COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC DÖÔÏC PHAÅM • Phần 1: MIỄN DỊCH • Phần 2: CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC PHẨM Phần 2: CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC PHẨM Chương mở đầu ► Bài 1: Kỹ thuật lên men ► Bài 2: Công nghệ sản xuất enzym ► Bài 3: Sinh tổng hợp Vitamin B12 Chương 1: KHÁNG SINH Bài 1: Đại cương về kháng sinh Bài 2: Kháng sinh nhóm β-Lactam Bài 3: Kháng sinh nhóm Tetracyclin và Aminoglycosid Bài 4: Kháng sinh nhóm Macrolid và kháng sinh có nguồn gốc vi khuẩn Chương 2: CÔNG NGHỆ Y DƯỢC HIỆN ĐẠI Bài 1: Vaccine Bài 2: Interferon và Kháng thể đơn dòng CÁC NHÓM KHÁNG SINH ĐIỂN HÌNH • Kháng sinh nhóm β-Lactam – Penicillin – Cephalosporin – Acid Clavulanic • Kháng sinh nhóm Tetracyclin – Clotetracyclin • Kháng sinh nhóm Aminoglycosid – Streptomycin – Gentamicin • Kháng sinh nhóm Macrolid – Erythromycin • Kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn – Polymicin CÁC NHÓM VACCINE ĐIỂN HÌNH • • • • Vaccine bất hoạt Vaccine giảm độc lực Vaccine tái tổ hợp Vaccine thực phẩm Miễn dịch là: • Tập hợp tất cả các cơ chế sinh học giúp cho một cơ thể đa bào giữ được sự liên kết giữa các tế bào và các mô đảm bảo sự toàn vẹn của cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hư hỏng cũng như các chất và sinh vật xâm hại MIỄN DỊCH • Chức năng sinh lý của hệ thống miễn dịch là bảo vệ một cơ thể chống lại các vật lạ xâm nhập vào cơ thể đó. • Có 2 hệ thống miễn dịch hoạt động độc lập và phối hợp với nhau để bảo vệ cơ thể:  Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu  Hệ thống miễn dịch đặc hiệu Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu Bao gồm 2 hàng rào bảo vệ: • Hàng rào thứ nhất: màng ngoài cơ thể (da, màng nhày) • Hàng rào thứ hai: tế bào và chất hóa học Thực bào: đại thực bào (monocyte), neutrophil, eosinophil, … Tế bào giết tự nhiên (NK): lymphocyte Các hóa chất gây viêm (histamin, kinin, protaglandin, lymphokin….) Protein kháng VSV (interferon, bổ thể, CRP) Phản ứng viêm Ý nghĩa của phản ứng viêm: • Ngăn ngừa sự lan rộng của các tác nhân gây hại đến mô lân cận • Loại bỏ các mảnh vụn của tế bào và khử các mầm bệnh • Tạo cơ sở cho các quá trình phục hồi Những hiện tượng chính của quá trình viêm • Sự giãn mạch và tính thấm của mạch tăng lên Hóa chất gây viêm được giải phóng→giãn mạch→xung huyết địa phương Tăng tính thấm ở các mao mạch địa phương →hiện tượng thoát dịch giàu protein →tái tạo tế bào, cô lập vùng bị tổn thương • Sự huy động thực bào: Neutrophil và đại thực bào được huy động→xuyên mạch →thực bào Protein kháng vi sinh vật • Chất bổ trợ (complement) là 1 nhóm protein huyết tương có khả năng tiêu diệt VSV, làm tăng thực bào do hiện tượng “opsonization”, tăng cường phản ứng viêm và đáp ứng miễn dịch. Các protein bổ trợ tạo thành nhóm gọi là MAC đính trên màng VSV→tạo lỗ mở trên màng gây thất thoát Ca2+ của tế bào→tiêu diệt VSV. Tăng cường phản ứng viêm: kích thích tế bào mỡ và basophil để giải phóng histamin. Quá trình opsonin hóa: Các phân tử protein bổ trợ phủ bên ngoài VSV→ cung cấp cầu kết nối cho đại thực bào và neutrophil gắn vào đó, cho phép chúng nhận chìm VSV nhanh hơn. • Interferon(IFNs): Là các protein nhỏ được tiết bởi các tế bào bị nhiễm virus để bảo vệ các tế bào chưa bị nhiễm Sự bảo vệ của IFNs có tính không đặc hiệu đối với virus, vì vậy IFNs được sản xuất để chống 1 loại virus đặc biệt có thể chống nhiều loại virus khác. Ngoài hiệu quả kháng virus, interferon còn hoạt hóa đại thực bào và γ-interferon huy động được các tế bào giết tự nhiên HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU • Hệ thống miễn dịch đặc hiệu (MDĐH) là một hệ chức năng nhận biết được các vật lạ đặc hiệu, làm bất động, trung hòa hoặc tiêu hủy chúng • Ba thuộc tính cơ bản của MDĐH: Tính phân biệt cấu trúc bản thân và ngoại lai Tính đặc hiệu Trí nhớ miễn dịch • Hai loại đáp ứng miễn dịch: Đáp ứng miễn dịch thể dịch Đáp ứng miễn dịch tế bào KHÁNG NGUYÊN – Ag • Kháng nguyên (Ag) là những chất có thể huy động hệ miễn dịch và gây phản ứng miễn dịch • Thông thường Ag là protein hay polysaccharide. • Mỗi kháng nguyên có nhiều vị trí epitope khác nhau để gắn kết với kháng thể Các đặc điểm Ag: • Khối lượng phân tử lớn: Kháng nguyên có khối lượng phân tử > 1000 dalton → Tính gây miễn dịch • Cấu trúc phân tử phức tạp: Chất có cấu trúc phân tử càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao... → Tính đặc hiệu kháng nguyên Nguồn gốc Ag: Ag ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài, như do hít, ăn, tiêm. Ag nội sinh là các kháng nguyên được sản xuất bên trong tế bào, là kết quả của quá trình chuyển hóa tế bào bất thường, hoặc do nhiễm khuẩn nội bào hay nhiễm virus KHÁNG THỂ - Ig • Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ • Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất Phân tử Ig cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm: • 2 chuỗi nặng (H: heavy) giống hệt nhau • 2 chuỗi nhẹ (L: light) cũng giống hệt nhau. Có 2 loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda) Các chuỗi liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide. • Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố định nhưng phần đầu của 2 "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên giữa các Ig khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp đặc hiệu với các Ag tương ứng Các lớp kháng thể IgG Vị trí chủ Máu yếu Tỷ lệ "Hóa trị"1 70% đến 75% 2 IgA IgM IgE IgD Niêm nhầy Các dịch tiết Lympho B Máu Bạch cầu ái kiềm Tế bào mast Lympho B 15% đến 20% các Ig trong huyết thanh 10% < 1% < 1% 2-4 Trung hòa các Ngưng tụ, độc tố, trung hòa Vai trò vi các vi khuẩn khuẩn, và virus 2 - 10 2 Ngưng tụ, Dị ứng, con trung hòa đường các cổ ký sinh điển trùng 2 Hoạt hóa các tế bào lympho B VAI TRÒ CỦA KHÁNG THỂ • Trong một đáp ứng miễn dịch, Ig có 3 chức năng chính: – liên kết với Ag – kích hoạt hệ thống bổ thể – huy động các tế bào miễn dịch • Liên kết với Ag: Các Ig có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với 1 Ag tương ứng nhờ các domain biến thiên → hiện tượng trung hòa, ngưng kết • Hoạt hóa bổ thể: Bổ thể là tập hợp các protein huyết tương khi được hoạt hóa sẽ tiêu diệt các vi khuẩn xâm hại bằng nhiều cách: (1) đục các lỗ thủng trên vi khuẩn, (2) tạo điều kiện cho hiện tượng thực bào (opsonine) (3) phóng thích các phân tử histamin (4) thanh lọc các phức hợp miễn dịch • Hoạt hóa các tế bào miễn dịch: Sau khi gắn vào Ag ở đầu biến thiên, Ig có thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định. Như vậy, các kháng thể gắn với một vi khuẩn có thể liên kết với một đại thực bào và khởi động hiện tượng thực bào. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG VÀ ĐA DÒNG • Kháng thể đơn dòng, liên kết với 1 epitope đặc hiệu • Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau KT đa dòng (Pab) Vs. đơn dòng (Mab) Các nguyên tắc cơ bản phải thực hiện khi sử dụng huyết thanh • • • • • Đúng đối tượng Đúng liều lượng Đúng đường Đề phòng phản ứng Phối hợp sử dụng vaccine Đáp ứng miễn dịch thể dịch • Miễn dịch thể dịch ( humoral immunity) do các tế bào lympho B đảm nhiệm với các Ig miễn dịch lưu hành trong các dịch : IgG, IgM, IgA, IgD, IgE • Các Ig được tiết ra từ tương bào (tế bào plasma) có nguồn gốc là lympho B đã được hoạt hóa. • Ag của miễn dịch dịch thể là kháng nguyên ngoại bào bao gồm : vi khuẩn, virus, kí sinh trùng, ấu trùng của nó, và tất cả tồn tại và sống ở dịch ngoại bào. • Sự chọn dòng và sự biệt hóa các tế bào B Một tế bào lympho B được hoạt hóa khi các Ig gắn vào các thụ quan trên bề mặt của nó lần đầu tiên Sau đó nó biệt hóa thành hai dòng tế bào: tương bào và tế bào nhớ Tương bào đóng vai trò sản xuất Ig với số lượng lớn để đáp ứng miễn dịch Tế bào nhớ sống lâu, có thể gây đáp ứng miễn dịch trực tiếp nếu chúng gặp lại Ag Miễn dịch thể dịch tích cực và thụ động • Miễn dịch thể dịch tích cực: Khi các tế bào B gặp Ag và sản xuất Ig chống các Ag đó, ta có hiện tượng miễn dịch thể dịch tích cực Tập nhiễm tự nhiên: khi cơ thể bị nhiễm virus, vi khuẩn Tập nhiễm nhân tạo: tiêm vaccine • Miễn dịch thể dịch thụ động: Khi ta truyền huyết thanh →ĐƯMD tức thời nhưng sau đó Ig được truyền sẽ thoái hóa 1 cách tự nhiên trong cơ thể Đáp ứng miễn dịch tế bào • Miễn dịch tế bào do các tế bào lympho T đảm nhiệm. Các tế bào T không thể nhận diện các Ag tự do, nó chỉ có thể nhận biết và phản ứng với các đoạn Ag protein đã được xử lý, biểu lộ trên bề mặt các tế bào của cơ thể. • Do vậy các tế bào T thích hợp đối với các động tác qua lại tế bào – tế bào và chống các tế bào cơ thể bị nhiễm virus, vi khuẩn hoặc các ký sinh trong tế bào, cả các tế bào cơ thể không bình thường hoặc các tế bào ung thư và các tế bào của mô lạ được cấy ghép. Trình diện kháng nguyên • Tế bào trình diện kháng nguyên (tế bào APC): là các đại thực bào có khả năng xử lý và trình diện các Ag dưới dạng cắt gọt trên màng tế bào thông qua các protein MHC • Xử lý Ag của các tế bào APC là quá trình hóa dáng protein lạ (virus, tế bào ung thư…) thành các đoạn peptid: – Protein lạ bị bắt giữ trong túi phagosome – Các túi lysosome + phagosome→ phagolysosome →các đoạn peptid nhỏ • Trình diện kháng nguyên: là quá trình các đoạn peptid gây miễn dịch trội được liên kết có chọn lọc với phân tử protein MHC và phức này được biểu lộ trên bề mặt tế bào để tế bào T nhận diện Hoạt động của tế bào T trong ĐƯMD • Nhận biết Ag: Các tế bào T chỉ nhận diện được Ag thông qua tế bào APC • Hoạt động của tế bào T: phức protein MHC-Ag được gắn lên thụ quan của tế bào T→các tế bào T gây độc giết các tế bào cơ thể bị virus xâm nhập và các tế bào ung thư, cả những mô ghép lạ • Sự tạo dòng và biệt hóa của các tế bào T: Khi hoạt động, tế bào T lớn lên và sinh sản tạo thành một dòng tế bào biệt hóa và thực hiện các chức năng tùy theo lớp tế bào T Quá trình phát triển của TB T trong tuyến ức TB vùng lõi: maturation Sản xuất các nhân tố điều hoà và biểu hiện rất nhiều MHC I và II • Tại tuyến ức: 2 quần thể chính – Tế bào tuyến ức vùng vỏ • 90% quần thể bên trong tuyến ức • phần lớn chưa trưởng thành • có chung một số dấu ấn với các tiền tế bào (CD2) nhưng về sau còn xuất hiện thêm một số khác nữa. – Tế bào tuyến ức vùng lõi • 10% quần thể • đã trưởng thành • trên màng mặt của chúng có những dấu ấn mới (CD3, CD4 hay CD8) cũng như là receptor T (TCR=T Cell Receptor). Biệt hoá TB T • Tế bào lympho tiếp thu một sự huấn luyện miễn dịch gồm có: – khả năng nhận biết kháng nguyên – khả năng phân biệt kháng nguyên của mình với kháng nguyên lạ (không phải của mình) • Sự huấn luyện qua 2 quá trình chọn lọc Chọn lọc dương tính • Liên quan đến khả năng nhận biết ra các phân tử MHC trên các tế bào khác thông qua TCR của tế bào tuyến ức vùng lõi Những TB lympho CD4+ có khả năng nhận ra phân tử MHC lớp II Những TB lympho CD8+ có khả năng nhận biết phân tử MHC lớp I Tiếp tục qua sự chọn lọc lần 2 Những TB không nhận biết được chết theo chương trình (apoptosis) Chọn lọc âm tính • Liên quan đến khả năng phản ứng với kháng nguyên bản thân Các tế bào đã qua sự chọn lọc dương tính có một ái lực quá mạnh với kháng nguyên bản thân Chết theo chương trình (Apoptosis) khả năng phản ứng với kháng nguyên bản thân yếu hay không có Di chuyển vào các trung tâm lympho ngoai vi để tiếp tục trưởng thành Phân tử CD4 – Là một monomer có 4 khu vực nằm bên ngoài tế bào – Đặc trưng của dưới nhóm quần thể tế bào lympho T hỗ trợ (TH) và được dùng như là ligand với các phân tử MHC lớp II Phân tử CD8 – Hình thành bởi 2 chuỗi α và β nối lại với nhau bằng một dây nối đồng hóa trị – Đặc trưng cho dưới nhóm quần thể tế bào lympho T độc (TC) và là ligand của phân tử MHC lớp I. Hoạt hoá TB Th sẽ tạo các TB T hiệu quả IL-2 100 x ↑ Vào chu trình TB TB nhớ TB T hiệu quả → TH & TC – Tế bào TH: mang trên bề mặt những phân tử protein tương tác với các ligand trên các tế bào khác (đại thực bào trong miễn dịch tế bào, tế bào B trong miễn dịch dịch thể), đồng thời tiết cytokin để hoạt hoá các tế bào khác – Tế bào TC: mang những hạt chứa các protein có thể giết virus và tế bào ung thư. – Bên cạnh do, một số tế bào T được biệt hoá thành tế bào T nhớ. Có thể tồn tại một cách yên lặng trong nhiều năm sau khi kháng nguyên được loại bỏ. Sau khi trình diện kháng nguyên Phần 2: CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC PHẨM KỸ THUẬT LÊN MEN • Cơ sở công nghệ Vi sinh vật: là quá trình sinh tổng hợp bằng kỹ thuật lên men nhờ VSV trong các bình phản ứng sinh học. • Môi trường dinh dưỡng + VSV → Sản phẩm + VSV + Cơ chất còn xót + Các sản phẩm phụ + Nhiệt năng • Các hình thức lên men – Lên men hiếu khí – Lên men kị khí Ưu và nhược điểm của phương pháp sinh tổng hợp • Ưu điểm: – Có khả năng tạo các phân tử phức tạp như protein, kháng sinh – Biến đổi sinh học cho năng suất cao hơn – Sinh tổng hợp ở điều kiện ôn hòa – Sản phẩm thu được không có đồng phân • Nhược điểm: – Dễ bị nhiễm trùng – Sản phẩm thường lẫn trong phức hợp – Cần xử lý 1 môi trường lớn – Quá trình lên men cần có thời gian dài Quá trình sản xuất dược phẩm bằng pp lên men VSV gồm 4 giai đoạn chính: + Lựa chọn môi trường thích hợp + Tuyển chọn giống VSV + Lên men ở đk tối ưu + Thu nhận và tinh chế SP Môi trường lên men • Thành phần nuôi cấy: – Nguồn Carbon – Nguồn Nitơ – Nguồn khoáng đa lượng: K, P, Ca, Mg, Fe – Nguồn khoáng vi lượng: Co… – Các vitamin – Chất kích thích sinh trưởng:2,4D; α-naptylacetic acid • Điều kiện nuôi cấy: – Nhiệt độ – pH Các nguồn nguyên liệu chủ yếu của công nghệ lên men • Nguồn NL từ nông nghiệp: củ cải đường, cà phê, ca cao , dừa, chè, … và các phế phụ phẩm nông nghiệp như: rơm, bã mía, chất thải gia súc, … • Nguồn NL từ lâm nghiệp: vỏ cây, mùn cưa, tre, nứa, dung dịch thủy phân gỗ, cellulose,… • Nguồn NL từ công nghiệp: mật rỉ, phế phụ phẩm của ngành chế biến thịt, cá, sữa, tinh bột … • Nguồn rác đô thị, bùn, nước cống,… Giống vi sinh vật • Yêu cầu chất lượng giống: – Tạo ra sp chính với năng suất cao, sp phụ ít – Phát triển tốt trên các nguồn nguyên liệu rẻ tiền – Sau lên men dễ tách sản phẩm ra khỏi sinh khối – Phải là chủng VSV thuần khiết – Có khả năng thích ứng và sinh sản mạnh – Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao – Dễ bảo quản, bảo tồn được đặc tính di truyền trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng • Nguồn giống VSV – Phân lập từ nguồn tự nhiên: chọn nguyên liệu dùng phân lập→Phân lập canh trường tập trung→Phân lập chủng thuần khiết →Kiểm tra tính di truyền mong muốn →Tạo sự ổn định đặc tính di truyền mong muốn – Nguồn giống từ ngân hàng giống hoặc bảo tồn giống: chọn điều kiện và môi trường thích hợp để kích hoạt giống trước khi đưa vào sản xuất Nguồn giống sẵn có từ các cơ sở sx: • B1: phân lập lại giống vsv đang sx • B2: kiểm tra tính di truyền • B3: ổn định đặc tính di truyền • B4: Nâng cao đặc tính di truyền – huấn luyện thích nghi với đk lên men công nghiệp – thay đổi cơ chế trong thông tin di truyền Các biện pháp nâng cao chất lượng giống • Kỹ thuật gây đột biến • Kỹ thuật dung hợp tế bào • Kỹ thuật tái tổ hợp Sơ đồ tổng quát quá trình nhân giống vi sinh vật cho sản xuất: • Giai đoạn nhân giống trong phòng thí nghiệm: Giống VSV được bảo quản trên mt thạch nghiêng → Nhân giống cấp 1 trong 10ml môi trường lỏng → Nhân giống cấp 2 trong 100ml môi trường lỏng → Nhân giống cấp 3 trong 1l môi trường lỏng • Giai đoạn nhân giống phân xưởng: Thu nhận giống cấp 3 → Nhân giống cấp 4 trong môi trường 10l → Nhân giống cấp 5 trong 100l môi trường lỏng → Nhân giống cấp 6 với thể tích 1m3 trong thiết bị lên men có cánh khuấy bằng thép không rỉ... Sơ đồ quá trình chuẩn bị giống lên men Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình nhaân gioáng • Thành phần định tính và định lượng của môi trường nuôi • Điều kiện nuôi khuấy: Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong phương pháp nuôi cấy tĩnh có thể được chia thành 6 giai đoạn: – Giai đoạn thích nghi – Giai đoạn sinh trưởng nhanh – Giai đoạn logarit – Giai đoạn sinh trưởng chậm – Giai đoạn ổn định – Giai đoạn suy vong • Ảnh hưởng của nhiệt độ: Mỗi loài VSV sẽ có 1 giá trị nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển • Ảnh hưởng của oxy: giúp VSV tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối • Sự khuấy trộn: giúp cho môi trường lỏng trở nên đồng nhất và làm tăng hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường • Ảnh hưởng của thời gian: Kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định để đạt hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất • Bảo quản giống: Nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật giống sẽ bị giảm dần hoạt tính và số tế bào chết sẽ gia tăng Các giai đoạn lên men • Cấp không khí vô trùng → Cần cho các quá trình lên men hiếu khí. Không khí phải được lọc vô khuẩn vì: – Khí hậu nóng ẩm→ảnh hưởng đến thiết bị lọc khí – Trong không khí chứa nhiều bụi – Trong không khí chứa nhiều vi sinh vật →gây nhiễm tạp khuẩn môi trường lên men • Khử trùng môi trường trước khi lên men – Tác nhân khử trùng: vật lý (tia X, tia cực tím, sóng siêu âm, nhiệt, hơi nước…), tác nhân hóa học – Khử trùng trực tiếp bằng nhiệt →gây biến tính protein, 1 số vitamin, caramen hóa đường, oxy hóa các hợp chất phenol, trùng hợp các aldehyd chưa no, xảy ra pứ Maillard tạo các basechif là các chất độc đối với nhiều VSV – Khử trùng liên tục bằng hơi nước quá nhiệt: không gây biến tính các thành phần của môi trường nuôi cấy vì thời gian tiếp xúc nhiệt ngắn Các phương pháp khử trùng môi trường lên men • Khử trùng bằng hơi nước theo phương pháp cổ điển: cho hơi nước sục hẳn vào môi trường Ưu điểm: – Đơn giản, dễ thực hiện – Giá thành thấp Nhược điểm: – gây biến tính protein, một số vitamin – gây quá nhiệt → sự trùng hợp một số thành phần môi trường làm cho môi trường bị biến đổi • Phương pháp thanh trùng liên tục Ưu: – Rút ngắn thời gian thanh trùng – Bảo tồn thành phần và tính chất ban đầu của môi trường – Kiểm soát tự động Nhược: – Thiết bị có giá thành cao • Quá trình sục khí – Mục đích: Cung cấp O2 cho 1 số qt OXH; đẩy nhanh qt làm thoát CO2 và các khí độc hại ra khỏi môi trường – Phải khử trùng không khí trước khi đưa vào môi trường lên men: Lọc sơ bộ không khí → Nén không khí → Làm lạnh không khí và tách hơi nước ngưng tụ → Khử trùng không khí • Khuấy trộn – Tạo sự tiếp xúc tối đa của môi trường và VSV, giúp sản phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi TB nhanh hơn – Các bọt khí có thời gian lưu trong môi trường lâu hơn→O2 hòa tan trong môi trường nhiều hơn Sơ đồ cấu tạo thiết bị lên men chìm Thu nhận và tinh chế sản phẩm Lọc/ Ly tâm Bốc hơi Kết tinh Lọc màng Sắc ký Kết tủa Biến đổi Tinh chế Sấy khô Phá vỡ tế bào Cô đặc Hòa tan Chiết xuất Sơ đồ cắt ngang máy lọc chân không hình trống Bản chất của quá trình lên men trong sản xuất dược phẩm bằng phương pháp sinh học: • Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro và điện tử. • Các enzym xúc tác cho quá trình này là các enzym oxy hóa khử (dehydrogenase, oxydase,…) chủ yếu từ VSV→ các quá trình lên men là các quá trình oxy hóa- khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian • Bản chất của quá trình lên men trong sản xuất dược phẩm bằng phương pháp sinh học là thu sinh khối VSV để sinh tổng hợp ra sản phẩm theo mong muốn. KỸ THUẬT SẢN XUẤT ENZYM ĐẠI CƯƠNG • Enzym là chất xúc tác sinh học, được hình thành trong tế bào sống: ĐV, TV, VSV • Đặc biệt: khi tách rời E ra khỏi tế bào nó vẫn thực hiện được chức năng xúc tác • Khả năng xúc tác cao • E tách khỏi tế bào dưới dạng tinh khiết có thể xúc tác biến đổi cơ chất nhiều lần, với kỹ thuật đặc biệt có thể kéo dài thời gian sử dụng E • Chức năng xúc tác của E còn phụ thuộc vào cấu hình không gian của chúng, chỉ cần làm thay đổi cấu hình không gian bằng pH hay nhiệt độ → E bị bất hoạt • E được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống hàng ngày trong: – nghiên cứu khoa học – y dược học – Công nghệ thực phẩm – bảo vệ môi trường KỸ THUẬT SẢN XUẤT ENZYM • Chọn giống vi sinh vật: – Có điều kiện lên men đơn giản – Tạo enzym ngoại bào – Qui trình thu sản phẩm và tinh chế đơn giản – Enzym ổn định trong khoảng nhiệt độ và pH rộng • Môi trường lên men: – Môi trường lên men xốp hoặc lên men chìm – Nguyên liệu môi trường phải đơn giản và rẻ: các loại ngũ cốc, rỉ đường, cao ngô…. Nguyên tắc chuyển gen để tạo enzym • Trang 45 Những vấn đề cần nghiên cứu để biến đổi enzym • Nâng cao hoạt tính enzym • Tăng độ ổn định • Cho phép enzym hoạt động ở môi trường thay đổi • Thay đổi pH hoặc nhiệt độ tối ưu • Thay dổi hẳn đặc tính của enzym • Thay đổi phản ứng xúc tác • Nâng cao hiệu quả quá trình Sơ đồ chiết xuất và tinh chế enzym • Trang 48 PHƯƠNG PHÁP BẤT ĐỘNG ENZYM Các bước bất động Enzym: • Enzym tinh chế được gắn hoặc được gói trong những polymer không hòa tan trong nước, hoặc hấp phụ trên các chất trơ vô cơ hoặc hữu cơ • Enzym bất động được nhồi vào cột hình trụ có kích thước phù hợp • Cho dung dịch cơ chất đi qua cột enzym→ enzym sẽ phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng • Tinh chế sản phẩm thô thu được Các phương pháp bất động enzym • Microencapsulation (gói enzym trong bao cực nhỏ) • Liên kết enzym vào chất mang không tan • Định vị enzym trong pha lỏng của hệ thống hai pha • Giữ enzym bằng màng siêu lọc Ưu điểm của phương pháp bất động enzym • Cho phép sử dụng enzym nhiều lần • Có thể tiến hành quá trình liên tục trong thời gian dài • Cho phép kiểm tra chặt chẽ hơn quá trình xúc tác • Cho phép phát triển hệ thống phản ứng nhiều enzym • Hiệu quả kinh tế cao CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 • Vitamin B12 : cyanocobalamin • Cung cấp nguyên liệu để tổng hợp ADN, góp phần vào quá trình phân chia tế bào và trưởng thành tế bào trong cơ thể • Vitamin cũng có vai trò quan trọng trong chuyển hóa acid béo và duy trì bao myelin của dây thần kinh Nguồn gốc • B12 do VK tổng hợp từ thiên nhiên, sau đó mới đi vào chu trình thức ăn của các động vật, chủ yếu từ các động vật ăn cỏ • Trong thực phẩm, vitamin B12 có trong thức ăn nguồn gốc động vật như thịt (nhất là nội tạng, đặc biệt là gan), trứng, sữa Công thức hóa học vitamin B12 • CTHH: C63H88CoN14O14P • B12 = Corin + nucleotide • Trong đó: – Nucleotide = 5,6 dimethylbenzimidazol + đường ribose + H3PO4 – Corin + cobalamin (Cobalt + R) 5,6 DMB Cobalt Cobalamin + R Corin + Nucleotide Ribose • Nếu R là CN→ Cyanocobalamin • Nếu R là OH→ Hydroxocobalamin H3PO4 Tính chất của vitamin B12 • Tinh thể hình kim màu đỏ sẫm • Nhiệt độ nóng chảy: 300oC • Tan trong nước, cồn, phenol • Không tan trong ether, cloroform, aceton • Dung dịch B12 trong nước có độ hấp thụ cực đại trong vùng UV ở: 278, 361, 550nm • Vitamin B12 bị ánh sáng phân hủy Lên men sinh tổng hợp vitamin B12 Các nguồn lên men tổng hợp B12: • Bùn + vi khuẩn sinh metan sống kị khí • Nước thải công nghiệp kháng sinh + vi khuẩn tạo kháng sinh tương ứng – Str.Griseus→Streptomycin – Str.aureofanciens→ Tetracyclin – …. • Lên men sinh tổng hợp B12 từ Probionibacterium shermanii Lên men sinh tổng hợp B12 từ Probionibacterium Shermanii • Trực khuẩn G (+) • Sống kỵ khí tùy nghi • Điều kiện môi trường: – pH 4,5 – 7,5 – Nhiệt độ 28 – 32oC – Nguồn carbon: glucose – Nguồn nitơ: các amino acid (Methionin tăng hiệu suất tổng hợp B12), muối amoni – Các ion kim loại: muối cobalt – Các vitamin: thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic… Giữ giống • Thành phần môi trường thạch giữ giống (%) – Glucose 3,0 – Cao ngô 0,5 – KH2PO4 0,1 – CoCl2.6H2O 0,01 – Agar 1,0 – pH 6,8 – 7,2 • Điều kiện giữ giống: – Khử trùng 110oC/20 phút – Điều kiện kỵ khí bắt buộc – Nhiệt độ 30oC trong 72 giờ Nhân giống • Thành phần môi trường nhân giống (%) – Glucose 3,0 – Cao ngô 1,5 – CoCl2.6H2O 0,015 – 5,6DMP 0,015 – pH 6,8 – 7,2 • Điều kiện nuôi cấy: – Khử trùng 115oC/30 phút – Điều kiện kỵ khí – Nhiệt độ 30oC/48 giờ – Tỷ lệ giống: 10% Lên men • Môi trường lên men tạo B12 (%): – Glucose 3,0 – Cao ngô 1,5 – CoCl2.6H2O 0,015 – 5,6DMP 0,015 – pH 6,8 – 7,2 • Điều kiện lên men: – Khử trùng 115oC/30 phút – Thời gian 6 – 7 ngày – pH: 6,8 – 7,2 • Cung cấp khí: – Kỵ khí bắt buộc trong 2 – 3 ngày đầu – Thổi khí nhẹ từ ngày thứ tư • Bổ sung 5,6 DMB: – Vai trò: Chuyển nhân tố B→vitamin B12, tăng hiệu suất sinh tổng hợp – Nồng độ cung cấp: 1-10mg/l – Thời điểm bổ sung: sau 72 giờ lên men • Hiệu suất sinh tổng hợp B12: 80-100mg/lít môi trường (trên qui mô 100 m3) ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH • Bước ngoặt lịch sử lớn trong y học là phát minh vĩ đại về kháng sinh của Alexander Fleming (1928) đã mở ra kỷ nguyên mới: khai sinh ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người. • Định nghĩa: Kháng sinh là những dược phẩm đặc biệt có nguồn gốc từ VSV, bán tổng hợp hay tổng hợp; có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt 1 cách chọn lọc trên 1 nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp Phân loại kháng sinh • Căn cứ vào tác dụng trị bệnh có thể chia kháng sinh thành 3 loại chính: – Kháng sinh kháng khuẩn – Kháng sinh trị nấm – Kháng sinh chống ung thư • Căn cứ vào cấu trúc hóa học chia ra các nhóm: – Các chất kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin) – Các chất kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) – Các chất kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) – Các chất kháng sinh polypeptid (polymycin, bacitracin) – Các chất kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) – Các chất kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (các tetracyclin) – Các chất kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin) – Các chất kháng sinh chống ung thư nhóm antracyclin (daunorubicin) – Các chất kháng sinh chống ung thư nhóm actinomycin (dactinomycin D) – ….. Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh Đơn vị kháng sinh • Đơn vị kháng sinh: là lượng kháng sinh tối thiểu pha trong 1 thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của chủng VSV kiểm định đã chọn. Thí dụ: – Với penicillin là số mg penicillin pha vào trong 50 ml môi trường canh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định – Với Streptomicin là số mg pha trong 1 ml môi trường canh thang và kiểm định bằng vi khuẩn E.coli • Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng 1 trong các đơn vị là : mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml hay UI/g, International Unit . Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu • Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm hay tiêu diệt 1 cách chọn lọc các chủng VSV gây bệnh, trong khi không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người bệnh được điều trị. Đặc tính này được biểu thị qua 2 giá trị: – Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt là MIC) – Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal Concentration - Viết tắt là MBC) Phổ kháng khuẩn của kháng sinh • Phổ kháng khuẩn của kháng sinh biểu thị số lượng các chủng gây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này. Theo đó ta có thể chia kháng sinh thành 2 loại: – Chất kháng sinh có thể tiêu diệt được nhiều loại mầm bệnh khác nhau được gọi là chất kháng sinh phổ rộng – Chất kháng sinh chỉ tiêu diệt được ít mầm bệnh là chất kháng sinh phổ hẹp Hiện tượng kháng thuốc và bản chất kháng thuốc của vi sinh vật • Hiện tượng kháng thuốc: Là hiện tượng mầm bệnh vẫn còn sống sót sau khi đã điều trị kháng sinh (VSV gây bệnh được coi là kháng thuốc nếu nồng độ MIC của chất kháng sinh trên VSV cao hơn nồng độ điều trị tối đa cho phép đối với bệnh nhân). • Có 2 dạng kháng thuốc: – Khả năng đề kháng sinh học: Khả năng kháng thuốc của VSV gây bệnh có thể được hình thành ngẫu nhiên trong quần thể, khi chúng chưa tiếp xúc với môi trường chứa chất kháng sinh – Khả năng đề kháng điều trị: Khả năng kháng thuốc của VSV gây bệnh xuất hiện sau khi chúng đã tiếp xúc với kháng sinh. Nguyên nhân là do trong tế bào VSV có chứa các yếu tố kháng thuốc R tiềm ẩn (Resistance Factor). Yếu tố kháng thuốc R có bản chất plasmid • Nguyên nhân hiện tượng kháng thuốc – Việc tuỳ tiện sử dụng thuốc không đúng liều lượng, không đúng chỉ định và không đủ thời gian cần thiết đã vô tình tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh cho các chủng VSV có khả năng kháng thuốc, đồng thời trở thành liệu pháp kích thích các chủng kháng thuốc này tổng hợp ra vô số plasmid mới. – Xu thế sử dụng tuỳ tiện chất kháng sinh trong chăn nuôi, đặc biệt là bổ sung vào khi chế biến thức ăn gia súc, gia cầm nuôi lấy thịt, trứng, sữa ... • Cơ chế của sự kháng thuốc: Cơ chế của sự kháng thuốc rất đa dạng và thường khác nhau đối với từng chủng VSV: – Một số loài có khả năng kháng thuốc tự nhiên với 1 số kháng sinh nhất định, do thuốc này không tác động lên chúng ( thí dụ như: nấm, virus, nguyên sinh động vật, do trên thành tế bào không có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động của các kháng sinh β – lactam). – Một số chủng vốn nhạy cảm với kháng sinh trở nên kháng thuốc khi chúng thu nhận được 1 trong các đặc tính mới (do đột biến) như: Có khả năng vô hoạt hay phá hủy chất kháng sinh (bằng cách tổng hợp ra các enzym ngoại bào làm phá vỡ cấu trúc của kháng sinh hay liên kết với kháng sinh để tạo ra dạng kém hiệu lực kháng sinh hơn). Có thể tự điều chỉnh khả năng hấp thụ của màng tế bào chất làm giảm hoặc ngăn ngừa chất kháng sinh xâm nhập vào tế bào chất. Có khả năng làm biến đổi cấu trúc phân tử của nơi hoặc vị trí mà chất kháng sinh tác dụng vào Tự điều chỉnh thay đổi đường hướng trao đổi chất để vô hiệu hóa tác dụng của chất kháng sinh đó… Cơ chế tạo chủng VSV kháng thuốc • Hiện tượng kháng chéo: – Là hiện tượng 1 chủng VSV khi đã kháng lại chất kháng sinh nhất định thì chúng cũng có khả năng kháng luôn 1 số chất kháng sinh khác cùng nhóm cấu trúc hay có các đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy – Thí dụ như 1 số chủng VSV gây bệnh đã kháng được penicillin thì cũng có trường hợp kháng luôn nhiều kháng sinh họ β - lactam khác. • Khắc phục hiện tượng kháng thuốc của VSV gây bệnh – Chỉ định điều trị kháng sinh đúng (làm kháng sinh đồ để chọn đúng kháng sinh thích hợp để chỉ định điều trị; dùng thuốc đúng liều, đúng phác đồ, đủ thời gian điều trị; chú ý phát hiện sớm dấu hiệu kháng thuốc) – Không lạm dụng kháng sinh khi chưa cần thiết (không lạm dụng "điều trị phòng ngừa" bằng thuốc kháng sinh, nghiêm cấm bệnh nhân tự chỉ định điều trị thuốc kháng sinh thay bác sĩ) – Nghiêm cấm sử dụng tràn lan chất kháng sinh trong chăn nuôi và giám sát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong thú y Kháng sinh đồ Điều chỉnh sinh tổng hợp kháng sinh • Việc điều chỉnh sinh tổng hợp kháng sinh trên nguyên tắc có thể được thực hiện qua hàng loạt cơ chế khác nhau. Thí dụ: cơ chế cảm ứng, cơ chế kiềm toả, cơ chế ức chế ngược ...Trong thực tiễn cần phải phối hợp hàng loạt các giải pháp khoa học và công nghệ, cụ thể có thể phân chia thành 2 nhóm lớn là: – Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh – Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh • Đây là thành quả của sự phối hợp đồng bộ hàng loạt giải pháp kỹ thuật tuyển chọn giống và tạo chủng tiên tiến như: – Kỹ thuật gây đột biến – Kỹ thuật dung hợp tế bào – Kỹ thuật tái tổ hợp – Các giải pháp kỹ thuật gen khác • Nhìn chung, quá trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinh cũng thường trải qua 6 giai đoạn cơ bản là: – Phân lập từ thiên nhiên – Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng " Siêu tổng hợp" có hoạt lực cao – Tuyển chọn sơ bộ – Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm – Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot – Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn công nghiệp • Mục tiêu của quá trình tuyển chọn tạo biến chủng công nghiệp không chỉ dừng lại ở năng lực siêu tổng hợp kháng sinh của chủng, mà còn định hướng đồng thời vào các mục tiêu khác như: – Tạo ra các biến chủng tích tụ ít các sản phẩm không mong muốn – Các biến chủng tổng hợp ra các sản phẩm hoàn toàn mới (nhất là các sản phẩm có cấu trúc và đặc tính mong muốn theo "thiết kế" của con người) – Các biến chủng rất nhạy cảm với chất kháng sinh hay các chủng có sức đề kháng cao với những chất kháng sinh nào đó .... Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men • Việc tối ưu hóa thành phần môi trường lên men có vai trò rất quan trọng, quyết định năng lực và hiệu quả chung của toàn quá trình, bao gồm: – Xác định nguồn nguyên liệu chính – Thành phần môi trường lên men – Nồng độ tương ứng của từng cấu tử trong từng thời điểm cụ thể Các nguồn nguyên liệu • Nguồn cacbon: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường ( glucoza, fructoza, maltoza, lactoza …) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, các loại rượu, dịch thủy phân gỗ, nước thải hồ sunfit… • Nguồn nitơ: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm nem, pepton, các muối NO3-, NH4+… • Các nguyên tố khoáng đa lượng: P, S, Mg, Fe, Ca, K, Na. • Các nguyên tố vi lượng: Cu, Zn, Co, Mo… và các chất sinh trưởng… Ngoài ra, trong quá trình lên men, người ta còn khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố khác trong môi trường như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, thế oxy hóa khử, cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men .. CÁC NHÓM KHÁNG SINH ĐIỂN HÌNH • Kháng sinh nhóm β-Lactam – Penicillin – Cephalosporin – Acid Clavulanic • Kháng sinh nhóm Tetracyclin • Kháng sinh nhóm Aminoglycosid – Streptomycin – Gentamicin • Kháng sinh nhóm Macrolid – Erythromycin • Kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn – Polymicin – Bacitracin KHÁNG SINH NHÓM β-LACTAM • Kháng sinh nhóm β-Lactam bao gồm các chất có chứa vòng β-Lactam (vòng amid 4 cạnh) • Đặc tính chung của kháng sinh β-Lactam là tác dụng lên thành tế bào VK bằng cách ức chế sự tổng hợp peptidoglycan của thành tế bào VK • Hai nhóm kháng sinh quan trọng nhất của họ β-Lactam là Penicillin và Cephalosporin SINH TỔNG HỢP PENICILLIN • Penicillin là loại kháng sinh phổ hẹp, được ứng dụng rộng rãi trong điều trị và được sản xuất ra với lượng lớn nhất trong số các chất kháng sinh đã được biết hiện nay. Có tác dụng lên hầu hết các VK Gram (+) và thường được chỉ định điều trị trong các trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn • Theo cấu trúc hóa học, các Penicillin tự nhiên là axit 6-aminopenicillanic. Đây là nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau có tác dụng điều trị tốt hơn • Một số penicillin bán tổng hợp phổ biến: Ampicillin; Amoxicillin Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Thành phần môi trường dinh dưỡng • Nguồn carbon: Glucose, lactose • Nguồn nitơ: – Nitơ vô cơ: các muối amoni và nitrate – Nitơ hữu cơ: nguồn đạm giàu amino acid (cao ngô, bột đậu tương, bột lạc) • Nguồn lưu huỳnh: muối sulfat của kali, natri, amoni; natrithiosulfat • Nguồn kim loại vi lượng: Mg, Mn, Fe, Zn, Na, Cu… Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum • Từ ba tiền chất ban đầu là α-aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ; • Tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng βlactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; • Sau đó trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L- α aminoadipic, L-cystein và L-valin Hình 2.8. Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr. (Hà Lan)) XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN VÀ TINH CHẾ THU PENICILLIN TỰ NHIÊN Một số nhược điểm của Penicillin • Kém bền vững khi gặp ẩm • Gây dị ứng, sốc phản vệ • Ít tác dụng lên vi khuẩn Gram(-) • Nhanh chóng bị kháng thuốc SẢN XUẤT CÁC β- LACTAM BÁN TỔNG HỢP TỪ PENICILLIN G • Nhiều trường hợp điều trị với Penicillin đã xuất hiện dấu hiệu kháng thuốc. Nguyên nhân chính là các VK gây bệnh này tổng hợp được enzyme penicillinaza và đặc biệt là enzyme β-lactamaza. Để vô hiệu khả năng kháng thuốc, giải pháp đơn giản hơn cả là làm vô hiệu khả năng tương tác của enzym với cơ chất bằng cách làm biến đổi cấu trúc phân tử penicillin. • Bằng con đường bán tổng hợp penicillin G hoặc penicillin V, có thể sản xuất ra một số dẫn xuất β -lactam có giá trị như các Cepalosporin bán tổng hợp hay các penicillin có hoạt tính kìm hãm βlactamaza. Cơ chế tổng hợp cephalosporin C ( giai đoạn cuối từ penicillin N) Sơ đồ phản ứng biến đổi cephalosporrin C thành axit 7- ADCA Sinh tổng hợp Acid Clavulanic • Sinh tổng hợp acid Clavulanic bằng pp lên men hiếu khí Streptomyces clavuligerus • Acid Clavulanic là sản phẩm ngoại bào, có thể chiết bằng nhựa trao đổi ion (Amberlite, Zeolite…) • Acid Clavulanic có hoạt tính kháng betalactamase, dựa vào ưu điểm này người ta thường phối hợp Clavulanic với các Ampicillin để mang lại hiệu quả kháng sinh cao. Augmentin = acid Clavulanic + amoxicilin Tách chiết và tinh chế acid Clavulanic • Bước 1: Hạ nhiệt độ dịch lên men xuống 5oC • Bước 2: Acid hóa dịch lọc bằng HCl hoặc H2SO4 (pH=2-3) Bổ sung dung môi không tan trong nước→acid Clavulanic chuyển sang pha dung môi • Bước 3: Chiết Clavulanic khỏi pha dung môi bằng NaHCO3 hoặc CaCO3…(pH trung tính) • Bước 4: Đem hấp phụ bằng nhựa trao đổi ion TETRACYCLIN • Tetracyclin là nhóm kháng sinh phổ rộng, ức chế hầu hết các vi khuẩn G(-), G(+)… • Hiện nay các Tetracyclin tự nhiên chủ yếu được sử dụng trong chăn nuôi. • Các Tetracyclin bán tổng hợp được dùng rộng rãi trong điều trị 1 số bệnh nhiễm trùng mắt, viêm phế quản, viêm tiết niệu do lậu cầu, dịch hạch… • Tetracyclin bền với acid→dùng đường uống. • Tác dụng phụ tạo phức calci bền vững làm răng vàng ố • Cơ chế tác dụng của Tetracyclin: phong tỏa hoạt động của nhiều E chính của quá trình trao đổi chất, ức chế quá trình tổng hợp protein của VK • Các Tetracyclin đều dễ bị kháng thuốc. Khi kháng thuốc: vị trí gắn Tetracyclin trên ribosome bị biến đổi→Tetracyclin không gắn được vào ribosome →mất tác dụng • Một số đặc tính chung cần quan tâm trong quá trình chiết xuất: – Tính lưỡng tính: có khả năng tạo muối với acid và các nhóm hydroxyl có khả năng tạo muối với kiềm hoặc với các Ca2+, Mg2+ – Không bền với những tác nhân OXH, ngay cả oxy không khí – Bị phân hủy bởi ánh sáng – Dễ bị đồng phân hóa ở pH 2,0-6,0→mất tác dụng – Trong môi trường kiềm quá hoặc acid quá tetracyclin sẽ bị khử hoạt tính SINH TỔNG HỢP TETRACYCLIN • Sinh tổng hợp Tetracyclin bằng phương pháp lên men hiếu khí Streptomyces. Aureofaciens • Các bước chính của quá trình sinh tổng hợp Tetracyclin • Sinh tổng hợp chuỗi Oligoketidamit • Khép vòng tạo khung pretetramit • Chuyển hóa tạo các Tetracyclin Điều kiện lên men • Nguồn H-C: bột ngô, bột mì.. • Nguồn N: bột ngô, bột mì, (NH4)2SO4 • Nguồn P: cao ngô. Thiếu P giống phát triển kém, hiệu suất lên men thấp. Thừa P giống phát triển nhanh nhưng hoạt lực kháng sinh giảm • Kim loại vi lượng: Mg, Mn, Fe, Cu từ cao ngô, bột đậu [...]... phân tử > 1000 dalton → Tính gây miễn dịch • Cấu trúc phân tử phức tạp: Chất có cấu trúc phân tử càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao → Tính đặc hiệu kháng nguyên Nguồn gốc Ag: Ag ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài, như do hít, ăn, tiêm Ag nội sinh là các kháng nguyên được sản xuất bên trong tế bào, là kết quả của quá trình chuyển hóa tế bào bất thường, hoặc do... Lympho B 15% đến 20% các Ig trong huyết thanh 10% < 1% < 1% 2-4 Trung hòa các Ngưng tụ, độc tố, trung hòa Vai trò vi các vi khuẩn khuẩn, và virus 2 - 10 2 Ngưng tụ, Dị ứng, con trung hòa đường các cổ ký sinh điển trùng 2 Hoạt hóa các tế bào lympho B VAI TRÒ CỦA KHÁNG THỂ • Trong một đáp ứng miễn dịch, Ig có 3 chức năng chính: – liên kết với Ag – kích hoạt hệ thống bổ thể – huy động các tế bào miễn dịch... IgG, IgM, IgA, IgD, IgE • Các Ig được tiết ra từ tương bào (tế bào plasma) có nguồn gốc là lympho B đã được hoạt hóa • Ag của miễn dịch dịch thể là kháng nguyên ngoại bào bao gồm : vi khuẩn, virus, kí sinh trùng, ấu trùng của nó, và tất cả tồn tại và sống ở dịch ngoại bào • Sự chọn dòng và sự biệt hóa các tế bào B Một tế bào lympho B được hoạt hóa khi các Ig gắn vào các thụ quan trên bề mặt của nó... protein đã được xử lý, biểu lộ trên bề mặt các tế bào của cơ thể • Do vậy các tế bào T thích hợp đối với các động tác qua lại tế bào – tế bào và chống các tế bào cơ thể bị nhiễm virus, vi khuẩn hoặc các ký sinh trong tế bào, cả các tế bào cơ thể không bình thường hoặc các tế bào ung thư và các tế bào của mô lạ được cấy ghép Trình diện kháng nguyên • Tế bào trình diện kháng nguyên (tế bào APC): là các đại... quan của tế bào T→các tế bào T gây độc giết các tế bào cơ thể bị virus xâm nhập và các tế bào ung thư, cả những mô ghép lạ • Sự tạo dòng và biệt hóa của các tế bào T: Khi hoạt động, tế bào T lớn lên và sinh sản tạo thành một dòng tế bào biệt hóa và thực hiện các chức năng tùy theo lớp tế bào T Quá trình phát triển của TB T trong tuyến ức TB vùng lõi: maturation Sản xuất các nhân tố điều hoà và biểu hiện