TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ MINH LUÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA ĐỆM LÓT CHUỒNG NUÔI GÀ CÓ BỔ SUNG MEN VI SINH BALASA N01 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH THÚ Y CẦN THƠ - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA ĐỆM LÓT CHUỒNG NUÔI GÀ CÓ BỔ SUNG MEN VI SINH BALASA N0.1 Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Ths BÙI THỊ LÊ MINH LÊ MINH LUÂN MSSV: LT11655 Lớp: CN1167L1 Cần Thơ - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài “ Đánh giá hiệu quả của đệm lót chuồng nuôi gà có bổ sung men vi sinh Balasa N01”. Do sinh viên Lê Minh Luân thực hiện tại trại gà thực nghiệm thuộc Quận Bình Thủy Thành phố Cần Thơ, phòng vi trùng và miễn dịch của Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013 Cần Thơ,ngày…tháng…năm 2013 Duyệt Bộ Môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn Bùi Thị Lê Minh Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013 Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình luận văn nào trước đây. Tác giả luận văn Lê Minh Luân ii LỜI CẢM ƠN Sinh ra và lớn lên trong một gia đình nay tôi rất tự hào và sung sướng khi sắp hoàn thành chương trình đào tạo đại học của mình, với một niềm vui thật khó tả. nghèo khó lại đông anh em, ước mơ vào giảng đường đại học đối với tôi thật khó thực hiện. Tuy không được học liên tục như các bạn cùng trang lứa, nhưng hôm Lời cảm ơn đầu tiên con xin cảm ơn Cha, Mẹ, Người đã sinh ra con, luôn dìu dắt và ủng hộ con mỗi khi con vấp ngã, luôn tạo điều kiện tốt nhất cho con tiếp tục đến trường. Cha Mẹ luôn là mục tiêu, là động lực để con vượt qua khó khăn thử thách trong cuộc sống. Xin trân trọng cảm ơn Cô Bùi Thị Lê Minh đã tận tình, hết lòng chỉ bảo động viên và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy Trần Ngọc Bích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài này và theo sát tôi trong suốt những năm học vừa qua, cùng tất cả quí Thầy Cô, thuộc Bộ môn Thú Y khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, đã tận tình truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi trong suốt quá trình học tập. Xin chân thành cảm ơn Chủ trại gà, chú Nguyễn Văn Hoàng và gia đình đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cùng tất cả các bạn lớp thú y liên thông khóa 37 đã giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt 2 năm qua. Xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC Trang duyệt ...........................................................................................................i Lời cam đoan ........................................................................................................ii Lời cảm ơn ............................................................................................................iii Mục lục .................................................................................................................iv Danh mục chữ viết tắt ...........................................................................................v Danh mục sơ đồ - hình ..........................................................................................vi Danh mục bảng .....................................................................................................vii Tóm lược...............................................................................................................viii Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................1 Chương 2.CƠ SỞ LÍ LUẬN..................................................................................2 2.1 Vi sinh vật trong chuồng nuôi..........................................................................2 2.1.1 Vi khuẩn hiếu khí..........................................................................................2 2.1.2 Coliform ......................................................................................................2 2.1.3 Escherichia coli............................................................................................3 2.2 Giới thiệu về đệm lót lên men..........................................................................6 2.2.1 Vai trò của các loại sinh vật trong đệm lót lên men ......................................6 2.2.2 Các nhóm vi sinh vật có trong đệm lót ..........................................................6 2.2.3 Vai trò của nguyên liệu làm đệm lót .............................................................8 2.3 Kỹ thuật làm đệm lót chuồng nuôi gà trực tiếp trên nền (chuồng kín hoặc hở).........................................................................................................................9 2.3.1 Cách thứ nhất ...............................................................................................9 2.3.2 Cách thứ hai.................................................................................................9 2.4 Kỹ thuật làm chất lót chuồng lồng tầng............................................................10 2.5 Vấn đề sử dụng và bảo dưỡng .........................................................................10 2.6 Vấn đề chống nóng..........................................................................................11 Chương 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................12 3.1 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................12 3.2 Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................12 3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu................................................12 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất.....................................................................................12 3.3 Phương Pháp nghiên cứu .................................................................................13 3.3.1 Bố trí thí nghiệm...........................................................................................13 3.3.2 Thu thập mẫu................................................................................................13 3.3.3 Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn ................................................14 3.4 Phân tích và xử lí số liệu .................................................................................20 Chương 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................21 4.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật trước khi sử dụng men Balasa No.1 .....................21 4.2 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1....................21 4.3 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 4 tuần sử dụng men Balasa No.1....................22 4.4 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 6 tuần sử dụng men Balasa No.1....................23 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................25 5.1 Kết luận...........................................................................................................25 5.2 Đề nghị............................................................................................................25 Tài liệu tham khảo.................................................................................................26 Phụ lục ..................................................................................................................27 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT E. coli: Escherichia coli Ctv: Cộng tác viên VSV: vi sinh vật VKHK: vi khuẩn hiếu khí NXB: Nhà xuất bản v DANH MỤC SƠ ĐỒ - HÌNH Danh mục sơ đồ Sơ đồ 2 Qui trình định lượng vi khuẩn hiếu khí, Ecoli, Coliform ...........................16 Sơ đồ1 Qui trình xác định vi khuẩn hiếu khí..........................................................19 Danh mục hình Hình 1 Cách lấy mẫu không khí chuồng nuôi (a) và mẫu chất lót chuồng (b) ........14 Hình 2 E. coli trên MC (a) và VKHK trên NA (b) ................................................15 Hình 3 Cách pha loãng mẫu...................................................................................16 Hình 4 Coliform trong môi trường BGBL..............................................................17 Hình 5 Kết quả thử sinh hóa E. Coli: a trypton (+),b MR (+), c VP (-), d simmoncitrate (-)...................................................................................................19 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Cách bố trí thí nghiệm ..............................................................................13 Bảng 2 Kết quả vi sinh vật trước khi sử dụng men Balasa No.1.............................21 Bảng 3 Kết quả vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1 ...........................21 Bảng 4 Kết quả vi sinh vật sau 4 tuần rắt men Balasa No.1 ...................................22 Bảng 5 Kết quả vi sinh vật sau 6 tuần rắt men Balasa No.1 ...................................23 vii TÓM LƯỢC Qua thời gian thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu quả của đệm lót chuồng nuôi gà có bổ sung men vi sinh Balasa N01” được thực hiện từ tháng 08 đến tháng 12 năm 2013, với mục tiêu khảo sát các chỉ tiêu vi sinh như vi khuẩn Coliform, Ecoli trong chất lót chuồng, không khí chuồng nuôi trước và sau khi sử dụng men vi sinh, chúng tôi nhận thấy hiệu quả xử lí đệm lót của men vi sinh Balasa No.1 tăng dần từ tuần thứ 2 đến tuần thứ 4 và đến tuần thứ 6 thì giảm dần, cụ thể là sau 2 tuần sử dụng men vi sinh thì số lượng vi khuẩn trong không khí đã giảm xuống, điển hình là vi khuẩn hiếu khí 63x103 CFU/m3, Coliform và E. coli là 185 CFU/m3, thấp hơn ở nghiệm thức không sử dụng men. Đến sau 4 tuần thì cả trên đệm lót lẫn không khí, số lượng vi khuẩn ở nghiệm thức sử dụng men các chỉ tiêu vi sinh theo dõi đa số đều giảm xuống. Đến tuần thứ 6 thì chỉ còn số lượng vi khuẩn trên đệm lót giảm xuống còn trên không khí thì bắt đầu tăng lên, cụ thể là ở nghiệm thức sử dụng men vi sinh trên lớp đệm lót, vi khuẩn Coliform 41x103 CFU/g, E. coli 31x103 CFU/g. viii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay ở Việt Nam, ngành chăn nuôi gà đang phát triển theo hướng công nghiệp hóa với qui mô đàn ngày càng lớn, từ đó năng suất và sản lượng chăn nuôi cũng tăng theo. Tuy nhiên, đi đôi với việc tăng năng suất chăn nuôi thì vấn đề dịch bệnh cũng ngày càng phức tạp. Trong chuồng nuôi các mầm bệnh như Coliforms, E. coli… luôn có sẵn trong phân, chất lót chuồng và không khí, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát triển và gây bệnh cho vật nuôi. Chính vì thế vấn đề xử lí chất lót chuồng và vệ sinh môi trường chăn nuôi cần được quan tâm và đặt lên hàng đầu. Hiện nay trên thế giới đã áp dụng nhiều phương thức chăn nuôi như chăn nuôi hữu cơ, chăn nuôi an toàn sinh học,… và mới đây là chăn nuôi sinh thái không chất thải dựa trên nền tảng công nghệ lên men vi sinh trên lớp đệm lót chuồng. Ở Việt Nam trong những năm gần đây, mô hình chăn nuôi gà trên đệm lót sinh học đã được ứng dụng ở nhiều nơi và mang lại nhiều hiệu quả thiết thực chẳng hạn ở Hưng Yên, Bắc Giang, Bến Tre, Hậu Giang, Đồng Tháp,… có những ưu điểm như chuồng trại trong lành, không mùi hôi, không có chất thải nhờ vi sinh vật phân giải nhanh, giảm đáng kể nơi sinh ruồi, muỗi vì toàn bộ chất thải được phân giải bên trong chuồng, tiết kiệm 10% chi phí thức ăn, 80% lượng nước sử dụng, 60% chi phí lao động, giảm bệnh tật, vật liệu rẻ tiền, không thay chất độn chuồng trong suốt quá trình nuôi, quy trình đơn giản dễ áp dụng (htt://thuvienphapluat.vn/ archive/bao-cao-2886/BC-BNN-CN). Chính vì lẽ đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của đệm lót chuồng nuôi gà có bổ sung men vi sinh Balasa No.1” nhằm mục tiêu khảo sát các chỉ tiêu vi sinh như vi khuẩn hiếu khí, Coliforms tổng số, E. coli trong chất lót chuồng không khí chuồng nuôi trước và sau khi sử dụng men vi sinh. 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN 2.1 Vi sinh vật trong chuồng nuôi Vi sinh vật trong không khí chuồng nuôi chủ yếu có nguồn gốc từ cơ thể hay các chất tiết từ vật nuôi, chất thải, thức ăn, chất lót chuồng. Số lượng vi sinh vật trong không khí chuồng nuôi có thể biến thiên từ vài trăm đến vài ngàn trong một lít không khí: trên 80% vi sinh vật là các cầu khuẩn Staphylococcus và Streptococcus có nguồn gốc từ đường hô hấp trên và da; 10% là Coliforms có nguồn gốc từ phân và 10% là nấm mốc. Số lượng vi sinh vật trong không khí chuồng nuôi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mật độ nuôi, tuổi động vật, độ thông thoáng, nhiệt độ, ẩm độ và hàm lượng bụi (Lăng Ngọc Huỳnh, 2007) Bản thân không khí không phải là môi trường cho vi sinh vật phát triển. Bởi vì trong không khí không có chất dinh dưỡng và các điều kiện khác cho vi sinh vật phát triển.Vi sinh vật có trong không khí chủ yếu là cùng với bụi bẩn bay lên rồi rơi xuống đất. Thời gian tồn tại của chúng trong không khí không lâu. Một số khá lớn do ánh sáng mặt trời tiêu diệt. Vì vậy, số lượng và hệ vi sinh vật không khí phụ thuộc vào số lượng và hệ vi sinh vật đất mà lớp không khí bao phủ. Số lượng vi sinh vật thay đổi theo quy luật là: càng lên cao lượng vi sinh vật càng giảm. Sự tăng số lượng vi sinh vật trong không khí do nhiều nguyên nhân, nhưng phần lớn do tình trạng vệ sinh kém (ít thông gió, ít quét dọn) hoặc động vật nhiều. 2.1.1 Vi khuẩn hiếu khí Nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí bằng cách làm rơi vi khuẩn trên đĩa thạch để phơi trong chuồng nuôi súc vật ở những chỗ độ cao cách mặt đất khác nhau, từ 5 - 10 phút (nếu không khí trong sạch hơn thì để 30 phút). Vi khuẩn theo bụi và giọt nước nhỏ rơi trên mặt thạch, phát triển thành khuẩn lạc; phương pháp này biểu thị một cách tương đối sự nhiễm trùng của không khí. Những vi khuẩn hiếu khí mọc dễ dàng trên môi trường NA, ở 37oC qua 24 giờ. Khuẩn lạc của chúng có kích thước và hình dạng khác nhau, do chúng bao gồm nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Tùy vào loại vi khuẩn mà chúng sẽ có sức đề kháng và gây bệnh khác nhau. 2.1.2 Coliforms Theo Trần Linh Thước (2003), Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật dùng để chỉ thị số lượng hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, 2 nước hay các loại mẫu môi trướng được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Coliforms là những vi khuẩn hình gậy, Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính chất ức chế tương tự, có khả năng lên men đường lactose kèm theo sinh hơi axit và aldehyde trong vòng 24 - 48 giờ. Loại vi khuẩn này không sinh bào tử, có phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của B-galactosidase. Coliforms phân (Feacal Coliforms) là Coliform chịu nhiệt có khả năng sinh Indol khi ủ trong 24 giờ, ở 44oC trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++- (Indol +, Methyl-red +, Voges-Proskauer -, Citrate - ). Khi Coliforms phân hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân. Trong các thành viên của nhóm Coliforms phân thì E. coli là loại được quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. 2.1.3 Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 do bác sĩ người Đức tên Thoedore Escherich, nó được xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật. Sau nhiều cách gọi, đến năm 1991, vi khuẩn được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli (http://vi.wikipedia.org). E. coli là vi khuẩn thường xuyên cư trú và hoạt động trong đường ruột và có thể trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy. Năm 1894, Ligniere lần đầu tiên báo cáo về trận dịch trên gà và đã phân lập được vi khuẩn E. coli từ tim, gan, lách của gia cầm bệnh. Từ năm 1938 – 1965, Garrard đã mô tả một thể bệnh u hạt do vi khuẩn E. coli (Hjarre’s disease), đồng thời đã xác định vai trò của vi khuẩn E. coli trong nhiều thể bệnh bao gồm: viêm túi khí, viêm khớp, viêm cuống rốn, viêm mắt, viêm phúc mạc, viêm ống dẫn trứng. Trong điều kiện bình thường, Ecoli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hóa và trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). 3 Bệnh E. coli phổ biến khắp nơi trên thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, bệnh cũng được ghi nhận trên đàn gia cầm và gây tổn thất khá lớn, đặc biệt là ở gà và vịt (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012). Đặc điểm vi khuẩn E. coli Cấu trúc kháng nguyên của E. Coli: Kauffman (1997) người đầu tiên khám phá ra kiểu huyết thanh dựa trên 3 loại kháng nguyên của E. coli là: kháng nguyên O (Somatic), kháng nguyên H (Flagellum) và kháng nguyên K (Caspular). Theo Lê Văn Tạo (2006) còn có thêm kháng nguyên F (Fimbriae). Cho đến nay đã xác định được 175 type kháng nguyên O, 89 type kháng nguyên K, 56 type kháng nguyên H và hơn 20 type kháng nguyên F (Fairbrother và Gyles, 2006). Độc tố của vi khuẩn: E. coli sản sinh các loài độc tố gồm: độc tố đường ruột (enterotoxin), độc tố tế bào (verotoxin), độc tố thần kinh (neurotoxin) ( Lê Văn Tạo, 2006). Đặc điểm hình thái E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2- 3x0,6µm. Trong cơ thể trực khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẽ đôi khi sắp xếp thành chuổi ngắn. Có khi trong môi trường nuôi cấy còn thấy những trực khuẩn dài 4 - 10 µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Vi khuẩn E. coli là vi khuẩn bắt màu gram âm (-), có thể bắt màu toàn thân hoặc sẩm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn; có lông ở xung quanh nên di động được, có thể hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt, nhưng soi tươi có thể không thấy được không hình thành nha bào. Nếu cố định bằng axit osmic rồi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào E. coli có nhân, đó là một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng (Nguyễn Như Thanh, 1997). Đặc tính nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí và hiếm khì tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15- 400C nhưng thích hợp nhất là 37oC, pH thích hợp là 7,2 - 7,4 (Đào Trọng Đạt và ctv, 1999) Môi trường Meller Kauffman và môi trường Malasit, E. coli không mọc; môi trường Vinson Blai thì E. coli bị ức chế. Môi trường Endo E. coli có khuẩn lạc màu đỏ, có ánh kim hoặc không ánh kim. (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997). 4 Môi trường DA (Desoxycholate Agar): E. coli có khuẩn lạc màu đỏ. dẹt, tròn và khô đường kính 0,5mm. (Lê Đình Phùng, 1997). Môi trường NA (Nutrient Agar) và TSA ( Tripticase Soy Agar) qua 18 24h ủ trong tủ ấm 37oC , hình thành khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc lồi, đường kính 2 - 3mm. Trên môi trường MC (MacConkey Agar) vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc to, tròn đều, màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2 -3mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1997). Trên môi trường EMB (Eosin Methylen Blue Agar) khuẩn lạc tròn, bóng, màu tím đen, có ánh kim (Trần Thị Phận, 2004). Đặc tính sinh hóa Theo Trần Linh Thước (2010), vi khuẩn E. coli được định danh bằng các phản ứng sinh hóa qua các môi trường như: môi trường KIA (Kliger Iron Agar), Simmons citrate, môi trường VP (Voges- Proskauer), môi trường MR (Methyl Red), môi trường Pepton. Indole: Triptophan là một axit amin có thể bị oxi hóa bởi sinh vật có hệ men trytphanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc Indole. Nếu trong môi trường có Triptophan, E. coli sẽ lí giải Triptophan thành Indole. Để nhận biết Indole người ta nhỏ vài giọt thuốc khử Kovac’s, hợp chất Indole với thuốc khử Kovas có màu đỏ. Methyl Red (MR): thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính axit bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi khác nhau tùy vùng pH hay nồng độ ion H+: đỏ khi pH thấp hơn 4,4, màu cam khi pH 5,0 - 5,8, vàng khi pH trên 6,0. Nồng độ ion H+ phụ thuộc vào tỷ lệ CO2, H2 và con đường chuyển hóa đường của từng vi sinh vật. Trong môi trường glucose, E. coli tạo ra môi trường có H+ cao (pH< 4,5) cho thuốc thử Methyl Red và môi trường có màu đỏ là phản ứng dương tính. Voges - prokauer (Vp): tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình lên men glucose sẽ cho sản phẩm cuối cùng khác nhau. Một trong số đó là acetone sẽ tạo phức màu đỏ với thuốc thử α-naphthol và KOH. E. coli có VP âm tính (không có màu đỏ). Citrate: trong môi trường Simmons citrate, nguồn cacbon duy nhất là citrate, vi khuẩn sử dụng citrate sẽ kiểm hóa môi trường làm đổi màu từ màu xanh lục sang màu xanh lơ E. coli có phản ứng citrate âm tính. 5 Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli đề kháng với nhiệt độ, ở 55oC sẽ bị diệt trong 1 giờ, 60oC trong 30 phút, và chết ngay khi đun sôi 100oC. Ở môi trường ngoài, các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997). Các chất tiêu độc bình thường như phenol, formol, vôi,... ở nồng độ thông thường cũng làm E. coli chết rất nhanh (Lê Văn Tạo, 2006). E. coli đề kháng với sự sấy khô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1997). 2.2 Giới thiệu về đệm lót lên men Theo Trung tâm khuyến nông quốc gia (http://www.khuyennongvn.gov.vn) thành phầm cơ bản của đệm lót lên men bao gồm: các chủng loại vi sinh vật có lợi đã được chọn lựa và nguyên liệu làm chất đệm. 2.2.1 Vai trò của các loại sinh vật trong đệm lót lên men - Tạo ra các hợp chất hữu cơ như rượu, acid có tác dụng giữ cho đệm lót có độ pH ổn định, có lợi cho vi sinh vật có ích và không có lợi cho các vi sinh vật gây bệnh trong đệm lót. - Phân giải mạnh và đồng hoá tốt các thành phần có trong chất thải động vật để chuyển hoá các chất vô hại thành các protein của bản thân các vi sinh vật có ích. - Sử dụng các thành phần khí thải độc hại để sinh trưởng, phát triển góp phần khử được khí độc của chuồng nuôi (tổng hợp protein từ nguồn dinh dưỡng là NH3, NH2, oxy hoá NH3 , NH2 thành NO3 và NO2 sử dụng hoặc oxy hoá H2S thành các muối sulfat). - Ức chế các vi khuẩn có hại, vi khuẩn gây thối rữa Clostridium perfringens, các vi khuẩn gây bệnh đường ruột E.coli, Salmonella,… nhờ có khả năng sản sinh ra các chất kháng vi khuẩn như acid lactic, acid acetic, rượu ethylic, ester, H2O2, bacteriocin Photosynthetic bacteria group (nhóm vi khuẩn quang hợp). - Hấp thụ các khí độc H2S, NH3,… làm giảm mùi hôi thối, tạo môi trường sống trong lành giúp vật nuôi phát triển tốt và hạn chế một số bệnh về đường hô hấp, tiêu hoá. Đồng thời góp phần cải thiện môi trường cho người chăn nuôi. 2.2.2 Các nhóm vi sinh vật có trong đệm lót Lactic acid bacteria group - Sản sinh ra các acid lactic cải thiện tính năng heo con mới dứt sữa. 6 - Loại trừ độc tố của vi khuẩn mang nguồn bệnh như độc tố vi khuẩn E.coli, thúc đẩy nhu động đường ruột loại trừ táo bón. - Ức chế sự trưởng thành của vi khuẩn gây mùi hôi thối trong đường ruột, đồng thời có tác dụng diệt khuẩn, giảm thiểu tối đa lượng vi khuẩn gây thối rửa trong chuồng trại. - Ức chế sản sinh ra vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus âm tính ở ruột non. - Acid lactic cũng có thể hợp thành nhóm vitamin B. - Phân giải protein, chất hữu cơ, tổng hợp một số vitamin, men tố, kích tố tăng trưởng giúp tăng tỉ lệ tiêu hoá lên đến 8%, cải thiện khả năng tăng trọng của con vật và rút ngắn thời gian nuôi dưỡng. Yeast group (nhóm nấm men) - Chứa một lượng lớn vitamin, men tố và các thành phần dinh dưỡng khác, hỗ trợ vi khuẩn có ích trong đường ruột, thúc đẩy sự hấp thụ thức ăn cho gia súc. - Sử dụng các chất khoáng như Ca, Mg, K, Zn,… phân giải thành các chất dễ hấp thụ. - Tác dụng điều chỉnh độ pH trong đường tiêu hoá. Actinomyces (nhóm xạ khuẩn) - Sản sinh ra vitamin B12. Tiết các chất enzyme giúp cho các hoạt động hấp thu dinh dưỡng tốt. - Nâng cao chất dinh dưỡng. - Thúc đẩy phân giải chất hữu cơ, ức chế vi khuẩn gây bệnh viêm phổi, bệnh đường hô hấp. Filamentous/ungi group (nhóm nấm mốc) - Phân giải chất dinh dưỡng. Sản sinh ra protein, chất béo, chất bột, chất xơ,… trong đường ruột, phân giải men tố, thúc đẩy tiêu hoá. - Sản sinh ra cồn rượu và acid hữu cơ phát huy tác dụng diệt khuẩn. Bacillus natto group - Làm sạch đường ruột, ức chế các vi khuẩn. - Diệt vi khuẩn thương hàn, vi khuẩn E.coli vi khuẩn gây kiết lị và một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hoá. - Phân giải protein thức ăn, tổng hợp acid amin và các vitamin. 7 - Sản sinh ra chất dinh dưỡng cung cấp cho vật nuôi. - Phân giải men tố protein trong đậu nành hình thành nhóm acid amin, nhóm vitamin B, B1, B2, B6, B12. - Bên cạnh đó các chủng vi sinh vật phải có khả năng thích ứng cao trong những điều kiện biến đổi của ngoại cảnh (nhiệt độ cao và acid cao), đồng thời phải quan hệ cộng sinh, do đó tạo nên sự cân bằng sinh thái, ổn định môi trường chung. 2.2.3 Vai trò của nguyên liệu làm chất lót chuồng Nguyên liệu làm chất lót chuồng tạo ra môi trường sống cho hệ vi sinh vật. Yêu cầu của nguyên liệu phải có thành phần xơ cao, không độc và không gây kích thích. Đặc biệt nguyên liệu phải bền vững với sự phân giải của vsv, đảm bảo thời gian sử dụng kéo dài. Khi sử dụng chất lót chuồng vi sinh vật sẽ tạo ra vòng tuần hoàn sinh vật. Con vật ăn, ở, đi lại và thải phân trên chất lót chuồng sẽ cung cấp dinh dưỡng cho vi sinh vật sử dụng. Đồng thời vi sinh vật phân giải phân và nước tiểu tạo thành các chất trao đổi và protein của bản thân chúng. Cung cấp dinh dưỡng làm tăng dinh dưỡng cho con vật; trợ giúp quá trình tiêu hoá, nâng cao miễn dịch cho cơ thể con vật. Ngoài ra vi sinh vật sinh trưởng phát triển ở mức độ nhất định sẽ sinh ra một nhiệt lượng nhất định đảm bảo cung cấp đủ ấm cho con vật trong mùa đông nhưng không phải quá nhiệt trong mùa hè. Vòng tuần hoàn được luân chuyển trong thời gian dài tạo ra môi trường không chất thải. - Yêu cầu nguyên liệu làm chất lót chuồng Nguyên liệu sử dụng làm chất lót chuồng, nền chuồng phải thoả mãn các điều kiện sau: Khả năng hút ẩm tốt (khả năng hút ẩm từ 140 – 1200% so với khối lượng ban đầu của nó); không bị nát vụn, không tạo nhiều bụi, không bị phân huỷ bởi VSV; giá rẻ, dễ kiếm. Một số nguyên liệu được sử dụng trong chăn nuôi như mùn cưa (hút ẩm 420%), lõi bắp nghiền (hút ẩm 140 – 150%), rơm rạ, trấu (hút ẩm 240%), tuy nhiên rơm rạ, lõi bắp thường do bị nhiễm nấm mốc. Trong thực tế, nguyên liệu sử dụng làm chất lót chuồng lên men vsv tốt nhất thường là mùn cưa hay dăm bào vì chúng thoả mãn tất cả các điều kiện trên và ít bị mốc. Hoặc có thể sử dụng hỗn hợp các nguyên liệu gồm mùn cưa và trấu hoặc dăm bào với tỷ lệ thích hợp. Tuy nhiên khi sử dụng mùn cưa phải đặc biệt lưu ý lựa chọn mùn cưa có kích thước hạt lớn từ 10 mm để tránh ảnh hưởng đến đường hô hấp của vật nuôi. Độ ẩm của lớp đệm lót chuồng thường duy trì ở mức 20 – 25%. Theo các tác giả, cách kiểm tra độ ẩm của lớp đệm lót đơn giản nhất là nắm chất lót 8 chuồng thặt chặt ttrong bàn tay, nếu chất lót chuồng thành khối kết dính, chắc thì quá ướt, đệm lót không dính thành khối mà rời ra hoàn toàn là quá khô, đạt yêu cầu là chất lót chuồng chỉ đủ dính thành khối, bóp nhẹ là tan ra. Khi chất lót chuồng quá ướt thì phải thay hoặc cho thêm chất lót chuồng mới, tăng cường xới đảo dể thông thoáng. Độ ẩm của lớp đệm lót nền cao kết hợp với các yếu tố khác như kích thước của nguyên liệu làm chất lót chuồng nhỏ, nồng độ oxy trong chuồng nuôi thấp, nhiệt độ không khí chuồng nuôi cao,… sẽ tạo điều kiện cho các vsv yếm khí phát triển, phân giải các hợp chất hữu cơ có trong phân giải phóng các khí độc hại gây mùi khó chịu. 2.3 Kỹ thuật làm chất lót chuồng nuôi gà trực tiếp trên nền (chuồng kín hoặc hở) 2.3.1 Cách thứ nhất (Rắc men trực tiếp lên chất lót chuồng ) Đây là cách làm đơn giản nhưng 1 kg chế phẩm Balasa No.1 chỉ rắc cho chất lót chuồng có diện tích từ 35 m2 trở xuống. Cụ thể làm theo các bước sau: Bước 1: Rải trấu lên toàn bộ nền chuồng dầy 10cm (gà thịt) hoặc trên 15 cm (gà đẻ), sau đó thả gà vào nuôi Bước 2: Sau một thời gian (sau 7-10 ngày đối với gà nuôi úm, sau 2- 3 ngày đối với gà lớn) quan sát thấy khi nào phân rải khắp trên bề mặt chuồng, thì rắc men. Cụ thể: Lấy 1 kg Balasa No.1 đem trộn thật đều với 1 kg bột khô (có thể là cám gạo, bột sắn hay bột ngô đều được), sau đó đem rắc đều lên toàn bộ bề mặt chất lót chuồng là được. 2.3.2 Cách thứ hai (Phải tiến hành nhân men sau đó mới rắc lên chất lót chuồng ) Làm cách này thì 1 kg chế phẩm Balasa No.1 sẽ rắc cho diện tích chất lót chuồng lớn hơn: từ 35 - 50m2 . Cách tiến hành như các bước 1 và 2 của cách thứ nhất đã nêu ở trên, chỉ khác là khi nào cần rắc men phải nhân men. Cụ thể như sau: Đem 1 kg chế phẩm Balasa No.1 trộn đều với 3 kg bột ngô hoặc cám gạo, cho thêm khoảng 1,2 lít nước sạch, xoa cho ẩm đều (bột ẩm nhưng vẫn tơi rời mới đạt yêu cầu), sau đó cho vào túi hoặc thùng đậy kín và để chỗ ấm ủ trên dưới 2 ngày, khi nào có mùi thơm, hơi chua thì đem rắc đều lên toàn bộ bề mặt chất lót chuồng . 9 Chú ý - Thực hiện làm chất lót chuồng có diện tích nền chuồng từ 35 – 50m2 phải trộn Balasa No.1 với bột ẩm ủ chỗ ấm để lên men với mục đích là làm tăng lượng men do đó sẽ làm chất lót chuồng cho diện tích chuồng nuôi rộng hơn, giảm chi tiền men . Nhưng nếu diện tích chuồng nuôi nhỏ hoặc không muốn ủ men phức tạp thì rắc men thẳng như cách thứ nhất. - Làm chất lót chuồng bằng mùn cưa giống như làm bằng trấu. Nếu mùn cưa khô bụi thì phun nước sạch cho hơi ẩm, nhưng nếu nuôi bằng lồng thì không cần phun ẩm. - Nuôi gà đẻ có thời gian nuôi kéo dài thì độ dầy chất lót chuồng có thể là 15-20 cm - Nuôi vịt, ngan, thỏ do thải phân có nước nhiều vì vậy nên dùng chất lót chuồng là mùn cưa hoặc kết hợp với trấu với độ dầy 20-30 cm. Chú ý khi vịt chăn thả dưới nước lên phải để khô cánh mới cho vào chuồng 2.4 Kỹ thuật làm chất lót chuồng lồng tầng Đối với chuồng nuôi đã có sẵn, chuồng có khoảng cách giữa đáy lồng với nền chuồng chỉ khoảng trên dưới 50 cm là có thể làm được chất lót chuồng. Cách làm như đã hướng dẫn ở trên. Chú ý: do mật độ gà cao, thải phân nhiều nên cần làm chất lót chuồng dầy từ 15- 20 cm. 2.5 Vấn đề sử dụng và bảo dưỡng - Chỉ cần rắc men 1 lần trong suốt quá trình nuôi, nhưng có thể định kỳ (trên 1 tháng) bổ sung thêm chế phẩm Balasa No.1, bằng cách đem 1 kg chế phẩm Balasa No.1 trộn đều với 2 kg bột bất kỳ (cám thô, bột sắn, mùn cưa…) rồi rắc cho 50 m2 nền chuồng. - Cứ sau một vài ngày (tùy lượng phân nhiều hay ít) cào nhẹ trên bề mặt chất lót chuồng một lần để giúp vùi phân và làm cho chất lót chuồng được thông thoáng, phân sẽ được phân hủy tốt hơn. - Chuồng nuôi phải thông thoáng để thoát mùi hăng hắc do tiêu hủy phân sinh ra - Tránh để bị nước uống và nước mưa hắt làm ướt chất lót chuồng . Nếu thấy nước rớt làm ướt chất lót chuồng ở khu vực máng uống thì phải thay ngay bằng lớp trấu mới. 10 - Chất lót chuồng lên men có sự khử trùng tốt nên không cần phun thuốc khử trùng định kỳ lên mặt chất lót chuồng. - Ở tháng nóng nhất trong mùa hè phải có biện pháp chống nóng như mở toàn bộ cửa cho thông thoáng, làm chất lót chuồng mỏng hơn để thoát hơi nóng nhanh. - Nếu nuôi với mật độ gà thích hợp, phương pháp sử dụng và bảo dưỡng tốt thì chất lót chuồng có thể dùng kéo dài hàng năm nhưng cần chú ý định kỳ bổ sung thêm men Balasa No.1. - Nuôi vịt cần chú ý không để vịt sau khi bơi ở ao hồ lên vào chuồng ngay để tránh chất lót chuồng bị ướt. - Do nhiệt độ ở đệm lót luôn ấm nóng nên khi úm gà chỉ cần quây kín ở dưới khoảng trên dưới 50 cm còn phía trên phải để thoáng, đặc biệt trong mùa nóng - Mùa nóng khi úm gà do chất lót chuồng luôn luôn ấm vì vậy nên treo đèn cao hơn để tránh nhiệt độ cao làm bốc hơi nước làm cho gà bị nhiễm lạnh - ẩm dễ bị bệnh. 2.6 Vấn đề chống nóng Do chất lót chuồng luôn sinh nhiệt nên ở các mùa có thời tiết mát lạnh thì nuôi gà rất tốt hoặc ở tháng có nhiệt độ không quá nóng mà có biện pháp chống nóng tốt cũng sẽ không ảnh hưởng nhiều. Vấn đề chống nóng cũng không đặt ra đối với úm gà, gà thả vườn, nuôi gà ở chuồng kín và gà đẻ lồng tầng bởi vì: Do gà con cần nhiệt độ chuồng nuôi cao nên làm chất lót chuồng chuồng để úm gà sẽ có được hiệu quả rất tốt ở tất cả các mùa trong năm Nuôi gà ở chuồng kín do có quạt hút làm hạ nhiệt độ của chuồng nuôi Nuôi gà đẻ lồng tầng cũng có thể duy trì chất lót chuồng quanh năm do gà không trực tiếp sống trên đệm lót Chống nóng trong mùa hè chủ yếu đối với gà nuôi thịt, gà đẻ trên nền chuồng láng xi măng hoặc lát gạch. Cụ thể cần mở hết cửa cho thông thoáng, nếu cần phải dùng quạt hơi nước để thoát hơi nóng và làm mát chuồng nuôi. Trong trường hợp không có biện pháp chống nóng tốt thì trong vài tháng nóng nhất có thể thực hiện làm chất lót chuồng mỏng hơn để thoát hơi nóng nhanh, định kỳ thay chất lót chuồng mới (theo Quy trình kỹ thuật sử dụng chế phẩm Balasa No.1 để tạo đệm lót sinh học nuôi gà, được Cục chăn nuôi (BNN và PTNT) công nhận theo Quyết định số 263/QĐ-CN-MTCN ngày 09/10/2013) 11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Khảo sát các chỉ tiêu vi sinh như: vi khuẩn hiếu khí, Coliforms tổng số, Ecoli trên chất đệm chuồng không khí trước và sau khi sử dụng men vi sinh. 3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: nghiên cứu được tiến hành từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. - Địa điểm bố trí thí nghiệm được thực hiện tại trại gà thực nghiệm Ba Hoàng, phường Thới An Đông, quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ. - Địa điểm phân tích mẫu: mẫu được phân tích tại phòng vi trùng và miễn dịch - Bộ môn thú y - Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Trường Đại Học Cần Thơ. - Đối tượng nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện trên 2 đối tượng là chất lót chuồng và không khí chuồng nuôi. 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất - Môi trường: Nutrient Agar (NA), Macconkey Agar (MC), Violet Red Bile Agar formicrobiology (VRBL), Simmons Ctrate Agar, MR-VP Broth: Methyl-red Voges-Proskauer, Trypton, Brilliiant Green Lactose Bile Salt (BGBL). - Hóa chất: Thuốc thử MR: lấy 0,1g Methyl red hòa với 300ml cồn 950, khuấy đều rồi cho nước cất vào sao cho hỗn hợp vừa đủ 500ml ( Khi pha nên cho Methyl vào cốc thủy tinh nghiền nát với cồn rồi mới cho nước cất vào). Thuốc thử Kovacc’s: lấy 5g Para dimethyl aminobenzaldehide trộn với 75ml cồn Isoamin để vào nước ấm 50-600C, lắc cho tan hoàn toàn, để nguội rồi cho HCL vào từng giọt, lắc đều. Thuốc thử VP1:α-napthol: 5g,cồn tuyệt đối: 100ml Thuốc thử VP2:NaOH 40%: 40g, nước cất vừa đủ: 100ml - Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống nghiệm , ống đong, đèn cồn, que cấy, cồn 700, cồn 900, găng tay, túi nylon, thùng chứa mẫu. - Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, autoclave, cân điện tử. 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Bố trí thí nghiệm Nghiên cứu được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nghiệm thức (đối chứng không sử dụng men và nghiệm thức có sử dụng men vi sinh Balasa No.1) với 3 lần lặp lại, bố trí 15 con trên lần, mỗi nghiệm thức bố trí 45 con. Chất đệm chuồng được sử dụng trong nghiên cứu là trấu, độ dày đệm chuồng ở mỗi nghiệm thức là 7cm đến 8cm. Diện tích mỗi nghiệm thức là 0,8x2m, trên nghiệm thức sử dụng men vi sinh Balasa No.1, sau khi thả gà vào nuôi được khoảng 7 ngày sẽ được rãi men với lượng men sử dụng là 100g, trộn với 100g cám. Thành phần men vi sinh Balasa No.1 gồm có: Bacllus polymyxa: 5x105 CFU/g Bac.subtilis: 5x102 CFU/g Bac. Megatherium: 1,1 x 107 CFU/g Lac. Plantarum: 1,1 x 107 CFU/g Nitrosomonas spp: 5 x 10 CFU/g Saccharomyces cerevieae: 5 x 10 CFU/g Bảng 1 Cách bố trí thí nghiệm. Nghiệm thức Lần1 Lần 2 Lần 3 Tổng (con) (con) (con) (con) Đối chứng 15 15 15 45 Balasa No.1 15 15 15 45 3.3.2 Thu thập mẫu Nghiên cứu được tiến hành thu thập mẫu tại 4 thời điểm: 1 tuần trước khi sử dụng men, và sau khi sử dụng men 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần. - Mẫu không khí: lấy mẫu ở 2 điểm đại diện trong lồng nuôi. Tại mỗi điểm, đặt 2 đĩa petri chứa môi trường thạch NA, 2 đĩa petri chứa môi trường 13 thạch VRBL và 2 đĩa chứa môi trường MC. Thời gian mở nắp: 5 phút cho đĩa NA, 10 phút cho đĩa VRBL và MC - Mẫu nền: lấy ở 5 điểm đại diện ở mỗi lô (khoảng 5g) cho vào túi nylon. - Sau khi lấy mẫu xong, ghi nhãn, xếp vào thùng chứa mẫu và chuyển về phòng thí nghiệm. a b Hình 1 Cách lấy mẫu không khí chuồng nuôi (a) và mẫu chất lót chuồng (b) 3.3.3 Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Mẫu không khí Sau khi chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, các mẫu không khí được ủ ngay vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc điển hình trong từng loại môi trường để xác định số lượng từng loại vi khuẩn tương ứng để tính kết quả. Số lượng vi sinh vật trong không khí được tính theo công thức của Omelinski V.L (1941) được trích dẫn bởi Lê Văn Việt Mẫn và Lại Mai Phương (2006). Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc trong 1m3 không khí (CFU/m3). 14 A: số khuẩn lạc trong bình đếm được trên 2 đĩa petri chứa cùng một môi trường thạch. S: diện tích bề mặt đĩa petri. T: thời gian cấy mẫu (phút). 5: hệ số qui đổi ra thời gian cấy mẫu là 5 phút. 100: hệ số qui đổi ra diện tích bề mặt đĩa petri là 100cm2. 100: hệ số qui đổi ra10 lít không khí thành 1m3 không khí. Với: S = r2 x 3,14 Trong đó: r bán kính bề mặt đĩa. a b Hình 2 E. coli trên MC (a) và VKHK trên NA (b) Mẫu nền Mẫu nền sau khi được lấy về sẽ được pha loãng với nước muối sinh lý 9 /00 vô trùng. Cách pha loãng như sau: 0 Cách pha: cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lý 9 /00 đã vô tùng, lắc đều thì ta được mẫu ở nồng độ 10-1, tiếp tuc rút 1ml ở ống này cho vào ống nghiệm khác cũng có chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, ta được ống nghiện ở nống độ 10 -2. Tiếp tục pha như thế cho đến ống nghiệm có nồng độ 10-6. 0 15 Hình 3 Cách pha loãng mẫu Phương pháp định lượng vi khuẩn hiếu khí Cách tiến hành: chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, chuyển 0,1 ml dung dịch mẫu vào đĩa môi trường NA (mỗi nồng độ 2 đĩa), dùng que chang đều trên mặt thạch, sau đó đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả: đếm tất cả các khuẩn lạc trên mặt thạch. Chọn đếm những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 (Trần Linh Thước, 2003) Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu có chế độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 10-6 Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 0,1 ml mẫu vào các đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ 2 đĩa) Rót vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường NA đã được làm nguội đến 450C, lắc cho mẫu tan đều vào môi trường, ủ ở 370C trong 24 giờ Chọn các đĩa các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 đến 250 khuẩn lạc để đếm Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml) Sơ đồ1 Qui trình xác định vi khuẩn hiếu khí 16 Công thức tính tổng số vi khuẩn hiếu khí (Trần Linh Thước, 2003) C X= (n1 + 0,1. n2) .d.m Trong đó: X: tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu thử. C: tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ 1 đếm được. n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ 2 đếm được. d: hệ số pha loãng thứ 1 đếm được. m: lượng mẫu cấy. Phương pháp định lượng Coliforms (theo TCVN 6848:2007) Chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau, mỗi nồng độ rút 0,1 ml dung dịch chang đều trên 2 đĩa môi trường VRBL. Sau khi chang xong đem đĩa đi ủ ở nhiệt độ 370C, trong 24 giờ. Sau 24 giờ ta tiến hành đếm khuẩn lạc. Trên môi trường VRBL khuẩn lạc có màu hồng, mặt bóng, hơi lồi, đường kính khoảng 1 – 2 mm. Khẳng định Coliforms bằng cách chọn 5 khuẩn lạc điển hình trên môi trường VRBL, ta cũng tiến hành cấy các khuẩn lạc này vào ống nghiệm chứa môi trường BGBL, có ống Durham, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nếu trong ống Durham có khí xuất hiện thì là dương tính, ngược lại là âm tính. Hình 4 Coliforms trong môi trường BGBL 17 Phương pháp định lượng E. Coli (theo TCVN 515-90) Chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau, mỗi nồng độ rút 0,1 ml dung dịch chang đều trên 2 đĩa môi trường MC. Sau khi chang xong đem đĩa đi ủ ở nhiệt độ 370C, trong 24 giờ. Trên môi trường MC khuẩn lạc có màu hồng, phần tâm của khuẩn lạc có màu sậm hơn hoặc trắng hơn, đường kính khoảng 1 – 2 mm. Kiểm tra sinh hóa khẳng định Ecoli bằng cách chọn 5 khuẩn lạc điển hình trên môi trường MC, ta tiến hành cấy các khuẩn lạc này lên môi trường sinh hóa. Các môi trường sinh hóa gồm có: Trypton, MR-PV và Simmon citrate agar. Sau khi cấy lên các môi trường sinh hóa, đem ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Để khẳng định Ecoli ta thực hiện các các thử nghiệm sinh hóa. Kết quả Ecoli dương tính khi thử nghiệm Indol: (+), MR: (+), VP: (-), Citrate natri: (-). - Thử nghiệm Indol: nhỏ thuốc thử Kovac’s vào môi trường trypton nếu có vòng màu đỏ xuất hiện thì là dương tính, không xuất hiện vòng màu đỏ là âm tính. - Thử nghiệm Methyl red: nhỏ thuốc thử Methyl red vào môi trường MR – VP nếu có vòng màu đỏ xuất hiện thì là dương tính, không xuất hiện vòng màu đỏ là âm tính. - Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP): nhỏ thuốc thử VP1 sau đó nhỏ VP2 vào môi trường MR – VP nếu có vòng màu đỏ xuất hiện thì là dương tính, không xuất hiện vòng màu đỏ là âm tính. - Thử nghiệm Citrate Natri: nếu trên môi trường thạch Simmon Citrate Agar chuyển màu từ xanh lá cây thành xanh dương thì là phản ứng dương tính, không đổi màu là âm tính. Tính kết quả E. coli và Coliforms trong đệm lót chuồng theo công thức N A(CFU/g) = xR n1.v.f1 + ... + ni.v.fi Trong đó: N : tổng số khuẩn lạc đếm được. v : dung tích mẫu ni : số đĩa có khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng. fi : độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm. R : tỉ lệ khẳng định. 18 a b c d Hình 5.Thử sinh hóa: (a) trypton (+), (b) MR (+), (c )VP (-), (d)citrate (-) Mẫu chất lót chuồng (trấu) Cân 1g Pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lí 0,9 % Rút 0,1 ml, chang đĩa VRBL ,ủ 370C, 24 giờ NA ,ủ 370C, 24 giờ MC ,ủ 370C, 24 giờ Đếm tổng số khuẩn lạc Đếm tổng số khuẩn lạc Đếm tổng số khuẩn lạc Chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường BGBL ủ 370C, 24 giờ Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào Trypton, MR-VP, Simmon citrate ủ 370C, 24 giờ Môi trường bị đục, ống Durham có khí xuất hiện Thử nghiệm IMViC IMViC (+ + - -) Coliform s Vi khuẩn E. coli Sơ đồ 2 Qui trình định lượng vi khuẩn hiếu khí, E. coli, Coliforms 19 3.4 Phân tích và xử lí số liệu So sánh số lượng vi khuẩn giữa các nghiệm thức bằng phân tích phương sai, so sánh các trị số trung bình bằng ANOVA sử dụng phần mềm Minitab 16. 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật trước khi sử dụng men Balasa No.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật trước khi sử dụng men Balasa No.1 được trình bày qua bảng 2. Bảng 2 Kết quả vi sinh vật trước khi sử dụng men Balasa No.1 Đối tượng Chất lót chuồng Không khí Vi khuẩn Đối chứng VKHK (CFU/g) 38x106 Coliforms (CFU/g) 63x104 E. coli (CFU/g) 63x104 VKHK (CFU/m3) 9x104 Coliforms (CFU/m3) 470 E. coli (CFU/m3) 470 Kết quả qua bảng 2 cho thấy chất lót chuồng nuôi trước khi sử dụng men Balasa No.1 có số lượng vi khuẩn hiếu khí là 38x106 CFU/g, Coliforms, E. coli là, 63x104 CFU/g. Môi trường không khí chuồng nuôi trước khi sử dụng men Balasa No.1 có số lượng vi khuẩn hiếu khí là 9x104 CFU/m3, Coliforms, E. coli là 470 CFU/m3. 4.2 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1 được trình bày ở bảng 3 như sau: Bảng 3 Kết quả vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1 Đối tượng Chất lót chuồng Không khí Vi khuẩn Đối chứng Balasa No.1 P - value VKHK (CFU/g) 505x105a 170x105a 0,141 Coliforms (CFU/g) 190x105a 2445x103a 0,148 5a 3a 0,137 E. coli (CFU/g) 190x10 1845x10 VKHK (CFU/m3) 115x103a 63x103 b 0,022 Coliforms (CFU/m3) 1150a 185b 0,024 E. coli (CFU/m3) 1150a 185b 0,024 21 Kết quả ở bảng 3 cho thấy số lượng vi sinh vật ở chất lót chuồng có sử dụng men vi sinh Balasa No.1 sau 2 tuần lần lượt là: vi khuẩn hiếu khí 170x105 CFU/g, Coliforms 2445x103 CFU/g, E. coli 1845x103 CFU/g. Qua phân tích thống kê cho thấy số lượng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E. coli sau khi sử dụng men và trước khi sử dụng là khác biệt không có ý nghĩa thống kê Không khí chuồng nuôi ở nghiệm thức sử dụng men vi sinh Balasa No.1 sau 2 tuần sau có số lượng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E. coli thấp hơn số lượng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E. coli trước khi sử dụng men Balasa No.1, cụ thể là vi khuẩn hiếu khí 63x103 CFU/m3, Coliforms và E. coli là 185 CFU/m3. Qua phân tích thống kê cho thấy số lượng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E. coli giữa nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức sử dụng men khác biệt có ý nghĩa thống kê (p[...]... men vi sinh Balasa No.1 tuy chưa cải thiện được các chỉ tiêu vi sinh vật trên chất lót chuồng nhưng đã cải thiện được các chỉ tiêu vi sinh vật này trên không khí chuồng nuôi 4.3 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 4 tuần rắt men Balasa No.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 4 tuần sử dụng men Balasa No.1 được trình bày ở bảng 4 Bảng 4 Kết quả vi sinh vật sau 4 tuần rắt men Balasa No.1 Đối tượng Chất lót chuồng. .. ta có thể bổ sung thêm men vi sinh lên chất lót chuồng để tăng hiệu quả và thời gian sử dụng chất lót chuồng 24 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi nhận thấy rằng men vi sinh Balasa No.1 bổ sung vào chất lót chuồng giúp cải thiện được môi trường chăn nuôi như làm giảm đáng kể mật độ vi khuẩn trong chuồng nuôi Cụ thể là sau 2 tuần sử dụng mật độ vi sinh. .. thay chất độn chuồng trong suốt quá trình nuôi, quy trình đơn giản dễ áp dụng (htt://thuvienphapluat.vn/ archive/bao-cao-2886/BC-BNN-CN) Chính vì lẽ đó, chúng tôi thực hiện đề tài: Đánh giá hiệu quả của đệm lót chuồng nuôi gà có bổ sung men vi sinh Balasa No.1” nhằm mục tiêu khảo sát các chỉ tiêu vi sinh như vi khuẩn hiếu khí, Coliforms tổng số, E coli trong chất lót chuồng không khí chuồng nuôi trước... nhiệt độ chuồng nuôi cao nên làm chất lót chuồng chuồng để úm gà sẽ có được hiệu quả rất tốt ở tất cả các mùa trong năm Nuôi gà ở chuồng kín do có quạt hút làm hạ nhiệt độ của chuồng nuôi Nuôi gà đẻ lồng tầng cũng có thể duy trì chất lót chuồng quanh năm do gà không trực tiếp sống trên đệm lót Chống nóng trong mùa hè chủ yếu đối với gà nuôi thịt, gà đẻ trên nền chuồng láng xi măng hoặc lát gạch Cụ thể... tiêu vi sinh trên chất lót chuồng Tuy nhiên ở thời điểm này có thể bổ sung thêm men vi sinh lên chất lót chuồng để tăng hiệu quả và thời gian sử dụng chất lót chuồng 5.2 Đề nghị Nên khảo sát hiệu quả của men vi sinh Balasa No.1 trên qui mô đàn lớn hơn, sử dụng nhiều vật liệu làm đệm lót khác như: rơm, mạc cưa, dăm bào, và trên nhiều đối tượng gia súc gia cầm khác 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Hồ Thị Vi t... Giới thiệu về đệm lót lên men Theo Trung tâm khuyến nông quốc gia (http://www.khuyennongvn.gov.vn) thành phầm cơ bản của đệm lót lên men bao gồm: các chủng loại vi sinh vật có lợi đã được chọn lựa và nguyên liệu làm chất đệm 2.2.1 Vai trò của các loại sinh vật trong đệm lót lên men - Tạo ra các hợp chất hữu cơ như rượu, acid có tác dụng giữ cho đệm lót có độ pH ổn định, có lợi cho vi sinh vật có ích... dụng men vi sinh 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN 2.1 Vi sinh vật trong chuồng nuôi Vi sinh vật trong không khí chuồng nuôi chủ yếu có nguồn gốc từ cơ thể hay các chất tiết từ vật nuôi, chất thải, thức ăn, chất lót chuồng Số lượng vi sinh vật trong không khí chuồng nuôi có thể biến thiên từ vài trăm đến vài ngàn trong một lít không khí: trên 80% vi sinh vật là các cầu khuẩn Staphylococcus và Streptococcus có. .. tốt khỏe mạnh Qua đây cho thấy nghiệm thức có sử dụng men có thể làm giảm tỉ lệ bệnh trên gà 4.4 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 6 tuần sử dụng men Balasa No.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 6 tuần sử dụng men Balasa No.1 được trình bày ở bảng 5 Bảng 5 Kết quả vi sinh vật sau 6 tuần rắt men Balasa No.1 Đối tượng Chất lót chuồng Không khí Vi khuẩn Đối chứng Balasa No.1 P - value VKHK (CFU/g) 385x105a... lượt là: vi khuẩn hiều khí 115x103 CFU/g, Coliforms và E coli là 1150 CFU/g, còn ở nghiệm thức có sử dụng men vi sinh Balasa No.1 có vi khuẩn hiếu khí 170x105 CFU/g, Coliforms 2445x103 CFU/g, E coli 1845x103 CFU/g Đến 4 tuần sử dụng men thì mật số vi sinh vật trên chất lót chuồng lẫn không khí ở nghiệm thức có sử dụng men vi sinh đều giảm rõ rệt Đến 6 tuần sau khi sử dụng men thì men vi sinh Balasa No.1... trước khi sử dụng men Balasa No.1 có số lượng vi khuẩn hiếu khí là 38x106 CFU/g, Coliforms, E coli là, 63x104 CFU/g Môi trường không khí chuồng nuôi trước khi sử dụng men Balasa No.1 có số lượng vi khuẩn hiếu khí là 9x104 CFU/m3, Coliforms, E coli là 470 CFU/m3 4.2 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1 Kết quả khảo sát vi sinh vật sau 2 tuần sử dụng men Balasa No.1 được trình