Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

86 1,522 4
  • Loading ...
1/86 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 22/10/2015, 10:37

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘITRỊNH LÊ ANHNGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠTCHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNGPHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔLUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP IHÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘITRỊNH LÊ ANHNGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠTCHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNGPHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔLUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP ICHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾMÃ SỐ:Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều AnhNơi thực hiện: Trường Đại Học Dược Hà NộiTrung tâm Kiểm Nghiệm Thanh HóaThời gian thực hiện: 20/01 – 20/5/2015HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠNTrong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi đã nhậnđược nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ quý báu từ các thầy cô giáotrường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị đồng nghiệp của Trung tâmkiểm nghiệm Thanh Hóa.Nhân dịp này tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. NguyễnThị Kiều Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báutrong quá trình thực hiện luận văn cũng như trong quá trình học tập, côngtác.Tôi trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáotrường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thànhkhóa học này.Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng tập thể cánbộ Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôitrong suốt thời gian học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận văn.Cuối cùng tôi trân thành cảm ơn và bày tỏ tình cảm sâu sắc tới nhữngngười thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôitrong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015Học viên Trịnh Lê Anh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTCGI: Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin InjectionESI: Chế độ ion hóa bằng phun điện tửHPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng caoLC: Sắc ký lỏngLC-MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ 2 lầnm/z: Khối lượng/ điện tíchMeCN: AcetonitrilMeOH: MethanolmM: MilimolMRM: Chế độ bắt đa mảnh phổMS: Khối phổPA: Tinh khiết phân tíchPDA: Detector photo diod arrayQ: Quadrupple tứ cựcR: Hệ số tương quan tuyến tínhRSD: Độ lệch chuẩn tương đốiSD, CV: Độ lệch chuẩn tuyệt đốiSIM: Chế độ bắt phổ chọn lọcSRM: Chế độ bắt một mảnh phổUPLC: Sắc ký lỏng siêu cao ápUVTia tử ngoại MỤC LỤCMỤCTRANGĐẶT VẤN ĐỀ1Chương 1. TỔNG QUAN31.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZININJECTION (CGI).1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI.1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạtchất.1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ địnhthuốc tiêm CGI.33351.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI71.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS)91.2.1.Khái niệm.91.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba [20], [18]91.2.3 Ứng dụng141.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP151.3.1. Tính đặc hiệu151.3.2. Độ tuyến tính151.3.3. Độ đúng151.3.4. Độ chính xác161.3.5. Độ vững17Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNGPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU1818 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU182.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU202.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích202.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích212.3.3 Xử lý kết quả24Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU253.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH253.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ253.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thànhphần của thuốc tiêm CGI.293.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH313.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp313.2.2 Độ tuyến tính của phương pháp343.2.3 Độ chính xác363.2.4 Độ đúng413.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích45Chương 4. BÀN LUẬN464.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH484.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH50KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ52KẾT LUẬN52KIẾN NGHỊ53TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNGTÊN BẢNGTRANGBảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1.19Bảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2.19Bảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3.19Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4.20Bảng 3.1 Các thông số khối phổ25Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phầnhoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI.31Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp33Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp35Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp38Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phươngpháp40Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượngđối với thành phần Glycin42Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượngđối với thành phần Glycyrrhizin43Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượngđối với thành phần L-Cystein44Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất trong điềukiện thí nghiệm.45 DANH MỤC CÁC HÌNHTÊN HÌNHTRANGHình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin3Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycine.4Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid4Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ.9Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI11Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba12Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực12Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76) tạo ramảnh con (m/z = 29).26Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76).26Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh glycyrrhizin (m/z = 840)tạo ra mảnh con (m/z = 453)27Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840).27Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein (m/z = 121) tạora mảnh con (m/z = 58).28Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121).28Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng.32Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng.32Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng.33 ĐẶT VẤN ĐỀThuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) chứa ba thànhphần hoạt chất bao gồm: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein20mg, được dùng trong điều trị rối loạn chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêmgan C; hỗ trợ điều trị eczema [14], [15]. Thuốc có trong danh mục thuốcthanh toán bảo hiểm y tế và danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam vì vậythuốc được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị nhất là điều trị nội trú,bảo vệ gan trước sự tác động có hại của các loại thuốc khác.Tại Việt Nam hiện nay đang tiến hành làm hồ sơ xin cấp phép lưuhành [14]. Tại Nhật Bản thuốc có thành phần tương tự được sử dụng rộngrãi trong điều trị [15].Để xây dựng tiêu chuẩn của thuốc, một trong những chỉ tiêu quantrọng nhất là phải xây dựng được phương pháp định tính và định lượngđược các hoạt chất đảm bảo tính đặc hiệu, ổn định và chính xác [5], [6].Đối với hai thành phần acid amin L-Cystein, Glycin trong chế phẩm thuốcCompound Glycyrrhizin Injection - là những hoạt chất không hấp thụ UVnên không thể định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS [12],[18], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detectorthông thường như: UV-VIS; PDA cũng không định lượng được các thànhphần hoạt chất này. Các hoạt chất này có thể phân tích được dựa vào phảnứng dẫn xuất nhóm amin với thuốc thử thích hợp và phát hiện bằng HPLCvới detector huỳnh quang [17]. Quá trình dẫn xuất được thực hiện trước cộthoặc sau cột khi phân tích bằng sắc ký, nhưng kết quả thường kém ổn địnhvà chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hailần (LC-MS/MS) là phương pháp phân tích hiện đại, có tính đặc hiệu vàlặp lại cao, có thể phân tích trực tiếp đồng thời các chất trong hỗn hợp ngaycả khi các chất phân tích không tách rời nhau khi qua hệ thống sắc ký. Do1 đó, kỹ thuật này được sử dụng ngày càng nhiều trong phân tích thuốc, đặcbiệt những phép phân tích khó như các thuốc có thành phần phức tạp, phântử lớn, hàm lượng thấp.Để góp phần triển khai kỹ thuật phân tích mới tại trung tâm Kiểmnghiệm thuốc Thanh Hóa và nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốclưu hành trên thị trường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứuphân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc kýlỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau:1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích để định tính, định lượngđồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein bằng kỹ thuật LCMS/MS.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Glycin,Glycyrrhizin, L-cystein trong chế phẩm thuốc CGI, từ đó hoànthiện qui trình định tính, định lượng các thành phần hoạt chấttrong chế phẩm thuốc CGI bằng LC-MS/MS.2 Chương 1. TỔNG QUAN1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION(CGI).1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI.+ Nguồn gốc:Thuốc tiêm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) được sản xuấtbởi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd. No.7 RongchangEast Street, BDA, Beijing, China.+ Công thức bào chế 20 ml dung dịch tiêm CGI:Monoamoni Glycyrrhizinate tương đương Acid Glycyrrhizin40 mgGlycin400 mgL-cystein hydrochlorid20 mgTá dược: Natri sulfit khan, natri clorid, amoniac, nước cất vừa đủ 20 ml[13].Thuốc đóng trong lọ thủy tinh trung tính, màu trắng, dung dịch thuốc trongsuốt, không màu.1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt chất.Monoamoni GlycyrrhizinatCOOHHOHONH4OOCOHO HOHOHOOCHO HOOOHHình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin3 - Công thức phân tử: C42H62O16;- Trọng lượng phân tử: 839,97 g/mol;- Tên khoa học: Acid (3β,18α)-30-hydroxy-11,30-dioxoolean-12-en-3yl 2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosiduronic.- Bột kết tinh màu trắng;- Tan tốt trong nước; tan trong ethanol, khó tan trong methylen clorid,không tan trong ether [14]GlycinOOHNH2Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycin-Công thức phân tử: C2H5NO2;Công thức cấu tạo: H2N-CH2-COOH;Trọng lượng phân tử: 75,07 g/mol;Tên khoa học: Acid aminoacetic;Bột kết tinh màu trắng, vị ngọt;Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trườngkiềm, tan trong ethanol, không tan trong ether [4], [13], [18].L – Cystein hydrocloridOOH . HCLHSNH2Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid.-Công thức phân tử: C2H5NO2;Công thức cấu tạo: HSCH2CH(NH2)COOH . HCl;Trọng lượng phân tử: 157,62 g/mol;Tên khoa học: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid;4 - Bột kết tinh màu trắng;- Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trườngkiềm, tan trong ethanol, không tan trong các dung môi hữu cơ ít phâncực [4], [13], [18].1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định thuốctiêm CGIDược lực học [15]+ Tác dụng chống viêm: Ức chế các enzym chuyển hóa acidarachidonic: Glycyrrhizin có thể liên kết với phospholipase A2 (enzymhoạt hóa cho sự chuyển hóa acid arachidonic) và lipoxygenase (chất gâyảnh hưởng đến acid arachidonic và là nguyên nhân sản xuất trung gianviêm), thông qua đó ức chế chọn lọc sự phosphoryl hóa và gây ức chế sựhoạt hóa các enzym.+ Tác dụng ức chế sự tổn thương tế bào gan: Thử nghiệm nuôi cấy tếbào gan chuột trong ống nghiệm, glycyrrhizin ức chế sự tổn thương tế bàogan do tetracloromethan gây ra.+ Ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus: Ở những chuột thínghiệm bị nhiễm viêm gan virus, điều trị với glycyrrhizin có thể kéo dàithêm tuổi thọ. Ở thỏ thí nghiệm bị nhiễm virus bệnh đậu mùa, glycyrrhizincó thể ức chế sự phát triển của virus. Trong các thử nghiệm in-vitro khác,glycyrrhizin cũng thể hiện tác dụng ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tínhcủa virus. Glycin và cystein gây ức chế hoặc giảm chứng tăng aldosterongiả do các bất thường trao đổi điện giải trong quá trình điều trị dài ngày vớiglycyrrhizin.Dược động học [15]+ Hấp thu: Đối với người khỏe mạnh, nồng độ thuốc trong máu giảmđáng kể sau 10 giờ tiêm 40 ml dung dịch Compound Glycyrrhizin Injection(chứa 80 mg glycyrrhizin). Sau đó nồng độ thuốc giảm dần dần. Acidglycyrrhizic, sản phẩm thủy phân của glycyrrhizin, xuất hiện sau 6 giờ tiêmthuốc, đạt nồng độ đỉnh sau 24 giờ và bị thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể sau48 giờ.5 + Thải trừ qua nước tiểu: Đối với người khỏe mạnh sau khi tiêmglycyrrhizin, nồng độ thuốc trong nước tiểu giảm dần. Tốc độ thải trừ là1,2% liều sau 27 giờ tiêm thuốc. Acid glycyrrhizic bắt đầu xuất hiện sau 6giờ và đạt nồng độ đỉnh sau 22 -27 giờ tiêm thuốc.Chỉ định [15]+ Hỗ trợ điều trị viêm gan mạn tính và cải thiện rối loạn chức năng gan.+ Hỗ trợ điều trị eczema, viêm da, nổi mày đay.Liều lượng và cách sử dụng [15]+ Thuốc dùng đường tiêm truyền tĩnh mạch. Dùng theo chỉ dẫn của bácsĩ điều trị.Người lớn: Liều thông thường: Tiêm 5-20 ml mỗi ngày một lần. Có thểđiều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của bệnh nhân.+ Bệnh nhân viêm gan: Tiêm hoặc truyền tĩnh mạch 40-60 ml mỗi ngàymột lần. Có thể điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng củabệnh nhân. Liều hàng ngày tối đa không được vượt quá 100 ml/ ngày.+ Bệnh nhân nhi: Chưa có nghiên cứu đầy đủ. Không khuyến cáo dùngcho nhóm đối tượng này.+ Bệnh nhân cao tuổi: Bệnh nhân cao tuổi thường có khuynh hướng bịhạ kali máu. Do đó, việc sử dụng thuốc của bệnh nhân cần được theo dõichặt chẽ.+ Sử dụng cho phụ nữ có thai và cho con bú: Chưa có nghiên cứu đầyđủ và được kiểm soát tốt trên bệnh nhân nhi. Không dùng cho nhóm đốitượng này.Chống chỉ định [15]+ Quá mẫn cảm với bất kỳ thành phần nào của thuốc.+ Tăng aldosteron, đau cơ hoặc hạ kali máu.+ Phụ nữ có thai hoặc nuôi con bú.6 1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGITrên thế giới đã có nhiều tài liệu công bố về các phương pháp địnhtính, định lượng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khác nhau bằng các kỹthuật: sắc ký lỏng [11], [13], [16]; chuẩn độ thể tích [12], [13], [18]; sắc kýlỏng khối phổ [19], [17], [22].Tuy thuốc CGI đã được sản xuất tại Nhật Bản, Trung Quốc và sửdụng tại nhiều nơi trên thế giới, xong chưa có quốc gia nào đưa chuyênluận thuốc tiêm có chứa các thành phần nói trên vào Dược Điển của mình.Cũng chưa tìm thấy tài liệu công bố phương pháp định lượng đồng thời bahoạt chất nói trên.Đối với thành phần Glycin dạng nguyên liệu một số dược điển đãxây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ môi trường khan, trongđó chất phân tích được hòa tan trong acid actetic băng, hoặc hỗn hợp acidacetic băng và acid formic rồi chuẩn độ bằng acid percloric 0,1N với chỉ thịtím tinh thể hoặc xác định điểm tương đương bằng đo điện thế [13]; [16];[18]. Với phương pháp này dựa vào tính kiềm của nhóm -NH2 trong phântử hoạt chất, phương pháp này sẽ bị hạn chế nếu có mặt của nước (là mộtdung môi khá phổ biến của thuốc tiêm), làm cho chất phân tích vừa thểhiện tính kiềm, vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trở nên trung tính,không chuẩn độ được.Chuyên luận thuốc tiêm Glycin (Glycine Irrigation Solution) trongmột số dược điển của các nước tiên tiến đã sử dụng phương pháp trung hòa[13]; [16]; [18]. Nguyên tắc của phương pháp này là trong môi trườngnước các acid amin vừa thể hiện tính base vừa thể hiện tính acid nên dungdịch trung tính. Khi có mặt formol các nhóm –NH2 bị khóa lại nên tính acidtrội lên có thể định lượng được bằng một dung dịch base chuẩn. Cả haiphương pháp định lượng hóa học dựa vào tính kiềm của nhóm –NH2; hoặctính acid của nhóm –COOH đều không đặc hiệu. Phương pháp có giới hạnphát hiện cũng như giới hạn định lượng cao. Khi trong công thức có thêmcác thành phần tá dược có tác dụng đệm pH, nền mẫu phức tạp phươngpháp sẽ gặp sai số hoặc không tiến hành được.7 Hoạt chất Cystein dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựngphương pháp định lượng bằng chuẩn độ oxy hóa khử, trong đó chất phântích được hòa tan trong nước rồi chuẩn độ bằng dung dịch iod 0,1N phươngpháp thừa trừ hoặc chuẩn độ trực tiếp với chỉ thị hồ tinh bột [13]; [16];[18]. Phương pháp này dựa vào tính khử của nhóm -SH trong phân tử hoạtchất, độ đặc hiệu kém và đôi khi bị ảnh hưởng của sự có mặt một số chấtoxy hóa, như oxy hòa tan trong dung dịch.Chế phẩm thuốc chứa Cystein một số tài liệu đã sử dụng phươngpháp oxy hóa khử với dung dịch chuẩn độ iod 0,1N chuẩn độ bằng phươngpháp trực tiếp hay phương pháp thừa trừ; hoặc dùng dung dịch chuẩn độ làdung dịch bromid, phương pháp thừa trừ. Các phương pháp trên đều cóchung nhược điểm như độ nhạy kém, và không đặc hiệu với thành phầnhoạt chất, phương pháp gặp phải sai số nhất định khi có một số tá dượcchất chống oxy hóa trong thuốc tiêm [12], [13], [18].Một số tài liệu công bố phương pháp định lượng thành phần LCystein dạng nguyên liệu cũng như dạng chế phẩm bằng phương phápHPLC detetor huỳnh quang; sử dụng bộ Kit tạo dẫn xuất huỳnh quang, tuynhiên phương pháp này gặp phải một số khó khăn như bộ Kit đắt tiền vàkhông sẵn có [23].Hoạt chất Glycyrrhizin trong chế phẩm thuốc tiêm CGI được xâydựng phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectorUV bước sóng 252 nm; hoặc detector PDA với bước sóng lấy pic là 252nm [12].Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R đã tiến hành định lượng acidGlycyrrhizin và các chất chuyển hóa của Acid Glycyrrhizin bằng phươngpháp LC-MS/MS, ở khoảng nồng độ thấp khoảng 1-2 µg/ml [22].8 1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS)1.2.1 Khái niệmSắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích có sự kết hợp giữakhả năng phân tách của hệ thống sắc ký (HPLC) với khả năng phân tíchkhối của hệ thống khối phổ.Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một hệ thống có vai trò tách các chấtdựa trên sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng [4].Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích củaion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫudựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong mộtđiện trường hoặc một từ trường nhất định [18], [13].1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập baHệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba (TripleQuadrupole) hay còn gọi là khối phổ hai lần (MS/MS) được sử dụng nhiềutrong công tác nghiên cứu, kiểm tra chất lượng thuốc, nhất là định lượngthuốc trong dịch sinh học, nghiên cứu tương đương sinh học, nghiên cứuđịnh lượng các thuốc có thành phần phức tạp vì thiết bị có độ nhạy, độchọn lọc cao.Trong các kiểu hình thành ion, kỹ thuật phun điện tử ESI(Electrospray Ionazition – ESI) được sử dụng nhiều hơn cả. Trong nghiêncứu này chúng tôi cũng sử dụng kiểu ion hóa theo kỹ thuật ESI vì vậy trongphần tổng quan này chúng tôi sẽ trình bày về hệ Triple Quadrupole vớinguồn Ion hóa kiểu ESI [18], [20].Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ.9 Một máy khối phổ tứ cực chập ba gồm có các bộ phận chính sau:Bộ phận nạp mẫu, đưa mẫu vào (Inlet);Bộ nguồn ion hóa (ion source);Bộ phận phân tích khối lần 1 (Q1): phân tích mảnh mẹ;Bộ phận buồng va chạm (Collision cell);Bộ phận phân tích khối lần 2 (Q2): phân tích mảnh con;Bộ phận phát hiện ion (Detector);Bộ phận ghi nhận và xử lý số liệu (data system).Bộ phận nạp mẫuBộ phận nạp mẫu để chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ionhóa của thiết bị khối phổ. Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760 mmHg) vào buồng chân không (10-5 – 10-8 Torr) phải không được ngắt chânkhông của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) và bộ phận phát hiện(detector) nên bộ phận nạp mẫu của LC-MS có khác biệt:Đầu ra của LC là dòng dung môi, nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòngdung môi vào phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy vàvận hành của thiết bị. Mặt khác khi các ion có trong thành phần của dungmôi dễ dàng va chạm với các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướngdi chuyển và bị bơm chân không hút ra ngoài. Do đó quá trình nạp mẫu từLC vào MS thường phải qua giao diện ghép nối phù hợp.Một ghép nối LC-MS cần có các đặc tính: cho phép chuyển mẫu hiệuquả và chính xác từ LC sang MS mà không phá hủy hay làm mất chất phântích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu.10 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESITrong ESI, tại đầu mao quản dưới ảnh hưởng của điện thế cao, sự hỗtrợ của khí mang và nhiệt độ mẫu được phun thành những hạt sương nhỏmang điện tích bề mặt. Điều kiện nhiệt độ trong buồng phun cao làm chodung môi trong các hạt sương bốc hơi khi đó mật độ điện tích tại các bề mặthạt sương gia tăng đến một giá trị tới hạn và tiếp tục phân chia thành các hạtsương nhỏ hơn vì lực đẩy tĩnh điện lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quátrình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từnhững hạt rất nhỏ mang điện tích cao này các ion phân tích được chuyểnthành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi từ đó đi vào bộ phận phân tích khối.Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra ngoài bởi bơm chân khôngcủa thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc và hội tụ bởi mộtđiện thế, khi đi ra khỏi buồng ion hóa các phân tử có tốc độ đạt cao nhất rồiđi vào phần phân tích khối là một dòng tập trung và đồng nhất.Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải biến thành chất điện ly,tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào dung môisử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.Kỹ thuật ion hóa kiểu phun điện tử được áp dụng để phân tích nhữngchất phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân tử lớn vàcác chất kém bền với nhiệt.11 Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập 3Q3Q1Q2 (Collision cell)Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập baHình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cựcBộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1; Q2; Q3. Các tứ cực nàyđược cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau tạo thànhhai cặp điện cực.Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vàotừng cặp đối diện của tứ cực. Dưới tác động của dòng điện từ trường tronglòng ống điện cực, các ion di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào sốkhối. ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.Q1 sẽ tách các ion cần quan tâm bằng cách các ion có tỷ số m/z xácđịnh đã lựa chọn sẽ đi thẳng đến tứ cực thứ 2 (Q2), những ion khác bị dậptắt do va chạm với thành của tứ cực ở các bản điện cực trái dấu.Tứ cực thứ 2 (Q2) còn gọi là buồng va chạm (Collision cell), bêntrong chứa khí trơ (Argon) thường được thiết kế cong để tăng sự va chạm.Các ion di chuyển từ tứ cực Q1 vào Q2 có vận tốc lớn va chạm với các12 phân tử khí trơ trong Q2, lúc này năng lượng động học của ion biến thànhnội năng nên các ion bị vỡ ra từng mảng tạo thành các ion con bé hơn.Tứ cực thứ 3 (Q3) có cấu tạo giống Q1, các ion mới được hình thànhtrong Q2 sẽ được di chuyển tiếp đến Q3. Q3 sẽ phân tích tách và bắt giữ tínhiệu của các ion con đặc trưng cần quan tâm của chất phân tích và đưa đếnbộ phận phát hiện (Detector).Bộ phận phát hiện (detector)Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion sẽ được đưa tới bộphận nhận tín hiệu, phát hiện ion. Bộ phận tín hiệu cho phép khối phổ tạora một tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ đượcđưa đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổFull-scan: Khi thao tác với chế độ full-scan, đầu dò sẽ nhận được tấtcả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốtquá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phântích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCANthường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.Chế độ chọn lọc ion: (Selected Ion Monitoring SIM): Trong chếđộ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một mảnh ion đặc trưng cho chấtcần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọntrước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư việncó sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựachọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (MultipleReaction Monitoring): Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hailần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sửdụng là SRM và MRM.SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong cácmảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dòđể phát hiện.13 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vilượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuậtghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ionmẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chấtlà buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cầnquan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.1.2.3 Ứng dụngPhương pháp phân tích khối phổ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vựckhác nhau của khoa học và công nghệ như: thực phẩm – đồ uống; môitrường; độc chất học; tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật; dược phẩm …Trong ngành dược một số ứng dụng cơ bản của kỹ thuật này:Xác định khối lượng phân tử, khối lượng nguyên tử;Xét đoán cấu trúc phân tử;Kiểm nghiệm thuốc: định tính, định lượng, kiểm tra độ tinh khiếtnguyên liệu, xác định tạp chất liên quan…;Nghiên cứu phát triển hợp chất mới;Phân tích thuốc trong dịch sinh học: nghiên cứu dược động học, sinhkhả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…;Một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh đã được trang bị thiết bịnày như: Hà Nội, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Huế… nhưng chưatriển khai được nhièu để phục vụ công tác kiểm nghiệm.+ Nghiên cứu xác định tạp chất liên quan là lĩnh vực thế mạnh củathiết bị khi các tạp chất có nồng độ thấp, độ nhạy của các thiết bị HPLCthông thường không đủ đáp ứng, đặc biệt khi không có chất chuẩn, vẫn cóthể định tính và xác định được dựa thư viện phổ của các chất đã được lưugiữ trong Detector khối phổ.+ Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng một số nhómhoạt chất không hấp thụ quang như: bán thành phẩm kháng sinh nhóm14 Aminoglycosid, phục vụ sản xuất mà trước đây không thực hiện được bằngcác phương pháp khác.+ Phân tích dư lượng một số dung môi tồn dư trong nguyên liệu làmthuốc, theo quy định của GMP.1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP1.3.1. Độ đặc hiệuĐộ đặc hiệu là khả năng phân biệt rõ chất cần phân tích khi các thànhphần khác có thể tồn tại trong mẫu thử. Thông thường gồm: các tạp chất,sản phẩm phân hủy, chất nền.Trong LC-MS, tính đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu được trênsắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách vànhận diện rõ ràng. Tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng tại vị trí các pic của chấtphân tích không được vượt quá 2%.1.3.2. Độ tuyến tínhĐộ tuyến tính của một qui trình phân tích diễn tả đáp ứng phân tíchthu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tíchtrong mẫu thử.Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữanồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được.Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định.Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + bYêu cầu:- Số điểm đường chuẩn n ≥ 5- Hệ số tương quan r ≥ 0,9981.3.3. Độ đúngĐộ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn mức độ gần nhaugiữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chấtphân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.15 Thường tiến hành ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định củaphương pháp (80% - 100% và 120%), mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫuhoặc 6 mẫu ở mức nồng độ 100%.Yêu cầu:- Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%;(Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết)1.3.4. Độ chính xácĐộ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau(mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử đượcchuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra.Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian vàđộ tái lặp.Độ lặp lạiĐộ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hànhtrong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lạibiểu thị độ chính xác trong định lượng.Thường được tiến hành trên 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%.Yêu cầu:- Định lượng: RSD ≤ 2,0%- Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0%Độ chính xác trung gianĐộ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trongcùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện: các ngày khác nhau,kiểm nghiệm viên khác nhau, và hóa chất khác lô sản xuất.16 Yêu cầu:- Định lượng: RSD ≤ 2,0%- Độ hòa tan: RSD ≤ 4,0%- Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%.Độ tái lặpĐộ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm (Phối hợpnghiên cứu giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩnhoá phương pháp).1.3.5 Độ vữngĐánh giá ảnh hưởng của các thay đổi nhỏ trong quy trình phân tíchđến kết quả phân tích và độ ổn định của kết quả. Trong nghiên cứu nàychúng tôi đánh giá độ ổn định theo thời gian của hoạt chất trong điều kiệnphân tích.17 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNGPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU- Chất chuẩn:+ Chất chuẩn: Glycin; nguồn gốc Viện Kiểm nghiệm thuốc TƯ, hàmlượng 99,87% (nguyên trạng); SKS: WS010814.+ Chuẩn L-Cystein: chuẩn nhà sản xuất; hàm lượng 98,04% (nguyêntrạng); SKS: C1276.+ Chuẩn Monoamoni Glycyrrhizinat: chuẩn Sigma Aldrich, Mỹ;hàm lượng 80,0% (nguyên trạng); SKS: SLBBG1855V.- Dung môi hóa chất:+ Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), nước cất đạt tiêu chuẩntinh khiết dùng cho sắc ký lỏng khối phổ LC/MS.+ Các dung môi hóa chất khác: cloroform; acid formic; acid acetic;acid tricloacetic, amoni acetat đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích(PA).- Thiết bị dụng cụ:+ Tất cả các thiết bị đều được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC17025 : 2005; và GLP, bao gồm:+ Hệ thống sắc ký lỏng UPLC – MS/MS, nguồn ion kiểu ESI, hãngWaters Acquity H (UPLC-Class); Detector Xevo TQD (Waters), Mỹ;+ Cân phân tích Mettler Toledo MS240S (d=0,1 mg);+ Các dụng cụ thủy tinh của phòng thí nghiệm cấp A;2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU- Mẫu Placebo: là các mẫu tự tạo có chứa các thành phần của côngthức thuốc và không chứa hoạt chất tương ứng. Trong nghiên cứu nàychúng tôi sử dụng 04 mẫu placebo. Công thức các mẫu Placebo được trìnhbày cụ thể trong các bảng: 2.1, 2.2, 2.3, 2.4.18 Bảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1STTThành phần1Natri sulfit khan2Natri clorid3Amoni hydroxyd4Nước cấtHàm lượng20 mg180 mgĐiều chỉnh pH = 7,0Vừa đủ 20 mlBảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2STTThành phầnHàm lượng1Glycin2L-Cystein20 mg3Natri sulfit khan20 mg4Natri clorid5Amoni hydroxyd6Nước cất400 mg180 mgĐiều chỉnh pH = 7,0Vừa đủ 20 mlBảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3STTThành phầnHàm lượng1Glycyrrhizin40 mg2L-Cystein20 mg3Natri sulfit khan20 mg4Natri clorid5Amoni hydroxyd6Nước cất180 mgĐiều chỉnh pH = 7,0Vừa đủ 20 ml19 Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4STTThành phần1Glycyrrhizin2Glycin3Natri sulfit khan4Natri clorid5Amoni hydroxyd6Nước cấtHàm lượng40 mg400 mg20 mg180 mgĐiều chỉnh pH = 7,0Vừa đủ 20 ml- Mẫu thử: Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection; nhà sảnxuất: Beijing Kawin Technology Share-Holding Co., Ltd. China; SKS:20140906/077; ngày sản xuất: 24/09/2014; hạn dùng: 23/09/2017.- Mẫu chuẩn: là các dung dịch chuẩn được pha với nồng độ thích hợptrong pha động.2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tíchXác định các điều kiện khối phổ phân tích Glycyrrhizin; Glycin; LCysteinSử dụng hệ thống khối phổ LC-MS/MS với nguồn ion hóa kiểu ESI,tiến hành thực nghiệm như sau:+ Glycyrrhizin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) vớinồng độ 2 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ20µl/phút;20 + Glycin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồngđộ 20 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ20µl/phút;+ Cystein được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồngđộ 1 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ20µl/phút.Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ với các nội dung sau:Xác định các ion mẹ;Tối ưu hóa các điều kiện ở nguồn ion hóa, bộ phận thấu kính hội tụđể lượng ion mẹ đi vào hệ thống khối phổ nhiều nhất và ổn định nhất;Xác định các mảnh ion con bền, ổn định và xác định năng lượng phânmảnh tối ưu nhất để lượng ion con tạo thành nhiều nhất và ổn định nhất.Khảo sát điều kiện sắc kýQua tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên cáccột C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) và cột C18; C8 (100 x 2 mm; 1,8 µm); trêncác hệ pha động gồm Acetonitril; dung dịch đệm amoniacetat 0,5 mMpH=3,0; dung dịch acid formic 0,01%; dung dịch acid tricloacetic 0,01%theo các tỷ lệ khác nhau.Từ kết quả khảo sát có thể chọn hệ sắc ký thích hợp để tiến hànhđịnh lượng đồng thời 3 hoạt chất trong thuốc tiêm CGI trên hệ thốngUPLC-MS/MS.2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tíchChuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng như sau:Chuẩn bị các dung dịch chuẩnChuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừađủ 100 ml.21 Dung dịch chuẩn Cystein làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịchchuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 100 ml được dung dịch cónồng độ: 1,078 µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.Chuẩn gốc Monoamoni glycyrrhizinat: cân 0,0165 g chuẩnGlycyrrhizin, pha trong nước vừa đủ 100 ml.Dung dịch chuẩn Monoamoni glycyrrhizinat làm việc: Hút chínhxác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50ml. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Glycyrhizin tương ứng:2,0µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừađủ 100 ml.Dung dịch chuẩn Glycin làm việc: Hút chính xác 5,0 ml dung dịchchuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml được dung dịch cónồng độ: 20,873µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.Chuẩn bị mẫu thử:Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml.Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml.Lọc qua màng lọc 0,2 µm.Mẫu trắng: Có chứa các thành phần tá dược, không chứa các thànhphần chất phân tích. Chuẩn bị như mẫu thử.Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phươngpháp phân tích của Asean [3].Tính chọn lọcTiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 lần phântích mẫu placebo tương ứng với từng thành phần của thuốc và thành phầnchuẩn đơn lẻ. Tiến hành ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng của mẫutrắng với mẫu chuẩn tại vị trí thơi gian lưu của chuẩn [3].22 Khoảng nồng độ tuyến tínhPha một dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp ban thành phần có nồngđộ khác nhau tương ứng 50%; 75%; 100%; 125%; 150% nồng độ địnhlượng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồđánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ hoạt chất và diện tích píc đápứng [3].Độ chính xác- Độ lặp lạiTiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trongcùng một ngày, cùng một kiểm nghiệm viên, cùng thiết bị. Tính toán kếtquả và đánh giá độ lặp lại của phương pháp [3].- Độ chính xác trung gianTiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trongcùng ngày hôm sau, với kiểm nghiệm viên khác, sử dụng cột phân tíchkhác. Tính toán kết quả và đánh giá độ chính xác trung gian của phươngpháp bằng cách so sánh kết quả phân tích của hai kiểm nghiệm viên tronghai ngày [3].Độ đúngĐộ đúng của phương pháp được tiến hành bằng cách phân tích mẫutự tạo bằng cách thêm chuẩn vào mẫu placebo số 1 ở ba khoảng nồng độ80%; 100% và 120% nồng độ định lượng. Mỗi nồng độ được tiến hành độclập 03 mẫu. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, tính toán kếtquả. Độ đúng được đánh giá dựa trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượngđược so với nồng độ thực của mẫu [3].Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tíchMẫu thử được chuẩn bị trong phần thẩm định độ lặp lại của phươngpháp được giữ lại bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ phân tích lại. So23 sánh với kết quả ban đầu để đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong điềukiện phân tích [3].2.3.3 Xử lý kết quảCác số liệu về diện tích pic, thời gian lưu, mảnh khối của các chấtphân tích trên sắc ký đồ, phổ đồ với phần mềm Maslyx của máy UPLCMS/MS Waters Acquity H (UPLC-Class); Detector Xevo TQD (Waters).Các số liệu phân tích được xử lý thống kê bằng phần mềmMicrosoftExcel.Công thức tính toán hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm:X (%) St100% C C  1000 ScHL  1000000Trong đó:+ St; Sc: diện tích pic của mẫu thử; mẫu chuẩn.+ Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml).+ HL: lượng hoạt chất có trong 1 ml chế phẩm (theo nhãn).24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổPha các dung dịch chuẩn Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong hỗnhợp MeOH: nước (1:1) có nồng độ lần lượt như sau: 2 µg/ml; 20 µg/ml; 1µg/ml.Tiêm các dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ cùng với dòng phađộng sắc ký (tốc độ 0,3 ml/phút). Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ mộtlần, quét toàn dải (Full scan MS); xác định các mảnh ion mẹ (parent ion)của các chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein.Kết quả xác định được các ion mẹ có số khối như sau: Glycin m/z =76,332 Da; Glycyrrhizin m/z = 840,363 Da; L-Cystein m/z = 121,832 Da;ứng với cấu trúc nhận một proton.Sau khi xác định được các mảnh ion mẹ, tiến hành tối ưu điều kiệnnguồn ion hóa: điện thế đầu cone (Cone voltage); năng lượng bắn phá đểtạo ra mảnh ion con cường độ tín hiệu cao và bền nhất.Từ kết quả thực nhiệm chúng tôi đã xác định được như sau:Bảng 3.1 Các thông số khối phổKhốilượngphântửNăngMảnhConeMảnh lượngion mẹ Voltage ion con bắnpháGlycin75,0776,321629,8322ESI+Glycyrrhizin839,36840,4626453,2532ESI+Cystein120,8121,832458,8820ESI+Thành phần25Chếđộion Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76,3) tạora mảnh con (m/z = 29,8).Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76,3).26 Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycyrrhizin(m/z = 840,4) tạo ra mảnh con (m/z = 453,3).Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840,4).27 Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein(m/z = 121,8) tạo ra mảnh con (m/z = 58,9).Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121,83).28 Thực nghiệm cho thấy khi thực hiện chế độ Intellistart (chế độ tunetự động) phân tử Glycin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da;Glycyrrhizin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 453,3 Da; L-Cysteinbị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da là những mảnh ion con cócường độ tín hiệu cao, bền vững và tín hiệu ổn định nhất.3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành phầncủa thuốc tiêm CGIChuẩn bị các dung dịch chuẩn trong pha động có nồng độ:+ Glycyrrhizin: 2 µg/ml;+ Glycin: 20 µg/ml;+ Cystein: 1 µg/ml.Cố định pha tĩnh là cột C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); Qua nghiên cứucác tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát với các pha động:+ Pha động 1: Methanol : dung dịch acid formic 0,1% (90:10);+ Pha động 2: Acetonitril : dung dịch acid formic 0,1% (90:10);+ Pha động 3: Methanol : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10);+ Pha động 4: Acetonitril : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10);+ Pha động 5: Methanol : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0(90 : 10);+ Pha động 6: Acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mMpH=3,0 (90 : 10);Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy:Đối với pha động số 1; số 2 có chứa thành phần acid formic thànhphần Cystein không ổn định trong pha động, bị phân hủy.Đối với pha động số 3; số 4 có chứa thành phần acid tricloacetic ởchế độ khối phổ của thành phần Cystein đường nền đáp ứng rất cao 105 vìacid tricloacetic gây nhiễu đường nền ở mảnh con 58,9 Da; dẫn đến độnhạy thấp không đáp ứng yêu cầu.29 Đối với pha động số 5; số 6 các thành phần hoạt chất ổn định trong phađộng, đường nền ổn định và giá trị S/N cao, phù hợp cho phép phân tích.So sánh giữa pha động số 5 và số 6 chúng tôi thấy pha động số 6 cácpic cân đối và ít bị kéo chân hơn. Từ kết quả khảo sát sơ bộ chúng tôi chọnpha động số 6 với thành phần acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5mM pH=3,0.Tiến hành khảo sát sâu hơn bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần củapha động số 6. Nếu tăng thành phần acetonitril lên pic Glycyrrhizin sẽ rasớm hơn, thời gian lưu của Glycin và Cystein gần như không ảnh hưởng. Ởtỷ lệ pha động acetonitril : dung dịch đệm amoni actetat 5mM pH=3,0 (35 :65), các pic tách nhau rõ ràng, thời gian lưu của Glycyrrhizin 2,2 phút.Giữ nguyên thành phần pha động thay đổi tốc độ dòng, khi tốc độdòng 0,2 ml/phút, pic Glycyrrhizin bị kéo chân; khi tốc độ dòng tăng lên0,4 ml/phút pic Glycyrrhizin ra sớm hơn xong áp suất hệ thống tăng cao, vìvậy chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút là phù hợp và đáp ứng yêu cầu.Giữ nguyên tốc độ và thành phần pha động, khảo sát trên cột dài hơnC18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) pic Glycyrrhizin bị lưu giữ rất lâu tR = 7 – 8phút, phải chạy chế độ Gradien tăng lượng acetonitril pic mới rửa giải ở tRkhoảng 4 - 6 phút.Từ các kết quả khảo sát chúng tôi quyết định sử dụng hệ sắc ký khốiphổ với các điều kiện như sau để định lượng đồng thời các thành phầntrong thuốc tiêm CGI: Điều kiện sắc ký.Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm);Pha động: Hỗn hợp acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mMpH = 3,0 (35:65);Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút;Thể tích tiêm: 10 µl;30  Điều kiện khối phổ.ion hóa bằng phun điện tử ion dương (ESI+);Chọn chế độ phát hiện MRM với các thông số sau:Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phầnhoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI.Mảnh mẹm/zConeVoltage(V)Mảnhconm/zNănglượngbắn phá(V)Chế độion hóaGlycin76,321629,8322ESI+Glycyrrhizin840,4626453,2532ESI+Cystein121,832458,8820ESI+Thành phầnChuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động có nồng độ:+ Glycyrrhizin 2 µg/ml;+ Glycin 20 µg/ml;+ Cystein 1 µg/ml.Mẫu thử được pha trong pha động để có nồng độ các thành phầntương đương với mẫu chuẩn.3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCHSau khi đã xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời cácthành phần của thuốc tiêm CGI, tiến hành thẩm định phương pháp phântích theo cách đã được trình bày ở mục 2.3.2 nhằm khẳng định phươngpháp phân tích đã xây dựng là tin cậy và phù hợp mục đích sử dụng.3.2.1 Độ chọn lọc của phương phápTiến hành sắc ký mẫu chuẩn đơn của từng hoạt chất pha trong phađộng để xác định thời gian lưu ứng với từng chất.31 Phân tích các mẫu placebo tương ứng, các mẫu chuẩn tương ứng phatrong pha động mục 2.3.2 theo phương pháp đã xây dựng. So sánh diện tíchpic thu được của từng chất trong mẫu chuẩn với diện tích pic thu được tạithời gian lưu tương ứng của chất chuẩn trong mẫu placebo tương ứng.Các sắc ký đồ được trình bày ở các hình 3.7; 3.8; 3.9. Kết quả tỷ lệđáp ứng pic được trình bày ở bảng 3.3.Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng.Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng.32 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng.Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương phápGlycinGlycyrrhizinCysteinTTABABAB11622,72810,518 128302,398138,536 20181,3956,21221655,16117,692 127433,20397,43920158,5205,16531725,13212,321 129295,16469,41920001,8547,11341653,6563,875127898,14360,05720697,3242,15751722,2542,090128099,34351,19520562,1625,87961672,8723,636128861,12754,43920661,1824,098TB1675,3018,355128314,89678,51420377,0735,104Tỷ lệ đáp ứng píc (%)0,5%-0,06-0,03A: Đáp ứng pic chất phân tích của mẫu chuẩnB: Đáp ứng pic tại tR tương ứng với pic chất phân tích của mẫu trắngKết quả thực nghiệm cho thấy:33 + Trên sắc ký đồ mẫu trắng (hình 3.7; 3.8; 3.9) tại các thời gian lưutương ứng của chất phân tích không xuất hiện các pic có: mảnh phổ m/z =76,33 -> 29,83 (đặc trưng cho Glycin); mảnh phổ m/z = 840,363 ->453,338 (đặc trưng cho Glycyrrhizin); mảnh phổ m/z = 121,832 -> 58,88(đặc trưng cho Cystein).+ Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn (hình 3.7; 3.8; 3.9) các pic chất chuẩnxuất hiện cân đối.+ Tỷ lệ đáp ứng pic mẫu trắng so với mẫu chuẩn tại thời gian lưutương ứng lần lượt: Glycin 0,5%; Glycyrrhizin 0,06%; Cystein là 0,03%(không quá 2%).Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầuvề độ chọn lọc để phân tích đồng thời các thành phần hoạt chất trong thuốctiêm CGI.3.2.2 Độ tuyến tính của phương phápTừ dung dịch chuẩn gốc Glycin; Glycyrrhizin; L-Cystein mục 2.3.2tiến hành pha loãng bằng pha động được một dãy các dung dịch chuẩn cónồng độ khác nhau.Tiến hành phân tích theo quy trình. Ghi lại sắc ký đồ và đánh giá sựphụ thuộc tuyến tính của nồng độ và diện tích pic. Kết quả được trình bày ởbảng 3.4.34 Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương phápSTT% so vớinồng độđịnhlượngNồng độ(µg/ml)Diện tích picđáp ứngNồng độ(µg/ml)Diện tích picđáp ứngNồng độ(µg/ml)Diện tích picđáp ứng15010,4361029,2371,0063987,1990,53910100,72127515,6551293,7531,5096226,7980,80815572,046310020,8731725,1322,00128302,3981,07820181,395412526,0912155,5622,50160433,9971,34725226,743515031,3092589,9783,00193009,9701,61730309,093GlycinGlycyrrizinL-CysteinPhương trình hồiquy:y = 80,17 x + 65,42y = 64450,55 x – 509,02y = 18579,21x + 253,33Hệ số tương quantuyến tínhr = 0,9964r = 1,000r = 0,999735 Kết quả thực nghiệm cho thấy:+ Khoảng tuyến tính của thành phần Glycin (bảng 3.6) từ: 10,4 –31,3 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ sốtương quan tuyến tính r = 0,9964 và hệ số chắn b = 65,41(tương đương3,79% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%.+ Khoảng tuyến tính của thành phần Glycyrrhizin (bảng 3.6) từ: 1,0– 3,0 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệsố tương quan tuyến tính r = 1,000 và hệ số chắn b = 509,02 (tương đương0,4% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%.+ Khoảng tuyến tính của thành phần L-Cystein (bảng 3.6) từ: 0,54 –1,62 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ sốtương quan tuyến tính r = 0,9997 và hệ số chắn b = 253,32 (tương đương1,2% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%.Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầuvề độ tuyến tính để phân tích các thành phần hoạt chất trong thuốc tiêmCGI.3.2.3 Độ chính xácTiến hành thẩm định 2 tiêu chí là độ lặp lại và độ chính xác trunggian.Độ lặp lạiĐể đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích đã xây dựng. Tiếnhành phân tích độc lập mẫu thử 6 lần.Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp như sauChuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừađủ 100 ml.36 Chuẩn gốc Glycyrrhizin: cân 0,0125 g chuẩn Glycyrrhizin, phatrong nước vừa đủ 100 ml.Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừađủ 100 ml.Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩngốc Cystein; 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc Glycyrrhizin; và 10,0 ml dungdịch chuẩn gốc Glycin vào bình định mức 100 ml, thêm pha động vừa đủ.Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độtương ứng: Cystein1,08 µg/ml; Glycyrrhizin: 2,00 µg/ml; Glycin:20,87µg/ml.Chuẩn bị mẫu thửHút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml.Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml.Lọc qua màng lọc 0,2 µm.Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.37 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương phápGlycinGlycyrrhizinL-CysteinSTTDiện tíchpicHàm lượng %so nhãnDiện tíchpicHàm lượng %so nhãnDiện tíchpicHàm lượng % sonhãnChuẩn1675-133343-20181-11656103,18147800108,521890998,962159999,63147725108,471893399,0831609100,25148405108,961870497,8841649102,75148829109,281899999,435159899,57147836108,551874098,0761645102,50147749108,481867897,75Trung bình:101,31108,7198,53RSD (%):1,650,310,7238 Kết quả thực nghiệm cho thấy:+ Định lượng lặp lại 6 lần độc lập đối với mẫu thử trong cùng mộtngày với cùng một kiểm nghiệm viên, tiến hành trong các điều kiện thửnghiệm hoàn toàn giống nhau cho thấy các thành phần hoạt chất trongthuốc CGI có độ lặp lại đáp ứng yêu cầu đặt ra:+ Glycin: RSD = 1,65% < 2%;+ Glycyrrhizin: RSD = 0,31% < 2%;+ L-Cystein: RSD =0,72% < 2%;Độ chính xác trung gianĐể đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp phân tích đãxây dựng. Tiến hành phân tích độc lập mẫu thử 6 lần với kiểm nghiệm viênkhác, ngày phân tích khác.Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.39 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương phápGlycinSTTDiện tích picGlycyrrhizinHàm lượng %so nhãnDiện tíchpicHàm lượng% so nhãn132335L-CysteinDiện tíchpicHàm lượng % sonhãnChuẩn1689208911159998,8015542699,231565298,802160499,1115627399,781520295,9631628100,6015622799,751565898,844159498,4915510199,031560698,515158998,1915633599,811565298,806161899,9815530399,161568499,00Trung bình:99,2099,4698,32RSD (%):0,930,361,19Trung bình (n = 12)100,2598,9998,42RSD (n = 12)1,690,730,9440 Kết quả thực nghiệm cho thấy:+ Định lượng lặp lại 12 lần độc lập đối với mẫu thử trong hai ngàykhác nhau với hai kiểm nghiệm viên, tiến hành trên hai cột phân tích khácnhau thấy các thành phần hoạt chất trong thuốc CGI có độ chính xác trunggian đáp ứng yêu cầu đặt ra:+ Glycin: RSD = 1,69% < 2%;+ Glycyrrhizin: RSD = 0,73% < 2%;+ L-Cystein: RSD = 0,94% < 2%;3.2.4 Độ đúngĐộ đúng được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu Placebo số 1sao cho nồng độ hoạt chất tương đương 80%; 100%; 120% nồng độ địnhlượng, rồi tiến hành định lượng theo phương pháp đã xây dựng.Chuẩn bị mẫu thử nghiệm:Mẫu 80%: Cân chính xác 320,0 mg Glycin; 32,0 mg Glycyrhizin;16,0 mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo.Mẫu 100%: Cân chính xác 400,0 mg Glycin; 40,0 mg Glycyrhizin;20,0 mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo.Mẫu 120%: Cân chính xác 480,0 mg Glycin; 48,0 mg Glycyrhizin;24,0mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo.Xử lý mẫu như hướng dẫn trong quy trình phân tích đã quy định, tiếnhành phân tích. Đánh giá độ đúng thông qua tỷ lệ thu hồi hoạt chất. Mỗinồng độ tiến hành độc lập ba lần.Kết quả được trình bày trong các bảng: 3.7; 3.8; 3.9.41 Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượngđối với GlycinSTTMẫuLượng hoạtLượng hoạtchất thêm vào Diện tích pic chất tìm lại(g)(g)Tỷ lệ thuhồi (%)1Chuẩn280%(1)0,321012960,316298,52380%(2)0,319212920,311798,76480%(3)0,320513280,3239101,075100%(1)0,401116150,393998,216100%(2)0,405416420,400798,847100%(3)0,409516770,409199,908120%(1)0,489619890,485299,109120%(2)0,487619890,485299,5010120%(3)0,485619650,479398,711689Trung bình98,18RSD (%):0,8842 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượngđối với GlycyrrhizinSTTMẫuLượng hoạtchất thêm vào Diện tích pic(g)Lượnghoạt chấttìm lại (g)Tỷ lệ thuhồi (%)1Chuẩn132335280%(1)0,03211243400,0321100,11380%(2)0,03221233470,031999,00480%(3)0,03191243300,0321100,725100%(1)0,04101565780,040598,706100%(2)0,04111560670,040398,137100%(3)0,04091554110,040298,208120%(1)0,04811876650,0485100,839120%(2)0,04791886640,0488101,7910120%(3)0,04691789330,046298,60Trung bình99,56RSD (%):1,3343 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượngđối với L-CysteinSTTMẫuLượng hoạtchất thêm vào Diện tích pic(g)Lượnghoạt chấttìm lại (g)Tỷ lệ thuhồi (%)1Chuẩn20891280%(1)0,0167127540,016398,34380%(2)0,0164125330,016198,40480%(3)0,0162125090,016199,435100%(1)0,0202156810,020299,966100%(2)0,0211163490,021199,777100%(3)0,0214163870,021198,608120%(1)0,0241186140,024099,459120%(2)0,0242186090,024099,0110120%(3)0,0244188600,024399,53Trung bình99,17RSD (%):0,61Kết quả thực nghiệm cho thấy cả ba khoảng nồng độ 80%; 100%;120% tỷ lệ thu hồi đối với từng thành phần như sau:Đối với thành phần Glycin: trung bình: 98,18%; RSD = 0,88%;Đối với thành phần Glycyrrhizin: trung bình: 99,56%; RSD = 1,33%;Đối với thành phần L-Cystein: trung bình: 99,17%; RSD = 0,61%;Từ kết quả thẩm định cho thấy ở cả ba khoảng nồng độ, tỷ lệ thu hồitrung bình đạt từ 98,18% đến 99,56%, các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%. Dođó phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng yêu cầu dùng cho phép thửđịnh lượng.44 3.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tíchMẫu thử được chuẩn bị trong phần đánh giá độ lặp lại của phươngpháp được giữ lại bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng và phân tích sau 24giờ, so sánh với kết quả định lượng ban đầu, đánh giá sự ổn định của dượcchất trong điều kiện thí nghiệm.Kết quả được trình bày trong bảng 3.10.Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chấttrong điều kiện thí nghiệm.HoạtHàm lượng Glycinchấtso nhãn (%)Hàm lượngGlycyrrhizin sonhãn (%)Hàm lượngL-Cystein so nhãn(%)Lần 1Sau 24hLần 1Sau 24hLần 1Sau 24h1103,18101,89108,52105,0998,96100,02299,63100,07108,47106,9199,0898,053100,2599,87108,96108,9297,8898,094102,7599,93109,28109,0199,43100,06599,57100,02108,55109,4598,0798,836102,50101,23108,48107,6397,7598,26Trung bình101,31100,50108,71107,8498,5398,891,670,850,331,650,710,94STTSD.T-testT table1,251,520,682,57 (df=5; p = 0,05; 2 đuôi)Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy, nồng độ hoạt chất trong mẫu phân tíchđã chuẩn bị trong điều kiện thí nghiệm bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòngsau 24 giờ so với kết quả định lượng ngay sau khi chuẩn bị mẫu khác nhaukhông có ý nghĩa thống kê với mức tin cậy 95%. Như vậy mẫu phân tích ổnđịnh trong điều kiện thí nghiệm trong vòng 24 giờ đáp ứng yêu cầu choviệc phân tích mẫu.45 Chương 4. BÀN LUẬNTheo thống kê mới nhất hội gan mật, hiện nay Việt Nam có khoảng20 triệu người nhiễm virus viêm gan; khoảng 12-16 triệu người nhiễm virusviêm gan B; 4,5 triệu người nhiễm virus viêm gan C.Các nghiên cứu khoa học cho thấy virus viêm gan có thể gây bệnhcho mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính, khả năng lây lan cũng không cógiới hạn, trong đó nguy hiểm nhất là virus viêm gan B và C. Hai loại virusnày thường có trong máu người bệnh, lây chủ yếu qua đường tiêm chích,truyền máu, giao hợp, từ mẹ sang con lúc sinh nở.Hiện nay, khoảng 5-10 % những người bị nhiễm virus viêm gan B,khoảng 20 % những người nhiễm virus viêm gan C có nguy cơ biến chứngsang xơ gan [6].Các thuốc thuộc nhóm bệnh này chủ yếu gồm các acid amin nhưArginin, L-Ornithin aspartate, Biphenyl-dimethyl-DicarboxylateChế phẩm thuốc CGI (Compound Glycyrrhizin Injection) do Công tyTNHH xuất nhập khẩu y tế Delta phân phối có thành phần Glycyrrhizin 40mg; L-Cystein 20 mg; Glycin 400 mg trong 20 ml có tác dụng chống viêmvà ức chế sự nhân lên của virus. Thuốc được chỉ định trong các trường hợp:viêm gan mạn tính, cải thiện rối loạn chức năng gan; hỗ trợ điều trị eczema,viêm da và nổi mày đay.Tại Nhật Bản thuốc tiêm Minophagen của hãng Eisai với thành phầntương tự với chỉ định điều trị viêm gan do virus viêm gan C. Thuốc cóđược bán tại các quốc gia trên thế giới như: Singapore, Philippin, HồngKông, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam, Myanmar, Căm phu chia, Lào,Brunei, Úc, các nước Trung Đông: (Jordan, Ả rập xê út, Yemen), Nga.Trong nước nhu cầu về thuốc trên là rất lớn, do vậy các công ty sảnxuất dược phẩm trong nước cũng quan tâm đầu tư nghiên cứu để đăng kýsản xuất thuốc trên. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu nàydựa trên các tài liệu tham khảo, các trang thiết bị hiện có tại phòng thínghiệm nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc và tiến tới có46 thể chuyển giao cho các công ty đăng ký sản xuất thuốc cũng như áp dụngkiểm tra chất lượng thuốc lưu hành trên thị trường. Chúng tôi đã xây dựngđược phương pháp định tính, định lượng đồng thời các hoạt chất có mặttrong thuốc bằng phương pháp LC-MS/MS. Phương pháp được thẩm địnhđầy đủ, theo quy định của Bộ Y tế đáp ứng yêu cầu của một phương phápdùng kiểm tra chất lượng thuốc.Phương pháp UPLC-MS/MS là một trong những kỹ thuật phân tíchhiện đại vào hạng bậc nhất hiện nay tại Việt Nam. Phương pháp có thờigian phân tích ngắn, tiết kiệm dung môi hóa chất và góp phần bảo vệ môitrường. Độ nhạy phương pháp cao, có thể phát hiện và định tính, địnhlượng được những hợp chất có nồng độ ppb (dạng vết) trong các nền mẫuphức tạp. Đặc biệt thiết bị có khả năng phát hiện được sự có mặt của hoạtchất không phụ thuộc vào đặc tính phân tử của chúng (có hấp thụ UV haykhông), khi được tích hợp ngân hàng phổ thiết bị có thể định tính chúngkhông cần dùng chất đối chiếu, điều này giải quyết được khó khăn của cácphòng thí nghiệm Việt Nam hiện nay.Tuy nhiên bên cạnh những mặt mạnh kỹ thuật UPLC-MS/MS cũngcó những hạn chế nhất định như: mức độ phổ biến của thiết bị hiện naychưa nhiều, giá thành thiết bị khá đắt.Đối với Trung tâm Kiểm nghiệm Thanh Hóa là một đơn vị kiểmnghiệm tuyến tỉnh đã đạt hai tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025:2005,được trang bị thiết bị UPLC-MS/MS là một kỹ thuật cao, đòi hỏi kiểmnghiệm viên phải có tay nghề vững, được đào tạo cơ bản và liên tục.Thiết bị có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích khácnhau như: thuốc, thực phẩm, môi trường… đã mở ra nhiều cơ hội phát triểncho đơn vị.So sánh với các phương pháp định tính định lượng các hoạt chất củathuốc tiêm CGI nói trên, phương pháp chúng tôi xây dựa trên kỹ thuậtUPLC-MS/MS có nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, có khả năng địnhlượng đồng thời các hoạt chất trong mẫu và thời gian phân tích ngắn.Từ quá trình thực nghiệm chúng tôi có một số bàn luận như sau:47 4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCHPhương pháp UPLC-MS/MS mới được đưa vào ứng dụng tại ViệtNam với những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc và độ đặc hiệu.Chính vì vậy phương pháp được ứng dụng ngày càng nhiều trong cácnghiên cứu như: định lượng thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinhhọc, theo dõi quá trình điều trị, nghiên cứu sinh dược học, đánh giá sinhkhả dụng, tương đương sinh học của thuốc.Thuốc tiêm CGI trong 20 ml dung dịch chứa: Glycyrrhizin 40mg;Glycin 400mg; L-Cystein 20 mg. Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bốphương pháp định lượng riêng lẻ từng thành phần của thuốc.Đối với thành phần glycyrrhizin là một hoạt chất chiết từ cây camthảo có vị ngọt có tính chất của saponin. Tiêu chuẩn cơ sở xây dựngphương pháp định lượng glycyrrhizin bằng phương pháp HLPC vớidetector UV-VIS [13]. Theo chuyên luận của Dược điển Châu Âu EP 5.0xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất monoamoni glycyrhinat bằngphương pháp chuẩn độ môi trường khan với mức chỉ tiêu chất lượng yêucầu từ 98,0% đến 102,0%, cũng trong tiêu chuẩn này quy định hàm lượngtạp chất liên quan không được quá 17%. Điều này cho thấy phương phápđịnh lượng hoạt chất mà EP 5.0 xây dựng không đảm bảo độ đặc hiệu dẫnđến mâu thuẫn giữa hai chỉ tiêu chất lượng.Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng Glycin bằngphương pháp chuẩn độ trung hòa, phương pháp dùng formol để định lượng acidamin. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản xong không đặc hiệu [13].L-cystein là một acid amin có chứa nhóm -SH là nhóm mang tínhkhử, Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất nàybằng phương pháp chuẩn độ Bromid. Phương pháp này tiến hành dễ dàng,48 đơn giản xong độ đặc hiệu không cao, có thể định lượng nhầm một sốthành phần khác có mặt trong công thức hoặc khi hoạt chất đã bị biến đổinhưng vẫn mang tính khử.Hai thành phần acid amin trong công thức là glycin; L-cystein lànhững chất không hấp thụ tia UV nên việc định lượng chúng trong cácthuốc gặp nhiều khó khăn, thông thường để định lượng các hoạt chất nàybằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC người ta phải tạo dẫn chất của chúngvà sử dụng các detector huỳnh quang, hoặc detector UV. Có hai phươngpháp để tạo dẫn chất đó là: tạo dẫn chất trước cột, phương pháp này có độlặp lại và ổn định không cao; tạo dẫn chất sau cột phương pháp này ổn địnhhơn xong lại cần thêm thiết bị phụ kiện và thuốc thử dùng cũng đắt tiền.Với phương pháp HPLC thông thường để định lượng đồng thời haithành phần Glycin và L-Cystein phải dùng cột chuyên dùng để phân tíchcác acid amin xong khả năng tách Glycin và L-cystein ra khỏi nhau là rấtkhó, hai pic khó đạt yêu cầu về độ phân giải.Với hệ thống UPLC chịu được áp suất cao, chúng tôi đã sử dụng cộtphân tích có khả năng phân tích tốt, cỡ hạt nhồi bé 1,8 µm xong hai picGlycin và L-Cystein vẫn không tách khỏi nhau, thời gian lưu trùng nhauhoàn toàn 0,41 phút. Với sự hỗ trợ của detector khối phổ, chọn chế độMRM (Multi Reaction Monitoring) tín hiệu của pic Glycin và L-Cysteinđược tách riêng và ghi thành hai kênh khác nhau nên vẫn có thể định lượngriêng từng thành phần cho dù chúng không tách khỏi nhau khi đi qua hệthống sắc ký. Như vậy với phương pháp UPLC-MS/MS đã xây dựng có thểtiến hành phân tích đồng thời, trực tiếp ba chất so với các điều kiện của cáctài liệu đã công bố khác rút ngắn thời gian phân tích, dơn giản hóa khâuchuẩn bị mẫu.49 Chúng tôi đã xây dựng được phương pháp LC-MS/MS dùng để địnhtính và định lượng các thành phần Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trongthuốc tiêm CGI. Phương pháp xây dựng có độ tuyến tính rộng (từ 50% đến150% nồng độ định lượng), thời gian phân tích ngăn, chi phí về dung môihóa chất thấp phù hợp về mặt kinh tế cho sản xuất, và góp phần bảo vệ môitrường.Phương pháp phân tích mà chúng tôi đã xây dựng việc chuẩn bị mẫuđơn giản. Chúng tôi đã khảo sát và tìm được một hệ pha động đảm bảo táchtốt các chất trong mẫu phân tích, các pic xuất hiện cân đối. Các thành phầntrong mẫu phân tích ổn định trong pha động và trong dung môi pha mẫu.Kết quả từ quá trình thực nghiệm cho thấy: chúng tôi đã tiến hànhkhảo sát pha mẫu trong một số loại pha động để xác định các điều kiện sắcký và các thông số của khối phổ xong rất khó để ổn định được cả ba thànhphần hoạt chất trong thuốc, nhất là thành phần L-Cystein rất nhạy cảm.4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCHPhương pháp phân tích định tính, định lượng đồng thời các thànhphần hoạt chất: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong thuốc tiêm CGI đãđược thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tíchcủa Asean. Các chỉ tiêu đã được thẩm định bao gồm: độ chọn lọc; độ tuyếntính; độ lặp lại; độ chính xác trung gian; độ đúng; độ sai lệch thô.Kết quả thẩm định cho thấy:Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) của phương pháp, nền mẫu và các thànhphần trong dung môi sắc ký không gây ảnh hưởng đến quá trình phân tíchcác thành phân hoạt chất trong thuốc. Kết quả đáp ứng của mẫu trắng tạicác vị trí thời gian lưu các thành phần giao động từ 0,03% đến 0,50% đáp50 ứng của mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ tương đương chứng tỏ phươngpháp có độ đặc hiệu (chọn lọc) phù hợp mục đích sử dụng.Độ tuyến tính: tiến hành thẩm định độ tuyến tính của các thành phầnhoạt chất trong khoảng 50% đến 150% nồng độ định lượng có hệ số tươngquan tuyến tính từ 0,9994 đến 1,0000 đạt yêu cầu đề ra.Độ lặp lại (độ chính xác trong ngày) n = 6 giá trị RSD từ 0,31% đến1,60%; độ chính xác trung gian (độ chính xác khác ngày) n = 12 giá trị RSDtừ 0,73% đến 1,69% phù hợp với yêu cầu của phép phân tích định lượng.Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi hoạt chất trung bình từ 98,70% đến 99,08%;với RSD của tỷ lệ thu hồi từ 0,77% đến 1,34% phù hợp với yêu cầu củaphép phân tích định lượng.Các hoạt chất bền vững trong pha động cũng là dung môi pha mẫu.Sau 24 giờ bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng hàm lượng hoạt chất trongdung dịch mẫu thử khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với hàm lượngban đầu ở mức tin cậy 95%.Đối chiếu với các yêu cầu quy định trong hướng dẫn thẩm định quytrình phân tích của Asean đạt yêu cầu các chỉ tiêu đề ra. Có thể sử dụng đểtriển khai phân tích mẫu thực chứa các thành phần này phục vụ tiêu chuẩnhóa cũng như quản lý chất lượng thuốc lưu hành.51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊKẾT LUẬNSau quá trình thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thờicác thành phần hoạt chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong chế phẩmthuốc tiêm CGI bằng phương pháp LC-MS/MS. Điều kiện cụ thể như sau:Điều kiện sắc ký:Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng;Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : dung dịch Đệm Amoni acetat 5,0mM pH = 3,0 (35:65);Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút;Thể tích tiêm: 10 µl;Nhiệt độ Autosampler: nhiệt độ phòng.Phát hiện chế độ MRM với các thông số:ConeVoltage(V)Nănglượngbắn phá(V)Chế độion hóaGlycin1622ESI+76,3229,83Glycyrrhizin2632ESI+840,46453,25Cystein2420ESI+121,8358,88Chất phântíchMảnh mẹ Mảnh conChuẩn bị mẫu.Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha độngvới các nồng độ: Glycyrrhizin 2 µg/ml; Glycin 20 µg/ml; Cystein 1 µg/ml.Dung dịch mẫu thử: Lấy thuốc của 5 ống, trộn đều. Hút chính xác2,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ 100 ml. Lắcđều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên, pha loãng bằng pha động vừa đủ20 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.52 Đánh giá kết quả định tính, định lượng.+ Định tính: so sánh thời gian lưu, mảnh khối chất phân tích trongsắc ký đồ/ phổ đồ của dung dịch thử với dung dịch mẫu chuẩn.+ Định lượng: dưa vào diện tích pic của chất phân tích trong sắc kýđồ dung dịch chuẩn, dung dịch thử, nồng độ chất phân tích trong mẫuchuẩn, thể tích và độ pha loãng của dung dịch chế phẩm tính hàm lượng %từng hoạt chất so với hàm lượng ghi trên nhãn.2. Đã thẩm định phương pháp đầy đủ theo hướng dẫn thẩm định quytrình phân tích của Asean và quy định của Bộ Y tế. Kết quả thẩm định chothấy: Phương pháp đã xây dựng có độ chọn lọc cao với các thành phần hoạtchất, không bị ảnh hưởng của nền mẫu; khoảng tuyến tính rộng từ 50% đến150% nồng độ định lượng với hệ số tương quan tuyến tính r > 0,997 đốivới cả ba chất; độ lặp lại tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 2%); độ đúng cao (giátrị trung bình của độ tìm lại 98,70 đến 99,08%); dung dịch mẫu đã chuẩn bịổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ.KIẾN NGHỊSau khi thực hiện đề tài với những kết quả nghiên cứu thu được,chúng tôi có một số kiến nghị sau:+ Áp dụng phương pháp định tính, định lượng các thành phần hoạtchất trong chế phẩm thuốc nói trên để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đăngký sản xuất, lưu thông tại Việt Nam.+ Kỹ thuật LC-MS/MS là một kỹ thuật tiên tiến, hiện đại có nhữngưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc, thời gian phân tích ngăn. Dovậy phương pháp này cần được cân nhắc xây dựng trong các chuyên luậnDược điển trong các lần xuất bản tiếp theo.53 TÀI LIỆU THAM KHẢOTài liệu Tiếng Việt.1. Trần Tử An và cs, 2010. Kiểm nghiệm dược phẩm, tập 2, tr 107 -121,2950318, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.2. Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Asean (bản TiếngViệt).3. Bộ Y tế, 2010. Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.4. Bộ Y tế, 2014. Thông tư 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm2014, Hướng dẫn đăng ký thuốc.5. Bộ Y tế, 2011. Tạp chí Y học Thực hành số 09 (782/2011). Nhà xuấtbản Y Học.6. Tào Duy Cần và cs, 2013. Thuốc và Biệt Dược, Nhà xuất bản Y học.7. Trịnh Văn Lẩu, 2010. Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phươngpháp kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất bản Y học.8. Trần Cao Sơn và cs, 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tíchhóa học & vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật.9. Phan Thị Nghĩa, 2014. Nghiên cứu định lượng Atenolol trong huyếttương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Luận văn Thạcsỹ dược học, trường Đại Học Dược Hà Nội.Tài liệu Tiếng Anh.10. Amit K. De, Sripama Datta, and Arup Mukherjee. Quantitativeanalysis of Glycyrrhizic acid from herbal preperation using liquidchromatographic technique. Journal of advanced PharmaceuticalTechnolgy & Research. Oct – Dec 2012. Doi 10.4103/22314040.104711. 11. BristishPharmacopoeiacommissionoffice,2013.BristishPharmacopoiea 2013.12. Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No. 6, EastRongjing Street, BDA, Beijing, 100176, P.R.China. Specificationand test Method of Compound Glycyrrhizin Injection 20 ml.13. Celine A. coiffard, Laurence j coiffard Francoise M. Peigne andYannickMdeRoeck-Halthanre,1998.MonoamoniumGlycyrrhizinate stability in anqueous buffer solution. University ofNance France (08/01/1998).14. Eisai Enters; In-licensing Agreement with MinophagenPharmaceutical. For Liver Disease/Allergic Disease Agents,Stronger Neo-Minophagen® C and Glycyron® Tablets.15. Test Method for Monoammonium Glycyrrhizinate 35 mg, Glycine25mg,DL-Methionine25mgTablets.http://www.nihs.go.jp/drug/Orange_Book_JPN16. Univ.-Prof. Dr. Christoph Klein. Amino acid analysis in biofluidsusing LC-MS/MS: Method development, validation and applicationin clinical research and dairy science.17. United States Pharmacopeial Convention 2012. United states ofPharmacopeia 34-NF 29.18. Xiaoyan Chen, Dafang Zhong*, Ying Han and Zhiyong Xie, 2010.Determination of carbocysteine in human plasma by liquidchromatography/tandem mass spectrometry employing precolumnderivatizationLaboratoryPharmacokinetics,ofShenyangDrugMetabolismPharmaceuticalWenhua Road, Shenyang 110016, China.University,and103 19. Wenyun Lu, Elizabeth Kimball, and Joshua D. Rabinowitz. A Highperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryMethod for Quantitation of Nitrogen.20. Ahuja S, Scypinski S. Hand book of modern pharmaceuticalanalysis. USA. Academic Press 2005. Page 415-42.21. Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R. Analysis and pharmacokinetics ofglycyrrhizic acid in humans and experimaental animal. Steroids.1994:59:121-6 [PubMed].22. Ivana Kabelová, Markéta Dvořáková, Hana Čížková, Pavel Dostálekand Karel Melzoch. Determination of free amino acids in cheesesfrom the Czech market. Department of Fermentation Chemistry andBioengineering, Faculty of Food and Biochemical. PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCHPhân tích các thành phần hoạt chất Glycin, L-Cystein, Glycyrhizintrong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký khối phổ (LC-MS/MS).Điều kiện sắc ký:Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng;Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : dung dịch Đệm Amoni acetat 5,0mM pH = 3,0 (35:65);Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút;Thể tích tiêm: 10 µl;Nhiệt độ Autosampler: nhiệt độ phòng.Điều kiện khối phổ: chế độ MRM với các thông số sau.Chất phântíchConeVoltage(V)NănglượngChế độbắn pháion hóaMảnh mẹ Mảnh con(V)Glycin1622ESI+76,3229,83Glycyrrhizin2632ESI+840,46453,25Cystein2420ESI+121,8358,88Chuẩn bị mẫu.Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha độngvới các nồng độ: Glycyrrhizin 2 µg/ml; Glycin 20 µg/ml; Cystein 1 µg/ml.Dung dịch mẫu thử: Lấy thuốc của 5 ống, trộn đều. Hút chính xác2,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ 100 ml. Lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên, pha loãng bằng pha động vừa đủ20 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.Đánh giá kết quả định tính+ Trên sắc ký đồ của mẫu thử phải cho các píc có cùng thời gian lưuvới píc tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.+ Mẫu thử phải thể hiện các mảng phổ đặc trưng của các thành phầnhoạt chất cụ thể như sau:Glycin: 76,32 => 29,83 Da;L-Cystein: 121,83 => 58,88 Da;Glycyrhizin: 840,46 =>453,25 Da.Đánh giá kết quả định lượngDựa vào diện tích pic của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịchchuẩn, dung dịch thử, nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn, thể tích vàđộ pha loãng của dung dịch chế phẩm tính hàm lượng % từng hoạt chất sovới hàm lượng ghi trên nhãn. Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 1 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeMethod: C:\MassLynx\Default.PRO\MethDB\CGI_240415_2.mdb 27 Apr 2015 15:22:44Calibration: 27 Apr 2015 15:22:44Name: Blank_ 1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:13:59, ID: test, Description:GlycinL-CysteintestMRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.833.15 1.506e+0022.423.942.171000.721.21100%%02.001.370.620.98MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.470e+0021.601.002.89 3.881.93Trace11 Glycin22 L-Cystein33 Glycyrrhizin0.32%2.00MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3384.526e+002Glycyrrhizin2.2767.616.76e12.911003.691.520.610min3.00# Nametest2.670min1.00Glycyrrhizintestmin3.001.00IS Area3.852.00RTAreaResponse Primar...76.332 > 29.830.374.7864.786bb121.832 > 58.880.322.3022.302bb840.363 > 453.3382.2767.60967.609bb3.00Conc.%DevName: Blank_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:18:56, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest1001.460.940.85MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.304e+0022.713.122.383.91Glycyrrhizintest100L-Cystein0.323.693.69e0MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.98 1.628e+0021.892.643.62testMRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3382.512e+0020.061001.00 1.141.643.762.77 3.27 3.733.900.63%%00min1.002.00%1.00# NameTrace11 Glycin22 L-Cystein33 Glycyrrhizin0min3.002.003.00min1.00IS Area2.00RTAreaResponse Primar...76.332 > 29.830.490.0310.031bb121.832 > 58.880.323.6953.695bb840.363 > 453.3382.3619.51419.514bb3.00Conc.%DevName: Blank_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:23:47, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest1000.010.98MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.833.14 1.666e+0022.631.783.482.353.92%test100GlycyrrhizinMRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.304e+0020.762.240.142.493.691.09 2.17%0min1.002.003.00test1000.35 0.690.79MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3382.87 2.508e+0021.793.29 3.951.91%0min1.002.003.000min1.002.003.00 Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 2 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Blank_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:23:47, ID: test, Description:# NameTrace11 Glycin76.332 > 29.8322 L-Cystein121.832 > 58.8833 Glycyrrhizin840.363 > 453.338RTArea0.392.548IS AreaResponse Primar...2.548bb2.1830.75630.756bbConc.%DevName: Chuan_50_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:28:38, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.401547.761.55e3MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.880e+004Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4110917.221.09e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.233e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3385.403e+005Glycyrrhizin2.2967181.846.72e4%3.7400min1.002.000min3.001.002.003.00min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.401547.755Response Primar...1547.755bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4110917.21510917.215bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.2967181.84467181.844bb3.00Conc.%DevName: Chuan_50_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:33:30, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.402114.252.11e3MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.832.470e+004Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4110952.111.10e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.203e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3385.404e+005Glycyrrhizin2.2966593.336.66e4%3.7500min1.002.003.00min1.002.003.000min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.402114.252Response Primar...2114.252bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4110952.11410952.114bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.2966593.32866593.328bb3.00Conc.%Dev Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 3 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Chuan_50_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:38:21, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.402529.902.53e3MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.833.098e+004Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4111467.701.15e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.293e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3385.505e+005Glycyrrhizin2.2968384.026.84e4%3.7500min1.002.000min3.001.002.003.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.402529.89522 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29min1.00IS Area2.00Response Primar...2529.895bb11467.69911467.699bb68384.01668384.016bb3.00Conc.%DevName: Chuan_75_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:43:12, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.414196.534.20e3MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.834.896e+004Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4116515.571.65e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.789e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3388.134e+005Glycyrrhizin2.2899927.659.99e4%3.7400min1.002.000min3.001.002.003.00min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.414196.534Response Primar...4196.534bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4116515.56616515.566bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.2899927.64899927.648bb3.00Conc.%DevName: Chuan_75_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:48:04, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.405689.255.69e3MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.836.514e+004%Glycyrrhizintest100L-Cystein0.4117069.291.71e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.864e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3388.295e+005Glycyrrhizin2.29100559.121.01e5%3.760min1.002.003.000min1.002.003.000min1.002.003.00 Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 4 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Chuan_75_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:48:04, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.405689.25122 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29IS AreaResponse Primar...5689.251bb17069.28917069.289bb100559.117100559.117bbConc.%DevName: Chuan_75_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:52:55, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.417487.327.49e3MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.838.330e+004Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4116695.611.67e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.881.802e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3388.177e+005Glycyrrhizin2.2999776.169.98e4%3.7600min1.002.000min3.001.002.003.00min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.417487.322Response Primar...7487.322bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4116695.61116695.611bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.2999776.15699776.156bb3.00Conc.%DevName: Chuan_100_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:57:46, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4010538.501.05e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.217e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4119749.311.97e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.072e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.098e+006Glycyrrhizin2.30130397.561.30e5%3.7600min1.002.003.00min1.002.003.000min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4010538.49610538.496Response Primar...bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4119749.31119749.311bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30130397.563130397.563bb3.00Conc.%Dev Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 5 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Chuan_100_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:02:38, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4112910.001.29e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.471e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4120433.992.04e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.190e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.101e+006Glycyrrhizin2.29131888.341.32e5%3.7600min1.002.000min3.001.002.003.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4112909.99922 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29min1.00IS Area2.00Response Primar...12909.999bb20433.99420433.994bb131888.344131888.344bb3.00Conc.%DevName: Chuan_100_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:07:29, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4111537.541.15e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.293e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4120891.702.09e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.224e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.104e+006Glycyrrhizin2.29132335.861.32e5%3.7700min1.002.000min3.001.002.003.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4111537.53822 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29min1.00IS Area2.00Response Primar...11537.538bb20891.70120891.701bb132335.859132335.859bb3.00Conc.%DevName: Chuan_125_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:12:20, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4116929.731.69e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.931e+005%Glycyrrhizintest100L-Cystein0.4124287.762.43e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.580e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.306e+006Glycyrrhizin2.29153372.591.53e5%3.760min1.002.003.000min1.002.003.000min1.002.003.00 Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 6 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Chuan_125_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:12:20, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4116929.73422 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29IS AreaResponse Primar...16929.734bb24287.75624287.756bb153372.594153372.594bbConc.%DevName: Chuan_125_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:17:11, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4117789.771.78e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.831.945e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4125143.442.51e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.745e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.299e+006Glycyrrhizin2.30152612.781.53e5%3.7700min1.002.000min3.001.002.003.00min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4117789.76817789.768Response Primar...bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4125143.43825143.438bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30152612.781152612.781bb3.00Conc.%DevName: Chuan_125_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:22:03, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4120118.412.01e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.832.221e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4123713.632.37e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.882.526e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.302e+006Glycyrrhizin2.29152205.061.52e5%3.7600min1.002.003.00min1.002.003.000min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4120118.41220118.412Response Primar...bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4123713.62923713.629bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29152205.063152205.063bb3.00Conc.%Dev Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 7 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Chuan_150_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:26:54, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4025267.002.53e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.832.826e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4128846.242.88e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.883.028e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.593e+006Glycyrrhizin2.29185119.201.85e5%3.7500min1.002.000min3.001.002.003.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4025266.99622 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29min1.00IS Area2.00Response Primar...25266.996bb28846.24228846.242bb185119.203185119.203bb3.00Conc.%DevName: Chuan_150_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:31:45, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4126116.542.61e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.832.986e+005Glycyrrhizintest100%L-Cystein0.4129684.952.97e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.883.205e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.590e+006Glycyrrhizin2.28185413.691.85e5%3.7400min1.002.000min3.001.002.003.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4126116.53522 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28min1.00IS Area2.00Response Primar...26116.535bb29684.94529684.945bb185413.688185413.688bb3.00Conc.%DevName: Chuan_150_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:36:37, ID: test, Description:GlycinL-Cysteintest100Glycin0.4029644.542.96e4MRM of 4 channels,ES+76.332 > 29.833.356e+005%Glycyrrhizintest100L-Cystein0.4129409.422.94e4MRM of 4 channels,ES+121.832 > 58.883.162e+005%test100MRM of 4 channels,ES+840.363 > 453.3381.546e+006Glycyrrhizin2.29183740.771.84e5%3.760min1.002.003.000min1.002.003.000min1.002.003.00 Quantify Sample ReportMassLynx MassLynx SCN855Page 8 of 10Dataset:UntitledLast Altered:Printed:Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard TimeMonday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard TimeName: Chuan_150_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:36:37, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4029644.54322 L-Cystein121.832 > 58.880.4133 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29IS AreaResponse Primar...29644.543bb29409.41629409.416bb183740.766183740.766bbConc.%DevName: THu_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:41:28, ID: test, Description:GlycinL-CysteinGlycyrrhizinTHu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+test76.332 > 29.831.889e+005Glycin1000.4116856.691.69e4THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+test121.832 > 58.881.505e+005L-Cystein1000.4115684.871.57e4THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+test840.363 > 453.3381.319e+006Glycyrrhizin1002.31155426.081.55e5%%%3.7800min1.002.003.000min1.002.003.00min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4116856.69116856.691Response Primar...bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4115684.86815684.868bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.31155426.078155426.078bb3.00Conc.%DevName: THu_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:46:19, ID: test, Description:GlycinL-CysteinGlycyrrhizinTHu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+test76.332 > 29.831.913e+005Glycin1000.4117835.081.78e4THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+test121.832 > 58.881.514e+005L-Cystein1000.4115652.791.57e4THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+test840.363 > 453.3381.317e+006Glycyrrhizin1002.29156273.311.56e5%%%3.7700min1.002.003.00min1.002.003.000min1.00IS Area2.00# NameTraceRTArea11 Glycin76.332 > 29.830.4117835.08217835.082Response Primar...bb22 L-Cystein121.832 > 58.880.4115652.79115652.791bb33 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29156273.313156273.313bb3.00Conc.%Dev Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time# NameTrace11 Glycin23IS AreaPage 1 of 11RTAreaPrimar…76.332 > 29.830,401029.237bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4010100.721bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.2963987.199bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: Std_75%_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 09:56:41, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411293.753bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4115572.046bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.2996226.798bbName: Std_100%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:00:51, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401725.132bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4120181.395bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29128302.398bbName: Std_125%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:04:21, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,412155.562bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4025226.743bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29160433.997bbName: Std_150%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:09:11, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,412598.978bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4030309.093bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29193009.970bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 2 of 11Name: Std_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:15:09, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411675.098bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4120181.908bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29133343.023bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: Thu_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:18:01, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401656.028bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018909.012bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29147800.092bbName: Thu_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:22:17, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411665.908bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018956.005bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29148778.004bbName: Thu_1_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:25:11, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411675.008bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018856.605bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29147878.004bbName: Thu_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:29:01, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401599.099bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118933.056bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29147725.896bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 3 of 11Name: Thu_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:33:17, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411589.076bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018956.044bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29147738.056bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: Thu_2_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:37:11, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411585.977bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018955.861bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29147895.328bbName: Thu_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:40:01, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401609.567bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118704.967bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29148405.955bbName: Thu_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:43:55, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411692.008bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018723.888bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29152654.675bbName: Thu_3_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:47:59, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411688.066bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4018733.876bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29153224.091bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 4 of 11Name: Thu_4_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:01:31, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,391649.009bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118999.034bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30148829.922bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: Thu_4_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:04:55, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411650.554bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918893.099bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28147985.044bbName: Thu_4_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:08:59, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401674.097bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.39189878.933bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30147888.915bbName: Thu_5_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:12:31, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,391598.656bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118740.981bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30147836.632bbName: Thu_5_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:15:05, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411609.523bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918861.098bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28148665.236bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 5 of 11Name: Thu_5_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:18:58, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401599.733bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918667.944bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30147789.656bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: Thu_6_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:22:31, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,391645.554bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118678.563bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30147749.654bbName: Thu_6_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:25:05, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411655.522bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918766.955bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28147452.311bbName: Thu_6_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:28:58, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401667.538bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918677.933bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30148003.944bbName: Std_dd_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:33:11, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411689.882bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4020891.092bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29132335.647bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 6 of 11Name: Std_dd_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:36:09, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411688.821bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4120887.992bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29133772.983bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: DD_80_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:39:01, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401296.219bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4012754.811bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29124340.735bbName: DD_80_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:42:17, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411299.291bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4012667.982bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29124652.452bbName: DD_80_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:45:11, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411292.821bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4012533.721bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29123347.731bbName: DD_80_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:49:01, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401289.129bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4112453.762bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29122939.839bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 7 of 11Name: DD_80_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:53:17, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411328.912bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4012509.362bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29124330.647bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: DD_80_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:57:11, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411302.112bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4012548.933bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29124536.527bbName: DD_100_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:01:01, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401615.237bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4115681.083bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29156578.738bbName: DD_100_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:04:55, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411617.829bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4015762.351bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29156837.922bbName: DD_100_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:08:09, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411642.367bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4016349.362bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.29156067.637bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 8 of 11Name: DD_100_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:12:31, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,391623.872bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4116352.831bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30157002.811bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: DD_100_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:15:38, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411677.361bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3916387.372bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28155411.927bbName: DD_100_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:18:59, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401679.728bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3916427.356bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30156001.273bbName: DD_120_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:22:31, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,391989.736bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118614.263bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30187665.367bbName: DD_120_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:25:53, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411899.920bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918728.293bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28188367.352bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 9 of 11Name: DD_120_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:28:58, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,401989.921bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918609.293bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30188664.722bbConc.%DevConc.%DevConc.%DevConc.%DevName: DD_120_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:32:31, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,391981.828bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.4118677.920bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30187998.723bbName: DD_120_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:36:05, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,411965.728bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918860.362bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.28178933.027bbName: DD_120_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:40:18, ID: test, Description:# NameTraceRTArea11 Glycin23IS AreaPrimar…76.332 > 29.830,402977.822bb2 L-Cystein121.832 > 58.880.3918799.262bb3 Glycyrrhizin840.363 > 453.3382.30177927.712bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855Dataset: UntitledLast Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard TimePrinted: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard TimePage 10 of 11 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMĐộc lâp - Tự do – Hạnh phúcBÁO CÁOSỬA CHỮA LUẬN VĂN DSCK CẤP I KHÓA 16Kính gửi:- Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I;- Phòng Sau đại học Trường đại học Dược Hà Nội;- Giáo viên hướng dẫn.Họ và tên học viên: Trịnh Lê AnhTên đề tài: Nghiên cứu nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc tiêm CGI.Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc.Mã số:Đã bảo vệ luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I vào hồi: 8 giờ 30 phútngày 13tháng 9 năm 2015 tại thành phố Thanh Hóa. Quyết định số:611/QĐ-DHN ngày 07 tháng 8 năm 2015 của Hiệu trưởng Trường Đại họcDược Hà Nội.NỘI DUNG SỬA CHỮA, HOÀN CHỈNH1. Những nội dung đã được sửa chữa theo yêu cầu của Hội đồng: Tên luận văn chưa phù hợp với nội dung:+ Đổi lại tên mới: “Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốctiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”. Cần nêu rõ nguồn gốc của thuốc tiêm CGI:+ Đã bổ xung thêm nguồn gốc thuốc tiêm CGI vào trong luận văn. Cách viết tài liệu tham khảo chưa đúng, một số tài liệu tham khảo đãquá cũ.+ Lược bỏ một số tài liệu tham khảo đã cũ của luận văn. Viết lại các tàiliệu tham khảo theo đúng quy định về trình bày tài liệu tham khảo của luậnvăn tốt nghiệp, nghiên cứu khoa học. Sửa từ “Độ thô” thành “Độ vững”.+ Đã sửa lại.  Trang 22: xem lại lượng cân và nồng độ của dung dịch chuẩn.+ Đã xem xét lại và hiệu chỉnh các lượng cân mẫu phù hợp. Bàn luận cần so sánh với các kết quả đã công bố.+ Bổ sung bàn luận so sánh giữa kết quả định lượng bằng phương phápLC-MS/MS và kết quả định lượng bằng phương phương pháp đã xâydựng trong TCCS của chế phẩm. Nội dung chưa đề cập đến phương pháp phân tích định tính.+ Bổ sung thêm phần định tính. Nên có phụ lục về quy trình phân tích.+ Đã bổ sung quy trình phân tích định tính và định lượng các hoạt chấttrong thuốc tiêm CGI bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LCMS/MS. Còn một số lỗi chính tả. + Đã đính chính các lỗi chính tả.2. Những nội dung xin bảo lưu: Không có.Hà Nội, ngàytháng 9 năm 2015Xác nhận của cán bộ hướng dẫnHọc viênTrịnh Lê AnhPGS. TS. Nguyễn Thị Kiều AnhXÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂNỦy viên thư ký Hội đồngTS. Nguyễn Trần LinhChủ tịch Hội đồngPGS. TS. Nguyễn Đình Luyện [...]... trng; - Tan tt trong nc; tan trong ethanol, khú tan trong methylen clorid, khụng tan trong ether [14] Glycin O OH NH2 Hỡnh 1.2 Cụng thc cu to ca Glycin - Cụng thc phõn t: C2H5NO2; Cụng thc cu to: H2N-CH2-COOH; Trng lng phõn t: 75,07 g/mol; Tờn khoa hc: Acid aminoacetic; Bt kt tinh mu trng, v ngt; Tan tt trong nc; tan trong c mụi trng acid v mụi trng kim, tan trong ethanol, khụng tan trong ether [4],... t: 157,62 g/mol; Tờn khoa hc: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid; 4 - Bt kt tinh mu trng; - Tan tt trong nc; tan trong c mụi trng acid v mụi trng kim, tan trong ethanol, khụng tan trong cỏc dung mụi hu c ớt phõn cc [4], [13], [18] 1.1.3 Tỏc dng dc lý, dc ng hc, ch nh, chng ch nh thuc tiờm CGI Dc lc hc [15] + Tỏc dng chng viờm: c ch cỏc enzym chuyn húa acid arachidonic: Glycyrrhizin cú th liờn... kali mỏu + Ph n cú thai hoc nuụi con bỳ 6 1.1.4 Phng phỏp nh lng cỏc hot cht trong thuc tiờm CGI Trờn th gii ó cú nhiu ti liu cụng b v cỏc phng phỏp nh tớnh, nh lng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khỏc nhau bng cỏc k thut: sc ký lng [11], [13], [16]; chun th tớch [12], [13], [18]; sc ký lng khi ph [19], [17], [22] Tuy thuc CGI ó c sn xut ti Nht Bn, Trung Quc v s dng ti nhiu ni trờn th gii, xong cha... sc ký (HPLC) vi kh nng phõn tớch khi ca h thng khi ph Sc ký lng hiu nng cao l mt h thng cú vai trũ tỏch cỏc cht da trờn s khỏc nhau v cỏc tớnh cht húa lý ca chỳng [4] Khi ph l k thut o trc tip t s khi lng v in tớch ca ion (m/z) c to thnh trong pha khớ t phõn t hoc nguyờn t ca mu da trờn s chuyn ng ca cỏc ion nguyờn t hay ion phõn t trong mt in trng hoc mt t trng nht nh [18], [13] 1.2.2 H thng sc ký. .. thng sc ký lng khi ph loi t cc chp ba (Triple Quadrupole) hay cũn gi l khi ph hai ln (MS/MS) c s dng nhiu trong cụng tỏc nghiờn cu, kim tra cht lng thuc, nht l nh lng thuc trong dch sinh hc, nghiờn cu tng ng sinh hc, nghiờn cu nh lng cỏc thuc cú thnh phn phc tp vỡ thit b cú nhy, chn lc cao Trong cỏc kiu hỡnh thnh ion, k thut phun in t ESI (Electrospray Ionazition ESI) c s dng nhiu hn c Trong nghiờn... ti trong mu th Thụng thng gm: cỏc tp cht, sn phm phõn hy, cht nn Trong LC-MS, tớnh c hiu c th hin khi kt qu thu c trờn sc ký mu th cho thy pic ca cht cn phõn tớch c phõn tỏch v nhn din rừ rng T l ỏp ng ca mu trng ti v trớ cỏc pic ca cht phõn tớch khụng c vt quỏ 2% 1.3.2 tuyn tớnh tuyn tớnh ca mt qui trỡnh phõn tớch din t ỏp ng phõn tớch thu c t l vi nng (trong khong nht nh) ca cht phõn tớch trong. ..Chng 1 TNG QUAN 1.1 THUC TIấM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION (CGI) 1.1.1 Ngun gc v cụng thc bo ch ca thuc tiờm CGI + Ngun gc: Thuc tiờm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) c sn xut bi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No.7 Rongchang East Street, BDA, Beijing, China + Cụng thc bo ch 20 ml dung dch tiờm CGI: Monoamoni Glycyrrhizinate tng ng Acid Glycyrrhizin 40 mg Glycin 400... cao Khi trong cụng thc cú thờm cỏc thnh phn tỏ dc cú tỏc dng m pH, nn mu phc tp phng phỏp s gp sai s hoc khụng tin hnh c 7 Hot cht Cystein dng nguyờn liu mt s dc in ó xõy dng phng phỏp nh lng bng chun oxy húa kh, trong ú cht phõn tớch c hũa tan trong nc ri chun bng dung dch iod 0,1N phng phỏp tha tr hoc chun trc tip vi ch th h tinh bt [13]; [16]; [18] Phng phỏp ny da vo tớnh kh ca nhúm -SH trong phõn... Glycyrrhizin trong ch phm thuc tiờm CGI c xõy dng phng phỏp nh lng bng sc ký lng hiu nng cao vi detector UV bc súng 252 nm; hoc detector PDA vi bc súng ly pic l 252 nm [12] Krọhenbỹhl S, Hasler F, Krapf R ó tin hnh nh lng acid Glycyrrhizin v cỏc cht chuyn húa ca Acid Glycyrrhizin bng phng phỏp LC-MS/MS, khong nng thp khong 1-2 àg/ml [22] 8 1.2 SC Kí LNG - KHI PH (LC-MS) 1.2.1 Khỏi nim Sc ký lng khi... t mc gn nhau (mc phõn tỏn) gia mt dóy kt qu thu c ca cỏc mu th c chun b t mt mu ng nht trong iu kin ó ra chớnh xỏc chia lm 3 cp: lp li, chớnh xỏc trung gian v tỏi lp lp li lp li din t chớnh xỏc ca quy trỡnh phõn tớch tin hnh trong cựng iu kin thớ nghim trong khong thi gian ngn lp li biu th chớnh xỏc trong nh lng Thng c tin hnh trờn 3 nng khỏc nhau, mi nng 3 ln (suy ra t ỳng) Cng cú th ... Lờ Anh DANH MC CC CH VIT TT CGI : Thuc tiờm Compound Glycyrrhizin Injection ESI : Ch ion húa bng phun in t HPLC : Sc ký lng hiu nng cao LC : Sc ký lng LC-MS/MS : Sc ký lng ph ln m/z : Khi lng/... 3.7 Sc ký mu chun Glycin v mu trng 32 Hỡnh 3.8 Sc ký mu chun Glycyrrhizin v mu trng 32 Hỡnh 3.9 Sc ký mu chun L-Cystein v mu trng 33 T VN Thuc tiờm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) cha... Cỏc sc ký c trỡnh by cỏc hỡnh 3.7; 3.8; 3.9 Kt qu t l ỏp ng pic c trỡnh by bng 3.3 Hỡnh 3.7 Sc ký mu chun Glycin v mu trng Hỡnh 3.8 Sc ký mu chun Glycyrrhizin v mu trng 32 Hỡnh 3.9 Sc ký mu
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn