc sử dụng nữa vì đã có những phƣơng pháp mới hơn không cần dùng những vật liệu có tính phóng xạ. 30 1.3.3.3. Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA) Kỹ thuật ngƣng kết hạt latex (RPLA) đƣợc ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm cũng nhƣ phát hiện độc tố trong những dòng tụ cầu. Trong kỹ thuật này, hạt nhựa đƣợc phủ kháng thể của độc tố trƣớc khi cho vào giếng [87]. Dịch chiết m ẫ u thực phẩm đƣợc cho vào giếng để tạo phản ứng. Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngƣng kết, màng đƣợc tạo thành dƣới đáy giếng, còn nếu không có độc tố thì không xảy ra ngƣng kết, do đó phản ứng tạo thành giọt ở đáy giếng. Lƣợng độc tố đƣợc xác định nhờ xác định hiệu giá kháng thể cao nhất mà ở đó còn xảy ra phản ứng ngƣng kết. Kỹ thuật này đủ nhạy để phát hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc, cũng nhƣ trong việc phát hiện những dòng tụ cầu tạo ra lƣợng độc tố thấp (10-20 ng/ml) mà phƣơng pháp khuếch tán trên gel không phát hiện đƣợc. Bộ kit thƣơng mại SET-RPLA của công ty Denka Seiken, Tokyo, Nhật Bản đang đƣợc bán tại Mỹ phát hiện đƣợc các SE SEA, SEB, SEC và SED [44]. 1.3.3.4. Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA Nguyên lý của phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể vốn đƣợc cố định trên một phiến nhựa (giá đỡ pha rắn) và việc sử dụng phản ứng enzym - cơ chất sẽ gây chuyển màu, qua đó để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện. Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm (RIDASCREEN, TECRA, TRANSIA và VIDAS). Nguyên tắc hoạt động của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Đầu tiên , mô ̣t kháng thể đă ̣c hiê ̣ u nhâ ̣n biế t SE sẽ đƣơ ̣c cố đinh ̣ lên bề mă ̣t của mô ̣t giế ng nhƣ̣a. Sau quá triǹ h rƣ̉a để loa ̣i bỏ các kháng thể không đƣơ ̣c cố đinh ̣ , mẫu phân tích sẽ đƣợc đƣa vào giếng . Nế u nhƣ trong mẫu phân tích có SE , khi đó sẽ xảy ra phả n ứng giữa SE với kháng thể cố định ở giếng , tạo phức hợp kháng thể cố định - SE. Sau quá trình rửa để loại bỏ các liên kết không đặc hiệu , mô ̣t kháng thể thƣ́ hai gắ n enzym và cũng có khả năng nhận biết đặc hiệu SE đƣợc đƣa vào giế ng để ta ̣o ra mô ̣t phƣ́c hơ ̣p mới kháng thể cố đinh ̣ - SE - kháng thể gắn enzym. Tiế p đó, lại thực hiện quá trình rửa để loại bỏ phân tử kháng thể gắn enzym dƣ còn sót lại trong giếng . Cuố i cùng, cơ chấ t của en zym đƣơ ̣c đƣa vào giế ng . Dƣới tác du ̣ng của enzym , cơ chấ t sẽ chuyể n hóa 31 thành sản phẩm có màu . Nhƣ vâ ̣y, dƣ̣a vào viê ̣c xuấ t hiê ̣n màu có thể phát hiê ̣n đƣơ ̣c SE trong mẫu phân tić h . Đối với một số bộ sinh phẩm , cƣờng đô ̣ màu sẽ tỷ lệ thuận với nồ ng đô ̣ SE trong mẫu phân tić h . Do vâ ̣y, bằ ng cách lâ ̣p đƣờng chuẩ n , có thể định lƣơ ̣ng đƣơ ̣c SE trong thƣ̣c phẩ m . Dƣới đây là các bộ sinh phẩm thƣơng mại trên thị trƣờng thế giới đang dùng để phát hiện các SE. Bảng 1.4. Các bộ sinh phẩm thương mại được sử dụng để phát hiện SE các[97] Thời gian phân Nguyên lý phân Độ tích nhạy(ng/ml) ELISA kẹp đôi dùng các đĩa vi giế ng chuẩn 0,2-0,7 2,5 Staphylococcal Enterotoxin ELISA kẹp đôi (SET) Identification TECRA3 dùng đĩa vi giế ng 1 4 ELISA kẹp đôi Staphylococcal Enterotoxin trong các đĩa vi (SET A-E) TECRA giế ng chuẩn 1 4 Bioenterprises ELISA kẹp đôi Transia Tube Staphylococcal dùng các ống nhƣ Enterotoxins A, B, C, D, E pha rắn 0,1 1 Diffchamb ELISA kẹp đôi trong các đĩa vi giế ng chuẩn 0,1 2 Diffchamb 1 1,5 BioMérieux Tên bộ sinh phẩm 3 Ridasreen SET A, B, C, D, E Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins A, B, C, D, E Vidas (SET) Staph enterotoxin ELISA kẹp đôi tự động Nhà sản xuất tích (giờ) R-Biopharm Bioenterprises Toàn bộ quy trình phân tích để phát hiện các SE thƣờng kéo dài từ 1 đến 4 giờ tùy theo bộ sinh phẩm . Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động 32 từ 0,1-1 ng/ml dịch mẫu phân tích, cho phép phát hiện đƣợc SE ở nồng độ rất thấp [60]. Tuy nhiên , nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả , đồ ng thời, các bộ sinh phẩm này cũng cần các kỹ thuật viên có tay nghề cao khi sử dụng để tránh hiện tƣợng dƣơng tính giả nên yêu cầu này hạn chế đáng kể khả năng phân tích tại hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Để đáp ứng nhu cầu phát hiện các SE trong các thực phẩm tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh SE. Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật ELISA, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Đỗ Phúc đã chế tạo kháng thể đa dòng kháng độc tố SEA từ thỏ và sử dụng kháng thể này để chế tạo bộ sinh phẩm ELISA nhằm phát hiện SEA trong thực phẩm [8]. Khi so sánh với bộ sinh phẩm chuẩn của hãng TECRA, quy trình ELISA này cho độ tƣơng đồng về mặt kết quả là 95,5%. Năm 2008, Nguyễn Hoàng Minh và nhóm nghiên cƣ́u đã phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật ELISA kẹp đôi để phát hiện SEA trong các sản phẩm thịt và sữa. Về độ đặc hiệu, bộ sinh phẩm đã đƣợc chứng minh là không có các phản ứng chéo với các loại độc tố khác nhƣ SEB, SEC1, SED và SEE. Về độ nhạy, bộ sinh phẩm có thể phát hiện đƣợc SEA với ngƣỡng xác định khoảng 1 ng/ml sữa tiệt trùng, tƣơng đƣơng với các bộ sinh phẩm hiện đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng [5]. Một ƣu điểm nổi bật khác của bộ sinh phẩm này là kết quả có thể đƣợc phân tích bằng mắt thƣờng cần sử dụng các máy đọc ELISA chuyên dụng , không , nên có thể đƣợc ứng dụng tại hiện trƣờng. Năm 2011, các bộ sinh phẩm này đã đƣợc sản xuất thử nghiê ̣m ở quy mô phòng thí nghiệm và thƣ̉ nghiê ̣m liên phòng ta ̣i ba phòng thí nghiê ̣m khác nhau . Các kế t quả thƣ̉ nghiê ̣m cho thấ y đố i với mẫu nem chua , đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u tƣơng đố i của bộ sinh phẩm đều đạt 100%, trong khi đó với các mẫu sƣ̃a tiê ̣t trùng có độ nhạy 100%, còn độ đặc hiệu là 83,3%. Các kết quả thử nghiệm bƣớc đầu này cho thấy tính chính xác của bộ sinh phẩm ELISA trong điều kiện phân tích tại hiện trƣờng là phụ thuộc vào kỹ thuật viên và chất nền (sữa hay nem chua). 1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG 1.4.1. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 33 1.4.1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch Hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng có cấu trúc gồm các hợp phần đƣợc biểu diễn trong Hình 1.7 dƣới đây [88]: Hình 1.7. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch HTSKMD thiết kế theo kiểu truyền thống bao gồm một số vùng, thƣờng đƣợc cấu thành bởi các phân đoạn làm từ các vật liệu khác nhau, gồm có: Điểm tra mẫu (sample pad), miếng giữ kháng thể cộng hợp (conjugate), màng nitrocellulose, giấy thấm (absorbent pad) và tấm lót plastic (Plastic adhesive backing card). Hệ thống này đƣợc tạo thành với các thành phần gối lên nhau: điểm tra mẫu đƣợc xếp gối lên miếng giữ kháng thể cộng hợp, rồi miếng này đƣợc xếp chồng dính với màng nitrocellulose, các hợp phần đó đƣợc đặt trên một tấm lót có chứa keo để gắn các hợp phần, chất keo này nhạy cảm với áp suất. Điểm tra mẫu (Sample pad) Điểm tra mẫu có chức năng là đƣa chất cần phân tích vào hệ thống và lọc mẫu, loại bỏ các chất không tan, chỉ cho các chất hòa tan trong mẫu đi qua và thẩm thấu lên màng chứa chất cộng hợp màu. Ngoài ra, điểm tra mẫu ở một số que thử còn chứa các chất nhƣ đệm ổn định mẫu, các chất hoạt động bề mặt, loại các muối, các chất có khả năng phong bế nhằm hạn chế sự tƣơng tác không đặc hiệu của điểm tra mẫu hoặc của chất cộng hợp màu với chất cần phân tích. Vật liệu làm miếng tra mẫu thƣờng là cellulose, sợi thủy tinh hoặc polyetylen[88]. Miếng giữ kháng thể cộng hợp (conjugate) 34 Miếng giữ kháng thể cộng hợp là nơi chứa chất chỉ thị để nhận biết kết quả của phản ứng, thƣờng là kháng thể đơn dòng, cộng hợp vàng, cộng hợp nanocarbon,...và bảo quản, giải phóng kháng thể cộng hợp có màu khi thực hiện phép phân tích mẫu một cách có hiệu quả. Khi dòng dung dịch mẫu chảy qua, toàn bộ chất trong mẫu và cộng hợp màu đều bị rửa trôi hoàn toàn trên màng nitrocellulose. Màng có tính trơ với các hóa chất và không có khả năng liên kết protein. Màng chứa chất cộng hợp thƣờng làm từ vật liệu là màng sợi thủy tinh hoặc polystyren không thấm nƣớc. Giấy thấm Giấy thấm có chức năng hút chất lỏng ra khỏi màng nitrocellulose, tạo dòng thẩm thấu một chiều, không cho dòng quay ngƣợc trở lại, dung dịch đi từ điểm tra mẫu dọc theo chiều dài que thử đi lên phía giấy thấm, với tốc độ dòng thích hợp. Dòng thẩm thấu chạy trong que thử chỉ dừng lại khi giấy thấm đã hút đầy dung dịch mẫu. Vật liệu dùng làm giấy thấm thƣờng là cellulose, polyester, các loại len,.... [76, 88]. Tấm lót plastic Tấm lót plastic có tác dụng nhƣ một giá đỡ để dán các hợp phần lên trên, hình thành một tấm hoàn chỉnh có thể cắt thành que thử. Nhiệm vụ của tấm lót plastic là để tăng tính bền, dễ thao tác đồng thời đảm bảo sự tiếp xúc chính xác giữa các hợp phần trong HTSKMD nhằm tạo ra dòng chuyển động thích hợp dƣới tác dụng của lực mao dẫn. Bề mặt tấm lót plastic đƣợc phủ một lớp keo rất đặc biệt, mỏng và đều. Vật liệu chế tạo tấm lót phải là các vật liệu trơ về mặt hóa học với các hóa chất sử dụng trong que thử, có bản chất là cellulose cứng [88]. Màng nitrocellulose Màng nitrocellulose là nơi gắn các kháng thể cố định để tạo thành vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng và có chức năng dẫn mẫu, các kháng thể, kháng nguyên di động chạy trên bề mặt của màng. Việc lựa chọn loại màng nitrocellulose cũng có ý nghĩa quan trọng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phép phân tích. Màng nitrocellulose liên kết với các protein bằng lực hút tĩnh điện giữa ester nitrat với các liên kết peptid trong phân tử protein. Khả năng liên kết của màng nitrocellulose đƣợc quyết định bởi diện tích bề mặt tiếp xúc của màng. Chỉ số này lại phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ kích 35 thƣớc lỗ, mật độ lỗ, độ dày màng, đặc tính vật lý của màng. Do màng nitrocellulose có ái lực lớn với protein nên trong một số trƣờng hợp phải phong bế màng (blocking trên màng ) để giảm thiểu các liên kết không đặc hiệu của mẫu phân tích và kháng thể cộng hợp đối với vạch thử nghiệm cũng nhƣ để giảm thiểu tín hiệu nền trên màng. Quá trình phong bế thƣờng đƣợc thực hiện bằng cách nhúng màng nitrocellulose vào các dung dịch protein hay các chất có hoạt tính bề mặt nhƣ: các loại protein (casein, gelatin, BSA,...) và đƣờng cao phân tử [88]. Các thành phần tham gia Có 3 loại kháng thể thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký miễn dịch: - Kháng thể phát hiện hay kháng thể cộng hợp (conjugate antibody): là kháng thể kháng lại với một epitop của kháng nguyên cần phân tích; kháng thể phát hiện thƣờng đƣợc gắn với các hạt nano vàng, nano carbon hay hạt cao su có màu. Hiện nay, hạt vàng (colloidal gold particle) có màu đỏ hay đƣợc sử dụng nhất trong các hệ thống sắc ký miễn dịch [88]. Tuy nhiên, giá thành của hạt vàng hiện vẫn rất cao. Một giải pháp là có thể sử dụng hạt nano carbon để tạo kháng thể cộng hợp. Ƣu điểm chính của hạt nano carbon là có giá thành thấp, có màu đen, do vậy tạo tín hiệu có tính tƣơng phản cao với màng nitrocellulose giúp làm tăng độ nhạy của phép phân tích. - Kháng thể vạch thử nghiệm (test line antibody hay capture line antibody): là kháng thể kháng lại một epitop khác của cùng kháng nguyên cần phân tích, đƣợc cố định lên màng nitrocellulose. Độ nhạy của que thử và độ nét của vạch thử nghiệm phụ thuộc nhiều vào nồng độ, khả năng bắt giữ của kháng thể vạch thử nghiệm. Trong trƣờng hợp kháng thể vạch thử nghiệm liên kết với màng không tốt hoặc các liên kết không đặc hiệu trên màng không đƣợc phong bế thì vạch thử nghiệm sẽ không nét, bị phân tán. - Kháng thể vạch kiểm chứng (control line antibody): là kháng thể kháng lại kháng thể cộng hợp, có nguồn gốc khác loài với kháng thể cộng hợp. Vạch kiểm chứng cho biết hoạt động của que thử bình thƣờng. Nếu không xuất hiện vạch kiểm chứng thì điều đó chứng tỏ que thử đã lỗi, kết quả không chính xác, cần phải tiến hành 36 lại thí nghiệm với một que thử khác, pha loãng mẫu phân tích hoặc kiểm tra lại quy trình chuẩn bị mẫu. 1.4.1.2. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký miễn dịch Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thực hiện dựa trên sự di chuyển của chất lỏng và sự tƣơng tác đặc hiệu với ái lực cao giữa kháng nguyên và kháng thể [88]. Sắc ký miễn dịch là một hệ thống phân tích đơn giản (thƣờng đƣợc sản xuất dƣới dạng que thử nhanh) cho phép phát hiện nhanh các tác nhân cần phân tích trong các mẫu thử. Trên que thử, kháng thể hoặc kháng nguyên đƣợc cố định dƣới dạng các vạch ở một số vị trí xác định. Khi đƣợc đƣa vào hệ thống sắc ký miễn dịch, mẫu thử chứa kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc trộn với một kháng thể cộng hợp có màu hoặc kháng nguyên cộng hợp có màu (thƣờng là kháng thể hoặc kháng nguyên đƣợc gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon), tạo thành một phức hợp kháng nguyên – kháng thể có màu và phức hợp này sẽ dịch chuyển dọc theo màng nitrocellulose nhờ tác dụng của lực mao dẫn. Phức hợp này khi di chuyển trên màng nitrocellulose đến vị trí cố định kháng thể hay kháng nguyên sẽ bị giữ lại và tạo ra tín hiệu màu có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng, nhờ đó cho phép phát hiện đƣợc sự có mặt của kháng nguyên cần xác định. 1.4.1.3. Phân loại que thử nhanh ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch Kỹ thuật sắc ký miễn dịch có nguyên lý của phản ứng miễn dịch nhƣ của kỹ thuật ELISA và có rất nhiều biến thể nhƣng thƣờng đƣợc chia làm hai loại chính là kỹ thuật kẹp đôi (sandwich assay) và kỹ thuật cạnh tranh (competitive assay). * Phản ứng theo dạng sandwich (sandwich assay) Que thử dạng này thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các chất phân tích có bản chất protein, có phân tử lƣợng lớn với nhiều vị trí gắn kháng nguyên nhƣ hCG, kháng nguyên Dengue, Hemoglobine,...[88] Chất cần phân tích vừa liên kết đƣợc với kháng thể cộng hợp màu, vừa liên kết đƣợc với kháng thể tại vạch thử nghiệm. Tại vị trí vạch thử nghiệm, cố định một kháng thể thứ hai có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phát hiện (khác với kháng thể cộng hợp có màu). Nếu các độc tố có mặt trong mẫu phân tích, chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp, tạo thành phức hợp kháng 37 nguyên - kháng thể cộng hợp có màu. Dƣới tác dụng của lực mao dẫn, dung dịch sẽ chuyển dịch đến vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng rồi di chuyển về phía giấy thấm hút lên trên que thử. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ bị giữ lại nhờ liên kết của kháng thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên. Sự xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa SE. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân tích, thì sẽ xuất hiện hai vạch màu. Ngƣợc lại chỉ có một vạch màu trong trƣờng hợp âm tính. Hình 1.8, thể hiện nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả của phản ứng theo dạng sandwich. Ƣu điểm của sắc ký miễn dịch kẹp đôi là độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng tới hai kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên ở những vị trí khác nhau. Tuy nhiên, phƣơng pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi không phải lúc nào cũng thực hiện đƣợc vì cần sử dụng hai kháng thể nhận biết hai vị trí kháng nguyên khác nhau khi không bị cản trở bởi không gian. Hơn nữa, nhƣợc điểm của nó là khó có khả năng phát hiện đƣợc cả 5 loại độc tố tụ cầu phổ biến hiện nay: SEA, SEB, SEC, SED, SEE, do trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể nào có thể bắt cặp với cả 5 loại kháng nguyên trên. 38 Hình 1.8. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi * Phản ứng theo dạng cạnh tranh (competitive assay): Que thử theo dạng này đƣợc sử dụng khi cần phát hiện các phân tử nhỏ với tính quyết định kháng nguyên duy nhất, mà không thể liên kết với 2 kháng thể cùng một lúc, ví dụ nhƣ các loại que thử chẩn đoán các loại thuốc gây nghiện, các steroid,... Chất phân tích sẽ di chuyển nhanh và cạnh tranh liên kết với chất cộng hợp màu tại vạch thử nghiệm. Tại vị trí vạch thử nghiệm, một kháng thể có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phát hiện đƣợc cố định. Trong trƣờng hợp này, cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon. Nếu độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch di chuyển về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng hợp sẽ tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm của que thử. Sự xuất hiện vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không có chứa SE. Ngƣợc lại, nếu trong mẫu phân tích có SE thì chúng cạnh tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm. Sự không xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa SE. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân 39 tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu. Ngƣợc lại sẽ có hai vạch màu trong trƣờng hợp mẫu âm tính. Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả của phản ứng theo dạng cạnh tranh trong Hình 1.9. Hình 1.9. Sắc ký miễn dịch cạnh tranh Ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh là đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một kháng thể. Hiện nay, trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể thƣơng mại nào có thể bắt cặp với cả 5 loại độc tố tụ cầu (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) nên nếu sử dụng phƣơng pháp miễn dịch cạnh tranh, chỉ cần sử dụng một kháng thể có khả năng liên kết đặc hiệu với 5 loại độc tố tụ cầu trên thì đã có thể phát triển đƣợc que thử sắc ký miễn dịch phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu phổ biến này. Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng ƣu điểm đó để tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu chỉ dựa trên một kháng thể IgY kháng (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). Ngƣợc lại, nhƣợc điểm của sắc ký miễn dịch cạnh tranh là độ nhạy thấp hơn so với sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi do sử dụng chỉ một kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên. 1.4.2. Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm Gần đây, một số nghiên cứu phát triển que thử ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện các SE trong thực phẩm đã đƣợc công bố [20, 109]. 40 Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự đã sử dụng que thử dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi để phát hiện độc tố ruột SEB của tụ cầu trong sữa và các sản phẩm của sữa với nồng độ thấp nhất từ 0,25 ng/ml tới nồng độ cao nhất có thể phát hiện là 50 µg/ml, trong 20 phút [20]. Các thực phẩm đƣợc kiểm tra bao gồm sữa có 2% chất béo, sữa có hƣơng liệu và các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa nhƣ sữa chua, sữa cho trẻ sơ sinh và kem. Các tác giả đã nhận thấy việc sử dụng que thử sắc ký miễn dịch để kiểm tra SEB trong các sản phẩm từ sữa đã giảm thiểu thời gian chuẩn bị mẫu. Các mẫu sữa (sữa 2% chất béo, sữa cho trẻ sơ sinh) có thể không cần pha loãng vì có khả năng chảy một cách dễ dàng vào que thử, còn các mẫu sữa và sản phẩm của sữa (sữa socola, kem, sữa chua) cần đƣợc pha loãng để có thể chảy đƣợc trên que thử. Điều thú vị là, mặc dù trong sữa chua có chất phụ gia là hoa quả, màu thực phẩm và có chứa chất béo nhƣng điều đó cũng không ảnh hƣởng đến sự phát hiện SEB. Trong các thử nghiệm phát hiện SEB này, màu trên que thử đã không bị nhạt đi khi để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút. Báo cáo của Boyle cho thấy việc sử dụng thành công kỹ thuật sắc ký miễn dịch trong việc phát hiện nhanh sự có mặt của SEB trong sữa và sản phẩm của sữa [20]. Năm 2013, Keiko Yamada đã công bố nghiên cứu tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện SEA trong sữa và sản phẩm của sữa dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi [109]. Trong nghiên cứu này, kháng thể gà IgY đa dòng kháng độc tố SEA tái tổ hợp đƣợc in lên vạch thử nghiệm của que thử sắc ký miễn dịch, kháng thể gà IgY đơn dòng kháng SEA tái tổ hợp đƣợc dùng làm kháng thể cộng hợp gắn keo vàng. Để chuẩn bị các mẫu mô phỏng độc tố trong thực phẩm, 102 CFU /ml chủng vi khuẩn S. aureus sinh độc tố SEA đƣợc nuôi cấy trong sữa với những khoảng thời gian khác nhau (0; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 hoặc 9h) để sinh các lƣợng độc tố khác nhau tƣơng ứng, trộn dịch sữa chứa độc tố này vào các sản phẩm sữa (kem, sữa chua và cà phê sữa), sau đó thử nghiệm với que thử. Que thử đƣợc áp dụng thành công trong việc phát hiện trực tiếp SEA (0,2 ng/ml-50µg/ml) trong sữa, trong vòng 15 phút. Gần đây , nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp 41 đôi để tạo que thử phát hiện SEA trong sữa thanh trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các kháng thể thƣơng mại của hãng Abcam là kháng thể đa dòng thỏ kháng SEA làm kháng thể cộng hợp gắn hạt nano carbon, kháng thể đa dòng cừu kháng SEA để in lên vạch thử nghiệm, kháng thể cừu kháng kháng thể thỏ in lên vạch kiểm chứng , sau đó thử giới hạn phát hiện trong đệm và trong sữa của que thử . Kết quả là que thử có thể phát hiện nồng độ thấp nhất 1 ng/ml đố i với SEA trong đệm, còn với sữa thanh trùng nhiễm chủ động SEA , nồng độ thấp nhất que thử xác đinh ̣ đƣợc là khoảng 3 ng/ml. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu. Trong nghiên cứu này, độc tố ruột SEA tái tổ hợp đƣợc sản xuất và in lên vạch thử nghiệm của que thử, kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng SEA đƣợc gắn với hạt nano carbon, sau khi tối ƣu hóa lƣợng SEA cần cố định và lƣợng kháng thể cộng hợp cần sử dụng, ngƣỡng phát hiện của que thử đƣợc xác định là khoảng 80ng/ml. 1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA IgY 1.5.1. Kháng thể lòng đỏ trứng IgY Năm 1893 Kleperer lần đầu tiên đã mô tả khả năng miễn dịch thụ động thu đƣợc ở gà. Ông đã chứng minh có sự di truyền các yếu tố miễn dịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con [41]. Ngay từ năm 1962, Williams đã xác định protein IgY là ɤ - globulin trong phần livetin của lòng đỏ trứng gà. Các loại kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng có thể kháng khoảng 200 loại kháng nguyên khác nhau [71]. Nồng độ của các loại kháng thể này trong máu gà là 5-6 mg/ml, trong khi đó ở lòng đỏ trứng là 10-25 mg/ml. Nồng độ IgY trong cả máu và lòng đỏ trứng là thấp hơn so với IgG trong máu của động vật có vú, ví dụ: nồng độ IgG trong máu thỏ là 35 mg/ml [83]. Tuy nhiên gà đẻ trứng mỗi ngày nên từ lƣợng lớn trứng thu đƣợc có thể tách chiết đƣợc đủ lƣợng kháng thể để dùng. Khi thỏ và gà đƣợc so sánh về sản xuất kháng thể (Bảng 1.5), ngƣời ta có thể rút ra kết luận đáng ngạc nhiên: một con gà sản xuất trong một năm đƣợc lƣợng kháng thể nhiều bằng lƣợng kháng thể thu thập đƣợc từ máu của 40 con thỏ [52]. Lòng đỏ trứng chứa khoảng 100 ÷ 150 mg IgY. Gà mái đẻ khoảng 42 280 trứng trong một năm. Nếu gà mái đƣợc tiêm chủng sẽ tạo ra 40g IgY một năm từ trứng, tƣơng đƣơng với lƣợng kháng thể thu đƣợc từ máu của 40 con thỏ. Bảng 1.5. So sánh kháng thể IgG ở thỏ và IgY ở gà [52] Động vật Thỏ (IgG) Gà (IgY) Nguồn kháng thể Huyết thanh Lòng đỏ trứng Loại kháng thể Đa dòng Đa dòng Cách thu kháng thể Lấy máu Lấy trứng Lƣợng kháng thể 200mg/1 lần lấy máu 100-150mg/trứng (400ml) Tổng lƣợng kháng thể/năm 1400mg 40.000mg Lƣợng kháng thể đặc hiệu Khoảng 5% Khoảng 2-10% Liên kết với protein A/G Có Không Tƣơng tác với IgG Có Không Tƣơng tác với khớp dạng thấp Có Không Kích hoạt bổ thể Có Không Kháng thể IgY có chức năng tƣơng tự IgG ở động vật có vú, đƣợc vận chuyển vào lòng đỏ trứng gà để bảo vệ thụ động gà con. Ở gà có ba lớp kháng thể: IgY, IgA và IgM. Trong suốt quá trình hình thành trứng, IgY trong huyết thanh đƣợc vận chuyển chọn lọc vào lòng đỏ trứng gà thông qua một thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của màng lòng đỏ, trong khi IgA và IgM ở lòng trắng trứng (Hình 1.10) [52] . Việc vận chuyển kháng thể vào lòng đỏ trứng đƣợc khai thác để sản xuất kháng thể đặc hiệu với các kháng nguyên trong nhiều ứng dụng về y tế và các lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm các lĩnh vực nhƣ chẩn đoán và proteomic [83, 101]. IgY có thể đƣợc sử dụng trong hóa miễn dịch với chức năng tƣơng tự IgG của động vật có vú. Kháng thể IgY là một thay thế hấp dẫn cho kháng thể động vật có vú vì các lý do kinh tế, lý do đạo đức sinh học và vì sự an toàn của động vật. 43 Buồng trứng Ống dẫn trứng Trứng Hình 1.10. Sự hình thành kháng thể IgY [52] Cấu trúc kháng thể IgY (Hình 1.11) bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng cầu nối disulfit (-S-S-). Khối lƣợng phân tử của IgY khoảng 180 kDa, lớn hơn so với IgG của động vật có vú (khoảng 150 kDa). Chuỗi nhẹ L bao gồm một vùng biến đổi VL (variable region) và một vùng cố định CL (constant light). Chuỗi nặng H của IgY gồm một vùng biến đổi VH và bốn vùng cố định CH1, CH2, CH3, CH4. Trong khi đó IgG chỉ có ba vùng cố định. IgY có một vùng bản lề ngắn và ít linh hoạt hơn IgG [52]. IgY có giá trị pI (điểm đẳng điện) từ 5,4 đến 7,6 là thấp hơn so với IgG [83]. IgY ổn định ở pH 4 đến 11 nhƣng nó sẽ bất hoạt nếu pH giảm đến dƣới 4 hoặc tăng đến trên 12 [52]. Ngoài ra, nhiệt độ ổn định của IgY và IgG là tƣơng tự. Giá trị nhiệt độ chịu đƣợc tối đa của IgY là 74°C, thấp hơn 3°C so với IgG [52]. 44 Hình 1.11. Cấu trúc phân tử của IgG thỏ và IgY gà [93] 1.5.2. Sản xuất kháng thể IgY Kháng thể lòng đỏ trứng IgY đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà mái để thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà. Gà nuôi làm thí nghiệm cần đƣợc đảm bảo vệ sinh môi trƣờng và lấy trứng đúng của từng con gà. Do đó, gà nên đƣợc nuôi trên lồng [9]. Kháng nguyên đích đƣợc tiêm vào gà dẫn đến một phản ứng miễn dịch dịch thể. Đó là biểu hiện ban đầu của quá trình sản xuất IgY đặc hiệu trong huyết thanh của gà đã đƣợc tiêm chủng, tiếp theo là sự vận chuyển IgY đặc hiệu vào trong lòng đỏ trứng. Sau khi phản ứng miễn dịch đã đƣợc tạo ra, việc vận chuyển IgY đi qua ống dẫn trứng mất khoảng 5 -6 ngày [93]. Các kháng thể đặc hiệu này chiếm 0,1-10% của tổng số IgY [83]. Tuy nhiên, có một tỷ lệ nhất định (10-15%) gà đƣợc tiêm chủng nhƣng có thể đáp ứng thấp với các kháng nguyên nhất định [26]. Các yếu tố nhƣ kháng nguyên, tá dƣợc, các đƣờng tiêm và lịch tiêm chủng đã đƣợc mô tả trong nhiều nghiên cứu. Tất cả những yếu tố này rất quan trọng vì chúng ảnh hƣởng đến kết quả (hàm lƣợng và độ đặc hiệu của IgY thu đƣợc) và sự an toàn của con gà mái. *Kháng nguyên: Bƣớc đầu tiên trong sản xuất IgY đặc hiệu là chọn kháng 45 nguyên mục tiêu, có thể là một kháng nguyên duy nhất (protein, peptide hoặc polysaccharide) hoặc một tổ hợp đa kháng nguyên (vi khuẩn, nấm mốc, virus hoặc các bộ phận trong số này). Các phân tử thể hiện tính miễn dịch tốt nhất là protein [96]. Độ tinh khiết của kháng nguyên là một tiêu chí quan trọng bởi vì nếu kháng nguyên bị lẫn các tạp chất có thể dẫn đến khả năng IgY có nhiều hoạt tính với các tạp chất hơn so với hoạt tính dành cho kháng nguyên đích. Hơn nữa, nếu kháng nguyên bị nhiễm các vi khuẩn, nội độc tố hoặc dƣ lƣợng hóa chất thì có thể ảnh hƣởng xấu đến sự an toàn cũng nhƣ sự đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm. Do đó, kháng nguyên cần đƣợc tinh sạch cao [59]. Kháng nguyên cần đƣợc gắn kèm với một protein mang khác nếu khối lƣợng phân tử dƣới 12 kDa hoặc có tính gây miễn dịch yếu [28]. Liều kháng nguyên đƣợc đề nghị của một loại protein hòa tan trong một liều vắc-xin khoảng từ 10 ng đến 1 mg (tốt nhất là 10-100 µg) [93]. * Tá dược: Để kích thích sự đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm, các kháng nguyên đích đƣợc kết hợp với các hợp chất phụ gia khác nhau. Tá dƣợc Freund (FA) vẫn là "tiêu chuẩn vàng" và đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất kháng thể thử nghiệm. Tá dƣợc Freund hoàn toàn (FCA) có hiệu quả nhất trong sản xuất kháng thể. Nhƣng FCA có liên quan tới một loạt các tác dụng phụ không mong muốn, đặc biệt là ở động vật có vú. Những phát hiện này đã dẫn đến nhiều nguyên tắc quy định kiểm soát việc sử dụng FCA ở động vật thí nghiệm. Tuy nhiên, một điều thú vị là FCA hầu nhƣ không gây tác dụng phụ ở các loài chim [26]. Để hạn chế nguy cơ phản ứng mô cục bộ, FCA thƣờng chỉ đƣợc tiêm chủng ở lần đầu tiên, còn tá dƣợc Freund không hoàn toàn (FIA), đƣợc tiêm trong những lần tiêm nhắc lại vì FIA không chứa các chất chiết xuất Mycobacteria, đƣợc ƣu tiên cho tăng cƣờng miễn dịch [59]. Điều này có tác dụng ngăn chặn các tác dụng phụ trong khi vẫn có thể thu đƣợc nồng độ IgY cao. Đáp ứng miễn dịch tƣơng tự cũng đƣợc tìm thấy khi chỉ có các dung dịch của kháng nguyên trong PBS đã đƣợc sử dụng để tiêm. Nghiên cứu gần đây cho thấy các hạt nano lipid đƣợc ứng dụng vào thử nghiệm chỉ gây ra kích thích mô nhỏ tại các điểm tiêm [59]. 46 * Đường tiêm: Đƣờng tiêm bắp đƣợc sử dụng thƣờng xuyên, nhất là tiêm ở ức gà [59]. Đƣờng tiêm dƣới da cũng đƣợc sử dụng nhƣng ít hơn. Kết quả đƣờng tiêm bắp cho lƣợng IgY cao hơn gấp gần 10 lần so với đƣờng dƣới da. Để bảo vệ an toàn động vật, ngƣời ta bắt buộc phải hạn chế số lƣợng tiêm. Lƣợng tiêm (liều và số vị trí tiêm) chỉ đủ để gây ra phản ứng kháng thể mà không vƣợt quá số lƣợng tối đa là 1 ml và bốn vị trí tiêm [26]. * Lịch tiêm chủng: Quá trình tiêm chủng nên đƣợc thực hiện khi gà đang trong độ tuổi đẻ trứng để thời điểm gà đẻ trứng tốt nhất trùng với thời điểm sản xuất kháng thể. Thời điểm này của gà thƣờng vào khoảng 28-30 tuần tuổi. Do đó, lần tiêm đầu nên thực hiện ở khoảng 20 tuần tuổi [26]. Việc tiêm nhắc lại là cần thiết để tận dụng lợi thế của bộ nhớ của hệ thống miễn dịch thích nghi. Khoảng thời gian nghỉ giữa các lần tiêm khoảng từ 1 đến 8 tuần, thông thƣờng là 3-4 tuần [59]. Tần số và khoảng thời gian phụ thuộc vào khả năng miễn dịch đối với kháng nguyên và phụ thuộc các tá dƣợc đƣợc sử dụng. 1.5.3. Các phƣơng pháp tinh chế kháng thể IgY Hiện nay, một số phƣơng pháp tách chiết và tinh chế IgY gà đã đƣợc mô tả và có thể đƣợc chia thành hai nhóm chính: Nhóm phƣơng pháp kết tủa: liên quan đến amoni, natrisulfat, natriclorua, polyetylenglycol (PEG), axit caprylic và caragenean [34, 83, 93]; Nhóm phƣơng pháp sắc ký: sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel [62, 93, 99], đồng thời có thể kết hợp sử dụng kỹ thuật siêu lọc. Thành phần chính của lòng đỏ trứng gà là lipit và protein. IgY là lipoprotein có tỷ trọng thấp và hòa tan đƣợc trong nƣớc. Tất cả các phƣơng pháp tinh sạch IgY, ban đầu đều cần loại bỏ lipid và lipoprotein, bƣớc tiếp theo là tinh sạch IgY. 47 1.5.4. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán miễn dịch Do gà và động vật có vú có khoảng cách tiến hóa xa nhau nên hệ thống miễn dịch ở gà đáp ứng với kháng nguyên của động vật có vú mạnh hơn. Kháng thể IgY có ái lực (affinity) và háo lực (avidity) cao với kháng nguyên. Đặc điểm này có thể dẫn đến việc khuếch đại tín hiệu khi sử dụng kháng thể IgY là kháng thể đầu tiên trong một số loại phản ứng miễn dịch. Điều này đã đƣợc chứng minh khi nhận thấy kháng thể gà có ái lực cao hơn 3-5 lần so với các kháng thể của lợn, cao hơn IgG thỏ trong ứng dụng khuếch đại tín hiệu ở thử nghiệm về miễn dịch [62]. Hơn nữa, do gà có khả năng sinh kháng thể kháng lại nhiều loại kháng nguyên khác nhau (protein, peptide, kích thích tố lipid và các thành phần carbohydrate của virus, vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật [62], các kháng nguyên có kích thƣớc bé và tính sinh miễn dịch yếu nhƣ các hapten [93]) nên có thể sử dụng IgY để chế tạo các sinh phẩm dùng trong xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao. Tƣơng tự nhƣ IgG, phân tử IgY cũng dễ dàng gắn vào các phân tử khác nhƣ các enzym, các chất đánh dấu ( tiêu biểu là biotin), các chất huỳnh quang. Hoạt tính của IgY không bị thay đổi sau khi gắn cũng nhƣ sau thời gian dài bảo quản. Gần đây, một số nghiên cứu đã cho thấy kết quả khả quan trong việc phát triển kỹ thuật để sử dụng IgY trong chẩn đoán miễn dịch, chẳng hạn nhƣ xét nghiệm miễn dịch để phát hiện sự lƣu hành kháng nguyên của Schistosoma japonicum, phát triển các kháng thể IgY chống lại các protein của Pythium insidiosum sử dụng trong kỹ thuật ELISA [62]. IgY đƣợc dùng phối hợp với kháng thể đơn dòng để làm xét nghiệm định type huyết thanh virus gây bệnh chân tay miệng [105], hoặc đƣợc gắn với các ống nano carbone để phát hiện tế bào ung thƣ có kháng nguyên HER2 [106], độc tố Shigatoxin [82]. Nghiên cứu của Wanchun Jin năm 2013 đã ứng dụng IgY cho việc phát triển kỹ thuật ELISA kẹp đôi để phát hiện các SE, kỹ thuật sắc ký miễn dịch phát hiện SEA trong sữa và sản phẩm sữa [109]. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy tính khả thi của các kháng thể đặc hiệu IgY kháng SE. Đây là cơ sở để chúng tôi sản xuất kháng thể IgY kháng lại 5 loại SE trong luận án này. 48 1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU Khi phát triển các kỹ thuật phát hiện SE, cần thiết phải có kháng nguyên tinh khiết là các SE phục vụ cho việc sản xuất kháng thể và phát triển bộ sinh phẩm. SE có thể đƣợc sản xuất bởi các cách: thu nhận trực tiếp từ S.aureus và thu nhận qua con đƣờng tái tổ hợp và tinh chế SE. 1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S. aureus Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất các SE trực tiếp từ S. aureus. Một nghiên cứu của Edward J. Schantz và cộng sự cho thấy độc tố SEB đƣợc thu nhận trực tiếp từ môi trƣờng nuôi cấy của S. aureus và tinh sạch bằng sắc ký trên màng carboxylmethyl - cellulose [37]. Năm 1967, với phƣơng pháp sắc ký trên cột CMcellulose và phƣơng pháp mới khi áp dụng gel lọc Sephadex G-75 và G-50, Concordia R.Bojia và Merlin S. Berdoll đã thu đƣợc độc tố SEC [27]. Năm 1979, Chang HC, Bergdoll MS đã kết hợp 2 phƣơng pháp tinh sạch bằng sắc ký trên màng carboxylmethylcellulose và áp dụng cột lọc Sephadex G-75 để thu đƣợc SED [24]. Các nghiên cứu sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S.aureus đã sản xuất ra ít nhất 12 loại độc tố ruột tụ cầu nhƣ sau: SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL và SEM [70]. Tùy theo mục tiêu sản xuất, dụng cụ, hóa chất có sẵn và điều kiện sản xuất, ngƣời ta đã tiến hành sản xuất các SE theo quy mô nhỏ hay quy mô lớn. * Quy mô nhỏ: Sản xuất các SE quy mô nhỏ có những phƣơng pháp nhƣ nuôi trên thạch rắn, nuôi trên thạch bán rắn, nuôi lắc trong bình tam giác và nuôi trong túi [70]. Các phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất và tinh sạch một lƣợng nhỏ độc tố để phân lập dòng vi khuẩn tạo các SE. Phƣơng pháp nuôi trên thạch rắn là phƣơng pháp đơn giản để nuôi các chủng tụ cầu tạo SE nhằm phân loại các chủng tạo độc tố tụ cầu. Robbins năm 1974 đã nuôi S. aureus trên môi trƣờng thạch bán rắn ở đĩa Petri [94]. Bên cạnh đó, nhiều độc tố đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp nuôi lắc vi khuẩn trong bình tam giác và thu đƣợc sản lƣợng độc tố SEA, SED và SEE tăng gấp 10 lần so với các phƣơng pháp thông thƣờng, trong khi đó độc tố SEB và SEC tăng ít hơn (gấp 2 lần). Với phƣơng pháp nuôi trong túi, môi trƣờng đƣợc đặt trong túi thẩm tích và đặt ở đáy bình tam giác, 20ml dịch chứa tế bào đƣợc thêm vào, thời gian nuôi 49 cấy là 24 giờ, lắc ở tốc độ vừa phải để dịch nuôi cấy đƣợc trộn đều trong túi thẩm tích. Môi trƣờng canh thang BHI (Brain heart infusion) thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất SE, đặc biệt ở quy mô nhỏ [70]. * Quy mô lớn: Thông thƣờng, sự sản xuất SE ở quy mô lớn đƣợc thực hiện trong bình tam giác hoặc các bình tƣơng tự với phƣơng pháp lắc, hoặc trong quá trình lên men. Các kích cỡ của bình chứa môi trƣờng lên men là khác nhau, các bình có kích thƣớc 0,5 - 2000 lít thƣờng đƣợc sử dụng cho quá trình sản xuất SE này. Metzger và cộng sự (1973) đã sản xuất đƣợc một lƣợng lớn độc tố SEB (lên đến 600 µg) trong một thể tích 50 lít môi trƣờng lên men [55]. Carpenter (1974) đã sản xuất đƣợc một lƣợng tƣơng đƣơng SEB trong 0,5 lít môi trƣờng nuôi cấy ở bình 1 lít [30]. Jarvis (1973) đã sản xuất đƣợc nhiều độc tố SEA trong 2 lít ở môi trƣờng lên men nhiều hơn so với trong bình lắc. Ngƣợc lại, với SEB và SEC thì thu đƣợc ở môi trƣờng lên men là ít hơn [17]. Nồng độ ô xy hòa tan có ảnh hƣởng đến sự sản xuất SEC: Carpenter và Silverman (1974) đã phát hiện ra rằng ở mức 10-50% lƣợng oxy hòa tan thì SEB đƣợc sản xuất nhiều hơn so với ở mức 0% hoặc 100%. Năm 1973, Metzger và các cộng sự đã tìm ra một phƣơng pháp tối ƣu về điều kiện môi trƣờng để tạo sản lƣợng SE cao, bằng cách thêm cao nấm men vào môi trƣờng nuôi cấy [55]. Các độc tố SEA và SEB đã đƣợc tạo ra với một sản lƣợng cao hơn sau khi bổ sung 1% cao men, 0,2% glucose và 4% NZA-A với các mức lần lƣợt là hơn 100µg/ml của SEA và hơn 400µg/ml SEB [70]. 1.6.2. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu bằng phƣơng pháp tái tổ hợp Các điều kiện nuôi cấy S. aureus nhằm kích thích tạo các SE đã đƣợc làm sáng tỏ. Tuy nhiên, việc tinh sạch các SE thƣờng rất phức tạp, gồm nhiều công đoạn do phải loại bỏ hoàn toàn protein A vốn có khả năng liên kết với các dạng IgG. Sản xuất các SE theo con đƣờng tái tổ hợp giúp khắc phục các nhƣợc điểm đã nêu ở trên. Trong trƣờng hợp một hỗn hợp của các protein chƣa biết hoặc một chiết xuất tế bào đã biết, có nhiều cách khác nhau để chọn các bƣớc tinh sạch tối thiểu và hiệu quả nhất nhằm đạt đƣợc độ tinh sạch mong muốn (ví dụ 98%, 99,5% hoặc 99,9%) [15]. Để protein tái tổ hợp đạt đƣợc độ tinh sạch cao dùng cho phân tích hoặc điều trị, một số kỹ thuật sắc 50 ký có thể đƣợc sử dụng: sắc ký trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, lọc gel và sắc ký ái lực [108]. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam đã sản xuất các SE, gồm: SEA, SEB, SEC, SED, SEE tái tổ hợp [4, 6, 61, 72, 109]. Khi sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, có thể sản xuất SE trong tế bào khả biến Escherichia coli không sinh protein A. Đồng thời, khi sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, chúng ta có thể tạo ra các SE dƣới dạng dung hợp với các đuôi ái lực, độc tố tái tổ hợp sẽ nối thêm 6 acid amin Histidin (đuôi His); hoặc nối thêm glutathione-S-transferase (đuôi GST). Các kỹ thuật DNA tái tổ hợp này sẽ cho phép đơn giản hóa quy trình tinh sạch đi rất nhiều. Ví dụ, đuôi His có ái lực cao với Ni2+ do có vòng thơm imidazole, vì thế protein dung hợp với đuôi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+, còn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này. Nhƣ vậy, sắc ký ái lực có thể cho phép thu protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch cao. Năm 2012, Liben Chen và các cộng sự đã tách dòng gen sea từ S. aureus, thiết kế thành công vec tơ biểu hiện pGEX-sea và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21. SEA tái tổ hợp ở dạng dung hợp với đuôi GST có khối lƣợng phân tử khoảng 56 kDa đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực có độ tinh sạch cao, để sản xuất vaccin chống SE [61]. Năm 2013, Wangchun Jin và các cộng sự đã sản xuất đƣợc các SEA, SEB, SEC, SED và SEE tái tổ hợp với đuôi His để làm các kháng nguyên cho sản xuất kháng thể IgY ở gà. Nghiên cứu này sử dụng vector pQE30 và chủng E. coli XL1Blue để biểu hiện các gen SE, các SE tái tổ hợp trên đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột gắn Ni2+ [109]. Đầu năm 2014, Nandita P. Agnihotri đã công bố sản xuất SEC2 tái tổ hợp với đuôi His sử dụng vector biểu hiện pQE30Xa và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli SG13009, tạo ra protein tƣơng ứng với khối lƣợng khoảng 29,7 kDa [72]. Protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột gắn Ni2+ và đƣợc sử dụng để tạo kháng thể trên thỏ. 51 Trong nghiên cứu của Nghiêm Ngọc Minh (2011) đã tiến hành tách dòng gen seb từ S. aureus bằng vector tách dòng pJet, thiết kế thành công vector biểu hiện pET21a+ mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên có độc tính và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. Protein tái tổ hợp SEB có đuôi His, khối lƣợng 28 kDa đƣợc tinh sạch thành công bằng cột Nikel Resin sẽ phục vụ làm nguyên liệu tạo SEB tái tổ hợp ở dạng đột biến không có độc tính, làm nguyên liệu cho việc tạo Kit phát hiện nhanh NĐTP do SE [6]. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp để làm nguyên liệu tạo que thử SEA bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh . Protein SEA tái tổ hợp đã đƣơ ̣c tạo ra ở trạng thái dung hợp với glutathione-S-transferase (GST) có khối lƣợng khoảng 53 kDa nhờ biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 mang plasmid pGEX-6P-1-sea và đƣơ c̣ tinh sạch bằ ng sắ c ký ái lƣ̣c sƣ̉ du ̣ng bộ kit GST SpinTrap [4]. 52 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid - Chủng Staphylococcus aureus P240 mang gen độc tố sec1 phân lập từ sữa, đƣợc cung cấp bởi phòng Vi sinh, Viện Dinh dƣỡng Quốc gia, chủng đƣợc tham chiếu thƣờng xuyên với chủng chuẩn S.aureus ATCC29213. - Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng BL21 (SHuffle® T7 Express Competent E. coli, C3030) (New England Biolab, Mỹ) sử dụng cho mục đích biểu hiện protein SEC1. - Vector biểu hiện pGS-21a có kích thƣớc 6169 bp [T7-P, GST-tag, His-tag, Amp] (Genescript, Mỹ). Hình 2.1. Sơ đồ vector biểu hiện pGS-21a - Các độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE chuẩn của hãng Toxin Technology, Mỹ. 53 2.1.2. Động vật thí nghiệm Gà mái dòng thuần Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, gồm 30 con, cân nặng 3540g/con, mua từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì, nuôi tại Hải Dƣơng. 2.1.3. Thực phẩm thử nghiệm Một số mẫu thực phẩm thu thập tại địa bàn Hà Nội bao gồm: - Sữa tƣơi tiệt trùng không đƣờng, thành phần dinh dƣỡng trong 100ml gồm chất đạm: 2,9 g; chất béo: 3,3 g; hydratcarbon: 4,7g, hỗn hợp các vitamin và khoáng chất. Mẫu thu thập ngày 15 tháng 8 năm 2014, 1 lốc gồm 4 hộp. - Thịt lợn: Mẫu thịt nạc vai đƣợc thu thập trong khoảng thời gian 6h đến 6h30 sáng, chọn thịt có màu hồng tƣơi, thớ thịt mịn đều, da mỏng, lớp mỡ có màu sáng bóng, có độ rắn. Mẫu đƣợc thu thập là 200g, ngày 5 tháng 9 năm 2014. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hóa chất và sinh phẩm - Hóa chất: Các hóa chất tinh khiết đƣợc sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ các hãng Sigma, Merk, vv ... bao gồm: Dung dịch tách chiết DNA:TE (Tris-EDTA), Dung dịch CaCl2 0,1M, ampicillin, agarose, acrylamide, bis-acrylamide, TEMED (Sigma), ethidium bromide10% SDS (Invitrogen) và 10% APS (Sigma), blue Coomassie, dung dịch rửa gel SDS (40% methanol, 10% acetic acid), skim milk (Sigma), Tween 20 (Sigma), TMB (Sigma), Polyethylene glycol (PEG) 0,05%, Tris-HCl (pH = 8.2) (Sigma) huyết thanh bào thai bê (BSA), H2SO4 0,5N, NaCl 0,85%,...và các hóa chất, dung môi khác đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. - Các sinh phẩm: Kit tách chiết DNA từ gel agarose GeneJET (Thermo Scientific); các enzym giới hạn BamHI và HindIII (Thermo Scientific); T4 DNA ligase (New England Biolabs); Kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng SEC ab15920 (Abcam); Cộng hợp kháng thể IgG dê kháng kháng thể thỏ gắn HRP ab 97051(Abcam); Kit His Mag SepharoTMNi (GE Healthcare); Tá dƣợc: FCA (Freund’s Complete Adjuvant) và FIA (Freund’s Incomplete Adjuvant) (Sigma); Thang chuẩn điện di protein (Thermo 54 Scientific); Thang chuẩn điện di DNA 1 Kb Plus (Biogen) ); cột sắc ký “HiTrapTM IgY Purification HP, 5ml” (GE Healthcare). - Mồi nhân gen: Cặp mồi sử dụng để tạo các điểm cắt của hai enzym giới hạn là BamHI - F và HindIII - R (chữ đƣợc gạch chân) ở hai đầu đoạn gen mã hoá cho protein SEC1 có trình tự: Mồi xuôi SEC-F (5'-TTTGGATCCGAGAGCCAACCAGACCCT-3') và mồi ngƣợc SEC-R (5'- TATAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGGAC3'). - Các dụng cụ, vật tư tiêu hao: Dãy giếng ELISA (Corning); Màng nitrocellulose AE99 (Whatman); Tấm lót plastic vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman); Giấy thấm (Whatman); hạt Carbon Black Nano – Strings 0210 (Maiia Diagnostics); Giấy lọc (Whatman) ; ống Falcon (Corning); Màng lọc (Merk), ... 2.2.2. Máy, thiết bị Các máy, thiết bị đều đang trong thời gian đƣợc kiểm định chuẩn, bao gồm: - Máy chu kỳ nhiệt 96 mẫu (eppendorf, Đức); - Máy soi chụp ảnh gel (BioRad, Mỹ); - Bộ điện di DNA Horrizontal mini (CBS Scientific, Mỹ); - Máy đồng hóa bằng siêu âm Sonics Vibra cell (VCX130, MIDSCI); - Bộ điện di protein (Bio-rad, Mỹ); - Máy cô đặc mẫu (Thermo Fisher, Mỹ); - Bộ chuyển protein từ gel sang màng (Mini Trans-Blot Cell, Bio Rad); - Máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, Mỹ); - Máy in phun Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ); - Máy cắt Cutter 4000 (BioDot, Anh); - Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Bản); - Cân phân tích CPA 324S (Satorius, Đức); - Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 (ESCO); - Máy lắc đảo ngƣợc Mini laboroller (Labnet); - Máy lắc ổn nhiệt DTU-2C (Taitec, Nhật Bản); -Máy lắc ổn nhiệt (eppendorf , Mỹ); - Máy li tâm lạnh Eppendorf Legend X1R (Thermo Fisher, Mỹ); - Máy ly tâm (Eppendorf, CHLB Đức); - Lò vi sóng (Samsung); 55 - Tủ lạnh (0-4oC) (Toshiba, Nhật); - Tủ lạnh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, Mỹ); - Máy vortex (Rotolab, OSI); Máy đo pH (HI 8424, HANNA Instruments); - Micropipette các loại Gilson (Pháp) và Biohit (Phần Lan). 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp Các bƣớc trong quy trình tạo độc tố ruột SEC1 tái tổ hợp đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.2 dƣới đây: Hình 2.2: Sơ đồ các bước tạo độc tố ruột SEC1 tái tổ hợp 2.3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S. aureus 56 Vi khuẩn Staphylococcus aureus mang gen sec1 đƣợc nuôi tăng sinh trong canh trƣờng BHI, ủ ở 37oC, 18 giờ. Tách chiết DNA tổng số dựa vào việc phá vỡ cấu trúc thành tế bào của S. aureus với quá trin ̀ h tách chiế t đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n nhƣ sau: Ly tâm 2ml huyền dịch S. aureus trong canh trƣờng BHI ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Sinh khối vi khuẩn đƣợc hòa tan trong 500µl dung dịch đệm TE bằng máy vortex. Thêm vào ống 50 µl dung dịch lyzozyme (10mg/ml), ủ ở 30oC trong 30 phút. Sau đó, thêm vào ống 30µl dung dịch SDS 10%, thêm tiếp 20 µl proteinase K và ủ ở 37oC trong 30 phút. Tiếp theo, thêm vào ống 100µl dung dịch NaCl 5M, tiếp tục thêm 80µl dung dịch NaCl 0,7M và ủ ở 65oC trong 10 phút rồi làm nguội ở nhiệt độ phòng. Bổ sung vào ống 800µl CIA (24 chloroform:1 isoamyl alcohol), trộn đều và ly tâm 1 phút ở 10.000 vòng/phút. Hút 500µl dịch nổi vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm vào ống 500 µl isopropanol, đảo trộn đều và quan sát tủa DNA. Dùng pipet hút sợi DNA vào ống có chứa 1000µl ethanol 70%, vortex và ly tâm 10.000 vòng/phút. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, dùng pipet hút toàn bộ dịch còn sót lại ra khỏi ống, làm khô ống và hòa tan kết tủa DNA trong 50µl nƣớc cất, ủ ở 55oC trong 5 phút. Nồng độ DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260/280 và chất lƣợng DNA đƣợc kiểm tra bằng cách điện di 10µl mẫu thu đƣợc trên gel agarose 0,8%. 2.3.1.2. Khuế ch đại gen sec 1 bằng kỹ thuật PCR DNA của vùng gen sec1 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, thành phần của một phản ứng PCR thể tích 50 µl nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm PCR 10X, 4 µl dNTP (2.5 mmol/µl), 0,5 µl Taq DNA polymerase, 1 µl mồi xuôi (10 pmol/µl), 1 µl mồi ngƣợc (10 pmol/µl), 2µl DNA khuôn (100ng/µl), 36,5 µl nƣớc khử ion vô trùng. Chu trình nhiệt: DNA hệ gen bị biến tính ở 95°C, 4 phút, quá trình nhân bản với 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc đƣợc thực hiện là biến tính ở 95°C, 30 giây, bắt cặp mồi ở 55°C, 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72°C, 1 phút. Phản ứng kết thúc ở 72°C, 5 phút. Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% trong 30 phút ở hiệu điện thế 100V, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium 57 brommide trong 10 phút. Chụp ảnh để ghi lại kết quả điện di bằng hệ thống máy soi gel. 2.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bƣớc nhƣ sau: Sau khi xác định đoạn DNA cần tách trên bản gel điện di, cắt mảnh gel chứa đoạn này cho vào ống 1,5 ml và cân xác định khối lƣợng gel. Thêm đệm B (Binding buffer) vào ống với tỷ lệ (1thể tích đệm B: 1 khối lƣợng gel), ủ ở 60oC trong 10 phút để mảnh gel tan hoàn toàn. Chuyển toàn bộ hỗn hợp trên vào cột GeneJET, ly tâm tốc độ 12000 g trong 1 phút, ở 4oC để loại bỏ hoàn toàn cặn của gel điện di. Rửa cột bằng 700 µl đệm W (Washing buffer), ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 1 phút. Hút 500µl dịch nổi vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm vào ống 500 µl isopropanol, đảo trộn đều và quan sát tủa DNA. Dùng pipet hút sợi DNA vào ống có chứa 1000µl ethanol 70%, vortex và ly tâm 10000g. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, hút toàn bộ dịch còn sót lại ra khỏi ống, làm khô ống và hòa tan kết tủa DNA trong 50µl nƣớc cất, ủ ở 55oC trong 5 phút. Nồng độ DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260/280 và chất lƣợng DNA đƣợc kiểm tra bằng cách điện di 10µl mẫu thu đƣợc trên gel agarose 0,8%. 2.3.1.4. Xây dựng vector biểu hiện mang gen sec1 Để thiết kế vector biểu hiện, đoạn gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) đƣợc cắt bằng enzym giới hạn là BamHI và HindIII tạo các liên kết đầu dính phù hợp với vector biểu hiện là pGS-21a đã đƣơ ̣c mở vòng , sau đó ghép nối với nhau bằng T4 DNA ligase tạo pGS-21a-sec1. * Cắt đoạn gen sec1 và plasmid pGS-21a bằng enzym giới hạn Gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) và plasmid pGS-21a đƣợc cắt bằng enzym giới hạn là BamHI và HindIII. Phản ứng cắt với enzym giới hạn có thể tích 50 µl, bao gồm thành phần các chất tham gia nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm, 2 µl BamHI, 2 µl HindIII, 35 µl DNA, 6 µl nƣớc khử ion vô trùng. Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó ủ ở 80oC trong 10 phút để bất hoạt enzym. Sản phẩm cắt đƣợc tinh sa ̣ch 58 bằ ng kit GeneJET (Thermo Scientific) và kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. * Nối gen sec1 vào vector pGS-21a Đoạn gen sec1 đƣợc nối vào vector pGS-21a bằng T4 DNA ligase kit (New England Biolabs). Thành phần và thể tích hỗn hợp tham gia vào phản ứng nhƣ sau: 1 µl đệm T4 ligase, 5 µl đoạn gen cần gắn, 5 µl vector đã mở vòng, 1 µl T4 ligase, 8 µl nƣớc khử ion vô trùng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4-8oC qua đêm. Sau đó sử dụng 5µl sản phẩm phản ứng để biến nạp vào 100 µl tế bào E. coli khả biến. 2.3.1.5. Biến nạp plasmid pGS-21a-sec1 vào tế bào E. coli BL 21 Plasmid pGS-21a-sec1, mang gen mã hóa SEC1 dạng dung hợp với đuôi HisGST, đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (New England Biolabs) bằng phƣơng pháp sốc nhiệt theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau: Rã đông một ống tế bào khả biến E. coli BL21 trong đá trong 10 phút. Thêm 2µl plasmid pGS-21a (20ng DNA plasmid) vào ống chứa tế bào khả biến, trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 10 giây, ủ đá trong 5 phút. Thêm 950µl môi trƣờng SOC vào ống và ủ ở 37oC trong 60 phút, lắc 150 vòng/phút. Cấy trải 50, 100, 200 µl lên bề mặt thạch LB có bổ sung 100mg/l ampicillin và ủ qua đêm ở 37oC. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR. - Kiểm tra đoạn gen biến nạp + Kỹ thuật PCR colony Để kiểm tra về sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid của tế bào biểu hiện protein E. coli BL21, từ kết quả cấy trải các tế bào đã biến nạp trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin, chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng để nuôi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng có ampicillin, mỗi chủng nuôi trong 3ml môi trƣờng qua đêm ở 30oC, lắc 150 vòng/phút. Các dòng vi khuẩn đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1 với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 2.3.1.2 để tìm khuẩn lạc mang vector pGS-21a-sec1. + Giải trình tự gen 59 Các khuẩn lạc mang plasmid pGS-21a-sec1 đã đƣợc sàng lọc bằng phản ứng PCR đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin. Sau đó, DNA của những plasmid tái tổ hợp đƣợc tách chiết và tinh sạch theo Kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System với quy trình của nhà cung cấp. Plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn là BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng cắt với enzym giới hạn có thể tích 50 µl nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm, 2 µl BamHI, 2 µl HindIII, 35 µl DNA, 6 µl nƣớc khử ion vô trùng. Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó ủ ở 80oC trong 10 phút để bất hoạt enzym. Sản phẩm cắt (gen sec1) đƣợc tinh sa ̣ch và ki ểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. DNA của plasmid đƣợc chuẩn bị với cặp mồi T7 promoter + T7 terminator và đem gửi công ty VnDat Co. Ltd để giải trình tự ở công ty 1st Base Selangor, Malaysia. 2.3.1.6. Biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp Để sản xuất SEC1 tái tổ hợp trong E. coli, dòng tế bào chuyển gen đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung thêm 100 mg/l ampicillin. Canh trƣờng đƣợc nuôi ở 30oC hoặc 37oC trong điều kiện lắc 150 vòng/phút cho đến khi OD600 nm đạt Để thu hồi sinh khối, 10 ml canh trƣờng đƣơ ̣c ly tâm ở 10000 g trong 5 phút. Sau khi loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn tế bào. Hòa cặn tế bào đã thu vào 1 ml dung dịch PBS 1X và tiến hành siêu âm trong đá lạnh bằng máy đồng hóa VCX130 trong 1 phút với chế độ siêu âm 10 giây, nghỉ 30 giây, công suất tối đa 130W. Ly tâm 10.000 g trong 10 phút, thu dịch nổi. 2.3.1.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEC1 Protein SEC1 tái tổ hợp ở da ̣ng dung hơ ̣p với đuôi 6 His-GST (6 Histidin- glutathione-S-transferase) ở đầu N đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực với Kit His Mag SepharoTMNi (GE Healthcare). Quy trình đƣợc tiến hành theo chuẩn của nhà sản xuất, bao gồm các bƣớc: Chuẩn bị hạt từ bằng cách hút 200 µl bi từ vào ống 1,5ml eppendorf, đặt ống eppendorf vào trong khay từ tính, loại bỏ đệm chứa. Thêm 0,5ml đệm cân bằng (sodium phosphate pH 7,4 : 500mM NaCl, 20-60 mM immidazole) vào ống, đảo ngƣợc vài lần để trộn bi từ, loại bỏ dịch nổi, lặp lại bƣớc này 2 lần (bƣớc cân bằng). Bổ sung immidazole vào 1ml mẫu (dịch nổi phá tế bào có chứa protein SEC1 tái tổ hợp) với các nồng độ khảo sát là 20 mM; 30 mM ; 40 mM; 50 60 mM và 60 mM immidazole. Sau đó mẫu đƣợc chuyển vào ống eppendorf chứa bi từ, đảo trộn mẫu chứa bi từ bằng máy lắc đảo ngƣợc trong 30 phút ở 4oC (bƣớc ứng dụng mẫu). Loại bỏ dịch lỏng và rửa ba lần bằng đệm liên kết, mỗi lần sử dụng 0,5ml đệm thực hiện tƣơng tự nhƣ ở bƣớc cân bằng (bƣớc rửa). Cuối cùng, protein tái tổ hợp SEC1 đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng cách thêm 100 µl đệm rửa giải (elution buffer: 20mM sodium phosphate pH 7,4; 500 mM NaCl; 500 mM immidazole) vào ống, trộn 5 phút, sử dụng khay từ để thu thập bi từ và chuyển dịch nổi chứa protein rửa giải vào ống sạch (bƣớc rửa giải). Lặp lại bƣớc rửa giải. 2.3.1.8. Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE){tc "II.2.6. Phương pháp đi?n di bi?n tính protein (SDS-PAGE)" \f C \l 3} Trong nghiên cứu này, protein SEC1 tái tổ hợp, các kháng thể IgY đƣợc xác định khối lƣợng và độ tinh sạch bằng kiểm tra điện di biến tính protein SDS-PAGE (12,5%), tiến hành theo các phƣơng pháp của Laemmli (1970). Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: Đổ gel tách (running gel) 12,5%, gel cô (stacking gel) 4%. Pha mẫu protein với đệm mẫu (0,1 M Tris pH 6,8; 0,2 M DTT; 4% SDS; 20% glycerol; 0,2% xanh bromophenol) tỷ lệ tƣơng ứng là 3:1, đun sôi trong 10 phút, để mẫu vào đá bào. Điện di 15 µl dịch protein đã xử lý trong đệm mẫu. Bản gel đƣợc chạy trên máy điện di protein kiểu đứng của hãng BIORAD, cƣờng độ dòng điện 15mA/1 bản gel với gel cô và 25mA/1 bản gel với gel tách, khi chỉ thị xanh bromophenol tới gần đáy bản gel thì dừng lại. Nhuộm gel qua đêm với dung dịch coomassie brilliant blue, tẩy màu bằng dung dịch rửa (methanol: axit acetic: H2O = 4 : 1 : 5) đến khi nền bản gel sáng lên. Căn cứ vào sự xuất hiện của các băng trên gel điện di có thể xác định bằng mắt thƣờng đƣợc độ tinh sạch và khối lƣợng phân tử của protein tái tổ hợp hoặc của kháng thể IgY 2.3.1.9. Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang Nguyên tắc của phƣơng pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bƣớc sóng 280 nm do có chứa các axit amin thơm nhƣ tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm thay đổi tuỳ loại protein nhƣng hệ số tắt đo đƣợc (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đƣờng sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính đƣợc nồng độ của protein tinh sạch. Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loại protein nào mà không biết hệ số tắt thì nồng độ protein đƣợc tính nhƣ sau: 61 Nồng độ protein (mg/ml) = 1,55 x A280 - 0,77 x A260 Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm; A260: độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm. 2.3.1.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot Độc tố ruột tụ cầu SEC1 (Toxin Technology) đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng và protein SEC1 tái tổ hợp đã tinh sạch đƣợc điện di trên gel SDS-PAGE 12,5%. Các protein đƣợc chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí nhƣ đã phân tách trên gel bằng máy điện di đứng ở hiệu điện thế 100V trong 1 giờ. Phong bế (bloking) màng lai trong đệm PBS 1X có 5% sữa tách bơ (skim milk). Ủ màng lai đã cố định protein với kháng thể thỏ đặc hiệu kháng SEC (kháng thể thứ nhất -primary antibody) trong skim milk 5% ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Rửa màng lai 3 lần x 5 phút trong dung dịch PBS 1X có 0,05% Tween-20. Ủ màng lai với kháng thể dê kháng IgG thỏ (kháng thể thứ hai- secondary antibody) gắn HRP (Horse-radish peroxidase) trong skim milk 5% ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Rửa màng lai 3 lần x 5 phút trong dung dịch PBS 1X có 0,05% Tween 20. Cuối cùng, màng đƣợc hiện màu trong dung dịch chất hiện màu (5ml methanol + 15 mg 4 - chloronapthol pha trong 50 ml TBS + 30µl H2O2) trong thời gian 10 phút, đọc kết quả. 2.3.2. Phƣơng pháp sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) Các bƣớc trong quy trình sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.3 dƣới đây: 62 Hình 2.3: Sơ đồ các bước tạo kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng SE (A+B+C1+D+E) 2.3.2.1. Gây miễn dịch Gà đƣợc gây miễn dịch để sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng BSA và kháng thể đa dòng IgY kháng các đ ộc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) theo quy trình sản xuất kháng thể IgY của Agro-Bio 2011 [11]. * Chuẩn bị gà để làm thực nghiệm Gà mái thuộc giống gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi gồm 30 con, cân nặng 3540g/con, mua từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì, đƣợc nuôi tại Hải Dƣơng trong cùng điều kiện đầy đủ thức ăn, nƣớc uống, thời gian chiếu sáng 12/24 giờ bằng ánh sáng tự nhiên. Hàng ngày chuồng nuôi gà đƣợc vệ sinh, gà đƣợc ăn uống và theo dõi tình trạng sức khỏe. Trong quá trình nuôi, gà không ốm và không dùng kháng sinh. Khi gà bắt đầu đẻ trứng ở tuần 18, chọn ra những con gà có các đặc điểm tốt cho việc đẻ trứng (vóc dáng cân đối, không dị tật ở mỏ, ngón chân, mồng, tích phát triển lớn, màu đỏ tƣơi, lông óng mƣợt, cánh ép sát vào thân) để theo dõi tình trạng đẻ trứng. Sau đó, lựa chọn 6 con gà này đẻ trứng đều trong hai tuần đầu, trọng lƣợng trứng khoảng 50-60g, vỏ trứng có màu trắng, phớt hồng sử dụng cho việc gây miễn dịch, sản xuất kháng thể IgY. * Gà mái để tiến hành thí nghiệm đƣợc chia thành 3 lô: 63 - Lô 1 (2 con): gây miễn dịch với hỗn hợp kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED và SEE để tạo kháng thể đa dòng IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E). - Lô 2 (2 con): gây miễn dịch với protein BSA (Sigma) để tạo kháng thể đa dòng IgY kháng BSA. - Lô 3 (2 con): là nhóm đối chứng, đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý 0,9%. * Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên gây miễn dịch cho gà - Để gây miễn dịch cho mỗi con gà với BSA, thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA Ống 1 2 3 Kháng nguyên BSA (ml) 1 1 1 Tá dƣợc FCA (ml) Tá dƣợc FIA (ml) 1 0 0 0 1 1 Nồng độ (mg/ml) 1 1 1 Dung dịch BSA nồng độ 2mg/ml trộn với tá dƣợc Freund hoàn toàn (FCA) theo tỷ lệ 1:1 ở lần tiêm đầu tiên. Dung dịch BSA nồng độ 2mg/ml đƣợc trộn với tá dƣợc Freund không hoàn toàn (FIA) với tỷ lệ 1:1 ở 2 lần tiêm nhắc lại. - Để gây miễn dịch cho mỗi con gà với kháng nguyên là các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED, SEE, kháng nguyên đƣợc chuẩn bị với thành phần nhƣ sau: Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên các SE Ống Kháng nguyên Nƣớc muối Tá dƣợc Tá dƣợc Nồng độ SE (A-E) (µl) sinh lý(µl) FCA (µl) FIA (µl) (ng/ml) 1 100 400 500 0 100 2 100 400 0 500 100 - Các độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE chuẩn đƣợc mua từ hãng Toxin Technology. Tất cả các độc tố đều đƣợc nhận dƣới dạng bột, bảo quản ở 20oC cho đến khi hoàn nguyên bằng cách thêm nƣớc loại ion vô trùng với dung dịch 64 ban đầu có nồng độ 100µg/ml. Các dung dịch độc tố này đƣợc pha loãng cao hơn bằng cách sử dụng dung dịch PBS 0,1M, pH 7,2. - Hỗn hợp kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED và SEE với nồng độ 20 ng/ mỗi loại độc tố đƣợc pha trong nƣớc muối sinh lý và trộn theo tỷ lệ thể tích 1:1 với tá dƣợc FCA ở lần tiêm đầu tiên, và với tá dƣợc FIA ở lần tiêm nhắc lại. Chuẩn bị các ống kháng nguyên bằng việc lần lƣợt thêm các thành phần nhƣ ở Bảng 2.3 hoặc Bảng 2.4, sau đó trộn đều tạo thành dịch đồng nhất kháng nguyên để gây miễn dịch cho gà. * Đường tiêm và khoảng thời gian giữa các lần tiêm Gà Lerhorn trắng 20 tuần tuổi đƣợc tiêm theo đƣờng tiêm bắp ở 2 vị trí: bên trái và bên phải cơ ngực, tiêm 0,5 ml kháng nguyên/một vị trí. Với kháng nguyên là BSA số lần tiêm là 3 lần (lần đầu tiên và 2 lần tiêm nhắc lại) còn với độc tố ruột tụ cầu số lần tiêm là 2 lần (lần đầu tiêm và lần tiêm nhắc lại). Khoảng thời gian giữa hai lần tiêm là 2 tuần. * Thu trứng gà Trong nghiên cứu này, trứng đƣợc thu từ ngày thứ 12 sau lần tiêm nhắc lại và tiếp tục thu trứng trong 14 ngày sau với lô gà tiêm kháng nguyên là các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE). Bên cạnh đó, với lô gà tiêm kháng nguyên là BSA thu trứng từ ngày thứ 12 sau khi tiêm nhắc lại lần thứ nhất và tiếp tục thu trứng cho đến sau khi tiêm mũi nhắc lại lần thứ 2 đƣợc 14 ngày. Đây là khoảng thời gian gà đẻ những quả trứng có nồng độ kháng thể IgY đặc hiệu cao. Những quả trứng này đƣợc sử dụng cho quá trình tinh sạch IgY. Từng quả trứng đƣợc ghi số con gà và ngày đẻ, sau đó đƣợc bảo quản ở 4o C cho đến khi sử dụng. 2.3.2.2. Tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng Để có đƣợc IgY với độ tinh sạch cao làm nguyên liệu cho sản xuất que thử, IgY đƣợc tinh sạch từ lòng đỏ trứng theo phƣơng pháp của PetrHokder phát triể n năm 2013 [84]. Sau đó dịch kháng thể thu đƣợc tiếp tục đƣợc tinh sạch bằng cột HiTrapTM IgY Purification HP 5ml (GE Healthcare), gồm các bƣớc sau: Bước 1: Loại lipid bằng cách gây kết tủa lạnh lòng đỏ trứng 65 Vỏ trứng đƣợc làm vỡ một cách cẩn thận và lòng đỏ đƣợc chuyển vào một thìa chuyên biệt dùng để tách lòng trắng khỏi lòng đỏ càng nhiều càng tốt. Chuyển lòng đỏ vào một giấy lọc và lăn trên giấy để loại bỏ hết lòng trắng trứng còn sót lại trên bề mặt lòng đỏ. Lòng đỏ sau khi đƣợc tách khỏi lòng trắng sẽ đƣợc chọc thủng bằng mũi dao nhọn vô trùng và đổ vào ống falcon 50ml vô trùng, đƣợc đo thể tích. Pha loãng lòng đỏ trứng với 1 thể tích PBS, 5 thể tích nƣớc cất, 1 thể tích HCl 0,5M, chỉnh pH = 5,0 với HCl 0,5M. Trộn đều dung dịch và làm đông ở -20oC. Tiếp theo, làm tan băng ở nhiệt độ phòng và lọc bằng giấy lọc. Bước 2: Tủa phân đoạn IgY bằng NaCl Thêm NaCl đến 8,8% vào dung dịch thu đƣợc sau khi lọc bằng giấy lọc, chỉnh pH = 4,0 với HCl 0,5M. Lắc đều ống dịch để tạo kết tủa trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm 3700g trong 20 phút. Tiếp theo, loại dịch nổi và hòa tan cặn thu đƣợc bằng PBS với thể tích bằng thể tích dịch lòng đỏ trứng. Bước 3: Tinh sạch IgY theo quy trình tinh sạch protein bằng cột HiTrapTM IgY Purification HP 5ml theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. - Dịch kháng thể IgY thu đƣợc sau tinh sạch ở bƣớc 2 đƣợc lọc qua màng lọc Minipore có kích thƣớc lỗ lọc là 0,45 µm để loại bỏ các tạp chất trƣớc khi đƣợc lọc bởi cột Hi Trap TM 5ml. Khả năng tinh sạch của cột này là 5ml. - Xử lý mẫu: Dịch IgY thu đƣợc ở bƣớc 2 bổ sung thêm K2SO4 đến nồng độ 0,5M, pH 7,5. - Rửa cột với 5 lần thể tích cột (25ml) ở mỗi đệm: đệm liên kết (20mM sodium phosphate: 0,5M K2SO4, pH 7,5), đệm rửa giải (20mM sodium phosphate, pH = 7,5), đệm làm sạch (20mM sodium phosphate, pH = 7,5 + 30% isopropanol), với tốc độ 0,5 đến 5ml/phút. - Cân bằng lại cột bằng 25ml đệm liên kết (20mM sodium phosphate: 0,5M K2SO4, pH 7,5). - Áp dụng với mẫu: sử dụng một xy lanh chứa mẫu, gắn xy lanh vào cột và bơm mẫu qua cột tinh sạch IgY. Giữ lại dịch qua cột sau khi gắn protein. - Rửa cột với 50ml của đệm liên kết, tốc độ 5ml/phút, giữ dịch rửa giải. 66 - Rửa, tách protein ra khỏi cột bằng 50 ml của đệm rửa giải với tốc độ 0,5 đến 5ml/phút và thu 2 ml ở mỗi phân đoạn sắc ký. - Sau khi rửa giải, cột sắc ký đƣợc làm sạch với 40 ml của đệm làm sạch. - Chuyển dung dịch protein thu đƣợc vào cột cô đặc protein, ly tâm 10.000 g trong 15 phút, bỏ dịch bên dƣới ống đựng, thu dịch đã cô đặc ở bên trên cột lọc. - Sản phẩm protein đƣợc xác định nồng độ bằng máy Nano Drop ở bƣớc sóng 260/280, điện di SDS – PAGE trên gel polyacrylamid 12,5%. 2.3.3. Chế tạo que thử phát hiện nhanh một số loại độc tố SE và thử nghiệm để phát hiện độc tố SE trên thực phẩm đƣợc gây nhiễm thực nghiệm Các bƣớc trong quy trình tạo que thử để phát hiện nhanh 5 loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên thực phẩm đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.4 dƣới đây: Hình 2.4 : Sơ đồ các bước tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên thực phẩm 2.3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của tụ cầu - Thiết kế bộ que thử: + Gắn cộng hợp nanocarbon cho độc tố SEC1 tái tổ hợp. 67 + Cố định kháng thể vạch thử nghiệm (IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E)) và kháng thể vạch kiểm chứng (IgY kháng BSA) lên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vị trí 25mm và 30 mm kể từ đầu que thử (Hình 2.5) + Gắn các hợp phần của que thử: màng nitrocellulose, giấy thấm lên tấm lót plastic, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm. Hình 2.5. Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu - Nguyên lý của bộ sinh phẩm: + Nếu độc tố không có trong mẫu phân tích, thì khi kháng nguyên SEC1 – nanocarbon di chuyển lên phía trên que thử, đi về phía vùng kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) sẽ gắn với kháng thể. Sự xuất hiện màu ở vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố tụ cầu. Ngƣợc lại, độc tố có trong mẫu phân tích, chúng sẽ cạnh tranh vị trí gắn với kháng nguyên cộng hợp để gắn với kháng thể tại vạch thử nghiệm. Do đó, sự không xuất hiện màu ở vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu phân tích chứa độc tố ruột tụ cầu. + Trong quy trình gắn nanocarbon-SEC1, BSA đƣợc bổ sung vào để phong bế các vị trí có thể liên kết với protein của nanocarbon. Do đó, khi cộng hợp nanocarbon dịch chuyển lên vạch kiểm chứng đƣợc cố định kháng thể IgY kháng BSA thì BSA có 68 gắn nanocarbon sẽ liên kết với kháng thể kháng BSA nên xuất hiện màu ở vạch kiểm chứng trên que thử. Kế t quả phân tić h đƣơ ̣c đánh giá dƣ̣a vào viê ̣c xu ất hiện vạch. Kết quả đƣơ ̣c coi là dƣơng tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng . Ngƣơ ̣c la ̣i, kế t quả đƣơ ̣c coi là âm tính nếu xuất hiện tín hiệu tại cả vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng . * Gắn cộng hợp nanocarbon cho kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp Kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc gắn với hạt nano carbon 100 nm theo khuyế n cáo của n hà sản xuất (Maiia Diagnostics). Quy trình chuẩ n bi ̣ đƣơ ̣c tóm tắ t nhƣ sau: dung dịch huyền phù carbon nồ ng đô ̣ 10 mg/ml đƣợc pha loañ g 10 lầ n trong dung dich ̣ đê ̣m borat 5 mM, pH 8,5 để thu nhận dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Tiếp đó, dung dịch huyền phù này đƣợc siêu âm trong 2 phút bằng máy siêu âm Sonics VibraCell với 30% biên đô .̣ Sau đó, 50 µg SEC1 chứa trong thể tích 500 μl dung dịch đệm borat 5 mM; pH 8,5 đƣợc trộn đề u với 500 µl dung dịch huyền phù ha ̣t carbon 1mg/ml. Sau khi ủ 1 giờ ở 30oC, hỗn hợp đƣợc bổ sung 1% BSA và tiếp tục trộn trong 30 phút. Hỗn hợp đƣợc rửa bằng cách ly tâm 14.000 g trong 20 phút, loại bỏ dịch nổi, thêm vào 500 μl dung dịch đệm bảo quản (đệm borat 100 mM; pH 8,5, 1% BSA; 0,02% NaN3). Bƣớc rửa đƣợc lặp lại 3 lần. Phức hợp phát hiện kháng nguyên nano carbon đƣợc chứa trong 500 μl dung dịch đệm bảo quản, để trong bóng tối, ở 4°C. * Cố định kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) và IgY kháng BSA lên màng nitrocellullose Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên các lá vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman). Kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) và kháng thể IgY kháng BSA đƣợc phun lên trên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vạch thử nghiệm và va ̣ch kiể m chƣ́ng b ằng thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). Ở vị trí vạch thử nghiệm trên màng, lƣơ ̣ng kháng thể đƣợc phun lên màng từ 0,2 µg; 0,6 µg đến 2 µg/que thử, ở vạch kiểm chứng , lƣợng kháng thể đƣợc phun là 0,04 µg; 0,12 µg và 0,4µg/que thử. Vị trí cố định c ủa vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng lần lƣợt là 25mm và 30 mm kể từ đầu que thử. Sau đó, màng đƣợc ủ ở 37oC qua 69 đêm để làm khô. Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Autokun. - Lựa chọn lượng kháng thể in lên vạch kiểm chứng Kháng thể IgY từ lô gà tiêm kháng nguyên BSA sau khi tinh sạch đƣợc cố định lên vạch kiểm chứng của que thử với liề u lƣơ ̣ng khác nhau: 0,4 µg; 0,12 µg và 0,04 µg /que thƣ̉ . Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích với liều lƣợng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm ch ạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3). - Lựa chọn lượng kháng thể in lên vạch thử nghiệm Kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) sau khi tinh sạch đƣợc cố đinh ̣ lên vạch thử nghiệm với liề u lƣơ ̣ng khác nhau : 0,2 µg; 0,6 µg và 2 µg /que thƣ̉ . Vạch kiểm chứng đƣợc in kháng thể IgY kháng BSA với hàm lƣợng là nồng độ đƣợc lựa chọn ở kết quả thí nghiệm lựa chọn lƣợng kháng thể in lên vạch kiểm chứng (hàm lƣợng kháng thể thấp nhất mà cho vạch kiểm chứng rõ nét). Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích mẫu âm tính với liều lƣợng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm chạy. 2.3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử * Xác định giới hạn phát hiện của que thử nhanh - Pha loãng các độc tố nguyên chất (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) với nồng độ từ 1 đến 1000 ng/ml (1; 3; 10; 30; 100; 300; 1000 ng/ml). Mỗi mẫu phân tích đƣợc nhiễm chủ động một trong các nồng độ độc tố trên cho vào trong100 µl dung dịch đệm chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20) và đƣợc đƣa vào các điã vi giế ng ELISA. - Cắm que thử vào giếng và ủ trong 5 phút. Sau đó thêm 2 µl dung dich ̣ cô ̣ng hơ ̣p phát hiê ̣n vào giế ng , đảo trô ̣n đề u và que thƣ̉ đƣơ ̣c tiếp tục nhúng vào giế ng và ủ trong 15 phút để toàn bộ lƣợng dung dịch trong giếng đƣợc hút cạn. Đọc kết quả. - Nồng độ của độc tố SE thấp nhất cho kết quả dƣơng tính đƣợc xác định là giới hạn phát hiện của que thử. * Đánh giá độ ổn định của que thử nhanh 70 Que thử đƣợc chia lô và bảo quản trong điều kiện khác nhau bao gồm: bảo quản ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC, sau đó thử nghiệm khả năng phát hiện của que thử với độc tố chuẩn SE ở những khoảng thời gian 1 tháng lấy mẫu một lần để kiểm tra, trong 6 tháng. 2.3.3.3. Thử nghiệm que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE * Chuẩn bị mẫu - Đối với mẫu sữa tƣơi tiê ̣t trùng: Pha loañ g sữa tƣơi tiệt trùng trong đê ̣m cha ̣y (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3), theo các tỷ lệ sữa: đệm chạy tƣơng ứng là: 1:0; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9. Sau đó lấ y 100 µl dịch thu đƣơ ̣c cho vào giế ng , sử dụng lƣợng kháng nguyên cộng hợp đã tối ƣu hóa để thử nghiệm. Mức độ pha loãng sữa thích hợp là mức độ pha loãng sữa thấp nhất mà tại đó vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm của que thử xuất hiện rõ nét. - Đối với mẫu thịt : Tiế n hành xay hoă ̣c nghiề n miṇ sản phẩ m thịt lợn trong cố i sƣ́, sau đó cân 3 g sản phẩm trong mỗi ống Falcon 50 ml, gồm 8 ống. Bổ sung độc tố SEC1 với các nồng độ 30, 60, 90 và 120 ng/g lần lƣợt vào 4 ống, 4 ống không bổ sung độc tố.Thêm dung dich ̣ đê ̣m chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3) vào mỗi ống lần lƣợt theo các tỷ lê ̣ thịt: đệm chạy tƣơng ứng là 1: 2; 1: 4; 1: 6 và 1: 8 rồ i tiế n hành đảo trô ̣n đề u . Tiến hành song song các kiểm chứng âm tính với các tỷ lệ trên. Tiế p đó , lọc dung dịch thu đ ƣợc bằng giấy lọc . Chuyể n 100 µl dịch lọc vào giếng . Tiến hành phân tích các mẫu này bằng que thử. Tỷ lệ pha loãng thấp nhất của mẫu thịt mà tại đó vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm xuất hiện rõ nét sẽ đƣợc sử dụng cho các thử nghiệm đối với các que thử đƣợc chế tạo. * Sử dụng que thử nhanh trên một số nhóm mẫu thực phẩm được gây nhiễm độc tố ruột tụ cầu với các nồng độ khác nhau - Tiến hành nhiễm chủ động các nồng độ kháng nguyên SEA; SEB; SEC1; SED và SEE tinh khiết đã đƣợc pha loãng với các nồng độ 3000 ng/ml, 900 ng/ml, 300 ng/ml, 90 ng/ml, 30 ng/ml, 9 ng/ml và 3 ng/ml vào thực phẩm (mẫu sữa, mẫu thịt). Sau 71 đó làm thử nghiệm phát hiện độc tố ruột tụ cầu SE trong thực phẩm bằng que thử nhanh, mỗi mẫu đều đƣợc thử nghiệm lặp lại 3 lần. Sơ đồ tổng hợp quá trình chế tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu trên thực phẩm đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 dƣới đây: Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quy trình chế tạo que thử 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 72 Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê và xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel. Các chỉ số đƣa ra trong quá trình phân tích: tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn p. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ S. aureus Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng S. aureus P240 (Hình 3.1) cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên cao, đó chính là DNA tổng số của S. aureus. Ngoài ra, bên dƣới xuất hiện một dải băng sáng mờ hơn DNA tổng số có thể là DNA plasmid, RNA có kích thƣớc nhỏ, những hợp phần này đã chạy nhanh hơn so với các DNA tổng số nên nằm ở phía dƣới. Nhƣ vậy, quy trình tách chiết đã thu đƣợc sản phẩm DNA đạt chất lƣợng để sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1. Hình 3.1. Điện di đồ DNA tổng số tách từ S. aureus M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: DNA tổng số S. aureus 73 3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen sec1, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pGS-21a, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym giới hạn BamHI và HindIII (các enzym có trong trình tự đoạn polylinker của vector pGS-21a) không có trong trình tự gen sec1 của S. aureus. Do đó, trình tự điểm cắt của 2 enzym BamHI và HindIII đƣợc bổ sung lần lƣợt vào đầu 5’ của cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc tƣơng ứng. Trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen sec1 với các thông số đƣợc thể hiện nhƣ sau: Mồi xuôi SEC-F (5'-TTTGGATCCGAGAGCCAACCAGACCCT-3') và mồi ngƣợc SEC-R (5'- TATAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGGAC-3'), chữ đƣợc gạch chân là trình tự nhận biết của enzym giới hạn. Các đoạn mồi này đƣợc dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1 từ DNA tổng số và phản ứng PCR sàng lọc những chủng đƣợc biến nạp thành công. Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ S. aureus, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%, kết quả thể hiện ở Hình 3.2. Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2% M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1 Kế t quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose (Hình 3.2) cho thấ y với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã thu đƣợc sản phẩm PCR duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 800 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi (kích thƣớc của gen sec1 là 801 bp). Nhƣ vậy, đoạn DNA mang gen mã hóa protein SEC1 đã đƣợc khuyếch đại 74 đặc hiệu. Kết quả này chứng tỏ chƣơng trình và cặp mồi khuếch đại gen mã hóa cho protein SEC1 đã đƣợc thiết kế hợp lý về mặt lý thuyết và kỹ thuật. Sản phẩm PCR này đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3. Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec1 * Cắt đoạn gen sec1 bằng các enzym giới hạn Sản phẩm của phản ứng PCR sau khi tinh sạch đƣợc cắt bằng enzym giới hạn BamHI và HindIII, kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose 1.2%. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch đƣợc thể hiện trên điện di đồ (Hình 3.3) chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc trong khoảng 800 bp, tƣơng đƣơng kích thƣớc của gen sec1, không có sản phẩm phụ, đo đó có thể làm nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu hiện. Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1 sau tinh sạch * Cắt plasmid pGS-21a bằng enzym giới hạn Chúng tôi tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn BamHI và HindIII để tạo vết cắt giống với đoạn gen sec1 sẽ đƣợc cài vào. 75 Hình 3.4. Điện di đồ plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn M: thang DNA chuẩn 1kb; 1: plasmid pGS-21a sau cắt chưa tinh sạch, 2: plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch. Kết quả điện di ở Hình 3.4 cho thấy plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch đạt yêu cầu để sử dụng biến nạp, là một băng duy nhất có kích thƣớc gần tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pGS-21a (6169 bp) nhƣ trong lý thuyết. * Nối đoạn gen sec1 vào vector pGS-21a Đoạn gen sec1 sau khi cắt bằng enzym giới hạn đƣợc nối vào vector pGS-21a bởi xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối là plasmid pGS-21a - sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21. Nhờ đặc tính của các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu nên chúng đƣợc sử dụng cho quá trình cắt và nối với gen sec1 và vector pGS-21a, tạo đầu dính phù hợp cho đoạn gen thu đƣợc sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR, tạo liên kết đầu dính phù hợp với vector biểu hiện pGS-21a. Tính bổ sung giữa những phần nhô ra (overhang) và các trình tự bổ sung cho phép gen sec1 có thể hòa nhập với vector thành vector tái tổ hợp một cách dễ dàng dƣới tác dụng của enzym T4 DNA ligase. Plasmid pGS-21a đƣơ ̣c thiế t kế để làm vectơ biể u hiê ̣n protein tá i tổ hơ ̣p trong Escherichia coli, với promoter T7 đƣơ ̣c cảm ƣ́ng bởi IPTGđể tổng hợp protein SEC1 có hiệu suất cao, có chứa gen kháng ampicilline làm gen chỉ thị, chọn lọc. Trên plasmid nàycó các trình tự mãhóa, cho phép ta ̣o ra độc tố SEC1 tái tổ hợp có dạng dung hợp đuôi GST- His dễ tách chiết và tinh sạch. 76 3.1.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEC1 vào E. coli BL21 Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trƣờng LB có ampicillin. Trên môi trƣờng thạch LB, ứng với mẫu E. coli đã đƣợc biến nạp thấy xuất hiện khoảng 50 khuẩn lạc. Trong khi đó, ở mẫu E. coli chƣa đƣợc biến nạp, không thấy xuất hiện khuẩn lạc nào. Tất cả các khuẩn lạc trên là những khuẩn lạc đƣợc biến nạp chứa gen kháng ampicillin và số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc cũng đủ cho các nghiên cứu tiếp theo. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony - PCR Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1, với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đƣợc sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid tái tổ hợp ở các dòng khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra, kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.5. Hình 3.5 Điện di đồ sàng lọc khuẩn lạc mang pGS-21a-sec1 bằng colony PCR M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: sản phẩm PCR từ DNA của các mẫu khuẩn lạc thu được; (-): đối chứng âm. Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.5 cho thấy ở các giếng 1-5 đều xuất hiện 1 vạch sáng, rõ nét ở vị trí khoảng 800 tƣơng ứng với kích thƣớc của đoạn gen sec1 (801 bp). Nhƣ vậy, việc biến nạp plasmid tái tổ hợp pGS-21a-sec1 vào trong tế bào E. coli BL21 đã thành công. 77 Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen Do các đột biến có thể phát sinh trong quá trình thiết kế vector nên những khuẩn lạc đã xác định có đoạn gen sec1 đƣợc lựa chọn để tách chiết plasmid, các plasmid mang gen sec1 đƣợc giải trình tự và đối chiếu với trình tự trên GeneBank của NCBI. Những plasmid không mang bất cứ đột biến nào đƣợc lựa chọn để biểu hiện protein SEC1. Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự gen của đoạn gen biến nạp sec1 Kết quả giải trình tự của đoạn gen sec1 (hình 3.6) cho thấy các đỉnh rõ nét và tƣơng đối đồng đều. So sánh với trình tự GeneBank có độ tƣơng đồng là 100%. Kết quả biểu hiện gen sec1 trong tế bào E. coli BL21 78 Gen sec1 trong vector biểu hiện hoạt động dƣới sự điều khiển của T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) có trong môi trƣờng. Để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin, lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,6 thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 30o C trong 5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel polacrylamide. Hình 3.7. Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp M: thang protein chuẩn; 1: Đối chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli BL21); 2: Protein tan trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS21a-sec1 được cảm ứng IPTG. Kết quả kiểm tra protein tổng số của dòng tế bào mang pGS-21a-sec1 và dòng đối chứng đƣợc trình bày ở Hình 3.7 cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh với thang protein chuẩn, kết quả này phù hợp với protein mà chúng tôi mong đợi, cụ thể là: SEC1 trong trạng thái dung hợp với đuôi GST và 1 vùng đuôi His (6 axit amin Histidin) có khối lƣợng là 57 kDa (SEC1 có khối lƣợng khoảng 28 kDa, đuôi His – GST có khối lƣợng khoảng 29 kDa). Điều này chỉ ra rằng protein tái tổ hợp đƣợc tạo ra có kích thƣớc hoàn toàn phù hợp với các tính toán lý thuyết. 79 3.1.5. Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E. coli Để thu đƣợc lƣợng SEC1 nhiều và có hoạt tính sinh học cao, các điều kiện nuôi tế bào E. coli chuyển gen nhƣ nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng đƣợc tiến hành khảo sát nhằm chọn điều kiện thích hợp cho biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp. - Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng hàng đầu đến sinh tổng hợp và chất lƣợng protein tái tổ hợp. Nhiệt độ càng cao thì lƣợng mARN càng dễ bị phá hủy và khả năng đào thải plasmid càng lớn. Trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp là một trong những điều kiện rất quan trọng cho việc ứng dụng. Thông thƣờng, các protein tồn tại ở dạng hòa tan sẽ giữ đƣợc hoạt tính sinh học và tính sinh miễn dịch cao do không bị biến đổi cấu trúc trong quá trình tinh chế và thu nhận protein. Ngƣợc lại, đối với nhiều loại protein khi đƣợc biểu hiện quá mạnh trong tế bào, thì các protein khác vốn giúp hình thành cấu trúc đúng của protein tái tổ hợp không đáp ứng đủ, dẫn đến hình thành cấu trúc bậc ba sai lệch, protein tạo ra không có hoạt tính sinh học. Theo lý thuyết, protein đƣợc biểu hiện dƣới dạng không tan thƣờng có cấu trúc sai lệch. Vì vậy cần phải lựa chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp để thu nhận đƣợc tối đa lƣợng protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học. Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy E. coli BL 21 nhằm biểu hiện protein ngoại lai là từ 16oC đến 37oC, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 30oC và 37oC với nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG và thu mẫu sau 5 giờ. Lƣợng tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc chuẩn về cùng một OD600 là 10 để so sánh protein tổng số giữa các mẫu nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau. Dịch chiết thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel acrylamide 12,5%. 80 Hình 3.8. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau M: thang protein chuẩn; 1: Protein tan tổng số ở 37oC; 2: Protein tan tổng số ở 30oC. Kết quả trên hình 3.8 cho thấy ở giếng số 2 xuất hiện băng protein SEC1 đậm hơn so với ở giếng số 1, điều đó chứng tỏ hàm lƣợng protein SEC1 dạng hòa tan trong điều kiện nhiệt độ 30oC nhiều hơn so với ở điều kiện 37oC. Vì vậy, nhiệt độ 30oC đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.  Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG Chất cảm ứng IPTG đƣợc sử dụng nhƣ một yếu tố trung hòa chất ức chế. Tuy nhiên, IPTG ở nồng độ cao có thể gây độc cho tế bào và ức chế tế bào sinh trƣởng. Vì vậy, khi thêm IPTG vào quá trình nuôi cấy chỉ nên cho lƣợng vừa đủ để trung hòa chất ức chế mà không gây ảnh hƣởng cho sự sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của tế bào. Bên cạnh đó, do IPTG có giá thành cao nên việc xác định nồng độ IPTG thích hợp nhất cho nghiên cứu cũng có giá trị thiết thực khi áp dụng sản xuất độc tố ở quy mô lớn. Hình 3.9. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các điều kiện IPTG khác nhau 1-7: Protein tan tổng số trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-21asec1 được cảm ứng ở các nồng độ IPTG lần lượt là 1mM; 0,9 mM; 0,7mM; 0,5mM; 0,3mM; 0,1mM; 0,05mM, 8: chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E. coli BL21 không bổ sung IPTG), 9: thang protein chuẩn. 81 Kết quả kiểm tra lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp khi chủng E. coli mang gen sec1 đƣợc cảm ứng ở 0,05 - 1mM IPTG (Hình 3.9) cho thấy sản lƣợng protein SEC1 không bị ảnh hƣởng nhiều bởi các nồng độ chất cảm ứng đã đƣợc thí nghiệm, ít có sự sai khác về sản lƣợng protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, tại các nồng độ khác nhau của chất cảm ứng thì sự biểu hiện của nồng độ protein vẫn có sự khác nhau: ở nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM đến 1mM thì nồng độ protein biểu hiện là cao hơn so với 3 nồng độ 0,05 mM; 0,1 mM và 0,3 mM. Vì thế để thu đƣợc sản lƣợng protein tái tổ hợp cao nhất mà vẫn tiết kiệm đƣợc lƣợng IPTG cần sử dụng, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG cho chủng mang gen sec1 là 0,5 mM (giếng 4).  Xác định thời điểm thích hợp để thu sản phẩm biểu hiện Protein tái tổ hợp bắt đầu đƣợc tổng hợp từ pha log ngay sau khi bổ sung IPTG vào môi trƣờng. Trong quá trình nuôi cấy, khi tế bào sinh trƣởng tới một mức sinh khối nhất định ở pha cân bằng, là khoảng thời gian mà nguồn dinh dƣỡng bị cạn dần, nên tế bào có khuynh hƣớng tiết nhiều protease để phân hủy tế bào chết và chuyển hóa các sản phẩm phụ thành nguồn dinh dƣỡng để duy trì tế bào. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lƣợng protein tái tổ hợp cũng giảm đi, lƣợng protein tái tổ hợp chỉ đạt tối đa ở một thời điểm nhất định. Do đó, cần phải xác định thời điểm thích hợp để thu nhận hàm lƣợng protein SEC1 tái tổ hợp. Hình 3.10. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 82 M: thang protein chuẩn, 1-4: Protein tan tổng số trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-21a-sec1 được nuôi cấy ở các điều kiện thời gian lần lượt là: 8h; 5h; 2h; 0h Trong thí nghiệm này, chủng tái tổ hợp mang gen sec1 đƣợc cảm ứng với 0,5mM IPTG và nuôi cấy ở 30oC để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Tế bào đƣợc thu ở các thời điểm khác nhau: 0, 2, 5, 8 giờ để kiểm tra lƣợng SEC1 pha tan trên gel polyacrylamide nhằm xác định thời gian thích hợp cho việc thu nhận protein tái tổ hợp. Kết quả (Hình 3.10) cho thấy lƣợng protein tái tổ hợp SEC1 đƣợc tổng hợp lớn nhất sau 8 giờ cảm ứng. Nhƣ vậy, điều kiện thích hợp để cảm ứng biểu hiện protein SEC1 trong chủng biểu hiện E. coli BL21 là ở nhiệt độ 30oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM và thu protein sau 8 giờ cảm ứng. 3.1.6. Tinh sạch protein SEC1 tái tổ hợp Nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn SEC1 để tinh sạch, các điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng E. coli BL21 mang vector pGS-21a-sec1 đã đƣợc ứng dụng để cảm ứng biểu hiện protein SEC1. Sau khi biểu hiện, các tế bào đƣợc phá vỡ bằng sóng siêu âm và tiến hành ly tâm 10.000g trong 15 phút để tách riêng pha cặn và pha dịch. Dịch nổi thu đƣợc dùng để phân tích protein tan và phần cặn đƣợc hòa với lƣợng nƣớc tƣơng ứng để kiểm tra protein không tan. Kiểm tra trên gel acrylamide cho thấy lƣợng protein SEC1 biểu hiện ở dạng hòa tan là đủ để tiến hành tinh sạch (Hình 3.11) 83 Hình 3. 11. Điện di đồ khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 tan của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở 30oC 1: Protein tan tổng số; 2: Protein không tan tổng số ; 3: Protein tổng số mẫu đối chứng âm không cảm ứng IPTG; M: thang protein chuẩn Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp SEC1 phục vụ cho mục đích chẩn đoán, protein tái tổ hợp ở pha hòa tan phải đƣợc tinh sạch. Protein SEC1 tái tổ hợp có gắn với 6 histidin ở đầu N nên có thể đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực với đuôi His, sử dụng Kit His Mag SepharoTMNi. Trong quá trình tinh chế, imidazol đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ trong phức hợp Ni2+histidine. Một số protein của chủng chủ có mang histidine nên cũng có ái lực với Ni2+ trên cột. Tuy nhiên, lực liên kết của các protein này với Ni2+ yếu hơn nhiều so với của protein tái tổ hợp có đuôi His chứa 6-histidine liền kề nhau ở đầu N làm tăng ái lực với Ni2+ lên nhiều lần. Các protein có ái lực yếu hơn sẽ bị đẩy ra khỏi cột nhờ nồng độ imidazol trong đệm rửa. Các protein bám không đặc hiệu đƣợc loại bỏ bằng cách rửa nhiều lần với đệm rửa có nồng độ imidazol tăng dần. Để thu đƣợc độc tố SEC1 tái tổ hợp có độ tinh sạch cao, chúng tôi khảo sát nồng độ imidazol trong đệm rửa ở một số nồng độ (20; 30;40; 50; 60 mM) trong khoảng nồng độ imidazol đƣợc nhà sản xuất Kit khuyến cáo (20 ÷ 60 mM) với quy trình tinh sạch protein cho độ tinh sạch cao. Hình 3.12. Điện di đồ protein SEC1 tinh sạch ở các nồng độ imidazol khác nhau M: thang protein chuẩn, 6: mẫu protein trước khi tinh sạch, 1-5: các nồng độ imidazol trong đệm rửa lần lượt là: 60mM; 50mM; 40mM, 30mM và 20mM. Kết quả khảo sát nồng độ imidazol của đệm rửa thể hiện ở Hình 3.11 cho thấy ở nồng độ imidazol là 20 mM (giếng 5) còn xuất hiện nhiều băng protein khác của vi 84 khuẩn E. coli xung quanh băng protein SEC1, ngƣợc lại từ nồng độ ≥ 30 mM imidazol (giếng 1-4) chỉ có một băng protein duy nhất, điều đó chứng tỏ rằ ng các protein lẫn trong dịch chiết protein tái tổ hợp tan đã đƣợc loại bỏ hiệu quả ở các nồng độ đệm rửa 30, 40, 50, 60 mM imidazol. Bên cạnh đó, kích thƣớc băng protein SEC1 tái tổ hợp đã đƣợc tinh sạch giảm dần từ giếng 4 đến giếng 1. Điều này chứng tỏ ở nồng độ imidazol đệm rửa là 30 mM, hầu hết các protein tạp nhiễm bị đẩy ra khỏi cột, trong khi đó SEC1 vẫn bám đặc hiệu. Tuy nhiên, khi nồng độ imidazol trong đệm rửa tiếp tục tăng lên từ 40 – 60 mM imidazol thì ngoài protein tạp nhiễm, một phần SEC1 cũng bị đẩy ra khỏi cột. Nhƣ vâ ̣y, ở nồng độ imidazol trong đệm rửa là 30mM quá trình tinh sa ̣ch đã thu đƣợc protein SEC1 tái tổ hợp có hàm lƣợng protein và độ tinh sạch cao, không tạp nhiễm các protein của vi khuẩn, thể hiện bởi một băng protein đậm, rõ nét trên gel không có băng protein tạp nhiễm, có thể phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.7. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng phản ứng Western Blot Protein SEC1 tái tổ hợp đƣợc kiểm tra tính kháng nguyên thông qua phản ứng Western Blot, song song với SEC chuẩn nhằm minh chứng protein tái tổ hợp thu đƣợc từ nghiên cứu có phải là protein SEC1 và giữ đƣợc đặc tính kháng nguyên của chúng, có phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng SEC hay không. 85 Hình 3.13. Kết quả chất lượng protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot. M: thang protein chuẩn, 1: đối chứng âm (protein BSA); 2: protein SEC1 sản xuất trong nghiên cứu; 3: đối chứng dương (protein SEC1 chuẩn) Kết quả (hình 3.13) cho thấy độc tố protein tái tổ hợp SEC1 đƣợc sản xuất từ nghiên cứu có phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng SEC, thể hiện bởi băng duy nhất phản ứng đậm trên màng có khối lƣợng trong khoảng 55-72 kDa, là phù hợp với protein SEC1 tái tổ hợp (57 kDa). Nhƣ vậy, quá trình sản xuất và tinh chế độc tố ruột SEC1 tái tổ hợp đã thu đƣợc protein SEC1 dạng dung hợp với đuôi His-GST có độ tinh sạch cao. 3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IgY Để làm nguyên liệu cho sản xuất que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm, chúng tôi đã tạo kháng thể IgY đặc hiệu với BSA và kháng thể IgY kháng lại năm loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE. 3.2.1. Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà Gà Legorhn có tính sinh miễn dịch tƣơng đối mạnh, trong nghiên cứu của T. Diraviyam năm 2011 đã đƣợc lựa chọn để sản xuất kháng thể IgY kháng độc tố ruột của Samonella [101]. Trong quy trình sản xuất kháng thể IgY của Agro-Bio, giống gà đƣợc lựa chọn là gà Legorhn. Chúng tôi đã áp dụng quy trình gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu của Agro-Bio, nên gà mái trắng, thuần chủng giống Legorhn đã đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu. Đây là giống gà đƣợc Công ty cổ phần Giống gia cầm Ba Vì giữ giống thuần chủng và phân phối. Việc nuôi dƣỡng và chăm sóc gà trong thời gian từ lúc mới nở đến khi đẻ trứng quyết định tuổi đẻ trứng đầu, số trứng đẻ ra và trọng lƣợng trứng. Gà đƣợc nuôi nhốt và ăn thức ăn đảm bảo vệ sinh, phù hợp với từng độ tuổi của gà nhƣ giai đoạn gà con (trong một tháng đầu tiên), giai đoạn gà hậu bị (từ tuần thứ 5 đến tuần 18), giai đoạn gà đẻ. Gà Legorhn bắt đầu đẻ trứng ở tuần tuổi thứ 18 đến tuần tuổi thứ 20, thời gian trung bình từ khi bắt đầu đẻ trứng đến khi ngừng đẻ thƣờng kéo dài khoảng 12 - 18 tháng. Để bảo đảm sức khỏe của gà trong thời gian sinh kháng thể đặc hiệu, việc gây miễn dịch với các mầm bệnh thƣờng gặp ở gà đƣợc tiến hành trƣớc khi gây miễn dịch chính thức để sản xuất kháng thể đặc hiệu [93]. Đối tƣợng 86 nghiên cứu của đề tài này cũng đã đƣợc gây miễn dịch với một số loài virus thƣờng gây bệnh ở gà (Marek, Newcastle, Gumboro, H5N1) trƣớc thời điểm gà đẻ trứng. Để tiến hành nuôi gà, các vấn đề nhƣ lựa chọn giống, cách nuôi dƣỡng, chăm sóc và quy trình phòng bệnh cho gà đã đƣợc tìm hiểu và thực hiện. Kết quả là toàn bộ số gà nghiên cứu đều sống và đẻ trứng đều đặn cho đến hết thời gian thí nghiệm. Trong giai đoạn nuôi để lấy kháng thể, 6 con gà thí nghiệm không bỏ ăn, không bị ốm hoặc bị tiêu chảy và không có biểu hiện bất thƣờng nào. 3.2.2. Cách gây miễn dịch và thu hoạch trứng Cách gây miễn dịch Hiệu quả sinh kháng thể IgY đặc hiệu bị ảnh hƣởng bởi các yếu tố liên quan trong cách gây miễn dịch nhƣ kháng nguyên, tá dƣợc, tiêm chủng. Kháng nguyên là protein có tính sinh miễn dịch cao và cần có độ tinh sạch cao [96]. Nghiên cứu này sử dụng kháng nguyên là BSA và các độc tố ruột tụ cầu có bản chất là protein và là sản phẩm thƣơng mại nên có độ tinh sạch cao. Hơn nữa, theo khuyến cáo của nhóm chuyên gia của trung tâm phê chuẩn phƣơng pháp mới của Châu Âu (European Centre for the Validation of Alternative Methods: ECVAM): thể tích tiêm trong mỗi lần tiêm gà không nên quá 1 ml, trong đó nồng độ kháng nguyên giao động khác nhau (từ 10 ng đến 1mg), số lần tiêm 2 – 3 lần tùy vào bản chất của kháng nguyên [93]. Nghiên cứu này sử dụng thể tích tiêm 0,5 ml cho một vị trí tiêm và tiêm ở hai vị trí trong mỗi lần tiêm chủng, phù hợp với thể tích đƣợc khuyến cáo. Nồng độ kháng nguyên và số lần tiêm để gây miễn dịch là khác nhau: với BSA, nồng độ là 1mg/ml; với 5 loại độc tố ruột tụ cầu là 100ng/ml. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng BSA tiêm chủng cho gà [83, 93], nồng độ protein BSA đƣợc tiêm là 1mg/ml là nồng độ thích hợp và số lần tiêm là 3 lần phù hợp cho sản xuất kháng thể IgY. Ngƣợc lại, với các độc tố ruột tụ cầu, do có hoạt tính siêu kháng nguyên nên để an toàn cho gà, hạn chế ảnh hƣởng xấu tới khả năng đẻ trứng, chúng tôi chọn nồng độ thấp trong khoảng nồng độ đƣợc khuyến cáo của liều kháng nguyên để gây miễn dịch (20ng/ một loại độc tố SE) và số lần tiêm là 2 lần. Bên cạnh đó, tá dƣợc FCA đƣợc lựa chọn sử dụng cho mũi tiêm đầu, còn các mũi tiêm sau 87 sử dụng tá dƣợc FIA, đây cũng là cách làm phổ biến đƣợc thực hiện trong nhiều nghiên cứu cho hiệu quả kích thích miễn dịch sinh kháng thể mạnh ở gà mái. Cách thức này phù hợp với các nghiên cứu khác ở trong nƣớc và trên thế giới [9, 84, 101]. Thu hoạch trứng có nồng độ kháng thể cao Theo một số nghiên cứu đã tiến hành trên thế giới, thời điểm thu hoạch trứng siêu miễn dịch có thể bắt đầu sớm nhất là 1 tuần sau lần tiêm đầu tiên, nhƣng hiệu giá IgY cao nhất ở tuần thứ 3 sau khi tiêm lần đầu và ở tuần thứ 2 sau khi tiêm nhắc lại [26]. Do đó, trứng nên đƣợc thu hoạch một cách phù hợp sau lần tiêm thứ 2 [92]. Sau khi gây miễn dịch, IgY đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh gà khoảng 4 ngày sau khi tiêm kháng nguyên và đạt hiệu giá tối đa sau 6 đến 8 ngày sau tiêm và giảm dần sau đó, đƣợc vận chuyển qua ống dẫn trứng vào lòng đỏ trứng khoảng 5- 6 ngày [92]. Vì vậy, chúng tôi đã thu trứng từ ngày thứ 12 sau lần tiêm nhắc lại đến sau 14 ngày đối với các lô gà thí nghiệm đƣợc sử dụng cho quá trình tinh sạch IgY. Đây là khoảng thời gian gà đẻ những quả trứng có nồng độ kháng thể IgY đặc hiệu cao. 3.2.3. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY Độ tinh sạch của sản phẩm IgY sau các bƣớc tách chiết và tinh sạch qua cột sắc ký đƣợc đánh giá bằng kỹ thuật SDS- PAGE trong điều kiện biến tính, kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.13. Hình 3.14. Điện di đồ kháng thể IgY sau mỗi bước tinh sạch Giếng 1: IgY thu được sau tinh sạch qua cột sắc ký; Giếng 2: Dịch rửa cột sau khi cho mẫu vào; Giếng 3: IgY sau tinh sạch bằng phương pháp của Petr Hodek; M: 88 thang protein chuẩn. Hình ảnh điện di trên gel polacrylamide (Hình 3.14) cho thấy kháng thể IgY thu đƣợc sau tinh sạch bằng phƣơng pháp do Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013 có độ tinh sạch cao (giếng 3), chỉ thấy xuất hiện hai băng protein với kích thƣớc khoảng 67 kDa và khoảng 25 kDa, phù hợp với kích thƣớc chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY, không thấy xuất hiện băng protein tạp. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của PetrHokder. Bên cạnh đó, sản phẩm IgY thu đƣợc sau sắc ký là tinh sạch nhất (giếng 1) vì ngoài hai băng protein của kháng thể IgY tƣơng tự nhƣ ở giếng 3, thì nền gel nằm giữa hai băng của giếng 1 có màu sắc sáng rõ hơn so với khoảng cách này ở giếng 3. Sản phẩm kháng thể IgY kháng BSA và IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) này đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu tạo que thử nhanh của các bƣớc nghiên cứu tiếp theo. Kháng thể IgY đƣợc đo nồng độ kháng thể sau tinh sạch bằng máy quang phổ. Sau khi hoàn thành quá trình tinh sạch IgY bằng phƣơng pháp do Petr Hokder tối ƣu, lƣợng protein thu đƣợc sau tinh sạch là 9,1 mg/ml dịch lòng đỏ trứng. Mỗi quả trứng có khoảng 10 đến 15ml lòng đỏ tƣơng đƣơng với 91 - 136,5 mg IgY. Kết quả đo lƣợng kháng thể IgY sau khi tinh sạch qua cột đạt là 5,94 mg/1ml dịch lòng đỏ. Vậy sau khi tinh sạch qua cột sắc ký lƣợng kháng thể IgY còn thu đƣợc là: 59,4mg đến 98,05 mg/ mỗi qủa trứng. Lƣợng kháng thể thu đƣợc này phù hợp với các nghiên cứu của một số tác giả khác đã công bố, theo đó sản lƣợng IgY thu đƣợc trung bình là 7,9 – 25 mg/ml dịch lòng đỏ trứng, tùy vào phƣơng pháp tính sạch [62]. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng sau khi tinh sạch qua cột sắc ký đƣợc tính toán dựa trên sản lƣợng protein thu đƣợc sau tinh sạch qua cột sắc ký so với tổng lƣợng protein trƣớc khi đƣa lên cột là 65, 24%. Việc lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch IgY cụ thể phụ thuộc vào hiệu suất và độ tinh khiết mong muốn, ứng dụng cuối cùng của IgY, cũng nhƣ chi phí vật liệu, công nghệ, quy mô tinh chế (phòng thí nghiệm hay công nghiệp) và tác động đối với môi trƣờng (quản lý chất thải). Khi dùng các phƣơng pháp tinh sạch khác nhau sẽ thu đƣợc IgY với độ tinh sạch khác nhau: phƣơng pháp kết tủa liên quan tới pha loãng nƣớc, 89 chỉnh pH, đóng băng (-20oC), tan băng (4oC) và bổ sung ammonium sulfate sẽ thu đƣợc IgY có độ tinh sạch là 72,25% [71]; phƣơng pháp kết tủa đƣợc Petr Hodek tối ƣu hóa năm 2013 với độ tinh sạch của IgY là 97% [84]; phƣơng pháp kết tủa sử dụng PEG có độ tinh sạch là 89,39% [71]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp pha loãng đƣợc Petr Hodek tối ƣu hóa năm 2013 bởi vì nó cho phép đạt đƣợc độ tinh sạch 97%, cao hơn nhiều so với của các phƣơng pháp khác. Ngoài ra, phƣơng pháp này có thể sản xuất với quy mô lớn, giá rẻ. Nguyên tắc để tách chiết và tinh sạch IgY trong phƣơng pháp này là loại bỏ lipit trong lòng đỏ trứng nhờ quá trình gây kết tủa lạnh lòng đỏ trứng gà đã pha loãng với đệm PBS và nƣớc, chỉnh đến pH phù hợp, đóng băng và tan chậm (ở 4°C) và lọc, sau đó kết tủa phân đoạn IgY bằng NaCl (Natriclorua 8,8%) để thu đƣợc dịch chiết IgY [84]. Tan chậm là một yếu tố quan trọng đối với sự phân lớp trong những phần dung dịch nƣớc và lipit. Để có thể ứng dụng cho kỹ thuật sắc ký miễn dịch, kháng thể phải có độ tinh sạch rất cao ( ≥ 98% ) [88]. Độ tinh khiết của IgY có thể đƣợc tăng lên nhờ sự kết hợp nhiều phƣơng pháp, ví dụ, kết tủa kết hợp với sắc ký ion. Trong đề tài luận án, hai phƣơng pháp đã đƣợc kết hợp sử dụng để tinh sạch IgY là phƣơng pháp đƣợc Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013 [84] và sau đó sử dụng dịch IgY tinh sạch này tiếp tục tinh sạch với cột sắc ký. “HiTrapTM IgY Purification HP”. 3.3. CHẾ TẠO QUE THỬ 3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) Trong sản xuất que thử, cần quan tâm việc sử dụng lƣợng nguyên liệu tối thiểu để có đƣợc sản phẩm đạt yêu cầu. Với kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh, để tăng độ nhạy của phép phân tích thì lƣợng kháng thể cần cố đinh ̣ lên màng phải vừa đủ, đảm bảo cho mẫu âm tính xuất hiện vạch thử nghiệm nhƣng không đƣơ ̣c quá dƣ. Do đó, việc xác định lƣợng kháng thể cần cố định lên các vạch kiểm chứng, vạch thử nghiệm và xác định lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng đƣợc tiến hành. 3.3.3.1. Xác định lượng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng 90 Các hàm lƣợng kháng thể IgY kháng BSA khác nhau tại vạch kiểm chứng sẽ đƣợc thử để tìm thấy sự phối hợp tốt nhất giữa kháng thể này và kháng nguyên cộng hợp sao cho với lƣợng kháng thể sử dụng ít nhất có thể cho tín hiệu rõ nét trên vạch kiểm chứng. 1.Nồng độ kháng thể là 0,4 µg /que thử 2.Nồng độ kháng thể là 0,12 µg /que thử 3.Nồng độ kháng thể là 0,04 µg /que thử Hình 3.15. Lựa chọn lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng. Kết quả phân tích (Hình 3.15) cho thấy vạch kiểm chứng xuất hiện rõ ở que thử số 1 và que thử số 2, còn ở que thử số 3 rất mờ, khó nhìn rõ bằng mắt thƣờng. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả thu đƣợc đều tƣơng tự. Vì vậy, để tiết kiệm chi phí cho việc ứng dụng sản xuất que thử trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành sử dụng nồng độ kháng thể 0,12 µg / que thử (que thử số 2). Từ lựa chọn trên có thể tính đƣợc một que thử cần 0,12 µg kháng thể kháng BSA, mỗi lòng đỏ trứng gà thu đƣợc lƣợng kháng thể khoảng 59,4 mg đến 98,05 mg. Nhƣ vậy với mỗi quả trứng thu từ gà sau khi tiêm BSA sẽ thu đƣợc lƣợng kháng thể có thể sử dụng để sản xuất đƣợc khoảng 495.000 đến 817.083 que thử. 3.3.3.2. Xác định lượng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm Tƣơng tự ở vạch kiểm chứng, các hàm lƣợng kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) khác nhau tại vạch thử nghiệm sẽ đƣợc thử để đƣa ra sự phối hợp tốt nhất giữa các kháng thể (IgY kháng BSA và IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE)) với kháng nguyên cộng hợp sao cho với lƣợng kháng thể trên vạch thử nghiệm sử dụng ít nhất có thể cho tín hiệu rõ nét ở cả vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm trên mẫu âm tính. 91 1. Nồng độ kháng thể là 2 µg/que thử 2. Nồng độ kháng thể là 0,6 µg /que thử 3. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg /que thử Hình 3.16. Lựa chọn lượng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm Kết quả phân tích (Hình 3.16) chỉ ra rằng nồng độ kháng thể thấp nhất để vạch thử nghiệm xuất hiện rõ là 0,6 µg/ que thƣ̉ , ở nồng độ 0,2 µg vẫn thấy vạch thử nghiệm nhƣng rất mờ khi nhìn bằng mắt thƣờng. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, chúng tôi đều thu đƣợc kết quả tƣơng tự. Nồng độ kháng thể IgY kháng các loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) in lên vạch thử nghiệm sẽ đƣợc sử dụng cho sản xuất que thử là 0,6 µg /que thử (que thử số 2). 3.3.3.3. Xác định lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng{tc "III.5.2. Xác đ?nh lư?ng kháng nguyên c?ng h?p c?n s? d?ng" \f C \l 3} Kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc gắn với hạt nano carbon 100 nm (Maiia Diagnostics), lƣợng độc tố là 50 µg chứa trong thể tích 500 µl phức hợp kháng nguyên-nanocarbon. Vì sử dụng phƣơng pháp cạnh tranh để phát hiện các độc tố ruột tụ cầu nên lƣợng kháng nguyên cộng hợp (cộng hợp nanocarbon - kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp) cần dùng phải có liều lƣợng ít nhất nhƣng vẫn đảm bảo mẫu âm tính xuất hiện vạch. Để xác định đƣ ợc lƣợng kháng thể cộng hợp dùng cho mỗi phản ứng, chúng tôi tiến hành sử dụng 1; 2; 3; 4; 5 ;6 ; 7; 8; 9 và 10 µl kháng nguyên cộng hợp cho mẫu âm tính. Các kết quả (Hình 3.17) chỉ ra rằng lƣợng kháng nguyên cộng hợp nhỏ nhất mà vẫn cho các tín hiệu vạch khá rõ ràng là 2µl (que thử số 9); ở nồng độ 1 µl vẫn thấy vạch thử nghiệm nhƣng mờ, khó phát hiện bằng mắt thƣờng. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sử dụng 2µl kháng nguyên cộng hợp cho một que thử, tƣơng ứng với lƣợng kháng nguyên SEC1 cần sử dụng là 0,2µg /que thử. 92 Hình 3.17. Ảnh hưởng của lượng kháng nguyên cộng hợp đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiê ̣m 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10: Lượng kháng nguyên cộng hợp sử dụng cho một phản ứng là 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 và 1 µl. Công thức phối hợp tối ƣu hóa về lƣợng kháng thể phun lên các vạch kiểm chứng (IgY kháng BSA), vạch thử nghiệm (IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) và lƣợng kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp cần sử dụng đã đƣợc khảo sát và lựa chọn lần lƣợt là: 0,12 µg/ que thử; 0,6 µg/ que thử và 0,2 µg /que thử. Để các quá trình trong HTSKMD diễn ra chính xác, điều quan trọng là chất phản ứng gắn đúng vị trí mong muốn tại vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm. Protein cố định với nitrocellulose nhờ lực tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết kỵ nƣớc. Mô hình thƣờng đƣợc chấp nhận cho liên kết của protein với nitrocellulose là protein ban đầu hút bề mặt màng bởi lực hút tĩnh điện. Sau đó, sự cố định lâu dài đƣợc thực hiện bởi việc kết hợp của liên kết kỵ nƣớc và liên kết hydro. Phần lớn các protein mất nhiều hoạt tính miễn dịch sau khi liên kết một cách thụ động vào bề mặt màng, do không có khả năng liên kết hóa trị. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình cố định kháng thể trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch và những yếu tố này phải đƣợc xem xét khi thực hiện các xét nghiệm và xử lý màng nitrocellulose. Một số yếu tố chính đƣợc liệt kê dƣới đây: lựa chọn chất phản ứng, môi trƣờng (độ ẩm cần đƣợc duy trì cho quá trình liên kết là 25-50% tại nhiệt độ phòng) [88], các phƣơng pháp gia công màng (các phƣơng pháp in phun và sấy). Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thực hiện dựa trên sự di chuyển của chất lỏng và sự tƣơng tác đặc hiệu có ái lực cao giữa kháng nguyên và kháng thể. Để hoạt động nhƣ 93 một chất nền của phản ứng trong HTSKMD, các vật liệu phải thấm nƣớc và có dòng chảy phù hợp. Tốc độ dòng chảy không đƣợc quá nhanh, sao cho có đủ thời gian để phản ứng kháng nguyên – kháng thể xảy ra. Một số lƣu ý về tốc độ thấm hút cần quan tâm khi thiết kế que thử: 1. Tốc độ dòng tăng thì thời gian phản ứng sẽ giảm, tỷ lệ phản ứng giảm, độ nhạy giảm, lƣợng hóa chất phải tăng. 2. Khi mật độ kháng nguyên, kháng thể trên vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng giảm thì tốc độ dòng sẽ tăng. Bên cạnh đó, khi khoảng cách chạy mẫu (khoảng cách từ điểm tra mẫu đến vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng) càng xa thì tốc độ dòng giảm. Lựa chọn tốc độ thấm hút là quan trọng đối với động học, thời gian của các xét nghiệm và sẽ có tác động quan trọng với độ nhạy của kỹ thuật sắc ký miễn dịch. Do vậy, việc lựa chọn lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng, vạch thử nghiệm, nồng độ kháng nguyên cộng hợp phù hợp sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến độ nhạy của que thử để phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong các mẫu thực phẩm. 3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử 3.3.2.1. Xác định giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE - Xác định giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA Phƣơng pháp 1000 Que thử + 300 + Nồng độ độc tố SEA (ng/ml) 100 30 10 3 + + - 1 0 - Hình 3.18. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA 94 - 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1 ng/ml và 8: mẫu âm tính không chứa SEA. Các kết quả phân tích với độc tố tinh khiết SEA thể hiện ở Bảng 3.1 và Hình 3.18 cho thấy: ở các nồng độ 1; 3 và 10 ng/ml và mẫu kiểm chứng âm tính có xuất hiện tín hiệu ở vạch thử nghiệm (kết quả âm tính: -) còn ở các nồng độ kháng nguyên là 30; 100; 300 và 1000 ng/ml thì không thấy xuất hiện tín hiệu (kết quả dƣơng tính: +). Với các độ pha loãng trên, nồng độ tối thiểu của độc tố SEA tinh khiết (Toxin Technology) bắt đầu cho kết quả dƣơng tính là 30ng/ml (que thử số 4). Nhƣ vậy, que thử có giới hạn phát hiện với độc tố SEA là 30ng/ml ở trong phòng thí nghiệm.  Xác định độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB {tc "III.5.3.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n c?a que th? v?i SEA" \f C \l 4} Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB Phƣơng pháp 1000 Que thử + 300 + Nồng độ độc tố SEB (ng/ml) 100 30 10 3 + + - 1 0 - - Hình 3.19. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1 ng/ml và 8: mẫu âm tính không chứa SEB. Các kết quả phân tích với độc tố tinh khiết SEB thể hiện ở Bảng 3.2 và Hình 3.19 là tƣơng tự nhƣ với SEA, giới hạn phát hiện của que thử với độc tố ruột tụ cầu SEB là 30ng/ml ở trong phòng thí nghiệm. 95  Xác định độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 Phƣơng pháp 1000 Que thử + 300 + Nồng độ độc tố SEC1 (ng/ml) 100 30 10 3 + + + - 1 0 - - Hình 3.20. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1 ng/ml và 8: mẫu âm tính không chứa SEC1. Trong khi đó, các kết quả phân tích với độc tố tinh khiết SEC1 ở Bảng 3.3 và Hình 3.20 cho thấy giới hạn phát hiện với độc tố SEC1 là 10ng/ml (que thử số 5) ở trong phòng thí nghiệm.  Xác định độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED Phƣơng pháp 1000 Que thử + 300 + Nồng độ độc tố SED (ng/ml) 100 30 10 3 + + - 96 1 0 - - {tc "III.5.3.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n c?a que th? v?i SEA" \f C \l 4} Hình 3.21. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1 ng/ml và 8: mẫu âm tính không chứa SED. Tƣơng tự nhƣ khi phân tích với SEA và SEB, {tc "III.5.3.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n c?a que th? v?i SEA" \f C \l 4}các kết quả phân tích ở Bảng 3.4 và Hình 3.21 cho thấy giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED là 30ng/ml ở trong phòng thí nghiệm (que thử số 4).  Xác định độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE Phƣơng pháp 1000 Que thử + 300 + Nồng độ độc tố SEE (ng/ml) 100 30 10 3 + + + - 1 0 - Hình 3.22. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1 ng/ml và 97 - 8: mẫu âm tính không chứa SEE. Tƣơng tự nhƣ với SEC1, {tc "III.5.3.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n c?a que th? v?i SEA" \f C \l 4}các kết quả phân tích với kháng nguyên SEE ở Bảng 3.5 và Hình 3.22 cho thấy giới hạn phát hiện của que thử với độc tố ruột tụ cầu SEE là 10ng/ml ở trong phòng thí nghiệm (que thử số 5). Từ kết quả sau khi phân tích que thử bằng các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trong đệm chạy, chúng tôi có thể kết luận giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE nhƣ sau: Với các độc tố SEA, SEB và SED giới hạn phát hiện của que thử khoảng 30 ng/ml; với SEC1 và SEE giới hạn phát hiện của que thử là 10 ng/ml. Kết quả giới hạn phát hiện của que thử trong luận án này phát hiện nồng độ độc tố cao hơn so với của que thử SEB trong nghiên cứu của Boyle 2009 (0,25ng/ml) [20] và so với của que thử SEA trong nghiên cứu của Keiko Yamada năm 2013 (0,2ng/ml) [109]. Tuy nhiên, que thử trong cả hai nghiên cứu này đều ứng dụng nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi để phát hiện độc tố ruột của tụ cầu, theo đó độc tố đƣợc nhận ra bởi hai kháng thể là kháng thể phát hiện (kháng thể cộng hợp) và kháng thể bắt cặp (trên vạch thử nghiệm). Ngƣợc lại, que thử của chúng tôi ứng dụng nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để phát hiện độc tố ruột của tụ cầu, theo đó độc tố chỉ đƣợc nhận ra bởi một loại kháng thể trên vạch thử nghiệm nên que thử có giới hạn phát hiện nồng độ độc tố cao hơn. Bên cạnh đó, khi so sánh ngƣỡng phát hiện của hai loại que thử cùng ứng dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch cạnh tranh, là que thử phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) nói trên với kháng thể vạch thử nghiệm là IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) do chúng tôi sản xuất với que thử phát hiện SEA sử dụng kháng thể IgG thỏ kháng SEA mua của hãng Abcam [4], cho thấy giới hạn phát hiện của que thử tạo ra trong đề tài luận án là cao hơn gần 3 lần so với que thử phát hiện độc tố SEA ( 80ng/ml) [4]. Điều này cho thấy kháng thể IgY mà chúng tôi thu đƣợc có hoạt tính kháng thể cao, có phản ứng mạnh với các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE). 98 3.3.2.2. Xác định tính ổn định của que thử Que thử phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE đƣợc bảo quản ở các điều điều kiện nhiệt độ khác nhau trong phòng thí nghiệm: ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC nhằm xác định tính ổn định của que thử và đƣa ra các điều kiện bảo quản trên thực tế ở nƣớc ta. Sau 6 tháng bảo quản, định kỳ tiến hành đánh giá theo các mức thời gian ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Tính ổn định của que thử phát hiện SE(A+B+C1+D+E) Que thử Thời gian 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng 25oC + + + + + + 4oC + + + + + + Kết quả (bảng 3.1) cho thấy trong các điều kiện bảo quản ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC, que thử vẫn giữ nguyên đƣợc hiệu giá phát hiện các độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE sau thời gian lƣu giữ. Tuy nhiên, thời gian lƣu giữ que thử cho đến thời điểm bản luận án này đƣợc viết là 6 tháng. Thông thƣờng, thời gian bảo quản của que thử sắc ký miễn dịch là từ 12 – 24 tháng ở nhiệt độ thƣờng [88]. Do đó, nghiên cứu về các điều kiện bảo quản với thời gian kéo dài hơn là cần thiết để có đƣợc các thông tin đầy đủ hơn về độ ổn định của que thử. 3.4. SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM 3.4.1. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm 3.4.1.1. Xác định độ pha loãng sữa để thử nghiệm 99 Hình 3.23. Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cần sử dụng 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Độ pha loãng sữa sử dụng cho 1 phản ứng là 1; 2; 3; 4; 5; 6 ; 7; 8; và 10 lần. Để sữa có thể chảy đƣợc nhờ lực mao dẫn của que thử chỉ cần pha loãng mà không cần bất cứ một quá trình tiền xử lý nào với mẫu. Để tối ƣu hóa đƣợc mức độ pha loãng sữa dùng cho thử nghiệm, chúng tôi tiến hành pha loãng ở các mức độ 1; 2; 3; 4; 5 ; 6 ; 7; 8; 9 và 10 lần trong dung dịch đệm chạy Kết quả chỉ ra rằng sữa đƣợc pha loãng 3 lần trong đệm chạy là mức độ pha loãng sữa thấp nhất cho thấy rõ tín hiệu ở cả vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng trên que thử (que thử số 3, Hình 3.23), đồng thời tốc độ dòng chảy của thử nghiệm là phù hợp. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, độ loãng này đƣợc sử dụng khi đánh giá que thử bằng mẫu sữa. Kích thƣớc lỗ của màng đƣợc sử dụng trong HTSKMD là khoảng từ 8 đến 15 µm [88]. Việc đồng nhất mẫu không tốt và nồng độ các hạt nhỏ trong mẫu quá cao sẽ lấp lỗ mao dẫn của màng hút mẫu, thời gian cho kết quả của que thử sẽ chậm. Do đó, cần phải pha loãng mẫu sữa với các nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ phù hợp cho phản ứng của que thử. Trong nghiên cứu của Boyle, các mẫu sữa chua, kem và các sản phẩm sữa có chất làm đặc cũng đƣợc pha loãng từ 1:4 đến 1: 20 trong đệm PBS, pH 7,2 [20]. 3.4.1.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm Vì mẫu sữa đƣợc sử dụng làm thí nghiệm là mẫu sữa đã pha loãng ba lần nên nồng độ độc tố bổ sung vào những mẫu phân tích này cũng phải đƣợc tăng lên gấp 3 lần để đảm bảo mẫu sữa tiến hành thí nghiệm đƣợc bổ sung hàm lƣợng độc tố giống nhƣ khi thử trong đệm chạy. Tiến hành nhiễm chủ động các nồng độ kháng nguyên SEA; SEB; SEC1; SED và SEE tinh khiết đã đƣợc pha loãng với các nồng độ 3000 ng/ml, 900 ng/ml, 300 ng/ml, 90 ng/ml, 30 100 ng/ml, 9 ng/ml và 3 ng/ml vào sữa và sau đó xác định giới hạn phát hiện của các que thử trong mẫu sữa.  Xác định giới hạn phát hiện SEA trên sữa Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên sữa Phƣơng pháp 3000 Que thử + 900 + Nồng độ độc tố SEA (ng/ml) 300 100 30 9 3 + + + - 0 0 - - Hình 3.24. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên sữa 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính sữa không chứa SEA và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEA. Các kết quả phân tích của que thử trên mẫu sữa gây nhiễm độc tố SEA thực nghiệm ở Bảng 3.7 và Hình 3.24 cho thấy que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEA ở các nồng độ pha loãng 30ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện độc tố ruột tụ cầu SEA của que thử là 30 ng/ml Xác định giới hạn phát hiện SEB trên sữa Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên sữa Phƣơng Nồng độ độc tố SEB (ng/ml) pháp 3000 900 300 100 30 9 3 0 Que thử + + + + + {tc "III.6.2.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n SEA trong s?a" \f C \l 4} Hình 3.25. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên sữa 101 0 - 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính sữa không chứa SEB và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEB. Tƣơng tự nhƣ với SEA, kết quả phân tích que thử trên mẫu sữa gây nhiễm độc tố SEB thực nghiệm ở Bảng 3.8 và Hình 3.25 cho thấy que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEB ở các nồng độ pha loãng 30ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện độc tố SEB của que thử là 30 ng/ml (que thử số 5) .  Xác định giới hạn phát hiện SEC1 trên sữa Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên sữa Phƣơng pháp 3000 Que thử + 900 + Nồng độ độc tố SEC1 (ng/ml) 300 100 30 9 3 + + + + - 0 0 - - Hình 3.26. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên sữa 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính sữa không chứa SEC1 và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEC1. Kết quả phân tích ở Bảng 3.9 và Hình 3.26 cho thấy trên mẫu sữa gây nhiễm độc tố SEC1 thực nghiệm, que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEC1 ở các nồng độ pha loãng 9ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử là 9 ng/ml (que thử số 6).  Xác định giới hạn phát hiện SED trên sữa Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên sữa Phƣơng pháp 3000 Que thử + Nồng độ độc tố SED (ng/ml) 900 300 100 30 + + + 102 9 + 3 - 0 - 0 - - Hình 3.27. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên sữa 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính sữa không chứa SED và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SED. Tƣơng tự nhƣ với SEA và SEB, các kết quả phân tích thể hiện ở Bảng 3.10 và Hình 3.27 cho thấy trên mẫu sữa gây nhiễm độc tố SED thực nghiệm, que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SED ở các nồng độ pha loãng 30ng/ml ÷ 3000 ng/ml và giới hạn phát hiện của que thử là 30 ng/ml (que thử số 5).  Xác định giới hạn phát hiện SEE trên sữa Bảng 3.11. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên sữa Phƣơng Nồng độ độc tố SEE (ng/ml) pháp 3000 900 300 100 30 9 3 0 Que thử + + + + + {tc "III.6.2.1. Xác đ?nh đ? nh?y phát hi?n SEA trong s?a" \f C \l 4} 0 - Hình 3.28. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên sữa 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính sữa không chứa SEE và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEE. Tƣơng tự nhƣ với SEC1, các kết quả phân tích trên mẫu sữa gây nhiễm độc tố SEE thực nghiệm ở Bảng 3.11 và Hình 3.28 cho thấy que thử có thể phát hiện đƣợc 103 độc tố SEE ở các nồng độ pha loãng 9ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử là 9 ng/ml (que thử số 6). Nhƣ vậy, khi phân tích que thử với các mẫu sữa đƣợc gây nhiễm các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE, giới hạn phát hiện của que thử trên sữa nhƣ sau: Với các độc tố SEA, SEB và SED giới hạn phát hiện của que thử khoảng 30 ng/ml; với SEC1 và SEE giới hạn phát hiện của que thử là 9 ng/ml, trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3.4.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt đƣợc gây nhiễm thực nghiệm 3.4.2.1. Xác định độ pha loãng thịt để thử nghiệm Để có thể phát hiện các độc tố ruột tụ cầu trong mẫu thịt cần phải xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị mẫu thích hợp. Nếu tỷ lệ mẫu/đệm chiết là lớn thì khả năng tách chiết độc tố sẽ giảm và các hợp chất trong thực phẩm có thể gây ảnh hƣởng đến tốc độ dòng chảy, phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Ngƣợc lại, tỷ lệ mẫu/đệm chiết nhỏ thì độ nhạy của que thử giảm, do độc tố bị pha loãng. Để đánh giá ảnh hƣởng của tỷ lệ mẫu/thể tích đệm chiết khi sử dụng đệm borat chiết các độc tố SEA, SEB, SEC1, SED và SEE, tiến hành nhiễm chủ động các độc tố trên vào mẫu thịt xay đã đƣợc xác định là âm tính với các độc tố này và tách chiết các mẫu thịt xay với tỷ lệ 1/2; 1/4; 1/6 và 1/8. Các kết quả phân tích (Hình 3.29) cho thấ y tin ́ hiê ̣u va ̣ch kiể m chƣ́ ng và vạch thử nghiệm có xuấ t hiê ̣n trong c ả bốn tỷ lệ mẫu/ đệm chiết, trong đó tỷ lê ̣ mẫu /đệm chiế t 1/2 (que thử số 1 và que thử số 2) là tỷ lệ pha loãng mẫu thịt thấp nhất, mẫu thịt pha loãng 3 lần. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng tỷ lê ̣ mẫu/đệm chiết là 1/2 để chuẩn bị mẫu thịt tiến hành các thử nghiệm phân tích bằng que thử. 104 Hình 3.29. Lựa chọn độ pha loãng thịt cho que thử 1, 3, 5, 7: Các mấu thịt xay âm tính pha loãng với tỷ lệ tương ứng 1/2; 1/4; 1/6; 1/8; 2, 4,6,8: Các mẫu thịt xay nhiễm chủ động 30 ng, 60ng, 90ng và 120ng SEC1 tương ứng với các tỷ lệ pha loãng mẫu 1/2;1/4; 1/6; 1/8. 3.4.2.2. Kết quả phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt được gây nhiễm thực nghiệm  Xác định giới hạn phát hiện SEA trên thịt Bảng 3.12. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên thịt Phƣơng pháp 3000 Que thử + 900 + Nồng độ độc tố SEA (ng/ml) 300 100 30 9 3 + + + + - 0 0 - - Hình 3.30. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên thịt 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, mẫu âm tính thịt không chứa SEA và mẫu âm tính đệm không chứa SEA. Các kết quả ở Bảng 3.12 và Hình 3.30 cho thấy trên mẫu thịt gây nhiễm độc tố SEA thựcnghiệm, que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEA nồng độ pha loãng 9 ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử là 9 ng/ml (que thử số 6).  Xác định giới hạn phát hiện SEB trên thịt 105 Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên thịt Phƣơng Nồng độ độc tố SEB (ng/ml) pháp 3000 900 300 100 30 9 3 0 Que thử + + + + + + { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } 0 - Hình 3.31 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên thịt 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính thịt không chứa SEB và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEB. Tƣơng tự nhƣ với SEA, các kết quả phân tích trên mẫu thịt gây nhiễm độc tố SEB thực nghiệm ở Bảng 3.13 và Hình 3.31 cho thấy que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEB nồng độ pha loãng 9 ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử là 9 ng/ml (que thử số 6).  Xác định giới hạn phát hiện SEC1 trên thịt Bảng 3.14. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên thịt Phƣơng Nồng độ độc tố SEC1 (ng/ml) pháp 3000 900 300 100 30 9 3 0 0 Que thử + + + + + + { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } Hình 3.32. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên thịt 106 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính thịt không chứa SEC1 và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEC1 Tƣơng tự nhƣ với SEA và SEB, các kết quả phân tích que thử trên mẫu thịt gây nhiễm độc tố SEC1 thực nghiệm ở Bảng 3.14 và Hình 3.32 chỉ ra rằng có thể phát hiện đƣợc độc tố SEC1 ở nồng độ pha loãng 9 ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử là 9 ng/ml (que thử số 6).  Xác định giới hạn phát hiện SED trên thịt Bảng 3.15. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên thịt Phƣơng Nồng độ độc tố SED (ng/ml) pháp 3000 900 300 100 30 9 3 0 0 Que thử + + + + + + { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } Hình 3.33. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên thịt 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính thịt không chứa SED và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SED. Tƣơng tự nhƣ khi phân tích kết quả với các độc tố trên, kết quả chỉ ra ở Bảng 3.15 và Hình 3.33 cũng cho thấy trên mẫu thịt gây nhiễm độc tố SED thực nghiệm, que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SED ở nồng độ pha loãng 9 ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử cũng là 9 ng/ml (que thử số 6).  Xác định giới hạn phát hiện SEE trên thịt Bảng 3.16. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt Phƣơng pháp 3000 900 Nồng độ độc tố SEE (ng/ml) 300 100 30 9 3 107 0 0 Que thử + + + + + + { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } { TC "III.6.2.1. Xác định độ nhạy phát hiện SEA trong sữa" \f C \l "4" } Hình 3.34. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; 3 ng/ml, 8: mẫu âm tính thịt không chứa SEE và 9: mẫu âm tính đệm không chứa SEE Kết quả thể hiện trên Bảng 3.16 và Hình 3.34 cũng cho thấy trên mẫu thịt gây nhiễm độc tố SEE thực nghiệm, que thử có thể phát hiện đƣợc độc tố SEE ở nồng độ pha loãng 9 ng/ml ÷ 3000 ng/ml, giới hạn phát hiện của que thử cũng là 9 ng/ml (que thử số 6). Nhƣ vậy, giới hạn phát hiện của que thử với cả 5 độc tố ruột SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên thịt là 9 ng/ml ở điều kiện phòng thí nghiệm. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Đã sản xuất và tinh sạch đƣợc độc tố ruột tụ cầu tái tổ hợp SEC1 ở dạng dung hợp với đuôi His - GST có kích thƣớc 57 kDa, có độ tinh sạch cao. 2. Đã sản xuất và tinh sạch kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE), thu đƣợc hàm lƣợng khoảng 5, 9 mg/ml dịch lòng đỏ, với độ tinh sạch cao. 108 3. Xây dựng đƣợc quy trình chế tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) trên thực phẩm. 4. Đã chế tạo thành công que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên một số nhóm thực phẩm (sữa và thịt) ở mức độ thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. Kháng thể IgY kháng SE(A- E) và kháng thể IgY kháng BSA đƣợc cố định lần lƣợt lên vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng trên màng nitrocellulose, gắn độc tố ruột SEC1 tái tổ hợp với hạt nanocarbon tạo kháng nguyên cộng hợp với các hàm lƣợng tƣơng ứng là 0,6 µg/ que thử; 0,12 µg/ que thử và 0,2 µg/que thử. 5. Sử dụng que thử đã phát hiện đƣợc 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) trên một số nhóm mẫu thực phẩm (sữa, thịt) gây nhiễm thực nghiệm với giới hạn phát hiện nhƣ sau: Với SEA, SEB và SED: giới hạn phát hiện của que thử trong đệm chạy là 30 ng/ml, trong sữa là 30 ng/ml và trong thịt là 9ng/ml ở điều kiện phòng thí nghiệm; Với SEC1 và SEE giới hạn phát hiện của que thử trong dung dịch đệm chạy là 10 ng/ml, trong sữa và trong thịt thì giới hạn phát hiện là 9 ng/ml ở điều kiện phòng thí nghiệm. KHUYẾN NGHỊ Để triển khai sản xuất, thƣơng mại hóa sản phẩm que thử cần hoàn thiện quy trình sản xuất que thử, cụ thể là: 1. Xác định độ đặc hiệu của que thử 2. Tiếp tục nghiên cứu nhằm tối ƣu hóa que thử để tăng độ nhạy phát hiện với 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) trên thực phẩm. 109 3. Tiếp tục khảo sát độ ổn định của que thử trong thời gian dài hơn với các điều kiện bảo quản khác nhau nhằm đánh giá thời gian sử dụng của que thử trong các điều kiện thực tế khác nhau. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2012), “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu”, Tạp chí Y học thực hành, Số 842, tr. 213-217. 110 2. Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Tô Kim Anh (2014), “Development of a Lateral Flow Immunoassay for the Rapid Detection of Staphylococcal Enterroxin A in Milk”, VNU Journal of Science; Natural Sciences and Technology, Vol. 30 (3S), pp. 153-157. 3. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên cứu phát triển hệ thống sắc kí miễn dịch cạnh tranh phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong sữa”, VNU Journal of Science; Natural Sciences and Technology, Vol. 31, No. 1, pp. 23-31. 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Dịp (1993), Ứng dụng những nguyên lý về vi sinh vật học và di truyền học để xác định tính chất dich tễ của Staphylococcus aureus, Luận án Tiến sĩ y học, Đại học Y khoa Hà Nội, Hà Nội. 3. Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Tô Kim Anh (2012), “Sản xuất và thử nghiệm bộ sinh phẩm ELISA phát hiện nhanh độc tố ruột dạng A của tụ cầu”, Tạp chí Y học thực hành (842), tr.217- 220. 4. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2012), “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu”, Tạp chí Y học thực hành (842), tr.213-217. 5. Nguyễn Hoàng Minh, Lê Quang Hòa, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Trần Hoa Cƣơng, Tô Kim Anh (2009), “Xây dựng quy trình phân tích phát hiện nhanh độc tố tụ cầu vàng dạng A (SEA) trong sản phẩm thịt sử dụng bộ Kit BK-SETA”, Kỷ yếu hội nghị khoa học An toàn vệ sinh thực phẩm lần thứ 5-2009, tr. 469 – 474. 6. Nghiêm Ngọc Minh (2011), “Biểu hiện và tinh sạch protein nội độc tố Staphylococcal enterotoxin (SEB) trong các chủng Staphylococcus aureus phân lập từ các vụ ngộ độc thực phẩm”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 86 (10), pp 179-183. 7. Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam. 8. Nguyễn Đỗ Phúc, Trần Linh Thƣớc (2008), “Tạo kháng thể đa dòng và xây dựng quy trình ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh (12), tr. 272-277. 9. Tim Sunnary (2013), Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng trực khuẩn mủ xanh, Luận án tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y 103, Hà Nội. 112 10. Đặng Đức Trạch (1984), Miễn dịch học, University of Amsterdam. TIẾNG ANH 11. Agro-Bio (2011), Protocol for the production of chicken polyclonal antibodies specific IgY, Version 2011/01. 12. Antonina A Votintseva, Rowena Fung, Ruth R Miller, Kyle Knox, Heather Godwin, David H Wyllie, Rory Bowden, Derrick W Crook, A Sarah Walker (2014), Prevalence of Staphylococcus aureus protein A (spa) mutants in the community and hospitals in Oxfordshire, BioMed Central, United Kingdom. 13. Antonsson, P., Wingren, A.G., Hansson, J., Kalland, T., Varga, M., Dohlsten, M. (1997), “Functional Characterization of the Interaction Between the Superantigen Staphylococcal Enterotoxin A and the TCR”. Journal of Immunology. 158, pp 4245–4251. 14. Asao, T., Kumeda, Y., Kawai, T., Shibata, T., Oda, H., Haruki, K., Nakazawa, H., Kozaki, S (2003), “An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: Estimation of enterotoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk’’, Journal of Epidemiology Infectionous. 130, 33– 40. 15. Asenjo, J.A. and B.A. Andrews (2009), “Protein purification using chromatology: selection of type, modelling and optimization of operating condition”, Journal of Molecular Recognit 22(2), pp 65-76. 16. Atanmassova. V, Meindl. A và Ring. C (2001), “Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococci enterotoxin in raw pork and uncooked smoked ham – a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR”, International Journal of Food Microbiology 68: 105-113. 17. Audrey W. Jarvis, R. C. Lawrence, and G. G. Pritchard (1973), “Production of Staphylococcal enterotoxins A, B and C under conditions of controlled pH and aeration”, Journal of Infection and Immunity 7(6), pp 847-854. 113 18. Balaban N, Rasooly A (2000), “Staphylococcal enterotoxins”, Internatinal Journal of Food Microbiology 61(1): 1-10.rnatio 19. Bergdoll, M.S., Crass, B.A., Reiser, R.F., Robbins, R.N., Davis, J.P. (1981), “A New Staphylococcal Enterotoxin, Enterotoxin F, Associated with Toxic-ShockSyndrome Staphylococcus aureus Isolates”, Lancet 1, pp 1017–1021. 20. Boyle T., Njoroge JM., Jones RL. Jr., Principato M. (2010), “Detection of staphylococcal enterotoxin B in milk and milk products using immunodiagnostic lateral flow devices”, Journal of AOAC International 93, pp 569-575. 21. Cameron, S.B., Nawijn, M.C., Kum, W.W., Savelkoul, H.F., Chow, A.W. (2001), “Regulation of Helper T Cell Responses to Staphylococcal Superantigens”, European Cytokine Netw (12), pp 210-222. 22. Casman E.P., (1965), “Staphylococcal enterotoxin”, Annals of the New York Academy of Sciences 128, pp 124–131. 23. Cha J.O., Lee J.K., JungY.H., Yoo J.I., Park Y.K., Kim B.S., Lee Y.S.(2006), “Molecular analysis of Staphylococcus aureus isolates associated with staphylococcal food poisoning in South Korea”, Journal of Applied Microbiology 101, pp 864–871. 24. Chang HC, Bergdoll MS (1979), “Purification and some physicochemical properties of staphylococcal enterotoxin D”, Journal of Biochemistry 18 (10), pp 1937–1942. 25. Chen T.R., Chiou, C.S., Tsen H.Y. (2004), “Use of Novel PCR Primers Specific to the Genes of Staphylococcal Enterotoxin G, H, I for the Survey of Staphylococcus aureus Strains Isolated From Food-Poisoning Cases and Food Samples in Taiwan”, International Journal of Food Microbiology 92, pp 189– 197. 26. Christopher Marcq, André Théwis, Daniel Portetelle, Yves Beckers (2013), “Refinement of the production of antigen-specific hen egg yolk antibodies (IgY) intended for passive dietary immunization in animals. A review”, Biotechnology Agron Society Environment 17 (3), pp 483-493. 114 27. Concordia R. Borja , Merlin S. Bergdoll (1967), “Purification and Partial Characterization of Enterotoxin C Produced by Staphylococcus aureus Strain 137”, Journal of Biochemistry 6 (5), pp 1467–1473. 28. Cook M.E. and Trott D.L (2010), “IgY–immune component of eggs as a source of passive immunity for animals and humans”, world's poultry science journal 66, pp 215-225 29. Crowle A.J (1961), Immunodiffusion, New York: Academic Press. 30. David F. Capenter and Gerald J. Silverman (1974), “Staphylococcal enterotoxin B and nuclease production under controlled dissolved oxygen conditions”, Journal of Applied Microbiology 28 (4), pp 628-637. 31. De Buyser M.L., Dufour B., Maire M., Lafarge V. (2001), “Implication of milk and milk products in food-borne diseases in France and in different industrialised countries”, International Journal of Food Microbiology 67, pp 1–17. 32. Desouza I.A., Hyslop S., Franco-Penteado, C.F., Ribeiro-DaSilva, G. (2001), “Mouse Macrophages Release a Neutrophil Chemotactic Mediator Following Stimulation by Staphylococcal Enterotoxin Type A”, Journal of Inflammation Research 50, pp 206– 212. 33. Desouza I.A., Hyslop S., Franco-Penteado C.F., Ribeiro-DaSilva, G. (2002), “Evidence for the Involvement of a Macrophage-Derived Chemotactic Mediator in the Neutrophil Recruitment Induced by Staphylococcal Enterotoxin B in Mice”, Toxicon 40, pp 1709-1717. 34. Diana Pauly, Pablo A. Chacana, Esteban G. Calzado, Bjorn Brembs, Rudiger Schade (2011), “IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) precipitation”, Journal of Visualized Experiments (51), pp 1-5. 35. Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M. (2000), “Exotoxins of Staphylococcus aureus”, Clinical Microbiology Reviews 13, pp 16–34. 36. Do Carmo, L. S., Cummings, C., Linardi, V. R., Dias, R. S., De Souza, J. M., Sena, M. J., Dos Santos, D. A., Shupp, J. U., Poreira, R. K., Jett, M. (2004), A 115 case study of a massive staphylococcal food poisoning incident. Foodborne Pathogens and Disease. 1, pp 241-246. 37. Edward J. Schantz , William G. Roessler , Jack Wagman , Leonard Spero , David A. Dunnery , Merlin S. Bergdoll (1965), “Purification of Staphylococcal Enterotoxin B*” , Journal of Biochemistry 4 (6), pp 1011–1016. 38. Evenson M.L., Hinds M.W., Bernstein R.S., Bergdoll M.S (1998), “Estimation of Human Dose of Staphylococcal Enterotoxin A From a Large Outbreak of Staphylococcal Food Poisoning Involving Chocolate Milk”, International Journal of Food Microbiology 7, pp 311–316. 39. Evin K., Brunner. G., My A. and Wong. C (1992), “Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in mushrooms”, Journal of Food Science 57(3), pp 700–703. 40. Goshorn SC, Schlievert PM (1988), “Nucleotide sequence of streptococcal pyrogenic exotoxin type C”, Journal of Microbiology Immunology and Infection 56, pp 2518-2520. 41. Hamal KR., Burgess SC., Pevzner IY., Erf GF. (2006), “Maternal antibody transfer from dams to their egg yolks, egg whites, and chicks in meat lines of chickens”, Journal of Poultry Science 85(8), pp 1364- 1372. 42. Haeghebaert S., Le Querrec F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V. (2002), “Les toxi-infections alimentaires collectives en France en 1999 et 2000”, Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire 23, pp 105-109. 43. Harris TO, Grossman D, Kapp.ler JW, Marrack P, Rich RR, Betley MJ (1993), “Lack of complete correlation between emetic and T-cellstimulatory activities of staphylococcal enterotoxins”, Journal of Microbiology Immunology and Infection 61, pp 3175-3183. 44. Hennekine Jacques-Antonie, Annick Ostyn, Florence Guillier, Sabine Herbin, AnneLaure Prufer and Sylviane Dragacc (2010), “How should Staphylococcal food poisoning outbreaks be characterized?”, Toxins (Basel) (2), pp 2106 – 2116. 116 45. Hennekinne de Buyser and S. Dragacci (2012), “Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation”, FEMS Microbiology Reviews 36, pp 815–836. 46. Le Quang Hoa, Tran Thi Sao Mai, Nguyen Thi Khanh Tram, To Kim Anh (2014), “Development of a Lateral Flow Immunoassay for the Rapid Detection of Staphylococcal Enterotoxin A in Milk”, VNU Journal of Science 30, pp 153-157. 47. Hovde CJ, Marr JC, Hoffmann ML, Hackett SP, Chi YI, Crum KK, Stevens DL, Stauffacher CV, Bohach GA (1994), “Investigation of the role of the disulphide bond in the activity and structure of staphylococcal enterotoxin C1”, Journal of Molecular Microbiology 13, pp 897-909. 48. Hu D.L., Omoe K., Shimoda Y., Nakane A., Shinagawa K. (2003), “Induction of Emetic Response to Staphylococcal Enterotoxins in the House Musk Shrew (Suncus Murinus)”, Journal of Microbiology Immunology and Infection 71, pp 567–570. 49. Hu D.L., Zhu G., Mori F., Omoe K., Okada M., Wakabayashi K., Kaneko S., Shinagawa K., Nakane A. (2007), Enterotoxin Induces Emesis Through Increasing Serotonin Release in Intestine and It Is Downregulated by Cannabinoid Receptor 1, Cellular Microbiology 9, pp 2267–2277. 50. Hu D.L., Omoe K., Sashinami H., Shinagawa K., Nakane A. (2009), “Immunization with a Nontoxic Mutant of Staphylococcal Enterotoxin A, SEAD227A, Protects Against Enterotoxin-Induced Emesis in House Musk Shrews”, Journal of Infectious Diseases 199, pp 302–310. 51. Jenny Schelin, Nina wallin-Carlquist, Marianne Thorup Cohn, Roland Lindqvist, Gary C. Barker and Peter rådström (2011), “The formation of Staphylococcus aureus enterotoxin in food environments and advances in risk assessment”, Virulence Journal 2 (6), pp 580-592. 52. Jennifer Kovacs-Nolan and Yoshinori Mine (2012), “Egg Yolk Antibodies for Passvie Immunity”, Annual Review of Food Science and Technology 3, pp 163182. 117 53. Jeremy M Berg, John L Tymoczko and Lubert Stryey (2002), Biochemistry, 5th edition, W.H Freeman, New York. 54. Jhalka Kadariya, Tara C. Smith and Dipendra Thapaliy (2014), Staphylococcus aureus and Staphylococcal Food-Borne Disease: An Ongoing Challenge in Public Health, BioMed Research International, Hindawi Publishing Corporation. 55. Joseph F. Metzger, Anna D. Johnson, William S. Collins II and Virginia McGann (1973), “Staphylococcusaureus Enterotoxin B release (excretion) under controlled condition of fermentation”, Journal of Applied Microbiology 25(5), pp 770-773. 56. Kenneth Todar, Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus), Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2005. 57. Kerouanton A., Hennekinne J.A., Letertre C., Petit L., Chesneau O., Brisabois A., DeBuyser M.L. (2007), “Characterization of Staphylococcus aureus strains associatedwith food poisoning outbreaks in France”, International Journal of Food Microbiology 115, pp 369–375. 58. Koets M., Sander I., Bogdanovic J., Doekes G., Van Amerongen A.(2006), A rapid lateral flow immunoassay for the detection of fungal alpha-amylase at the workplace, Journal of Environmental Monitoring 8 (2006) 942-6. 59. Leenaars M. and Hendriksen C.F (2005), “Criticalsteps intheproduction of polyclonaland monoclonal antibodies:evaluationand recommendations”, ILAR Journal 46, pp 269-279. 60. Ler S.G., Lee F.K., Gopalakrishnakone P. (2006), “Trends in Detection of Warfare Agents. Detection Methods for Ricin, Staphylococcal Enterotoxin B and T-2”, Journal of Chromatography A1133, pp 1–12. 61. Liben Chen, Shuang Li, Zhengfang Wang, Ruilong Chang, Jingliang Su and Bo Han (2012), “Protective effect of recombinant staphylococcal enterotoxin A entrapped in polylactic-co-glycolic acid microspheres against Staphylococcus aureus infection”, Veterinary Research 43 (20), pp 1-11. 118 62. Lívia Silveira Munhoz, Gilberto D’Ávila Vargas, Geferson Fischer, Marcelo de Lima, Paulo Augusto Esteves, Silvia de Oliveira Hübner (2014), “Avian IgY antibodies: characteristics and applications in immunodiagnostic”, Ciência Rural 44 (1), pp 153-160. 63. Marrack P., Kappler J. (1990), “The staphylococcal enterotoxins and their relatives”, Science 248, pp 705-711. 64. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha (2010), “Staphylococcal enterotoxins: Molecular aspects and detection methods”, Journal of Public Health and Epidemiology 2, pp 29-42. 65. María Ángeles Argudín, María Carmen Mendoza and María Rosario Rodicio (2010), “Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins”, Toxins 2, pp 1751-1773. 66. McCormick JK, Yarwood JM, Schlievert PM (2001), “Toxic shock syndrome and bacterial superantigens: an update”, Annual Review of Microbiology 55, pp 77-104. 67. Miethke T, Wahl C, Heeg K, Echtenacher B, Krammer PH, Wagner H (1992), “T cell-mediated lethal shock triggered in mice by the superantigen staphylococcal enterotoxin B”, Critical role of tumor necrosis factor. Journal of Experimental Medicine 175, pp 91-98. 68. Márta D, Wallin-Carlquist N, Schelin J, Borch E, Radstrom P. (2011), “Extended staphylococcal enterotoxin D expression in ham products”, International Journal of Food Microbiology 28, pp 617–620. 69. Mead PS, Slutsket L., Dietz V., McCaig LF., Bresee JS., Shapiro C., Griffin PM., Tauxe RV. (1999), “Food-related illness and death in the United States”, Emerging Infectious Diseases Journal 5, pp 607-25. 70. Merlin S. Bergdoll and Amy C. Lee Wong (2006), “Staphylococcal intoxication”, Foodborne Infection and Intoxications, pp 523-551. 71. Mihai Sandaran, Valentin Ordori, Ioanna Sisu, Horea Sandaran, Victor Lorin Purcarea, Mircea Pennescu (2010), “Obtaining High Purity antibodies with 119 therapeutic potential”, FARMACIA 58 (6), pp 686-694. 72. Nandita P. Agnihotri, ManglaBhide (2014), “Cloning and expession of sec2 gene of Staphylococcus aureus for antibody production”, Journal Biology Innovation 3 (1), pp 49-62. 73. Notermans, S. and Heuvelman, C.J (1983), “Combined effects of water activity, pH, and suboptimal temperature on growth and enterotoxin production”, Journal of Food Science 48, pp 1832-1835. 74. Novick, R.P. (2000), “Pathogenicity factors and their regulation” In: Gram Positive Pathogens (Fischetti, V.A., Novick, R.P., Feretti, J.J., Portnoy, D.A. and Rood, J.I., eds.). ASM Press, Washington, D.C., USA, pp. 392-407. 75. Oakley C.L and Fulthorpe A.J (1953), “Antigenic analysis by diffusion”, Journal of Pathology and Bacteriology 65, pp 49-60. 76. O’Farrell B. and Bauer J. (2006), “Developing highly sensitive, more reproducible lateral flow assays”, Part 1: New approaches to old problems. IVD Technology June issue, pp 41. 77. Onoue, Y. and Mori, M (1997), “Amino acid requirement for growth and enterotoxin production by Staphylococcus aureus in chemically defined media”, International Journal of Food Microbiology 36, pp 77-82. 78. Ostyn A, De Buyser ML, Guillier F, Groult J, Felix B, Salah S, Delmas G, Hennekinne JA.(2010), “First evidence of a food poisoning outbreak due to staphylococcal enterotoxin type E”, France, Euro Surveillance 15 (13), pp 528. 79. Ouchterlony O. (1948), “Antigen-antibody reactions in gels”, Archiv fur Kemi, Mineralogi, och Geology 26B, pp 1-9. 80. Oudin J. (1952), “Techniques and analysis of the quantitative precipitin reaction B. Specific precipitation in gels and its application to immunochemical analysis”, Methods in Medical Research 5, pp 335-378. 81. Otero, A., Garcia, M.C., Garcia, M.L. and Moreno, B (1988), “Effect of a commercial starter culture on growth of Staphylococcus aureus and 120 thermonuclease and enterotoxins (C1 and C2) production in broth cultures”, International Journal of Food Microbiology 6: 107-114. 82. Parma Y.R., Chacana P.A. et al. (2012), “Detection of Shiga toxin- producing Escherichia coli by sandwich enzym-linked immunosorbent assay using chicken egg yolk IgY antibodies”, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2012, pp 8492 83. Petr Hodek and Marie (2003), “Chicken Antibodies – Superior Alternative for Conventional Immunoglobulins”, Proceedings of the Indian National Science Academy B69 4, pp 461-468. 84. Petr Hodek, Pavel Trefil, Jiri Simunek, Jiri Hudecek, Marie Stiborova (2013), “Optimized protocol of chicken antibody (IgY) purification providing electrophoretically homogenous preparations”, International Journal of Electrochemical Science 8, pp 113-114. 85. Pinchuk I.V., Beswick E.J., Saada J.I., Suarez G., Winston J., Mifflin R.C., Di Mari J.F., Powell D.W., Reyes V.E (2007), “Monocyte Chemoattractant Protein1 Production by Intestinal Myofibroblasts in Response to Staphylococcal Enterotoxin a: Relevance to Staphylococcal Enterotoxigenic Disease”. Journal of Immunology 178, pp 8097- 8106. 86. Proft T, Fraser JD (2003), “Bacterial superantigens”, Journal of Clinical and Experience Immunology 133, pp 299-306. 87. Plotz C.M. and Singer J.M. (1956), “The latex fixation test”, Application to the serologicdiagnosis of rheumatoid arthritis, American Journal of Medicine 21 (6), pp 888–892. 88. Raphael C. Wong, Harley Y. Tse (2009), Lateral Flow Immunoassay, Springer, Humana Press, Springer Science and Business Media, New York, NY 10013, USA. 89. Regassa, L.B., Novick, R.P. and Betley, M.J (1992), “Glucose and nonmaintained pH decrease expression of the accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus”, Journal of Infectious Immunology 60, pp 3381-3388. 121 90. Reginald W. Bennett and Jennifer M. Hait (2011), Bacteriological Analytical Manual- Chapter 13A Staphylococcal Enterotoxins: Micro-slide Double Diffusion and ELISA-based Methods. 91. Richman DD., Cleverland PH., Oxman MN, Johnson KM. (1982), “The binding of Staphylococcal protein A by the sera of different animal species”, Journal of Immunology 128 (5), pp 2300-2305. 92. Roberts T. A., Baird-Parker A. C. and Tompkin R. B. (1996), Staphylococcus aureus Microbiological specifications of food pathogens, International Commission on Microbiological Specifications for Foods, Blackie Academic, London. 93. Rüdiger Schade, Esteban Gutierrez Calzado, Rodolfo Sarmiento, Pablo Anibal Chacana, Joanna Porankiewicz-Asplund and Horacio Raul Terzolo (2005), “Chicken Egg Yolk Antibodies (IgY-technology): A Review of Progress in Production and Use in Research and Human and Veterinary Medicine”, ATLA 33, pp 1–26. 94. Ruth Robbins, Sara Gould, and Merlin Bergdoll (1974), “Detecting the Enterotoxigenicity of Staphylococcus aureus Strains”, Journal of Applied Microbiology 28 (6), pp 946-950. 95. Sameshima T., Magome C., Takeshita K., Itoh M. and Kondo Y. (1998), “Effect of intestinal Lactobacillus starter cultures on the behaviour of Staphylococcus aureus in fermented sausage”, International Journal of Food Microbiology 41, pp 1-7. 96. SchwarzkopfC., StaakC., BehnI.and ErhardM. (2001), Chicken egg yolk antibodies, production and application: IgY technology, pp 25-64, Springer Publishcation. 97. Shinagawa. K,Ono. H. K, Omoe. K, Imanishi. K, 2008 “Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins types S and T”, Journal of Infectionous Immunology 76, pp 4999–5005. 98. Taylor S.L., Schlunz L.R., Beery J.T., Cliver D.O., Bergdoll M.S. (1982), “Emetic Action of Staphylococcal Enterotoxin A on Weanling Pigs”, Journal of Infectionous Immunology 36, pp 1263–1266. 122 99. Thermo Fisher Scientific (2010), Thermo Scientific Pierce Antibody Production and Purification, Technical Handbook 2, pp 1-77. 100. Thomas H.Kent, M.D (1965), “Staphylococcal enterotoxin gastroenteritis in Rhesus Monkeys”, The American journal of pathology 48(3), pp 387- 407. 101. T. Diraviyam, T. Jeevitha, P. Saravanan, A. Michael and S. Meenatchisundaram (2011), “Preparation of Enteric Infections in Poultry”, Journal of Microbiology and Biotechnology Research 1 (4), pp 95-103. 102. Van Den Bussche RA, Lyon JD, Bohach GA (1993), “Molecular evolution of the staphylococcal and streptococcal pyrogenic toxin gene family”, Molecular Phylogenetics and Evolution 2 (4), pp 281-292. 103. Vaitukaitis J.L., Braunstein G.D. and Ross G.T. (1972), “A radioimmunoassay which specifically measures human chorionic gonadotropin in the presence of human luteinizing hormone”, Journal of Obstetrics and Gynaecology 15, pp 751–758. 104. Victor E. Reyes et al. (2010), “Staphylococcal enterotoxins”, Toxins 2, pp 21772197. 105. Veerasami M., Singanallur N.B., Thirumeni N., Rana S.K., Shanmugham R., Ponsekaran S., Muthukrishnan M., Villuppanoor S.A. (2008), “Serotyping of foot-and-mouth disease virus by antigen capture-ELISA using monoclonal antibodies and chicken IgY”, Microbiology News 31(4), pp 549-554. 106. Xiao Y., Gao X., Taratula O., Treado S., Urbas A., Holbrook R.D., Cavicchi R.E., Avedisian C.T., Mitra S., Savla R., Wagner P.D., Srivastava S., He H. (2009), “Anti-HER2 IgY antibody- functionalized single-walled carbon nanotubes for detection and selective destruction of breast cancer cells”, BMC Cancer 9, pp 351. 107. Yves Le Loir, Florence Baron and Michel Gautier (2003), “Staphylococcus aureus and food poisoning”, Genetic and Molecular Research 2, pp 63-76. 108. Walk G (2002), Protein pruification and characterizatio, Proteins Biochemistry and biotechnology, John Wiley Sons LTD, pp 99-116. 123 109. Wanchun Jin, Keiko Yamada, Mai Ikami (2013), “Application of IgY to sandwich enzym-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products”, Journal of Microbiological Methods 92, pp 323-331. 110. Wang RF., Cao WW. and Cerniglia CE. (1997), “A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods”, Journal of Applied Microbiology 83, pp 727-736. 111. Wieneke A.A., Roberts, D. Gilbert, R.J. (1993), “Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom”, Journal of Epidemiology and Infection 110, pp 519531. 112. http://www.chongdoc.org.vn/LinkClick.aspx?fileticket=J691bNddmOQ%3D&ta bid=66&language=vi-VN. 113. http://www.doc.edu.vn/tailieu/staphylococcus-aureus-va-benhvien-dostaphylococcus-11353 . 124 PHỤ LỤC Hình 1: Gà Lerghor mới nở Hình 2: Nuôi gà thực nghiệm tại Hải Dương 125 Hình 3: Nuôi Gà thực nghiệm tại Hải Dương Hình4: Chuồng nuôi gà đang đẻ trứng thực nghiệm tại Hải Dương 126 Hình 5: Tiêm vắc xin cho gà thực nghiệm tại cơ ức Hình 6: Tiêm vắc xin cho Gà thực nghiệm tại cơ ức 127 [...]... phát hiện của que thử với độc tố SEA .94 Bảng 3.2 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB 95 Bảng 3.3 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 96 Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED .96 Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE 97 Bảng 3.6 Tính ổn định của que thử phát hiện SE(A+B+C1+D+E) 99 Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện của que. .. hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trong thực phẩm Nội dung nghiên cứu của đề tài - Sản xuất và tinh sạch độc tố ruột tụ cầu tái tổ hợp SEC1 và ứng dụng để phát triển que thử; - Sản... hiện nhanh cả 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) Vì thế, việc phát triển một hệ thống sắc ký miễn dịch có khả năng phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm là rất cấp thiết, giúp đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các sản phẩm lƣu hành trong nƣớc và sản phẩm thực phẩm xuất khẩu Từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài luận án: Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh. .. thịt); - Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của que thử trên một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt) đƣợc gây nhiễm thực nghiệm Điểm mới của luận án Đã có nhiều nghiên cứu về S.aureus và các độc tố của chúng nhƣng việc nghiên cứu, chế tạo thành công que thử để phát hiện nhanh các độc tố của S.aureus trong thực phẩm ở nƣớc ta thì đây là một kết quả mới, cụ thể... hiện của que thử với độc tố SEA trên sữa 101 Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên sữa 101 Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên sữa 102 Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên sữa 102 Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên sữa 103 Bảng 3.12 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên thịt... Hình 3.27 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên sữa 103 Hình 3.28 Lựa chọn nồng độ pha loãng thịt cho que thử 105 Hình 3.29 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên thịt 105 Hình 3.30 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên thịt 106 Hình 3.31 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên thịt 106 Hình 3.32 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên thịt ... nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE 97 Hình 3.22 Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cần sử dụng 100 Hình 3.23 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên sữa 101 Hình 3.24 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên sữa 101 Hình 3.25 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên sữa 102 Hình 3.26 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên sữa 103 Hình 3.27 Độ nhạy của. .. IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) và ứng dụng để tạo que thử; 11 - Tối ƣu hóa lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng, vạch thử nghiệm của que thử và lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng trên que thử; - Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của que thử; - Xây dựng quá trình chuẩn bị mẫu của một số nhóm thực phẩm (sữa,... Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên thịt 106 Bảng 3.14 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên thịt 106 Bảng 3.15 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên thịt 107 Bảng 3.16 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt 107 9 MỞ ĐẦU Việc đảm bảo chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe con ngƣời Ngộ độc thực phẩm. .. ra các độc tố SEB, SEC và SED [74, 77, 89] Khi các chủng vi khuẩn tụ cầu vốn mang gen mã hóa các độc tố ruột SE phát triển đến một số lƣợng nhất định trong thực phẩm (khoảng 106 CFU/g, ml), chúng có thể tiết ra một lƣợng độc tố đủ để gây ra hiện tƣợng ngộ độc cho ngƣời tiêu dùng [Theo 51, 107] 1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu 1.1.3.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên ... sinh an toàn thực phẩm cho sản phẩm lƣu hành nƣớc sản phẩm thực phẩm xuất Từ thực tế trên, thực đề tài luận án: Nghiên cứu tạo que thử để phát nhanh số độc tố ruột tụ cầu khuẩn thực phẩm Mục tiêu... kháng nguyên 1.4.2 Một số nghiên cứu tạo que thử phát độc tố ruột tụ cầu thực phẩm Gần đây, số nghiên cứu phát triển que thử ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát SE thực phẩm đƣợc công bố... hiệu với loại độc tố tụ cầu phát triển đƣợc que thử sắc ký miễn dịch phát loại độc tố ruột tụ cầu phổ biến Trong luận án này, sử dụng ƣu điểm để tạo que thử phát loại độc tố ruột tụ cầu dựa kháng