BÔ Y TÉ TRlTÔNG DAI HOC DÜOC HÀ NÔI ............................... î a X s * ................................... TRLfONG THj THU Hl/ÔNG SO SANH HAI PHITONG PHÂP DINH Ll/ÜNG CLARITHROMYCIN TRONG VIÊN NÉN BÂNG HPLC VÀ BÀNG VI SINH VÂT • • (KHOÂ LUÂN TÔT NGHIÊP DUOC SÏ KHÔA 2004 - 2007) Nguôi huomg dân: PGS - TS. THÂI DUY THÎN PGS - TS. THÂI PHAN QUŸNH NHÜ Noi thtfc hiên: Viên kiém nghiêm thuoc Trung uang Trung tâm kiém nghiêm Dirac - Mÿ pham Binh Dinh Thoi gian thuc hiên: 2/2007 - 5/2007 _ \ 7 ô à Q IU , th â n g . 5 - 2 0 0 7 i ! -, > Trircfc hét tôi xin bày tô long thành kmh và biét an sâu sâc nhât toi PGS -TS Thâi Duy Thin, PGS -TS Thâi Phan Quÿnh Nhir và DSCKI Nguyen Duy Khang là nhüng nguôti thây dâ truc tiép huomg dân, dâ dành nhiêu thôi gian và tâm sire giüp dô tôi trong suot quâ trinh nghiên cuu. Tôi xin trân trong câm on Ban Giâm hiêu cùng câc thây cô giâo Trifàng Bai hoc Difdc Hà Nôi dâ nhiêt tînh giâng day, truyën dat kiên thirc vô cùng quÿ bâu cho tôi trong suô't quâ trînh hoc tâp tai truèng cüng nhu trong quâ trinh thuc hiên khôa luân này. Tôi xin bày tô long biét on Viên kiem nghiêm thuoc Trung ifdng dâ tao moi dièu kiên thuân loi cho tôi trong quâ trînh thuc hiên dê tài. Tôi xin câm on Lânh dao Trung tâm Kiê’m nghiêm Dirçfc pham - Mÿ pham tïnh Binh Djnh và câc dông nghiêp dâ tao diêu kiên giüp dô tôi trong thôi gian qua dé tôi hoàn thành tôt khôa hoc vàn bàng 2 - Dai hoc Duac và trong quâ trinh thuc hiên dê tài khôa luân này. Cuôi cùng tôi xin câm cm nhüng nguôi thân trong gia dinh và ban bè dâ luôn dông viên quan tâm chia sê cùng tôi trong quâ trinh hoc tâp. Hà nôi, thâng 5 nâm 2007 Trufong Thi Thu Hufrng MUC LUC Trang Dàt van dê................................................................................................................... 01 Phàn 1: TÔNG QUAN 1.1. Tong quan vê khâng sinh Clarithromycin............................................................ 2 1.1.1 Câu truc...............................................................................................................2 1.1.2. Công thtic câ'u tao cüa Clarithromycin..............................................................2 1.1.3.Tmh châ't hôa lÿ...................................................................................................2 1.1.4. Duçfc lÿ và ca ché tac dung.......................................................................... 3 1.2. Tong quan câc phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên n én ............. 5 1.2.1. Phuong phâp sâc kî long hiêu nâng cao (HPLC)..............................................5 1.2 .2. Phucmg phâp Vi sinh vât dinh luçmg khâng sinh............................................ 11 Phàn 2: THUC NGHIÊM VÀ KÉT QUÂ.............................................................. 21 2.1. Nguyên vât lieu và phuong phâp thuc nghiêm................................................... 21 2.1.1. Nguyên vât liêu và thiê't bi................................................................................21 2.1.2. Phuong phâp nghiên cuti.................................................................................. 22 2.2. Kê't quâ thuc nghiêm và nhân xét...................................................................... 23 2.2.1.Kêt quâ thuc nghiêm dinh luçmg Clarithromycin / viên nén bàng HPLC......... 23 2.2.2. Kê't quâ thuc nghiêm dinh luçmg Clarithromycin/viên nén bàng Vi sinh vât.31 2.2.3. So sânh hai phucmg phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén...............35 2.2.4. Âp dung hai phuong phâp dinh luçmg trên de dinh luçmg mot so chê pham viên nén Clarithromycin............................................................................................ 37 KÉT LUÂN............................................................................................................... 40 Tài liêu tham khâo. Phu lue: Câch tînh toân dinh luçmg Clarithromycin bàng vi sinh vât ( bàng phàn mém tfnh toân theo phuong phâp ngâu nhiên). DAT VAN DÊ Van dë bâo dâm châ't luçmg thuô'c là rat quan trong, bol vï châ't luçmg thuô'c ành hirong lôn dê'n tmh mang, suc khoê ngudi bênh và hiêu quâ dieu tr i. Hiên nay thuô'c viên nén Clarithromycin liru hành trên thi truông Viêt Nam khâ pho bien do duac nhâp khâu và duac nhiêu doanh nghiêp duac pham trong nuôc sân xuâ't. Thuô'c khâng sinh Clarithromycin thuôc nhôm khâng sinh macrolid, cô thcâ gian bân thâi kéo dài han Erythromycin và thâi trir mot phàn dâng kë qua nuôc tiëu cho nên cô loi cho nhiêm khuân tiê't niêu sinh duc han câc thuô'c khâc trong nhôm. Clarithromycin tâc dông trên câc vi khuân Streptococcus, Staphylococcus, Helicobacter pylori và câc vi khuân ca hôi manh han Erythromycin. Nhung Duac diën môi nhâ't cüa Viêt Nam (DDVN III) chua cô chuyên luân kiém nghiêm chê' phâm viên nén Clarithromycin. Câc Duac diën (DD) nuôc ngoài nhu DD Mÿ (USP 28), DD Nhât (JP2001), DD Anh (BP2005) dinh luçmg Clarithromycin bâng HPLC; DD Trung Quô'c 2000 và mot sô tiêu chuân nhà sân xuâ't dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén bàng vi sinh vât. Dë cô ca sa lua chon phuong phâp kiëm nghiêm dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén phù hap vôi diéu kiên khoa hoc kÿ thuât, ca sà vât châ't và diéu kiên kinh te cüa câc Trung tâm kiëm nghiêm duac phâm à câc dia phuong nhung vân dâm bâo dô chmh xâc, tin cây; Phuc vu cho công tâc kiëm tra châ't luçmg thuô'c, dâm bâo chat luçmg thuô'c sân xuâ't và luu hành, an toàn cho ngucd su dung. Chüng tôi tien hành nghiên cüu so sânh 2 phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin bàng HPLC và bàng vi sinh vât. Mue tiêu dê tài: • Dânh giâ phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén bàng Sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC). • Dânh giâ phuong phâp dinh luang Clarithromycin trong viên nén bàng vi sinh vât. • So sânh 2 phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén bàng HPLC và bàng Vi sinh vât. 1 Phân 1. TÔNG QUAN 1.1. TÔNG QUAN VÊ CLARITHROMYCIN 1.1.1. Câu truc: Heterosid thân lipid [3], Clarithromycin chüa vông lacton 14 câu tir là khâng sinh nhôm macrolid thé hê II diroc bân tong hop tù Erythromycin A bàng câch thay -OH (à vi tri 6) bàng nhôm -OCH3(methoxy). Phân genin là vông lacton lôn gôm alkyl và -OH. Phân dircmg (ose) gôm câc dirông trung tmh và duông amin; dircmg amin dua lai tmh base cho phân t ü . 1.1.2. Công thurc câu tao: [20 ], [22 ], [23 ], [24 ] H3C O II CH3 CH3 Công thurc: C38H69NOi3 Phân tir luçmg : 748 Tên khoa hoc: (37?,4S,55,6/?,7/?,9/?,ll/?,12/?,131S,14/?)-4-[(2,6-Dideoxy-3-C-methyl3--hexopyranosyl)oxy]-14-ethyl-12,13-dihydroxy-7-methoxy3,5,7,9,1 l,13-hexamethyl-6-[[3,4,6-trideoxy-3-(dimethylamino)-b-D-xy/ohexopyranosyl]oxy]oxacyclotetradecane-2,10-dione Hoâc 6-O-methylerythromycin A. 1.1.3. Tînh chat hôa lÿ:_[3 ], [ 20], [22 ], [23 ] > Bôt két tînh màu trâng hoâc gân nhu không màu, vi rât dàng. > Không tan trong nuôc, tan nhiêu trong dung môi hüu cô (aceton, methylen clorid), tan ît trong methanol và ethanol. > Bên à pH acid. 2 > Vông lacton dê bi phâ vô à trong môi trirdng pH quâ kiëm hoâc quâ acid. > Cho phàn ûng màu vôi acid sulfuric, acid clohydric dâm dâc. Câc phàn ûng hôa hoc dinh tmh Clarithromycin nhu sau: [22 ] - Lâ'y mot luçmg ché phâm Wang üng 5mg Clarithromycin thêm 2ml H2S04 xuât hiên màu dô nâu. - Lâ'y mot luçmg chê' phâm tucmg lîng 3mg Clarithromycin thêm 2ml aceton và thêm 2ml HC1 xuât hiên màu cam rôi chuyën sang dô tfm. > Dinh tmh bàng phuong phâp sâc kÿ lôp mông: [22 ] - Ban mông silicagel GF254 - Hê dung môi triën khai: Cloroform-Methanol-Amoniac tî lê (100:5:1) - Dung dich chuân: 2,5mg Clarithromycin/4ml CHC13 - Dung dich thû: Lâ'y mot luçmg bôt chê' phâm tuong duong 12,5mg Clarithromycin hôa tan trong 20ml, loc lâ'y dung dich loc chàm sâc kÿ. - Chàm riêng biêt 5|il dung dich thü và chuân lên bân mông - Triën khai trong pha dông 12cm, lâ'y ra dë khô trong không khi. - Hiên màu: Phun acid sunfuric dâm dâc, sâ'y 105°C trong lOphüt > Dinh luçmg: • Phuong phâp HPLC [10 ], [12], [20 ], [ 21], [ 22], [24] • Phucmg phâp vi sinh vât [9 ], [11 ],[ 23] 1.1.4. Dirçrc lÿ và ca chê tâc dung: [2 ] ,[8 ] > Ca chê tâc dung : - Clarithromycin thuông cô tâc dung kim khuân, ngoài ra cô thë cô tâc dung diêt khuân a liêu cao hoâc dô'i vôi nhîrng chüng nhay câm. - Clarithromycin ûc chê' su tong hop protein à vi khuân nhay câm bàng câch gân vào tiëu dan vi 50S ribosom, làm cho câc acid amin không gân vào chuôi peptid dang thành lâp do dô không tong hap duac câc protein càn thiê't dân dê'n vi khuân bi tiêu diêt. - Clarithromycin tâc dông lên câc vi khuân Staphylococcus, Streptococcus, Helicobacter pylori và câc vi khuân ca hôi manh han Erythromycin. 3 - Ngoài ra Clarithromycin côn cô tâc dung rat manh dôi vôi Chlamydia spp, Ureaplasma, Mycobacterium spp. > Duac dông hoc - Clarithromycin bén vüng trong môi trirdng acid, hâ'p thu tôt qua diràng tiêu hôa Thuoc chuyên hôa à gan và thâi ra phân qua duông mât, mot phân dâng kë thâi qua nuôc tiëu. Nira dcfi cüa Clarithromycin khoàng 3-4giô. > Chî dinh - Clarithromycin duac chî dinh thay thê' cho penicillin khi bi nhiêm vi khuân nhay câm nhu viêm amidan, viêm tai giûa, viêm xoang câ'p, viêm phé quân man cô dot cap, viêm phoi, da và câc mô mêm. Dâc biêt dë diêu tri viêm phoi do Mycoplasma pneumoniae và Legionella, bênh bach hâu và giai doan dàu cüa ho gà và nhiêm khuân co hôi do Mycobacterium. - Clarithromycin duac dùng dë diêt trùf Helicobacter pylori trong diéu tri bênh loét da dày-tâ tràng dang tiê'n triën. > Chong chî dinh: - Ngirôi bi di iïng vôi câc macrolid. - Chông chî dinh tuyêt dôi dùng chung vôi terfenadin. > Lieu luang: - Ngucfi lôn: 250-500mg, 21àn/ngày. - Trê em: Liêu thông thuôfng : 7,5mg/kg thë trong, 2 làn/ngày. - Clarithromycin dùng phoi hop vôi chat trc chê bam proton và câc thuoc khâc vôi liêu 500mg, 3 làn/ngày dë diêt tân gô'c Helicobacter pylori. 4 1.2. TÔNG QUAN CÂC PHUONG PHÂP DINH LlTONG CLARITHROMYCIN TRONG VIÊN NÉN: 1.2.1. Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao : [6], [7], [17], [20], [24] 1.2.1.1.Khâi quât vé phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC): Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC) là mot phuong phâp phân tîch hôa lÿ dùng dë tâch, dinh tmh và dinh luang câc thành phàn trong hôn hop dua trên ai lue khâc nhau giûa câc châ't vôi hai pha luôn tiép xüc nhung không trôn lân vôi nhau: pha dông là châ't long và pha tînh chuta trong côt. Quâ trinh sâc kÿ long dua trên ca chê' hâ'p phu, phân bô', trao doi ion hay phân loai theo kîch cô. Ngày nay HPLC dâ và dang duac sur dung nhiêu trong ïïnh vire phân tîch hôa hoc nôi chung cüng nhu trong kiëm nghiêm thuô'c và phân tîch sinh duac hoc. Quâ trinh phân tâch trong kÿ thuât HPLC là do quâ trinh vân chuyën và phân bô' cüa câc chat tan giûa hai pha khâc nhau. Dung dich câc chat phân tîch khi vào côt sê duac hâ'p phu hoâc liên két vôi pha tînh tùy thuôc vào bân châ't cüa côt và cüa châ't càn phân tîch. Pha dông duac bam qua côt duôi âp suât cao sè di chuyën vôi mot toc dô nhâ't dinh khi qua côt sâc kÿ sê dây câc châ't tan bi pha tînh luu giû ra khôi côt. Tùy theo bân chat pha tînh, bân châ't cüa châ't tan, bân chât dung môi mà quâ trinh rüa giâi tâch duac câc châ't ra khôi côt sâc kÿ. Câc châ't sau khi ra khôi côt sê duac phât hiên bôi detector ( tü ngoai, dô dân, huÿnh quang, chî sô khüc xa...). Tùy theo bân chât cüa chât càn phân tîch mà sü dung detertor thîch hop câc tîn hiêu duac chuyën qua bô xü lÿ kê't quâ. Kê't quâ cuô'i cùng duac dua ra mây in hoâc hiën thi trên màn hinh. Nêu ghi quâ trinh tâch sâc kÿ cüa hôn hap nhiêu thành phân, ta së cô mot sâc dô gôm nhiêu pic. Quâ trinh tâch sâc kÿ tôt thi hôn hop cô bao nhiêu thành phàn sê cô bâ'y nhiêu pic riêng biêt trên sâc kÿ dô. 1.2.1.2. Câc thông so dâc trung cüa quâ trinh sâc kÿ: Két quâ cüa quâ trînh sâc kî duac detertor phât hiên, phông dai và ghi thành sâc kÿ dô (hinh 1): 5 Hinh 1: Sâc kÿ do cüa hai chât và câc thông so dâc trung Trong dô: to (thôi gian chét): Là thôi gian cân thiët dë pha dông chày qua côt tâch. tR (thôi gian luu): thôi gian kë tù khi chât càn phân tîch duac bam vào côt cho dén khi xuât hiên dinh cüa pic châ't cân phân tîch. tR’(thôi gian luu thuc) = tR-t0 8: Dô rông nüa pic tai câc diëm uôn tuong ung. W0)5: Dô rông pîc à nüa chiêu cao = 2,354 8 W: Dô rông dây pic. a/ Thôi gian luu tR (Rétention time) Thôi gian luu cüa mot chât là thôi gian tînh tù lue bam mâu vào côt dén khi chât dô ra khôi côt giâ tri eue dai. Thôi gian luu tRcüa môi chât là hâng dinh và câc chât khâc nhau thi thôi gian luu sê khâc nhau trên cùng mot dieu kiên HPLC dâ chon. Vî vây, thôi gian luu chînh là dai luçmg dë phât hiên dinh tînh câc chât. 6 Trong mot phép phân tîch nê'u tR nhô quâ thî su tâch kém, côn lôn quâ (tR >20 phüt ) thi pic bi doâng và dô lâp lai kém, thôi gian phân tîch dài. Dë thay dôi thôi gian luu ta thay dôi mot hoâc nhiêu yéu tô phu thuôc trên. b/ Hê sô dung luçmg k ’ : Capacity factor. Hê sô dung luçmg cüa mot chat cho biét khâ nâng phân bô cüa chât dô trong 2 pha trên suc chüa cüa côt, tüc là tî sô giûa luçmg châ't tan trong pha tînh và luçmg châ't tan trong pha dông ô thôi diëm cân bàng: k' = —- = ~^° = — —1 K t0 2,5 thî diëm cuô'i cüa pic rât khô xâc dinh. Vî vây cân thay dôi câc diêu kiên sâc kÿ dë làm cho pic cân xûng han theo câc câch sau: - Làm giâm thë tich chê't, tue là doan nô'i tù côt dén detector. - Thay dôi thành phàn pha dông sao cho khâ nâng rüa giâi tâng lên. - Giâm bôt luang mâu dua vào côt bàng câch pha loâng mâu phân tîch hoâc giâm thë tich tiêm. 8 1.2.1.3. Nguyên tâc câu tao cüa mây sâc kÿ long hiêu nâng cao: May HPLC gôm cô câc bô phân ca bân duac tôm tât trên sa dô (Hinh 2). Hinh 2 : Sffdo mây sâc kÿ long hiêu nâng cao Trong dô: 1. Bînh dung dung môi (pha dông) 4. Côt sâc kÿ (pha tînh) 2. Bam cao âp 5. Detector 3. Van tiêm mâu 6. Mây ghi tm hiêu Dê'n nay câc bô phân cüa mây HPLC dâ duac câi tiê'n, hiên dai hôa cao, ta cô thë cô mot mây HPLC theo ÿ muô'n vôi câc câu hînh lua chon nhu sau: a/ Binh dung dung môi (pha dông) và hê thông xùr lÿ dung môi: - Pha dông là yê'u tô' thü 2 quyê't dinh hiêu suât tâch sâc kÿ, no quyê't dinh thôi gian luu giü cüa câc châ't phân tîch và hiêu quâ cüa su tâch sâc kÿ. Pha dông cô thë làm thay doi: Dô chon loc a; Thôi gian luu tR; Hiêu nâng cüa côt tâch H; Dô phân giâi R; Dô rông hoâc su cân dôi pic. + Trong truông hop rüa giâi thuông (isocratic) chî càn 1 bînh dung môi. + Trong trucfng hap rüa giâi gradient: 9 Thucmg dùng 2,3,4 bînh chua câc dung môi khâc nhau và hê dung môi rüa giâi là hôn hop câc dung môi trên duac trôn trong quâ trînh sâc kÿ vôi tî le bien doi theo chuang trinh dâ dinh. b/ Boni cao âp: De bam pha dông vào côt tâch thuc hiên quâ trînh sâc kÿ, bom phâi tao duac âp suât cao (khoâng 250at-500at) và phâi tao dông liên tue. cl Côt tâch: Côt chua pha tînh duac coi là trâi tim cüa hê thong sâc kÿ . + Côt pha tînh thucmg làm bàng thép không ri, dài khoâng 10-30cm, dudng kmh trong 4-10mm, hat nhôi cô 5-10|im. + Vôi châ't nhôi côt cô 3-5 jum cô thë dùng côt ngân (3-10cm) và nhô (duông kmh trong 1- 4,6cm) loai côt này co hiêu nâng râ't cao. + Chât nhôi côt tùy theo loai côt và kiëu sâc kÿ.Thông thucmg châ't nhôi côt là silicagel hoâc là silicagel dâ duac silan hôa hoâc bao môt lôp mông hCru ca, Nguôi ta côn dùng câc hat khâc: Nhôm oxit, polymer xô'p, chât trao doi ion... + Doi vôi câc phuong phâp phân tich yêu câu nhiêt dô cao hoâc thâ'p hem nhiêt dô phông thi côt sê duac dât trong bô phân diéu nhiêt. d/ Detector + Là bô phân phât hiên câc chât khi chüng ra khôi côt và cho câc tm hiêu ghi trên sâc kÿ dô dë cô thë dinh tînh và dinh luçmg. Tùy theo tînh châ't cüa câc châ't cân phân tich mà nguôi ta sü dung loai detector thfch hap và phâi thôa màn diêu kiên trong môt vùng nông dô nhâ't dinh cüa chât phân tich. + Tm hiêu cô thë là: Dô hâ'p thu quang, cuàng dô phât xa, cucmg dô dông diên, diên thê', dô dân diên, chiét suât... Cô câc loai detector sau : + Detector quang pho tü ngoai và khâ kiên: 190-900nm dë phât hiên câc chât hâ'p thu quang. Dây là loai thông dung nhâ't. Loai don giàn chî cô thë dât môt buôc 10 sông cô' dinh trong quâ trînh sâc kÿ. Loai hiên dai là loai Diod array cô khâ nâng thay doi buôc sông theo chuang trinh dâ cài dât trong mot quâ trînh sâc kÿ . + Môt sô' loai detector khâc: Detector do khüc xa vi sai; Detector huÿnh quang; Detector diên hoâ; Detector khô'i pho, Detector tân xa ânh sâng bay hai. 1.2.1.4. Diéu kiên tien hành: Trên ca sô môt mây HPLC dâ duac lira chon, dë tien hành phân tich thi phâi cô môt diêu kiên sâc kÿ phù hofp. Diêu kiên này cô thë duac nêu ra trong câc tiêu chuân chât luçfng cüa chê' phâm càn kiëm nghiêm, nê'u chua cô thi phâi tien hành nghiên cün xây dung. Môt diêu kiên sâc kÿ bao gôm: - Pha tînh: Loai côt sâc kÿ và câc thông sô vê kich thuôc. - Pha dông: Thành phàn và tî le câc thành phàn, tô'c dô dông hoâc chuang trinh gradient dung môi. - Detector: Loai detector và câc thông sô phù hçfp. - Thë tich bam mâu; Câc yê'u tô' khâc: Nhiêt dô, thuô'c thü... 1.2.1.5. Câch tînh két quâ: - Dua vào diên tich hoâc chiêu cao cüa pic dâp umg cüa dung dich chuân và dung dich thü cô tuang quan tÿ le thuân trong khoâng tuyê'n tînh dâ khâo sât, ta tmh duçfc nông dô dung dich thü. - Thông thucmg dung dich chuân duçfc sü dung là ngoai chuân, nhung cô nhüng trucfng hçfp dâc biêt phâi dùng nôi chuân hoâc thêm chuân - Trong câc nghiên cüru chua cô châ't chuân, cô thë tînh theo phân trâm diên tich pic: Nông dô cüa mâu thü duac tfnh toân dua trên diên tich pic tfnh theo tî lê phàn trâm diên tîch pic chât thü trên tong diên tîch toàn bô pic cô trong sâc dô. Trong HPLC, phuong phâp này chî dung khi cô su dâp ûng cüa detector trên tâ't câ câc châ't là nhu nhau, nê'u nhu không nhu nhau khi dô vôi môi châ't càn cô hê sô' hiêu chînh. 1.3.2. Phuong phâp dinh luang khâng sinh bàng vi sinh vât:[l] ,[4] ,[7],[ 13], [14] [15], [18], [23], 1.3.2.1. Khai quât vê phuong phâp dinh luçmg khâng sinh bàng vi sinh vât: 11 Phuong phâp vi sinh vât là môt trong nhüng phuong phâp duçfc sûr dung dâu tiên dë xâc dinh hoat lue cüa thuoc khâng sinh, nhâ't là nhûng khâng sinh môi, hoâc nhûng châ't cô tâc dung khâng khuân. Dôi vôi nhûng châ't cô nguôn gô'c sinh vât mà tâc dung sinh hoc không thë tuong un g vôi phân ûng hoa hoc, nguôi ta thuông âp dung phuong phâp vi sinh vât. Phuong phâp này cô nhûng uru diëm sau: + Rat nhay câm, nên cô thë xâc dinh à hàm luçmg nhô. + Cô tfnh dâc hiêu cao, nên su cô mât cüa câc hôn hçfp khâc không ành huông dén két quâ thi nghiêm. + Rât thfch hçfp dôi vôi khâng sinh, câc chât diêu chê' tùr vi sinh vât, câc vitamin và câc acid amin trong hôn hçfp. + Phuong phâp xâc dinh hoat lue khâng sinh bàng vi sinh vât dâ duçfc nghiên cüru nhiêu vê lÿ thuyê't và thuc hành. Dë xâc dinh hàm luçmg cüa câc khâng sinh, thuông âp dung pho bien hai phuong phâp: Phuong phâp khuyê'ch tân và Phuong phâp do dô duc. Dôi vôi dê tài này chî sü dung phuong phâp khuyê'ch tân. I.3.2.2. Nguyên tâc cüa phuong phâp khuyê'ch tân: Trong thü nghiêm, nhûng khâng sinh chua biét duoc chrnh xâc hoat lue, duçfc dë cho khuyê'ch tân vào môi truông nuôi câ'y dâ tiê'p chûng. Chüng khuyê'ch tân và tao ra xung quanh môt vùng üc chê' vôi chüng mang thü nghiêm. Tiê'n hành dông thôi khâng sinh chua biét nông dô vôi khâng sinh cùng loai dâ biê't châc chân nông dô và kîch thuôc vùng urc chê' do chüng tao ra. Dùng phuong phâp thông kê sinh hoc sê tfnh ra duoc hoat lue cüa khâng sinh cân xâc dinh. Cô nhiêu yê'u tô' tâc dông dê'n quâ trînh khuyê'ch tân, ành huông dê'n quâ trînh khuyê'ch tân, ành huông dê'n kê't qüa dinh luçmg nhu: nhiêt dô, thành phàn môi truông nuôi câ'y, thôi gian ü, dô khô cüa thach, chiêu dày lôp thach, dô thuân nhâ't và sô luçmg cüa vi khuân nuôi câ'y.. Cô 2 loai khuyê'ch tân: Khuyê'ch tân duông doc và duông ngang. Hiên nay phuong phâp khuyê'ch tân duông doc ft duoc sü dung. *Phuong phâp khuyê'ch tân duông ngang: 12 + Tao môi truông khuyê'ch tân duông ngang bàng câch: Dùng dïa pétri cô dây phâng, trong dô do môi truông thach nuôi câ'y, tao mot lôp môi truông cô bê mât phâng và dô dày dông dêu. Khâng sinh thu: nghiêm duoc tâm vào khoanh giâ'y roi dât lên môi truông, hay pha thành dung dich roi nhô vào câc ong tru dât trên bê mât thach, hoâc nhô vào câc lô thach dâ duoc tao ra bàng câch duc vào môi truông thach. Khâng sinh sè khuyê'ch tân tù câc diëm dât ra môi truông tao thành mot vùng ire chê' hînh trôn. Do và so sânh vùng uc chê' cüa khâng sinh thir và khâng sinh chuân trong cùng môt diêu kiên. + Dùng phuong phâp thông kê sè tmh toân duçfc hoat lue cüa khâng sinh thü. 1.3.2.3. Nguyên lÿ khuyêch tân dudng ngang: Theo Cooper trong truông hoip khâng sinh khuyê'ch tân tù môt diëm nhu tù ô'ng tru, khoanh giâ'y tâm hoâc lô dung dung dich khâng sinh vào môi truông thach dinh duông. Khi sir dung khay kmh phâng hoâc hôp pétri cô dây phâng thi sê xây ra hiên tuçfng khuyê'ch tân theo chiêu ngang. Phuong trînh tfnh khoâng câch vùng ûc chê' khi cho luçfng khâng sinh cô nông dô M, khuyê'ch tân tù ô'ng tru cô chiêu dày H nhu sau: r2=4.D.T( ln ^ -lnC-ln(47t.D.T)) M: luofng khâng sinh trong ô'ng tru hoâc ô'ng thach D: Hê sô' khuyê'ch tân T : Thôi gian khuyê'ch tân H: Chiêu dày lôp thach C : Nông dô tôi han cüa khâng sinh r: Bân kmh vùng vô khuân A.D.T = ln ■ — - InC - ln(47t.D.T) H = lnM- ( (lnH+lnC+ln(47t.D.T)) = ln M- ln(47t.D.T.H.C) lnM = —^ — + ln(4îi.D.T.H.C) A.D.T 13 Doi sang logarit thâp phân ta cô: + 2,303.1g(47c.D.T.H.C) 2,3031gM lgM = — ---- + lg(4îr.D.T.H.C) 9,21 .D.T Ta thây phuong trînh cô dang: Y=aX+b Nhu vây tri so logarit luçmg khâng sinh trong ong tru co su tuong quan tuyén tînh vôi kich thuôc vùng ûc ché. 1.3.2.4. Câc dieu kiên thi nghiêm : > Chon diêu kiên thü nghiêm > Tim dung chrnh xâc mûc liêu làm viêc : De phép thü chmh xâc, càn chon câc mire liêu trong “vùng nhay câm” cüa duông cong dâp ûng, tai vùng này, mot su thay doi nhô cüa nông dô sê cho su thay doi eue dai cüa su dâp ûng. > Càn tiêu chuàn hôa luçmg nhü dich câ'y truyên cho môi thü nghiêm. Trong thü nghiêm khuyê'ch tân, bf quyê't dë dat duoc su phât triën dông dêu sau khi ü, cô duçfc vông vô khuàn rô ràng, sâc nét là do trôn vùa dü và dông nhâ't luçmg nhü dich câ'y truyên vào môi truông. > Diêu chînh cô vông vô khuàn Nê'u thi nghiêm thu duçfc câc vông vô khuàn cô duông kmh quâ nhô sê chua thât chrnh xâc. Nô không chî làm giâm kfch thuôc vông vô khuàn mà côn giâm dô dô'c duông thâng (hay giâm dô nhay cüa thü nghiêm). - Dôi khi môi truông duçfc sü dung quâ nhiêu châ't dinh duông, cho phép chüng chî thi phât triën khâ nhanh, nhung lai gây cân trô su khuyê'ch tân cüa khâng sinh. > Câch bô' tri thi nghiêm: Bô tri theo hînh vuông Latin Thuông dùng hôp pétri duông kmh 10 cm hoâc khay hinh vuông cô canh 23cm. • Bô' tri 4x4 (2+2) hai liêu chuàn, hai liêu thü. Thü nghiêm giûa mot châ't chuàn và môt châ't thü. 14 • Bo tri 6x6 (2+2) thir nghiêm giûa hai chat thü và mot chat chuân, môi chat hai lieu. • Bo tri 6x6 (3+3) thü nghiêm gôm mot châ't thü và mot châ't chuân, môi chat ba liéu, co 6 vong cho mot liêu. Dây là phuong phâp thuân tien de chon duoc câc thü nghiêm cô dô doc cüa dudng dâp üng. Liêu lirçmg dat dirac dô thâng song song à mire châc chân và chfnh xâc cao. 1.3.2.5. Câch tien hành thü nghiêm: a/ Ché tao dich cây truyên: - Nguôn chüng dông khô thtfông cô duoc tùr : National collection of type cultures (NTCT) Hoâc American type culture collection (ATCC) - Câc chüng dông khô này phâi diiçfc hoàn nguyên trong canh thang dinh dirông bâng câch ü qua dêm 32-37°C. - Dich canh thang cô vi sinh vât, sau dô duçfc cây vào thach nghiêng roi tiê'p tue cây truyên ît nhât 2 lân. Câc ong thach nghiêng này cô thë bào quàn tü lanh và cây chuyën hàng thâng. b/ Chê tao nhü dich nha bào cua vi khuân: - Cây chuyën câc chüng chî thi nhu B. Pumilus, B. Subtilis tù ong thach nghiêng vào môi truong nuôi cây, ü qua dêm d 32-37°C. - Dùng nuôc câ't gât lâ'y vi khuân dâ moc, dùng pipet vô trùng hüt nhü dich vô khuân và trâi dêu lên mât thach nghiêng cüa mot binh Roux chûa khoâng 100ml *) môi trucmg. U bînh Roux a 37°C trong 7 ngày. Dùng nirôc cât và nhûng viên bi thüy tinh dë gât vi khuân, chuyën và rüa djeh vi khuân trong ong ly tâm vô trùng. - Dun câch thüy nhü dich nha bào à 70°C trong 30 phüt dë giê't thuc thë. - Làm test và diêu chînh su pha loàng cüa dung dich tiê'p chüng de cô vông üc chê' sâc nét. c/ Chê tao dîa hoâc khay phàng thür nghiêm: 15 + Câc môi truông dâ ché tao dirçfc dông vào bînh non cô thé tîch thïch hop, duofc dây bàng nüt bông, bao ngoài bàng giây nhôm, tiêt trùng, kiëm tra lai giâ tri pH cüa môi bînh và diêu chînh lai düng pH. Do môi trvràng vào dla, khay phang: * Do mot lôp: - Môi truông duofc dun nông, khuâ'y cho tan, hâ'p tiêt trùng à 121°C trong 15 phüt, de nguôi dén nhiêt dô 50-60°C . - Sâp xép câc khay dïa thü nghiêm trên mot mât phâng. - Trôn dêu dich câ'y truyên trong môi truông trirôc khi phân phôi vào dïa. - Dùng pipet chia vach hüt dich môi truông dâ câ'y truyên (côn mât và long) phân phôi vào câc dïa vôi mot luong thich hçfp - Giû yen dïa trong khoâng 20-30phüt de thach dông ciing *Do hai lôp: - Câc buôc chuàn bi và tao môi trucmg tuong tu nhu do môt lôp thach. - Dé truôc mot lôp thach nên vào hôp pétri. De cho thach dông dâc, - Tiép tue dé lôp thach nuôi câ'y (thach dâ câ'y truyên chüng chî thi) lên trên lôp thach nên vôi mot luçmg thfch hçfp. Thuông dô'i vôi môi dïa pétri duông kfnh 10cm do 5ml thach nuôi câ'y. d/ Ché tao dung dich chuân cua thi nghiêm: - Cân môt luong chfnh xâc khoâng 50mg chat chuân - Pha mot dung dich chudn gô'c cô nông dô 1000 Ul/ml bàng câch thêm chmh xâc mot thë tfch dung môi bàng buret vào luçfng cân trên dé tao thành dung dich gô'c mong muô'n. - Lâc hoâc dùng siêu âm dé hôa tan hoàn toàn. - Câc dung dich chuân mang thir nghiêm duoc pha loâng tùt dung dich chuân gô'c bàng dung môi hoâc dung dich dêm thfch hôp. e/ Ché tao dung dich thur cua thi nghiêm: Théo chuyên luân riêng cüa tùng chê' phâm hoâc Vf du: Viên nén thi lâ'y 20 viên nghiên thành bot min. Cân chînh xâc mot phân bot này tuong ung vôi nông dô giâ dinh 1000 Ul/mg. Thêm chînh xâc mot thé ti'ch 16 dung môi bàng buret vào luçmg cân trên dë tao thành dung dich gôc mong muôn. Tiép tue hôa loâng vôi dung dich dêm dë duoc câc dung dich thu nghiêm. g/ Tao lô thach, dât ong tru: - Dùng dung eu tao lô thach, làm thành 6 lô thach trong môt hôp Pétri. - Câc lô thach câch dêu nhau và câch tâm hôp Pétri khoâng 2,5cm - Dung dich chuân và mâu thü duoc chuyën vào câc lô thach hoâc ong tru bàng micropipet, môi lô 100(il theo kiëu bô' tri thi nghiêm ngâu nhiên hôa. Vi du: Mâu chuân và mâu thü duçfc pha thành 3 nông dô 1, 2, 3 . Môi nông dô làp lai 6 làn. Duçfc bô' tri nhu sau: Dial S2 T2 T3 SI TI S3 Dïa 2 T2 TI SI T3 S3 S2 Dïa 3 TI S2 S3 T2 T3 SI Dïa 4 S3 SI T2 TI S2 T3 Dïa 5 T3 S3 TI S2 SI T2 Dïa 6 SI T3 S2 S3 T2 TI • S,: Vi tri cüa dung dich chuân O T,: Vi tri cüa dung dich thü Hinh 3: Kiéu bô tri thi nghiêm trên dîa thach h/ Tînh toân kê't quâ: [4] Sau khi thü nghiêm ta thu duçfc câc vông vô khuân ( xem hinh 4) do duông kfnh câc vông vô khuân này dë tînh toân két quâ. Két quâ tî le phân trâm hoat lue (R) cüa khâng sinh thü so vôi chuân duoc tmh theo công thûc: R = Antilog 2 + 4 [(7^+ r , + r î ) - f e + s ; + s 1)] 3 (t ,+ s M t ,+ s ,) log / O, Sj, S2, Ss 7 ;, T2, T3 là tong giâ tri dirô'ng kïnh câc vông vô khuân tfnh bàng mm cüa câc nông dô tj, t2, t3, sx, s2, s3; I là tî sô cüa hai nông dô pha loâng ke tiê'p nhau, I = 2, do dô log2=0,301 Hoat lue cüa mâu thü duoc tînh theo công thüc: - Nguyên liêu (UI/mg)= R%.a/b.S - Viên (UI/viên)= R%.a/b .MTBV.S Trong dô: R%: Phân trâm hoat lue tînh theo kê't quà thông kê. a : Khôi luçmg chuân (mg) mang pha dung dich thü gôc b : Khôi luong mâu thü (mg) mang pha dung dich thü gôc. Mtbv: khôi luçmg trung bïnh cüa mot viên. S : Sô don vi trong mot mg chuân Thi nghiêm phâi dat duoc câc dieu kiên theo qui dinh và câc sô liêu thông kê sai sô dat yêu câu (e< 5%) thî kê't qua môi cô giâ tri. Hinh 4: Hînh ânh kê't qua dinh litong khâng sinh trên hôp Pétri 18 Sa dô quy trinh tien hành thü nghêm: 19 Môt so công thûc tinh toân trong xû ly thong kê ket quâ > Giâ tri trung binh: — 1 ” x = ~ T *!x , n , =l n- 1 > Sai so tuyêt doi: s —±£ = x - > Sai so tuong doi: £% = S ju (ju : giâ tri thuc hoâc giâ thtic) S x 100 hoâc £ = =■x 100 M ' x g > Dô lêch chuân tuong dô'i: RSD% = — x 100 x Trong do : x, là két quâ xâc dinh lân thû i; n: là sô làn xâc dinh + Tiêu chuân Fischer dé dânh giâ dô chînh xâc hay dô làp lai cüa 2 phuong phâp thî nghiêm khâc nhau: p _Sl r m~ c ; trong do Sj>S2 2 ■ Fto>Flt Dô chînh xâc hoâc dô lâp lai cüa hai phuong phâp khâc nhau không cô y nghîa thô'ng kê ■ Ftn Muô'i monobasic potassium phosphat (KH2P04), muô'i dikalihydrophosphat (K2HP04), H3P04: Hôa châ't tinh khiê't phân tfch . > Methanol tinh khiê't HPLC, Methanol tinh khiê't phân tfch. > Hôa châ't pha chê' môi truông dinh duông nuôi cây vi khuân: pepton khô, casein pancreatic glucose, nuôc câ't, thach. > Chüng vi sinh vât chî thi: Chüng Bacillus pumillus ATCC 8241. 21 2.1.1.3. Thiëtbi + Mây sâc kÿ long hiêu nâng cao Elit Chrom 2000 (Merck-Hitachi) - Bom: Gradient pump (4 kênh dung môi) - Côt sâc kÿ RP18(4xl50mm);5fim - Detector UV-Vis. - Buông tiêm mâu bàng tay: loop 20|il - Dàu loc, màng loc duông kmh lô loc 0,45(xm. + Cân phân tich Satorius CP 224S dô chrnh xâc 0,1 mg. + Mây do pH JENWAY cüa Anh. + Mây do vông khâng khuân. + Mây câ't nuôc 2 làn + Mây làc siêu âm EBRO ARMATUREN cüa Dure. + Mây loc hüt chân không Satorius + Nôi hâ'p tiêt trùng + Tü â'm + Tü sâ'y Memmert + Phàn mém xü lÿ kê't quâ HPLC + Phàn mêm xü lÿ két quâ vi sinh vât + Câc dung eu thüy tinh: Pipet, autopipet, bînh dinh müc, binh non, phêu loc: Dat yêu câu dùng cho kiëm nghiêm thuô'c. 2.1.2. Phuong phâp nghiên cûu: > Nghiên cûu trên lÿ thuyê't và tài liêu tham khâo dë lua chon phuong phâp phân tich. > Bàng thuc nghiêm, dua vào kê't quâ thu duoc, xü lÿ thông kê và rut ra két luân. > Phuong phâp sü dung trong thuc nghiêm: HPLC, Vi sinh vât. 22 2.2. KÊT QUÂ THUC NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT 2.2.1. Kê't quâ thiic nghiêm dinh luong Clarithromycin trong viên nén 2.2.1.1. Lua choit dieu kiên sâc ky de dinh luong Clarithromycin trong viên nén bàng HPLC: Tham khâo USP 28, BP2005, JP 2001 câc dieu kiên sâc kÿ dinh luçmg Clarithromycin (ghi trong bàng 1). Bàng 1 : Câc dieu kiên sac ky tham khâo Tài lieu [20] [21] [22] [24] Pha dông Acetonitril- Acetonitril- Acetonitril- Methanol-Dêm Dêm phosphat Dêm phosphat Dêm phosphat phosphat pH4,4 pH4,4 pH4,4 (pH=4,0) gradient 35:65 7:13 65:35 C18 C18 C18 C18 (4,6mmxl00mm, (4mmx 150mm (4mmx 150mm (4mmx 150mm 3,5|im) 5|im) 5|im) 5|im) Detector UV 205 nm UV 210nm UV 210nm UV 210nm Toc dô 1,1 1,0 Sao cho 1,0 Tî le câc thành phân Pha dông Loai côt tR=8 phüt dàng (ml/phût) Thé tich lOmcl lOmcl lOmcl 20mcl 40°C 50°C 50°C 50°C tiêm Nhiêt dô * Qua tham khâo câc tài lieu trên vôi trang bi ( loai côt, vông tiêm mâu) và dung môi cho pha dông hiên cô chüng tôi lua chon diêu kiên sâc kÿ theo tài lieu 23 USP 28 ( [24] ) dë dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén Claritab do Công ty Duçfc-TTBYT Binh Dinh sân xuât nhu sau: - Côt RP18 (4mmxl50mm;5|nm) - Detector UV : 21 Onm - Pha dông: MeOH-dung dich dêm KH2P 04 0,067M ti le (65:35) diéu chînh pH = 4.0 bàng H3P 04. - Nhiêt dô côt: 50°C + 1°C - Thë tich tiêm: 20(il - Toc dô dông: l,0ml/phüt 2.2.I.2. Tien hành dânh giâ phuong phâp HPLC dâ lua chon: > Tinh thich hop cüa hê thông sâc kÿ: + Pha dung dich chuân: Cân chrnh xâc 64,2mg Clarithromycin chuân (hàm luçmg 97,28% tfnh theo nguyên trang) cho vào binh dinh miic 50ml. Thêm 35ml Methanol, lâc siêu âm 5 phüt, thêm Methanol tôi vach, lâc dêu. Hüt chrnh xâc 5ml dung dich này cho vào binh dinh mire pha loâng vôi pha dông vira dü 50ml, loc qua giâ'y loc 0,45jim, lâ'y dich loc chuân ( nông dô 124,91mcg/ml)dë tiêm sâc kÿ. + Tien hành sàc kÿ theo diêu kiên dâ chon. + Tiêm lâp lai dung dich chuân 6 lân. Kê't quâ dânh giâ tmh thfch hçfp hê thông sàc kÿ dë dinh luçmg viên nén Clarithromycin ô diêu kiên lua chon: Sâc kÿ dô mâu chuân Clarithromycin à hinh 5. 0 1 2 3 4 5 6 7 Minutes Hinh 5 : Sâc kÿ dô mâu chuân Clarithromycin 24 Ban g 2: Kët quâ khdo sât tînh thich hop cüa hé thông sac ky STT Thôi gian litu Diên tich pic(S) Sô dia lÿ Hê sô dôï (tR) (phut) (mAU.min) thuyê't (H) xüng (T) 1 3.62 512696 2850 1,25758 2 3.62 513316 2861 1,27401 3 3.62 510949 2841 1,26060 4 3.62 511383 2877 1,26786 5 3.62 511232 2880 1,29279 6 3.62 507991 2892 1,27695 Trung 3,62 511261 2867 1,27163 0,00% 0,36% binh RSD% * Nhân xét: - Câc giâ tri RSD % cüa thôi gian lim = 0,00%, RSD diên tfch pic = 0,36%, sô rîïa lÿ thuyê't = 2867, hê sô dôi xüng T = 1,292, dêu nàm trong giôi han cho phép chüng tô viêc tâch Clarithromycin cüa hê thông sâc kÿ thich hop tôt. - RSD cüa tR và RSD cüa diên tfch pic nhô do dô dâm bào duoc tfnh thfch hop cüa hê thông. > Khdo sât tinh âac hiêu cüa phitang phâp + Mâu tràng: Cô thành phân gôm câc tâ duac cô trong viên nén Clarithromycin dem khào sât Tinh bôt bâp : 0,107g Aerosil : 0,00086g Era-gel : 0,400g Magnesi sterat: 0,0020g PVP : 0,0065g Lactose: 0,800g Sodium Starch Glycolat: 0,0082g 25 Cân chmh xâc khoâng 0,304g hôn hop tâ duoc trên, hoà tan trong 50ml MeOH, lâc siêu âm 10 phüt, loc qua giâ'y loc, hüt 3ml dich loc thêm dung môi pha dông vùra dû 100ml, loc qua giâ'y loc 0,45|im rôi tiêm 20 mcl vào côt sâc kÿ. + Kê't quâ thu duoc sâc kÿ dô mâu trâng à hinh 6. Hinh 6: Sâc ky dô mâu trâng + Dung dich mâu trâng cô thêm chuân cüng dtfoc tiêm sâckÿ. Sâc kÿ dô mâu trâng cô thêm chuân thu dtfçfc ô hinh 7: H ic •£i! ;eI1 4 Minutes Hinh 7: Sâc ky do mâu trâng cô thêm Clarythromycin chuân + Kê't quâ sâc kÿ dô mâu trâng không cô pic nào xuâ't hiên à khoâng thôfi gian liru cüa Clarithromycin cho thâ'y không cô ânh huông cüa tâ dirçfc dê'n pic cüa Clarithromycin > Tînh tuyê'n tfnh giùa nông dô châ't khâo sât và diên tîch pic: Dô tuyê'n tmh duoc khâo sât trên 06 dung dich cüa câc châ't chuân cô nông dô: 0,03123 - 0,06245- 0,1249- 0,2498 - 0,3747 - 0,4996mg/ml. Kê't quâ duoc trînh bày trong bâng 3. 26 Bâng 3: Kët quâ khdo sât tinh tuyën tinh Dung dich Nông dô 2 1 3 4 5 6 0.03123 0.062455 0.12491 0.24982 0.37473 0.49964 129508 510655 1031763 1517794 2031677 (mg/ml) (Amount) Diên tich pic 254963 (Area) (mAU.phût) y = 2.45567e-007x + 0.000000 r = 0.9999 Dô thi khâo sât tmh tuyén tînh cüa phuong phâp HPLC ô hinh 8 Peak: Clarithromycin - ESTD - UV-VIS Area Hinh 8: Do thi khdo sât tinh tuyën tinh cûa phuong phâp HPLC * Nhân xét: Kê't quâ khâo sât dô tuyén tfnh cho thây hê sô tuong quan r = 0,9999 chüng tô khoâng nông dô dà khâo sât cô sir tuong quan tuyê'n tfnh giûa nông dô do và diên tîch pic. > Dô lâp lai cûa phuong phâp: Câc thü nghiêm này duoc tiê'n hành trên 6 mâu dung dich thü cùng vôi dung dich chuân duoc chuân bi nhu sau: * Dung dich thü: Lâ'y 20 viên nén Clarithromycin cân xâc dinh khôi luong trung binh viên, nghiên thành bôt min và trôn dêu. Cân chrnh xâc môt luong bot 27 thuôc tucmg üng vai 400mg Clarithromycin và chuyën vào bînh dinh mure dung tfch 100ml. Thêm 70ml methanol, lâc bàng mây lâc 15 phüt, thêm methanol toi vach, lâc déu. Loc qua giâ'y loc khô, bô 20ml dich loc dàu. Hut chfnh xâc 3ml dich loc này cho vào bïnh dinh müc 100ml thêm pha dông dê'n vach, lâc dêu, loc qua giâ'y loc 0,45jim, lâ'y dich loc thü dë tiêm sâc kÿ. * Dung dich chuân: Lâ'y dung dich chuân dâ chuân bi ô mue khâo sât tmh thich hop cüa hê thông sâc kÿ . * Tiêm lân luçrt 20mcl câc dung dich chuân và dung dich thü vào hê thông sâc kÿ, tien hành sâc kÿ. Dua vào diên tfch hoâc chiêu cao pic trên sâc dô cüa dung dich chuân và dung dich thü, nông dô cüa dung dich chuân, tmh hàm luçmg(%) hoat châ't cô trong chê' phâm so vôi luçmg ghi trên nhân theo công thûc sau: Sc x mt x3 250 Trong dô: S,: Diên tfch pic mâu thü Sc: Diên tfch pic mâu chuân (Sc = 511261) mc: Khô'i luçmg cân mâu chuân (64,2mg) Cc : Hàm luçmg thuc cüa mâu chuân (97,28%) m,: Khô'i luçmg cân mâu thü mTBV: Khô'i luçmg trung bînh viên (435,2mg) 250 : Hàm luçmg ghi trên nhân * Kê't quâ khâo sât dô lâp lai cüa phuong phâp: - Sâc kÿ dô cüa mâu thü à hînh 9. 1 0 -i i1 1 1 5 H Ni (« ro ' ! >> il Ic i !i i\ Hinh 9: Sâc kÿ dô mâu thü Clarithromycin 28 - Kê't quâ dô lâp lai cüa phuong phâp HPLC duoc tmh toân dira vào diên tich pic cüa mâu chuân (Sc = 511261) và ghi trong bàng 4. ____________ Bàng 4: Kët quâ dô lâp lai cüa phuong phâp H P L C __________ Hàm luong Hàm Khôï luong Diên tich pic Luong STT cân bôt TB viên mâu thü luong thü(mg) (mg) (mAu.min) viên (mg) 1 698,4 435,2 500800 254,13 101,65 2 696,0 435,2 500748 254,98 101,99 3 697,0 435,2 505549 257,05 102,82 4 697,8 435,2 500714 254,30 101,72 5 698,0 435,2 501400 254,58 101,83 6 697,2 435,2 503628 256,00 102,4 255,17 102,1 Trung bînh (%) 0.456 S(dô lêch chuan) 0,447 RSD(%) * Nhân xét: Kê't quâ khâo sât dô lâp lai cho thâ'y vôi chuong trinh sâc kÿ dâ chon dinh lirong Clarithromycin cô dô lâp lai cao thé hiên à sai sô' tuong dô'i cüa phuong phâp khâ nhô (RSD%=0,456%). > Dô dung cüa phuong phâp: - Dô dung cüa phuong phâp duoc xâc dinh bàng phuong phâp thêm chuân. - Thêm mot luong chfnh xâc khoâng 20% châ't chuân Clarithromycin so vôi luong cô trong mâu thü, tien hành chay sâc kÿ theo dieu kiên dâ chon lira, lâp lai thuc nghiêm 6 lân. Dira vào hàm luong hoat châ't dâ biê't trong mâu thü, hàm luong cüa câc chat chuân và cân cü’ vào diên tich pic trên sâc kÿ dô tmh diroc hàm luong câc chât thu hôi lai. Tmh toân kê't quâ khâo sât dô dung dua vào diên tich pic cüa mâu chuân là Sc = 511261 à bàng 5 . 29 Bâng 5: Kët quâ dô dung cüa phuong phâp HPLC S Luong Diên tich Diên tich Luong (%) Tinh thông kê TT thêm pic mâu pic mâu tim tim (n -6 P=0,95 vào thü chua thü thêm lai(mg) lai ta=2,571) (mg) thêm chuan chuan (mAu.min) (mAu.min) 1 24,98 500757 603190 25,03 100,2 XTB=99,7 % 2 24,98 500757 602209 24,79 99,2 S =0.863 3 24,98 500757 601432 24,60 98,5 e = 0,9059 4 24,98 500757 602216 24,86 99,5 £% =0,9086% 5 24,98 500757 604008 25,23 101,0 trN=0,747 6 24,98 500757 602945 24,97 99,9 y.: là giâ tri thuc (=100%) I ( X TR - u) Ix *Jn tTN =--------------- -------- *Nhân xét: Câc két quâ thuc nghiêm cho thây; - tXN(0,747) Môi truâng nuôi cây: Dùng môi trucmg khâng sinh sô 5 DDVNIII Pepton khô 6,0g Casein pancreatic 4,0g Caomenbia 3,0g Thach 1,0g Nuôc cât 1000g Glucose 10,0g pH sau tiêt trùng 8,0 + 0,2 > Diêu chê dung dich dêm phosphat so 2 ( theo DDVN III) Cân chînh xâc 2 hoat chât sau dây: Dikali hydrophosphat (K2HP04) : 16,75g Kali dihydrophosphat (KH2P04) : 0,523g Thêm 400ml nuôc câ't hôa tan hoàn toàn. Chînh vê pH 8 bàng dung dich acid phosphoric 18N hoâc NaOH 10N và thêm nuôc vùa dü 1000ml. Hâ'p tiêt trùng ô 121°C trong 15 phüt. 31 > Diéu chê dung dich chuan và dung dich thü : * Dieu chê' dung dich chuân Clarithromycin : Cân chînh xâc 51,4mg Clarithromycin chuân (hàm luong 97,28% theo nguyên trang) hôa tan vôi 35ml methanol (TT) trong binh dinh mut 50ml thêm methanol dén vach lâc dêu dë thu duoc dung dich chuân gô'c Clarithromycin . Tù dung dich chuân này tiép tue pha loâng vôi dung dich dêm phosphat 0,1M (cô pH 8,0) dë duoc câc dung dich chuân thi nghiêm cô nông dô 2-4-8 (mcg/ml). * Dung dich chê'phâm thü-. Cân 20 viên chê' phâm, tfnh khô'i luong trung binh viên. Nghiên thành bôt min. Cân chînh xâc mot luong bôt dâ nghiên min tuong duong vôi lOOmg Clarithromycin, hôa tan vôi methanol trong binh dinh mûc 100ml, lâc dêu, thêm methanol dê'n vach sê cô dung dich gô'c vôi nông dô giâ dinh khoâng 1000 mcg/ml. Tù dung dich này tiê'p tue pha loâng vôi dung dich dêm phosphat pH 8,0 dë duoc câc dung dich thü nghiêm cô nông dô Clarithromycin khoâng 2-4-8mcg/ml. > Thuc hiên câc hôp pétri : + Dùng 6 hôp pétri dây bâng phang dà tiêt trùng, dât trên mât phâng nam ngang. Dun chây môi truông dinh luong, dë nguôi dê'n 45°C. Do vào hôp pétri 20ml môi truông chua tiê'p chüng làm lôp nên , dë yên cho môi truông dông dâc. Thêm 5ml môi truông dâ thêm nhü dich chüng vi khuân vôi nông dô 1% so vôi môi truông. Dë yên cho môi truông dông dâc. + Dùng dung eu tao lô thach tao ra trong môi dïa 6 lô cho câch dêu nhau. Nhô lOOmcl câc dung dich khâng sinh thü nghiêm dâ duoc diêu chê' ô trên theo câch bô tri ngâu nhiên. + Thôi gian tién khuyê'ch tân khoâng 30phüt dén lgiô. + Cho vào tü â'm nhiêt dô 37°C ü 16-18giô lâ'y ra do vông khâng khuân bàng mây do vông khâng khuân vôi dô chînh xâc 0,1mm > Tinh toân két quâ bàng phuong phâp thông kê sinh hoc. Két quâ dô lâp lai dinh luong Clarithromycin trong viên nén bàng phuong phâp vi sinh vât trong bâng 6. ( 1 don vi hoat lue cûa Clarithromycin = lmcg ). 32 Bàng 6: Kê't qua khâo sât dô lâp lai cüa phitong phâp dinh luang Clarithromycin trong viên nén Claritab 250mg bàng vi sinh vât. STT Khô'i Khô'i luçmg Phân trâm Hàm luçmg luang cân trung binh hoat % so vôi mâu thü viên (mg) luc(R%) nhân Giôi han (%) (250mg) (mg) 1 174,6 436,5 97,3 91,1 95,5 -104,7 2 174,5 436,5 103,8 103,7 96,9 -103,2 3 174,6 436,5 97,5 97,5 96,4-103,7 4 174,2 436,5 98,7 98,9 97,4 -102,6 5 174,7 436,5 100,9 100,8 97,8 -102,2 6 174,4 436,5 98,3 98,4 96,9-103,2 99,4 Trung bînh 2,438 Dô lêch chuân (S) RSD% 2,452 2.2.2.2. Dânh giâ ket qua thü nghiêm dinh luang Clarithromycin trong viên nén bàng phitong phâp vi sinh vât: Thi nghiêm dat duac câc dieu kiên: + Hoat lue cüa châ't thü gàn sât vôi thuc tê' dë kê't qua doc duac nàm trong pham vi ducmg cong chuân. + Dô dô'c cüa ducmg biëu diên logarit nông dô vôi ducmg kmh vông vô khuân phâi cô ÿ nghîa. + Câc ducmg biëu diên logarit nông dô cüa châ't thü và châ't chuân vôi ducmg kmh vông vô khuân phâi song song. 33 + Trong khoâng nông dô dà chon su phu thuôc gifla logarit cüa nông dô vôi duông kfnh vông vô khuân tuong üng là tuyê'n tfnh. + Sai sô thtr nghiêm: vôi e < 5% 2.2.23. Nhân xét phuong phâp dinh luong Clarithromycin bàng vi sinh vât : Dinh luong Clarithromycin bàng vi sinh vât dê mâc nhiéu nguyên nhân gây sai sô do nhüng yê'u tô' ânh huông dê'n vùng ûc chê' và kê't quâ xâc dinh hoat lue khâng sinh nhu sau: ■ Vi sinh vât chî thi: Vi sinh vât dùng trong dinh luong phâi nhây câm vôi khâng sinh thü, phâi thuàn chüng và duoc nuôi câ'y trong nhüng diêu kiên thfch hop (dinh duông, nhiêt dô, pH). Trong quâ trïnh nuôi câ'y, bâo quân vi sinh vât chî thi cô thé bi nhiêm tap khuân hoâc chuyën thành nhüng dang cô suc dê khâng cao hon dô'i vôi khâng sinh thü. Mot su tap nhiêm à mûc nhe cüa chüng chî thi cüng dü gây ra sai sô lôn. ■ Khâng sinh thü và khâng sinh chuân: Phâi dông nhâ't vê tac dung sinh hoc, tan tôt trong dung môi thfch hop, cô khâ nâng khuyê'ch tân cao. ■ Môi truông nuôi câ'y : - Thach : Thach dùng dinh luong chon loai tinh khiê't, - Thành phân dinh duông cüa môi truông :cô thé không chê' toc dô phât triën cüa VSV de tao duoc vùng ire chê' cô kfch thuôc mong muô'n ■ Dô khô cüa thach ■ pH môi truông: Câc khâng sinh khâc nhau thuông cô su on djnh và giü duoc hoat lue à pH hàng dinh thfch hçfp. ■ Câc muô'i hôa tan làm tâng khâ nâng khuyê'ch tân cüa khâng sinh. ■ Chiêu dày lôp thach: Chiêu dày cüa lôp thach tâng lên thï vùng üc chê' së nhô di và nguoc lai. Nhung lôp thach quâ dày hoâc quâ mông dêu dân dê'n quan hê giüa dâp üng và liêu luçmg không côn tuyê'n tfnh nüa. Chiêu dày lôp thach tù 2-4mm là thfch hôp. 34 ■ Nhiêt dô ü: Nhiêt dô ü phâi dëu vôi tâ't câ câc dîa thî nghiêm. Nhiêt dô ü ành huông truc tiép dén hê sô khuyê'ch tân, tî lê moc cüa vi khuàn mot yê'u tô quyê't dinh cho viêc tao vùng ûc ché. ■ Thôi gian tiën û và tiên khuyê'ch tân: 9 ■ Anh huông cüa sô luong dich chüng mang câ'y truyên: - Khi nhü dich tiép chüng ban dâu cô nông dô khâ lôn thî vông vô khuân rat nhô, không rô ràng. Kê't quâ dinh luçmg không chmh xâc. - Néu luong vi sinh vât loâng quâ, vùng vô khuân sê cô kîch thuôc lôn, vi sinh vât lai moc thua, vî vây mép vông vô khuân cüng không rô ràng. ■ Câc nguyên nhân sai sô' khâc khi thuc hiên thî nghiêm: - Môi truông và dung eu làm thi nghiêm bi nhiêm khuân - Sai sô' khi doc duông kmh vông vô khuân. - Duc lô thach bi sut me. - Bê mât dô thach không duoc tuyêt dô'i bàng phâng - Bê mât khay dât trong tü â'm không phâng. - Sai sô' kîch thuôc câc dîa pétri. * Kê't luân: Cô nhiêu yê'u tô anh huông tôi kê't quâ thi nghiêm theo phuong phâp vi sinh vât Vi vây dë thu duoc kê't quâ chmh xâc, nguôi làm thî nghiêm càn tim hiëu kÿ tùng yéu tô, trânh nhûng sai sô' dâng tiê'c hoâc cô thë tu diêu chînh kÿ nâng thuc hành thi nghiêm dë dat duoc dô chmh xâc cüa phép thü. 2.2.3. So sânh hai phuong phâp dinh luong Clarithromycin trong viên nén bàng HPLC và Vi sinh vât. 2.2.3.1. So sânh két quâ dô lâp lai cüa hai phuong phâp dinh luong: Câc tînh toân duoc thuc hiên trên câc kê't quâ thu duoc khi dinh luong viên nén bao phim Claritab do Công ty Duçfc -TTBYT Bînh Dinh sân xuât. Tôm tât kê't quâ thu duoc khi dinh luçmg viên nén bao phim Claritab bàng hai phuong phâp ô bâng 7. 35 Bàng 7: Tôm tât câc kê't quâ thuc nghiêm thu duofc khi dinh luong viên nén bao phim Claritab Phuong phâp Hàm luong Phuong sai Dô lêch chuân Solân thi trung binh (S2) (S) nghiêm (%) HPLC 102,1 0,2079 0,456 6 Vi sinh vât 99,4 5,513 2,438 6 Dùng chuan F(Fisher): Ftn = S,2/S22 Ftn = 5,513/0,2079= 26,51 S! : là dô lêch chuân cüa phuong phâp HPLC S2 : là dô lêch chuân cüa phuong phâp vi sinh vât. F,t (ô mire tin cây 95% khi bâc tu do K,= 6-1=5; K2=6-l=5 )là : 5,05 Nhu vây Ftn(26,51)>Flt (5,05)do do dô lâp lai cüa 2 phuong phâp dinh luong Clarithromycin trong viên nén khâc nhau cô y nghîa thô'ng kê, không thé so sânh hai giâ tri trung binh (Test T). Phuong phâp HPLC cô dô lâp lai cao hon . 2.23.2. Dânh giâ uu nhuoc âiêm cüa hai phuong phâp dinh luong Clarithromycin trong viên nén > Phuong phâp HPLC: • Uu diëm cüa phuong phâp HPLC là: + Dô dung và dô lâp lai cao, thài gian phân tich ngân, cô thë xâc dinh câc châ't à hàm luong nhô do cô khâ nâng phât hiên câc châ't rat nhay vé dinh tînh và dinh luong nhè khâ nâng phân tâch câc chat vôi hiêu nâng cao. VI vây phuong phâp dâ và dang duoc üng dung rông râi trong câc ngành phân tich. 36 + Trânh duoc câc sai so hê thông do mây môc cô thë chuân hoâ duoc và giâm duoc nhiëu sai sô' khâc do thao tac thf nghiêm don gian. + Dinh luçmg dông thôi duoc câc thành phân trong hôn hôp mà không qua chiê't tâch. • Nhuoc diêrn: + Hiên nay mây HPLC giâ thành vân côn cao + Câc loai dung môi và hôa châ't dùng cho phuong phâp này phâi là tinh khiê't dùng cho HPLC. Do dô giâ thành dë phân tfch kiëm nghiêm mâu bàng HPLC là rât cao. + Kê't quâ dinh luçmg chî phân ânh vê luçmg khâng sinh cô trong mâu thü mà không phân ânh duoc hoat lue cüa no. > Phuong phâp dinh luçmg khâng sinh bàng vi sinh vât: • Üu diëm cüa phucmg phâp Vi sinh vât là: + Râ't nhay câm, nên cô thë xâc dinh à hàm luçmg nhô. + Phân ânh duoc hoat lue cüa khâng sinh. + Râ't thich hop dô'i vôi khâng sinh. + Không dôi hôi thiê't bi mây môc dât tién + Hôa châ't, môi truèfng dë dinh luçmg ré tiën,dê kiëm. + Chi phi dë dinh luçmg khâng sinh bàng phuong phâp này thâp. + Phù hop vôi co sô kiëm nghiêm chua cô mây HPLC • Nhuoc diëm cüa phuong phâp là: + Dê mâc nhiêu nguôn sai sô dân dê'n dô dung, dô lâp lai thâ'p và phu thuôc nhiëu vào kÿ nâng thao tâc và kinh nghiêm cüa nguôi thuc hiên thf nghiêm. Châng han khi kê't quâ thf nghiêm thu duoc nhung không thoâ mân mot trong câc diéu kiên qui dinh thi kê't quâ dinh luçmg dô không cô giâ tri. 2.2.4. Âp dung hai phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong mot sô chê phâm viên nén Clarithromycin : Kê't quâ duoc trinh bày trong bâng 8. 37 Bâng 8: Két quâ dinh luong Clarithromycin trong môt so chê pham viên nén Két quâ dinh luçmg STT Tên mâu Nhà sân xuât PP HPLC PP vi sinh vât 1 Claritab CTD & TTBYT SKS: 0306 Binh Dinh TB: 102,1% TB: 99,4% 98,4% 96,0% 99,0% 97,4% TB: 98,7% TB: 96,7% HD: 0609 2 Clathrimax SL: 0605002 CtyTNHHSPM HD: 0508 3 Clarithromycin Pharmaniaga 96,28% 97,1% SL: 5L.8847 Malaysia 96,84% 95, 3% TB: 96.6% TB: 96,2% 98,4% 100,2% 98,6% 99,0% TB: 98,5% TB: 99,6% HD: 0908 4 Clarithromycin SL:6027002 CTy TNHH Dông Nam HD:052008 5 Clarithromycin CTCPDP 98,0% 98,2% SL:020706 Hâu Giang 97, 9% 99,2% TB: 97,9% TB: 98,7% HD: 022008 * Nhân xét : - Qua khâo sât mot so chë phâm viên nén Clarithromycin chüng tôi thây vân cô su chênh lêch két quâ dinh luong bâng 2 phuong phâp HPLC và Phuong phâp vi sinh vât. Và dô sai khâc cüa 2 kê't quâ cùng mot mâu cüa phuong phâp vi sinh vât lôn hon cüa phuong phâp HPLC. - Cùng vôi két quâ khâo sât mâu Claritab ô phàn trên chüng tô dô lâp lai cüa phuong phâp vi sinh vât kém hon cüa phuong phâp HPLC. 38 - Tuy vây, môi phuong phâp dêu cô uu nhuoc diém riêng. Do dô trên thuc te cüa công tac kiëm nghiêm thuôc, tuy theo dieu kiên trang thiët bi cüa phông thf nghiêm mà cô thë thuc hiên dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén theo mot trong hai phuong phâp trên. Nëu co sà cô mây sâc kÿ long hiêu nâng cao thï nên sü dung phuong phâp này dë cô thë tiên hành nhanh chông, don gian mà dat duoc kët quâ chfnh xâc hon, tâng luçmg mâu kiëm tra duoc lên nhiêu lân. Tuy vây nëu không cô thiët bi sâc kÿ long hiêu nâng cao thi cô thë dùng phuong phâp vi sinh vât, no phân ânh duoc hoat lue cüa Clarithromycin mâc dàu phâi châp nhân nhûng kët quâ dinh luçmg và dô chfnh xâc không cao. 39 KÉT LUÂN Trong quâ trinh thuc hiên khôa luân tôi dâ thu duffc câc kët quâ hoc tâp sau: + Hiëu duoc cor sô lÿ thuyê't cüa phuong phâp sâc kî long hiêu nâng cao, mot phuong phâp phân tich hiên dai cô nhiêu üng dung trong kiê’m nghiêm thuôc và câc ngành khâc, biê't sü dung thành thao câc thao tâc co bân cüa mây HPLC. + Biê't câch dânh giâ mot phuong phâp dinh luong + Hiêu duoc co sô lÿ thuyê't và thuc hành thành thao phuong phâp dinh luong khâng sinh bàng phuong phâp vi sinh vât, tim hiëu duoc nhüng nguyên nhân ânh huông dê'n kê't quâ dinh luong bàng phuong phâp vi sinh vât. + Biê't câch nghiên cüu, tra cüu, tim tài liêu tham khâo và hoàn thành mot dê tài nghiên cüu khoa hoc. + Biê't câch dânh giâ so sânh 2 phuong phâp dinh luong khâc nhau bàng phuong phâp thô'ng kê. Và phân tich câc uu nhuoc diëm cüa tirng phuong phâp. + Trong quâ trinh thuc hiên khôa luân chüng tôi dâ thu duoc câc kê't quâ nghiên cüu sau: Dinh luong bàng phuong phâp HPLC: Hàm luong clarithromycin dat 102,1% ; vôi RSD% = 0,447% Dinh luong bàng phuong phâp vi sinh vât: Hàm luong clarithromycin dat 99,4% ; RSD% = 2,452% Dô lâp lai cüa hai phuong phâp khâc nhau cô ÿ nghîa thô'ng kê. Phuong phâp HPLC chrnh xâc hon phuong phâp vi sinh vât vi cô RSD% nhô hon. - Tuy vây bàng thuc nghiêm chüng tôi dâ chüng minh duoc râng tuÿ theo diêu kiên trang thiê't bi cüa co sô kiëm nghiêm mà cô thë âp dung môt trong hai phuong phâp trên dë dinh luong Clarithromycin trong viên nén. * Mot so y kiên de xuât: Tiê'p tue khâo sât nghiên cüu dày dü hon nüa dë cô co sô lua chon phuong phâp dinh luong Clarithromycin trong viên nén dua vào Duoc diën Viêt Nam trong làn xuât bân tôi. 40 TÀI LIEU THAM KHÂO TIÉNG VIÊT 1. Bô môn Công nghiêp Duoc- (2006). Giâo trînh Kÿ thuât sân xuâ't Duac phâm tâp II - Kÿ thuât sân xuâ't thuôc bàng phuong phâp sinh tong hop; Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi ; tr.91-93 2. Bô môn Duoc lÿ - (2004) Giâo trînh Duoc lÿ - Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi tr.136 3. Bô môn Hôa Duoc - (2004) Giâo trinh Hôa duoc ; Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi; tr.232-238 / 4. Bô môn Hôa phân tich - (2004) Giâo trînh Kiëm nghiêm thuô'c; Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi; tr. 83-98, tr .122-128 5. Bô môn Hôa phân tich - (2005). Giâo trînh Hôa phân tîch tâp 1; Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi tr.29-44. 6. Bô môn Hôa phân tîch - (2004). Giâo trinh Hôa phân tîch tâp 2; Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi; tr.60-84. 7. Bô Y tê' (2002) Duoc diën Viêt Nam III, nhà xuâ't bân Y hoc, Hà Nôi; PL84PL85; PL 149-PL174; PL 194-PL201. 8. Bô Y tê' (2002) Duoc thu Quô'c gia Viêt nam,lân xuâ't bân thu: nhâ't, Nhà xuâ't bân Y hoc Hà Nôi, trang 283-284 9. Công ty CPDP Domesco (2004) ; Tiêu chuân ca sô Viên bao phim Clarithromycin 250mg 10. Công ty CPDP Hâu Giang (2004) ; Tiêu chuân ca sô Viên bao phim ClaBact 11. Cty Duoc Quâng Binh (2005) ;Tiêu chuân ca sa Viên bao phim Clarithromycin 250mg 12. CTyTNHH DP SPM (2005) Tiêu chuân ca sa Viên bao phim Clarithrimax 13. Bùi Xuân Dông; Chu Thi Lôc - Bô môn Vi Sinh hoc - Truông Dai hoc Duoc Hà Nôi (2004) - Kiëm nghiêm thuô'c bàng phuong phâp vi sinh vât; tr.23-31. 14. Nguyên Duy Khang-Truông phông vi sinh-Viên Kiëm nghiêm thuô'c TW(2005)Phuong phâp vi sinh vât âp dung trong kiëm nghiêm thuô'c-mÿ phâm. 15. Nguyên Duy Khang - Trucmg phông vi sinh - Viên Kiëm nghiêm thuôc Trung uong-Thông bao kiëm nghiêm sô 4/1995 -“Tim hiëu công thüc tmh hoat lire khâng sinh bàng phuong phâp vi sinh vât.” trang 22 16. Thâi Phan Quÿnh Nhu - Viên Kiëm nghiêm thuôc Trung Uüng. (2005) Phuong phâp phân tfch bàng sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC). 17.Dào Hùng Phi - Viên Kiëm nghiêm thuôc Trung uong (1996)-“Tài liêu tâp huân Kÿ thuât kiëm nghiêm thuôc “ 18. Lê Tan Phüc - Truông khoa Vi sinh - Viên kiëm nghiêm thuôc TP. HCM (2006) - “Tài liêu tâp huân dinh luong khâng sinh bàng phuong phâp vi sinh vât.” 19. Nguyên Thi Tâm, Nguyên Thi Kim Xuân, Trinh Vân Lâu - Viên Kiëm nghiêm thuôc Trung uong- Tap chf kiëm nghiêm thuôc sô 4/2004 tr.22-“Dinh luong Azithromycin trong chê' phâm viên nén bàng PP HPLC.” TIÉNG ANH 20. British pharmacopoeia 2005, vol 1, p. 392 21. Gorge Lunn and Norman R.Schmuff - HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis- A Wiley-Interscience publication John Wiley&sons.Inc - p.370 22. Japan Pharmacopoeia XIV (2001), parti, p.367-368. 23. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2000),vol II, p. 167-169; A-77 24. The United states Pharmacopoeia 28, vol I, p.487-488 Scientific Sofwarejnc. EZChrom Elite Client/Server Vial Summary Report Sequen name : Analyst: Vial: Clarithromycin.DT.Seq Truong Thi Thu Huong 0 UV-Vis Data Description Clarithromycin.DTHOO 1-Rep 1.dat Clarithromycin.DTH 001-Rep2.dat Clarithromycin.DTH 001-Rep3.dat Clarithromycin.DTH 001-Rep4.dat Clarithromycin.DTH 001-Rep5.dat Clarithromycin.DTH 001-Rep6.dat Clarithromycin.DTTOOl- Rep 1.dat Clarithromycin.DTTOOl- Rep2.dat Clarithromycin.DTT002- Rep 1.dat Clarithromycin DTT002- Rep2.dat Clarithromycin DTT003- Rep 1.dat Clarithromycin.DTT003- Rep2.dat Clarithromycin.DTT004- Rep 1.dat Clarithromycin.DTT004- Rep2.dat Clarithromycin.DTT005- Rep 1.dat Clarithromycin.DTT005- Rep2.dat Clarithromycin DTT006- Rep 1.dat Clarithromycin DTT006- Rep2.dat Clarithromycin.DLL 001- Rep 1.dat Clarithromycin.DLL 001- Rep2.dat Clarithromycin.DLL 002- Rep 1.dat Clarithromycin.DLL 002- Rep2.dat Clarithromycin.DLL 003- Repl.dat Clarithromycin.DLL 003- Rep2.dat Clarithromycin.DLL 004- Repl.dat Clarithromycin.DLL 004- Rep2.dat Clarithromycin.DLL 005- Repl.dat Clarithromycin.DLL 005- Rep2.dat Clarithromycin.DLL 006- Rep 1.dat Clarithromycin.DLL 006- Rep2.dat 02-Apr-07 02:29:07 PM Clarithromycin Area 513198.00 515227.00 511349.00 512516.00 514769.00 508854.00 130337.00 128678.00 255138.00 254787.00 511461.00 509845.00 1034295.00 1029231.00 1519169.00 1516418.00 2028888.00 2034465.00 500750.00 500850.00 500796.00 500700.00 505449.00 505649.00 500825.00 500603.00 500827.00 501973.00 503512.00 503744.00 Clarithromycin Rétention Time 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.62 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 3.59 Scientific Sofwarejnc. EZChrom Elite Client/Server Vial Summary Report Sequen name : Analyst: Vial: Clarithromycin.DT.Seq Truong Thi Thu Huong 0 UV-Vis Data Description Clarithromycin.DD 001- Repl.dat Clarithromycin.DD 001- Rep2.dat Clarithromycin.DD 002- Repl.dat Clarithromycin.DD 002- Rep2.dat Clarithromycin.DD 003- Repl.dat Clarithromycin.DD 003- Rep2.dat Clarithromycin.DD 004- Repl.dat Clarithromycin.DD 004- Rep2.dat Clarithromycin.DD 005- Repl.dat Clarithromycin.DD 005- Rep2.dat Clarithromycin.DD 006- Repl.dat Clarithromycin.DD 006- Rep2.dat Clarithromycin.DD 006- Repl.dat Clarithromycin.DD 006- Rep2.dat 02-Apr-07 02:29:07 PM Clarithromycin Area 603798.00 602582.00 601899.00 602519.00 600543.00 602321.00 601628.00 602804.00 603592.00 604424.00 602549.00 603341.00 500787.00 500737.00 Clarithromycin Rétention Time 3.58 3.58 3.58 3.58 3.58 3.59 3.58 3.59 3.58 3.59 3.58 3.59 3.59 3.59 BÂO CÂO KÉT QUÂ PHÂN TICH HPLC Thiet bi phân tîch: EZCHROM ELITE Version 3.1.6 Ngirôi phân tîch: Trtfdng Thi Thu Hitông Mâu phân tîch: Clarithromycin chuan Ngày phân tîch: 27-Mar-07 9:45:56 AM Phutfng phâp phân tîch: D:\HPLC data 2005\Khang sinh\M ethod\Clarithromycin.met LiTu trû” dïï liêu: D:\HPLC data 2005\Khang sinh\Data\Cal_Clarithromy cin.dtOO 1-Rep 1.dat Ngày in dCf liêu: 03-Apr-07 03:09:20 PM Côt RP-18(125cmx4cmx5mcm) M P:KH2P04 0.067M :M ethnol(35:65),pH4 UV:210nm Nhiêt dô:50 dô C v = lm l/phüt V= 20mcl Dung dich chuâ’n : 124,91 mcg/ml mAU r 15 Minutes UV-VIS Results Name Rétention Area Time Clarithromycin chuan 3.620 Theoretical plates Asymmetry (USP) 513198 2849 1.25088 BÂO CAO KÊT QUÂ PHÂN TICH CUA HPLC mAU Thietbi phân tich: EZCHROM ELITE Version 3.1.6 Ngiïôi phân tich: Truüng Thi Thu Hifdng Mâu phân tîch: Clarithromycin thiî Ngày phân tîch: 27-Mar-07 1:37:55 PM PhuWng phâp phân tîch: D:\HPLC data 2005\Khang sinh\Method\Clarithromycin.met Liïu trtf dû1lieu: D:\HPLC data 2005\Khang sinh\Data\Clarithromycin.DLL002-Rep2.dat Ngày in dû’ lieu: 03-Apr-07 03:05:11 PM Côt RP-18(125cmx4cmx5mcm) MP:KH2P04 0.067M:Methnol(35:65),pH4 UV:210nm Nhiêt dô:50 dô C v = lml/phüt V =20m cl Dung dich thü: 120mcg/ml Minutes UV-VIS Results Name Rétention Time Area Theoretical plates Asymmetry _________________________________________________________________ (USP)_____________ 2957 1.29101 3.587 501588 Clarithromycin HÔ s d PHÂN TICH Tên mâu: Viên nén bao phim Claritab( Clarythromycin 250 mg) SKS: 0306 HD:0609 NSX : CTDTTBYT Binh Dinh Nguài thuc hiên: Truông Thi Thu Huiông 6X6 ASSAY (3-LEVEL . SINGLE TEST) DATE 28/3/2007 PATERN 8 MEASURED RESPONSES 22.20 20.00 17.20 17.30 22.40 19.90 20.00 17.20 22.50 17.40 19.80 17.20 22.20 20.00 22.40 17.20 22.50 17.30 22.50 19.80 19.80 20.00 22.40 19.80 17.40 22.20 22.20 19.80 17.50 19.70 17.20 17.00 19.70 17.40 22.50 22.20 UNSCRAMBLED RESPONSES SH SM SL TH TM TL 22.20 22.20 22.20 22.50 22.50 22.20 19.90 20.00 19.80 20.00 19.80 19.80 17.20 17.00 17.20 17.50 17.40 17.20 22.40 22.50 22.40 22.50 22.40 22.20 20.00 20.00 19.70 19.80 19.70 19.80 17.30 17.20 17.30 17.40 17.40 17.20 TOTAL 133.80 119.30 103.50 134.40 119.00 103.80 MEAN 22.30 19.88 17.25 22.40 19.83 17.30 Measured responses: Total row 119.00 118.90 118.60 119.70 119.20 118.40 Square Total column 14161.00 14137.21 14065.96 103.50 133.80 119.30 14328.09 14208.64 14018.56 134.40 119.00 103.80 Square Total 36 responses 17902.44 14232.49 10712.25 713.80 18063.36 14161.00 10774.44 Square of each response: 492.84 396.01 492.84 400.00 492.84 392.04 506.25 400.00 392.04 506.25 492.84 392.04 Total 2983.86 2372.13 14308.18 Total of total 295.84 501.76 289.00 506.25 295.84 501.76 306.25 506.25 302.76 501.76 295.84 492.84 1785.53 3010.62 400.00 299.29 400.00 295.84 388.09 299.29 392.04 302.76 388.09 302.76 392.04 295.84 2360.26 1795.78 155.112 Total SSQ= 0.176 Between dish SSQ= 154.596 Between doses SSQ= 0.341 Error SSQ= 0.010 Between Préparations SSQ= 154.534 SSQ due to Régression = 0.004 SSQ for Parallelism = 0.016806 SQ for Quadratic Curvature SQ for Différence of Quadratic 0.031250 Curvatures between Preparations= 2.5375 Différence due to Dose E= 0.033333 Différence due to sample F= 2.000000 Ratio of Doses (I) = 0.30103 Log Ratio of Doses = 8.429393 Slope b= 0.0039544 Log Potency Ratio M= 1.009147 Potency ratio= 0.000021 V(M)= 46865.268 Assay weight= 0.004619 S(M)= Limit: Logarithm of Percentage confidence 2.0095 Upper= 1.9905 Lower= Corresponding confidence limit are: 102.22 Upper= 97.83 Lower= 0.013470 Log potency Ratio M-upper= 1.031502 Potency Ratio of M-upper= Log potency Ratio M-lower= -0.005561 0.987 Potency Ratio of M-lower= 6X6 ASSAY (3-LEVEL . SINGLE TEST) 1000 ASSUMED POTENCY Ul/m g ANALYSIS OF VARIANCE REDUCED SOURCE OF Df PREPARATIONS 0.010000 F-RATIO SQUARES SSQ VARIATION MEAN 1 CRITICAL F-RATIO 0.010000 0.7329 7.77 p=0.01 MAX p=0.01 MIN REGRESSION 154.53375 1 154.5338 11325.7634 7.77 PARALLELISM 0.003750 1 0.003750 0.2748 4.24 p=0.05 MAX CURVATURE 0.016806 1 0.016806 1.2317 4.24 p=0.05 MAX OPP. CURVATURE 0.031250 1 0.031250 2.2903 4.24 p=0.05 MAX ESTIMATION OF RESIDUAL ERROR SOURCE OF VARIATION REDUCED Df MEAN SQUARES SSQ DOSES 154.59556 5 30.9191 DISHES 0.175556 5 0.035111 ERROR 0.341111 25 0.013644 TOTAL 155.11222 35 RELATIVE POTENCY LOWER LIMIT 1.0091 0.9873 ABSOLUTE POTENCY LOWER LIMIT 1009.1 987.3 F-RATIO F-RATIO 2266.0586 2.5733 UPPER LIMIT 97.8% 1.0315 CRITICAL 3.85 p=0.01 MIN 3.85 p=0.01 MAX STATISTICAL WEIGHT 102.2% UPPER LIMIT 1031.5 Két luân : Phân tràm hoat lue cüa clarithromycin là 100,9% 46865.3 [...]... Kột quõ dụ lõp lai dinh luong Clarithromycin trong vi n nộn bng phuong phõp vi sinh võt trong bõng 6 ( 1 don vi hoat lue cỷa Clarithromycin = lmcg ) 32 Bng 6: Kờ't qua khõo sõt dụ lõp lai cỹa phitong phõp dinh luang Clarithromycin trong vi n nộn Claritab 250mg bng vi sinh võt STT Khụ'i Khụ'i luỗmg Phõn trõm Hm luỗmg luang cõn trung binh hoat % so vụi mõu thỹ vi n (mg) luc(R%) nhõn Giụi han (%) (250mg)... pic cụ trong sõc dụ Trong HPLC, phuong phõp ny chợ dung khi cụ su dõp ỷng cỹa detector trờn tõ't cõ cõc chõ't l nhu nhau, nờ'u nhu khụng nhu nhau khi dụ vụi mụi chõ't cn cụ hờ sụ' hiờu chợnh 1.3.2 Phuong phõp dinh luang khõng sinh bng vi sinh võt:[l] ,[4] ,[7],[ 13], [14] [15], [18], [23], 1.3.2.1 Khai quõt vờ phuong phõp dinh luỗmg khõng sinh bng vi sinh võt: 11 Phuong phõp vi sinh võt l mụt trong. .. kiởm nghiờm thuục, dõc biờt l thuục da thnh phn 30 2.2.2 Thuc nghiờm dinh luong Clarithromycin trong vi n nộn bng Phuong phõp vi sinh võt 2.2.2.I Lua chon dieu kiờn thuc nghiờm phuong phõp vi sinh võt dộ dinh luong Clarithromycin trong vi n nộn: Tham khõo Duoc diởn Trung Quụ'c 2000 v tiờu chuõn nh sõn xuõt Vi n nộn bao phim Clarithromycin 250mg cỹa Cụng ty CPDP Domesco, Cty Duoc Quõng Bợnh Chỹng tụi lua... khõc khụng nh huụng dộn kột quõ thi nghiờm + Rõt thfch hỗfp dụi vụi khõng sinh, cõc chõt diờu chờ' tựr vi sinh võt, cõc vitamin v cõc acid amin trong hụn hỗfp + Phuong phõp xõc dinh hoat lue khõng sinh bng vi sinh võt dõ duỗfc nghiờn cỹru nhiờu vờ l thuyờ't v thuc hnh Dở xõc dinh hm luỗmg cỹa cõc khõng sinh, thuụng õp dung pho bien hai phuong phõp: Phuong phõp khuyờ'ch tõn v Phuong phõp do dụ duc Dụi vụi... nghiờn cỹu: Clarithromycin: Chõ't chuõn hm luỗmg: 97,28% tinh theohiờn trang Dụ õm:l,26% do Vi n kiởm nghiờm thuục TW sõn xuõt Mot sụ lụ chộ phõm vi n nộn Clarithromycin: - Vi n nộn bao phim Claritab 250mg, So lụ SX: 0306 ; HD: 06.09 Nai sõn xuõ't: Cụng ty Duoc-TTBYT Binh Dinh - Vi n nộn bao phim Clarthrimax 250mg, Sụ lụ SX: 0605002; HD: 0508 Nai sõn xuõ't: Cụng ty TNHH SPM - Vi n nộn bao phim Clarithromycin. .. nghiờm: HPLC, Vi sinh võt 22 2.2 KấT QU THUC NGHIấM V NHN XẫT 2.2.1 Kờ't quõ thiic nghiờm dinh luong Clarithromycin trong vi n nộn 2.2.1.1 Lua choit dieu kiờn sõc ky de dinh luong Clarithromycin trong vi n nộn bng HPLC: Tham khõo USP 28, BP2005, JP 2001 cõc dieu kiờn sõc k dinh luỗmg Clarithromycin (ghi trong bng 1) Bng 1 : Cõc dieu kiờn sac ky tham khõo Ti lieu [20] [21] [22] [24] Pha dụng Acetonitril-... luang Clarithromycin trong vi n nộn bng phitong phõp vi sinh võt: Thi nghiờm dat duac cõc dieu kiờn: + Hoat lue cỹa chõ't thỹ gn sõt vụi thuc tờ' dở kờ't qua doc duac nm trong pham vi ducmg cong chuõn + Dụ dụ'c cỹa ducmg biởu diờn logarit nụng dụ vụi ducmg kmh vụng vụ khuõn phõi cụ nghợa + Cõc ducmg biởu diờn logarit nụng dụ cỹa chõ't thỹ v chõ't chuõn vụi ducmg kmh vụng vụ khuõn phõi song song 33... thnh mot vựng ire chờ' hợnh trụn Do v so sõnh vựng uc chờ' cỹa khõng sinh thir v khõng sinh chuõn trong cựng mụt diờu kiờn + Dựng phuong phõp thụng kờ số tmh toõn duỗfc hoat lue cỹa khõng sinh thỹ 1.3.2.3 Nguyờn l khuyờch tõn dudng ngang: Theo Cooper trong truụng hoip khõng sinh khuyờ'ch tõn tự mụt diởm nhu tự ụ'ng tru, khoanh giõ'y tõm hoõc lụ dung dung dich khõng sinh vo mụi truụng thach dinh duụng... quõ HPLC + Phn mờm xỹ l kột quõ vi sinh võt + Cõc dung eu thỹy tinh: Pipet, autopipet, bợnh dinh mỹc, binh non, phờu loc: Dat yờu cõu dựng cho kiởm nghiờm thuụ'c 2.1.2 Phuong phõp nghiờn cỷu: > Nghiờn cỷu trờn l thuyờ't v ti liờu tham khõo dở lua chon phuong phõp phõn tich > Bng thuc nghiờm, dua vo kờ't quõ thu duoc, xỹ l thụng kờ v rut ra kột luõn > Phuong phõp sỹ dung trong thuc nghiờm: HPLC, Vi sinh. .. 0,36%, sụ rợùa l thuyờ't = 2867, hờ sụ dụi xỹng T = 1,292, dờu nm trong giụi han cho phộp chỹng tụ vi c tõch Clarithromycin cỹa hờ thụng sõc k thich hop tụt - RSD cỹa tR v RSD cỹa diờn tfch pic nhụ do dụ dõm bo duoc tfnh thfch hop cỹa hờ thụng > Khdo sõt tinh õac hiờu cỹa phitang phõp + Mõu trng: Cụ thnh phõn gụm cõc tõ duac cụ trong vi n nộn Clarithromycin dem kho sõt Tinh bụt bõp : 0,107g Aerosil : 0,00086g ... dinh luỗmg Clarithromycin / vi n nộn bng HPLC 23 2.2.2 Kờ't quõ thuc nghiờm dinh luỗmg Clarithromycin/ vi n nộn bng Vi sinh võt.31 2.2.3 So sõnh hai phucmg phõp dinh luỗmg Clarithromycin vi n nộn... phuong phõp dinh luang Clarithromycin vi n nộn bng vi sinh võt So sõnh phuong phõp dinh luỗmg Clarithromycin vi n nộn bng HPLC v bng Vi sinh võt Phõn TễNG QUAN 1.1 TễNG QUAN Vấ CLARITHROMYCIN 1.1.1... phõp dinh luang khõng sinh bng vi sinh võt:[l] ,[4] ,[7],[ 13], [14] [15], [18], [23], 1.3.2.1 Khai quõt vờ phuong phõp dinh luỗmg khõng sinh bng vi sinh võt: 11 Phuong phõp vi sinh võt l mụt nhỹng