BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ KHÁNH TRÂM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hà Nội - 2013 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ KHÁNH TRÂM Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 62720115 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. ĐINH HỮU DUNG PGS. TS. NGUYỄN VŨ TRUNG Hà Nội - 2013 Lời cám ơn Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thày cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Hữu Dung, PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung, những người thày đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Phủng, Trưởng Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Thị Vinh, TS. Phạm Hồng Nhung, TS. Lê Văn Duyệt, ThS. Văn Đình Tráng hướng dẫn và đóng góp cho tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn CN. Nguyễn Thị Minh Thư, CN. Vũ Thị Hồ Vân, KTV. Lê Thị Hải, KTV. Phạm Thị Vinh, những người đã giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, các thày cô giáo Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã trang bị kiến thức, tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám đốc Bệnh viện Bạch Mai, Ban Lãnh đạo và tập thể Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện và động viên tôi học tập tốt. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và Tập thể khoa xét nghiệm Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương, Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội, Trung tâm Y tế Quận Đống Đa, các nhân viên của các cơ sở dịch vụ ăn uống tham gia nghiên cứu, đã giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu, thu thập số liệu phục vụ luận án này. Tôi vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình và bạn bè thân thiết đã động viên, hỗ trợ tôi cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Hà Nội, tháng 8 năm 2013 Lê Khánh Trâm CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu do tôi chủ trì thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Hữu Dung và PGS.TS Nguyễn Vũ Trung. Các số liệu trong luận án là trung thực và kết quả nghiên cứu chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Lê Khánh Trâm MỤC LỤC Lời cam đoan Mục lục Chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................... 3 1.1. VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH THƢỜNG ............................................................3 1.1.1. Khái niệm về vi hệ ............................................................................ 3 1.1.2. Các vi hệ ở ngƣời .............................................................................. 3 1.1.3. Vai trò của vi hệ với sức khỏe .......................................................... 4 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS .....................................................................5 1.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại .......................................................... 5 1.2.2. Tính chất sinh học của S. aureus ...................................................... 6 1.2.3. Đặc điểm di truyền của S. aureus ..................................................... 7 1.3. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS ...............7 1.3.1. Tỷ lệ mang ........................................................................................ 7 1.3.2. Đặc điểm và kiểu cách cƣ trú............................................................ 8 1.4. CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS ..........................................11 1.4.1. Các yếu tố độc lực là thành phần cấu trúc tế bào ........................... 11 1.4.2. Các yếu tố độc lực là sản phẩm ngoại tiết ...................................... 12 1.4.3. Các yếu tố độc lực khác .................................................................. 15 1.5. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS .................................................16 1.5.1. Gen mã hoá coagulase của S. aureus .............................................. 17 1.5.2. Các gen mã hoá cho độc tố ruột của S. aureus ............................... 19 1.6. CÁC BỆNH DO S. AUREUS GÂY RA....................................................21 1.6.1. Nhiễm khuẩn ngoài da và các mô mềm .......................................... 21 1.6.2. Hội chứng da phồng rộp ................................................................. 21 1.6.3. Viêm tủy xƣơng .............................................................................. 21 1.6.4. Viêm khớp....................................................................................... 22 1.6.5. Viêm nội tâm mạc ........................................................................... 22 1.6.6. Nhiễm khuẩn huyết ......................................................................... 22 1.6.7. Viêm phổi........................................................................................ 22 1.6.8. Ngộ độc thực phẩm và viêm ruột cấp ............................................. 23 1.6.9. Hội chứng sốc nhiễm độc ............................................................... 24 1.6.10. Nhiễm trùng bệnh viện do S. aureus ............................................ 24 1.7. CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH S. AUREUS TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM .......................................................................................................24 1.7.1 Các kỹ thuật thông thƣờng xác định S. aureus ................................ 24 1.7.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử ......................................................... 26 1.8. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ VÀ GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS .........................................................................................32 1.8.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 32 1.8.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam............................................................ 35 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 38 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................38 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú của S. aureus ................................................................................... 38 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu sự phân bố gen độc lực của S. aureus ........ 38 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................38 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 38 2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu .............................................................. 38 2.2.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu.......................................................... 40 2.3. VẬT LIỆU ....................................................................................................40 2.3.1. Thiết bị ............................................................................................ 40 2.3.2. Hóa chất .......................................................................................... 41 2.4. CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU ............................................................42 2.4.1. Lấy mẫu .......................................................................................... 42 2.4.2. Phân lập, xác định S. aureus ........................................................... 43 2.4.3. Lƣu giữ các chủng .......................................................................... 46 2.4.4. Quy trình PCR xác định gen độc lực .............................................. 46 2.4.5. Kỹ thuật sequencing xác nhận kết quả của phản ứng PCR ............ 53 2.5. CÁCH KHỐNG CHẾ SAI SỐ ...................................................................55 2.6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ KIỂU CÁCH MANG S. AUREUS ...........56 2.7. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .........................................56 2.8. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ..........................56 2.9. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ........................................................................57 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................... 58 3.1. TỶ LỆ MANG, KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS ...................58 3.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu.................................... 58 3.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus và một số yếu tố liên quan ........................... 60 3.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số yếu tố liên quan ............................................................................. 66 3.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan. ................ 69 3.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay ................................................. 72 3.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay ............................................. 73 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS... 74 3.2.1. Kết quả nghiên cứu gen mã hóa coagulase của S. aureus .............. 75 3.2.2. Kết quả nghiên cứu gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus............. 79 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................... 85 4.1. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS .............85 4.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu.................................... 85 4.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus chung và một số yếu tố liên quan ................ 86 4.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số yếu tố liên quan ......................................................................................... 90 4.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan .................. 96 4.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở cả mũi và cả tay ...................................... 100 4.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay ........................................... 101 4.2. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS .............................................. 102 4.2.1. Gen mã hóa coagulase .................................................................. 103 4.2.2. Gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus .......................................... 107 KẾT LUẬN ............................................................................................ 115 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................... 116 ĐỀ XUẤT……………............................................................................ 117 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA NGHIÊN CỨU SINH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHỮ VIẾT TẮT A: Adenine bp: Base pair (cặp bazơ) C: Cytosine DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotid triphosphate ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzyme) EFT: Exfoliatin toxin G Guanine MLST: Multi-locus sequence typing (Giải trình tự gen nhiều locus) MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng methicillin) PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi) RFLP: Restriction fragment length polymorphism (Kỹ thuật xác định tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) SE: Staphyloccocal enterotoxin (Độc tố ruột của tụ cầu) T: Thymine TNF: Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử u) TSST: Toxic shock syndrome toxin (Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc điểm các các loại dung huyết tố của S. aureus ................ 14 Bảng 1.2: Vị trí di truyền của một số gen sinh độc tố ruột của S. aureus ..... 20 Bảng 2.1: Trình tự các mồi của các gen se ............................................. 51 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SIE, SEJ ................................... 52 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi SEG .... 52 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng đối với ống chuẩn ................................ 53 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng đối với các ống chứa mẫu .................... 54 Bảng 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sequence .......................... 55 Bảng 2.7: Tiêu chuẩn xác định kiểu cách cƣ trú của S. aureus ............... 56 Bảng 3.1: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới ................................. 58 Bảng 3.2: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo nhóm tuổi ....................... 58 Bảng 3.3: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo vị trí làm việc ................. 59 Bảng 3.4: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo thâm niên công tác .......... 59 Bảng 3.5. Phân bố các chủng S. aureus theo các lần và vị trí lấy mẫu ở 53 nhân viên có mẫu dƣơng tính .................................. 60 Bảng 3.6: Phân bố tỷ lệ mang S. aureus theo số lần lấy mẫu .................. 62 Bảng 3.7: Phân bố tỷ lệ mang S. aureus ở các lần lấy mẫu ..................... 62 Bảng 3.8: Tỷ lệ mang S. aureus theo giới ............................................... 63 Bảng 3.9: Tỷ lệ mang S. aureus theo nhóm tuổi ..................................... 64 Bảng 3.10: Tỷ lệ mang S. aureus theo vị trí làm việc ............................... 64 Bảng 3.11: Tỷ lệ mang S. aureus theo thâm niên công tác ....................... 65 Bảng 3.12: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo nhóm tuổi ............................................................................... 67 Bảng 3.13: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo thâm niên công tác ......................................................................... 69 Bảng 3.14: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay ..................................................... 69 Bảng 3.15: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo giới ...................................... 70 Bảng 3.16: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo nhóm tuổi ............................ 70 Bảng 3.17: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo vị trí làm việc ..................... 71 Bảng 3.18: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo thâm niên công tác ............... 72 Bảng 3.19: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay ......................................... 72 Bảng 3.20: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay tính chung .................... 73 Bảng 3.21: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo nhóm tuổi ............. 73 Bảng 3.22: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo vị trí làm việc ....... 74 Bảng 3.23: Phân bố các genotype của gen mã hóa coagulase ở 101 chủng S. aureus ...................................................................... 75 Bảng 3.24: Phân bố các genotype gen mã hóa coagulase của S. aureus ở tay và mũi ........................................................................... 78 Bảng 3.25: Phân bố nhân viên theo số lƣợng các genotype gen mã hóa coagulase ............................................................................... 79 Bảng 3.26: Tỷ lệ chung mang gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus ........ 79 Bảng 3.27: Phân bố các chủng S. aureus mang gen độc tố ruột ở mũi và ở tay .................................................................................. 81 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu tỷ lệ mang S. aureus ở tay nhân viên cơ sở dịch vụ ăn uống của một số tác giả ............................... 98 Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu genotype gen mã hóa coagulase của một số tác giả ....................................................................... 104 Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu gen độc tố ruột ở S. aureus của một số tác giả .............................................................................. 111 Bảng 4.4: Sự phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lƣợng các gen mã hóa độc tố ruột của một số nghiên cứu. .................... 113 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ mang S. aureus ......................................................... 63 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi ................. 66 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo giới .................................................................................... 66 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo vị trí làm việc ......................................................................... 68 Biểu đồ 3.5: Phân bố các genotype chính của gen mã hóa coagulase của S. aureus ...................................................................... 76 Biểu đồ 3.6: Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo loại gen mã hóa độc tố ruột ................................................................... 80 Biểu đồ 3.7: Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lƣợng các gen mã hóa độc tố ruột ....................................................... 83 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh Staphylococcus aureus dƣới kính hiển vi điện tử ...... 6 Hình 1.2: Tỷ lệ mang S. aureus ở các vị trí khác nhau trên quần thể ngƣời bình thƣờng và trên nhóm ngƣời mang S. aureus ở mũi ... 10 Hình 1.3: Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus ....................... 13 Hình 1.4: Cấu trúc của gen mã hoá coagulase và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể ......................................................................... 18 Hình 1.5: So sánh vị trí cắt của AluI giữa chủng S. aureus A và chủng S. aureus B, vị trí gắn của các primer 1, 2, 3, 4, trong phản ứng PCR. .............................................................. 19 Hình 1.6: Vị trí nhiễm trùng và các bệnh do S. aureus gây ra ................ 23 Hình 2.1: Sơ đồ phân lập, xác định S. aureus ......................................... 43 Hình 2.2: Kết quả giải trình tự gen sec ................................................... 54 Hình 3.1: Kết quả điện di các sản phẩm thu đƣợc sau PCR vòng 2 xác định gen coagulase ........................................................... 76 Hình 3.2: Kết quả cắt DNA của một số chủng S. aureus bằng enzyme AluI ........................................................................... 77 Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen seb của một số chủng S. aureus ................................................................................ 81 Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen sei của một số chủng S. aureus ................................................................................ 82 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen seg của một số chủng S. aureus ................................................................................ 82 Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen sec của một số chủng S. aureus ................................................................................ 83 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn hay gặp nhất trên cơ thể ngƣời, nó cũng là căn nguyên của nhiều loại nhiễm trùng khác nhau. S. aureus có thể gây nhiễm trùng ngoài da, ngộ độc thực phẩm, viêm tủy xƣơng, nhiễm khuẩn huyết…Tùy vào mức độ và loại nhiễm trùng mà biểu hiện trên lâm sàng khác nhau. S. aureus là thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Khoảng 30% ngƣời khoẻ mạnh mang S. aureus. S. aureus đƣợc phát hiện thấy ở nhiều vùng của cơ thể nhƣ da ở vùng cổ, ngực, bụng, bàn tay…và một số hốc tự nhiên trên cơ thể. Vị trí cƣ trú hay gặp nhất của S. aureus là lỗ mũi trƣớc. S. aureus có thể cƣ trú thƣờng xuyên, không thƣờng xuyên và không cƣ trú trên cơ thể ngƣời. Khi có tổn thƣơng da, niêm mạc, sức đề kháng của cơ thể suy giảm thì các nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Sự có mặt và số lƣợng S. aureus ở trên cơ thể phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh, miễn dịch, và nhiều yếu tố khác của cơ thể vật chủ cũng nhƣ của vi khuẩn [6]. Phần lớn các chủng S. aureus đều có một hoặc một số gen độc lực liên quan đến những tình trạng nhiễm trùng và bệnh lý khác nhau. Một số gen chịu trách nhiệm sản xuất các độc tố ruột (Staphylococcal enterotoxinsSE), gen liên quan đến hội chứng sốc nhiễm độc (Toxic shock syndrome toxin 1-tsst1), gen mã hóa coagulase gây đông huyết tƣơng ... Ngoài ra, nhiều gen khác chịu trách nhiệm việc S. aureus kháng lại nhiều kháng sinh và một số kiểu gen của S. aureus cũng liên quan đến những bệnh cảnh lâm sàng đặc thù do vi khuẩn này gây ra [57]. Trên thế giới, ngày càng có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử của S. aureus và mối liên quan giữa các yếu tố độc lực, các kiểu gen cũng nhƣ vai trò của các yếu tố này với tình trạng nhiễm trùng và kháng kháng sinh của của S. aureus [9]. 2 S. aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới và cho đến nay vẫn còn là vấn đề nan giải. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus chiếm khoảng 25% số vụ và 10% số bệnh nhân ngộ độc phải nhập viện điều trị, có trƣờng hợp nặng nguy hiểm đến tính mạng. Ở Việt Nam, S. aureus là nguyên nhân chính gây ô nhiễm thực phẩm. Do khí hậu nóng ẩm, thiếu các điều kiện bảo quản phù hợp, sự có mặt của S. aureus với số lƣợng lớn trong thực phẩm là nguy cơ tiềm ẩn bùng phát các vụ ngộ độc tập thể gây tổn thất nặng về kinh tế. Những ngƣời làm việc chế biến thực phẩm, bán hàng ăn, tiếp xúc trực tiếp với thức ăn luôn là nguồn gây ô nhiễm S. aureus trong quá trình chế biến, sản xuất, đóng gói, vận chuyển và bảo quản thực phẩm [15]. Ở nƣớc ta đã có nhiều nghiên cứu về vai trò gây bệnh và tính kháng thuốc của S. aureus nhƣng chƣa có nghiên cứu về kiểu cách cƣ trú và rất ít nghiên cứu về gen độc lực của vi khuẩn này. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài „„Xác định kiểu cách cƣ trú và gen độc lực của Staphylococcus aureus ở nhóm ngƣời làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống” với hai mục tiêu sau: 1. Xác định tỷ lệ mang, kiểu cách cư trú của S. aureus ở mũi và tay của nhóm người làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống tại Hà Nội. 2. Xác định sự phân bố, tính đa hình của gen mã hóa coagulase và gen mã hóa độc tố ruột của các chủng S. aureus phân lập được. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH THƢỜNG 1.1.1. Khái niệm về vi hệ Vi hệ ở ngƣời bình thƣờng (normal microbial flora) là những quần thể vi sinh vật sinh sống trên cơ thể ngƣời khỏe mạnh. Chúng có mặt ở trên da và niêm mạc của hầu hết các cơ quan có tiếp xúc với môi trƣờng ngoài [32]. Thành phần của vi hệ bình thƣờng đƣợc chia làm hai nhóm: i) Các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên (thƣờng trú - resident flora) và ii) các vi sinh vật vãng lai (tạm trú - transient flora). Các vi sinh vật thƣờng trú có sự ổn định tƣơng đối về chủng loại và tƣơng quan số lƣợng (mật độ) giữa chúng, tùy thuộc vào vị trí cƣ trú và lứa tuổi của chủ thể. Các vi sinh vật tạm trú có nguồn gốc từ môi trƣờng, chúng cƣ trú trên da và niêm mạc từ vài giờ, vài ngày đến vài tuần, chúng không có sự ổn định về chủng loại và tƣơng quan số lƣợng và không trở thành thƣờng trú. Bình thƣờng các vi sinh vật tạm trú không gây bệnh nhƣng một số trong chúng có thể trở thành gây bệnh khi sự cân bằng của các vi sinh vật thƣờng trú bị phá vỡ [48]. Thành viên của vi hệ bình thƣờng có thể thay đổi do nhiều yếu tố khác nhau nhƣ yếu tố di truyền, tuổi tác, giới tính, dinh dƣỡng, chế độ ăn uống và thậm chí cả yếu tố căng thẳng thần kinh của mỗi ngƣời. 1.1.2. Các vi hệ ở ngƣời Vi khuẩn có ở nhiều cơ quan trên cơ thể ngƣời nhƣ da, hệ tiêu hóa, hô hấp, tiết niệu, sinh dục. Trong nghiên cứu này chúng tôi đề cập chính đến vi hệ ở da và đƣờng hô hấp. 1.1.2.1. Vi hệ ở da Vi hệ ở da chủ yếu là các vi khuẩn Gram dƣơng, thƣờng là tụ cầu da 4 (Staphylococcus epidermidis), trực khuẩn kỵ khí (Propionibacterium acnes gây mụn trứng cá). Ngoài ra còn có tụ cầu vàng (S. aureus), liên cầu nhóm viridians, trực khuẩn giả bạch hầu và vi khuẩn sinh nha bào có trong không khí. Ƣớc tính trên da ngƣời có khoảng 1010 vi khuẩn. Các yếu tố trên da góp phần hạn chế sự cƣ trú của các vi sinh vật khác là: pH thấp, acid béo trong các chất tiết của tuyến bã nhờn và lysozym. Nồng độ muối cao và độ ẩm làm cho bề mặt da có tính ƣu trƣơng và có thể tiêu diệt một số vi khuẩn. Lysozym do tuyến mồ hôi tiết ra diệt đƣợc những vi khuẩn Gram dƣơng khác. Tuyến mồ hôi tiết ra những peptide chống lại vi khuẩn, đƣợc gọi là cathelicidin. Lipid đƣợc phân cắt thành các acid béo không bão hòa có khả năng diệt các vi khuẩn Gram âm và một số nấm [48]. 1.1.2.2. Vi hệ ở đường hô hấp Có nhiều loài vi khuẩn sinh sống ở hốc mũi và ở họng mũi (nasopharynx). Đƣờng hô hấp dƣới nhƣ khí quản, phế quản, mô phổi và trong xoang ngƣời khỏe mạnh không có vi sinh vật [12]. Vi khuẩn hay gặp nhất ở đƣờng hô hấp trên, đặc biệt ở họng là các liên cầu tan máu anpha và không tan máu; các cầu khuẩn Gram-âm, tụ cầu, trực khuẩn giả bạch hầu, phế cầu, Haemophilus và Bacteroides. Vi hệ ở hốc mũi thƣờng gặp là các tụ cầu, liên cầu và Corynebacterium. Đáng lƣu ý là tụ cầu vàng vì khả năng gây bệnh và lan truyền của nó [13]. 1.1.3. Vai trò của vi hệ với sức khỏe 1.1.3.1. Lợi ích của vi hệ Ngƣời ta đã chứng minh rằng các vi khuẩn ở ruột có nhiều ích lợi cho cơ thể. Các enzym của chúng đã làm giáng hóa thức ăn để sản sinh ra các vitamin nhóm B, K và các acid amin mà cơ thể cần [28]. Hệ vi khuẩn bình thƣờng của cơ thể còn có một vai trò quan trọng là 5 chống nhiễm trùng, bảo vệ cơ thể không cho vi khuẩn lạ, vi khuẩn gây bệnh xâm nhập do cơ chế “cạnh tranh vi sinh học” [28]. Chúng cạnh tranh nơi cƣ trú, cạnh tranh dinh dƣỡng với các vi khuẩn gây bệnh hoặc sản sinh ra các chất chống vi sinh vật gây bệnh nhƣ bacteriocins đặc hiệu, peroxide hay một số acid béo. Thành ruột của ngƣời có nhiều tổ chức lympho, nhiều đại thực bào. Vi hệ bình thƣờng đã kích hoạt hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể [48]. 1.1.3.2. Tác hại của vi hệ Trong một số trƣờng hợp nhất định vi sinh vật thuộc vi hệ lại có thể trở thành tác nhân gây bệnh, đó là khi cơ thể suy giảm sức đề kháng, môi trƣờng thay đổi và chúng xâm nhập đƣợc vào máu hay mô. Vì vậy, một số vi sinh vật thuộc vi hệ bình thƣờng còn đƣợc coi là những kẻ “gây bệnh cơ hội” (opportunist) [49]. Vi hệ bình thƣờng, đặc biệt ở những ngƣời thƣờng hay sử dụng kháng sinh, mang những vi khuẩn chứa gen đề kháng kháng sinh và đó là nguồn dự trữ, có thể sẵn sàng “chuyển giao” cho vi khuẩn gây bệnh khi có điều kiện. Ví dụ tụ cầu kháng penicillin hoặc E. coli mang plasmid đa kháng kháng sinh. Nhƣ vậy hệ vi khuẩn bình thƣờng cũng tham gia vào quá trình dự trữ và lan truyền các gen đề kháng kháng sinh [28]. 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS 1.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại Tụ cầu (Staphylococci) là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời đƣợc biết đến từ rất sớm. Năm 1878, Robert Koch phát hiện đƣợc Staphylococci trong mủ của một bệnh nhân. Hai năm sau - 1880, Louis Pasteur đã nuôi cấy đƣợc vi khuẩn này trên môi trƣờng lỏng nhân tạo. Sau đó, năm 1881, Ogston chứng minh vai trò gây bệnh thực nghiệm cho chuột và đặt tên cho những cầu khuẩn này là Staphylococcus [5]. Chi Staphylococcus bao gồm ít nhất 20 loài, trong đó S. aureus là loài gây bệnh hay gặp nhất ở ngƣời [56]. 6 1.2.2. Tính chất sinh học của S. aureus S. aureus là những cầu khuẩn Gram dƣơng, có đƣờng kính 0,8-1m, xếp thành hình chùm nho, không có lông, không sinh nha bào và thƣờng không có vỏ. Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 100C-450C và nồng độ muối cao tới 10%, thích hợp ở cả điều kiện hiếu và kỵ khí. Trên môi trƣờng thạch thƣờng, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đƣờng kính 1-2mm sau 24h ở 370C, thƣờng có màu vàng chanh. Trên môi trƣờng thạch máu tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại hemolysin: α, β, δ, ε, γ. Trên môi trƣờng canh thang: tụ cầu vàng làm đục môi trƣờng, để lâu, có thể lắng cặn. Tụ cầu có hệ thống enzyme phong phú. Những enzyme đƣợc dùng trong chẩn đoán nhƣ coagulase có khả năng làm đông huyết tƣơng ngƣời và động vật khi đã đƣợc chống đông. Vi khuẩn sinh catalase nên có khả năng chuyển hoá H2O2 thành nƣớc và oxy [5]. Hình 1.1: Hình ảnh Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử [116] 7 Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn khác thƣờng bị diệt ở 600C trong 30 phút). Khả năng đề kháng với nhiệt độ thƣờng phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (45 0C) mà vi khuẩn có thể phát triển. 1.2.3. Đặc điểm di truyền của S. aureus Trong những năm gần đây, toàn bộ trình tự gen của một số chủng S. aureus đã đƣợc giải trình tự hoàn toàn. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu sâu thêm về cấu trúc cũng nhƣ chức năng của vật liệu di truyền của S. aureus. Trình tự bộ gen đầu tiên của S. aureus đƣợc công bố năm 2001 là của chủng Mu50 và N315 (Kuroda và cộng sự). Cho tới nay đã có hơn 10 chủng đƣợc giải trình tự gen. Khi so sánh các trình tự gen nói trên, các nhà khoa học nhận thấy, có những gen có mặt ở tất cả các chủng S. aureus nhƣng cũng có những gen chỉ có ở chủng này mà không có ở những chủng khác. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy 22% bộ gen của S. aureus chứa những vùng hay thay đổi. Bộ gen của 5 chủng S. aureus đƣợc giải trình tự hoàn toàn có kích cỡ từ 2820 đến 2903 bp với G+C chứa khoảng 33% và có từ 2592 đến 2748 trình tự mã hoá cho các protein. Trong đó, 75% các trình tự là rất ít thay đổi giữa các chủng S. aureus. Tập hợp toàn bộ các trình tự này gọi là vùng gen gốc [102]. 1.3. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÖ CỦA S. AUREUS 1.3.1. Tỷ lệ mang Sự phối hợp giữa việc mang S. aureus và các nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra đã đƣợc Danbolt đề cập từ năm 1931. Kể từ năm 1947 trở đi, khi tỷ lệ S. aureus kháng penicilin đã trở thành vấn đề đáng lo ngại, việc hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của các bệnh do S. aureus ngày càng trở nên cần thiết [70]. 8 S. aureus là thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Khoảng 20 - 30% ngƣời khoẻ mạnh mang S. aureus. S. aureus đƣợc phát hiện thấy ở nhiều vùng của cơ thể nhƣ da ở vùng cổ, ngực, bụng, bàn tay…và một số hốc tự nhiên trên cơ thể. Vị trí cƣ trú hay gặp nhất của S. aureus là lỗ mũi trƣớc [5]. Các công trình nghiên cứu sau này cho thấy, các chủng S. aureus cƣ trú ở mũi và các chủng S. aureus gây nhiễm trùng trên bệnh nhân đó đều có chung týp phage và kiểu gen [118]. Mang vi khuẩn ở mũi cũng là yếu tố nguy cơ cao của nhiễm khuẩn huyết trong nhiễm trùng bệnh viện. Thậm chí, những ngƣời nằm viện lâu ngày đƣợc coi là nguồn chứa S. aureus [16]. S. aureus là một trong những căn nguyên hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm. Từ lâu, mối liên quan mật thiết giữa ngƣời mang vi khuẩn và ngộ độc thực phẩm do S. aureus đã đƣợc đề cập và quan tâm nghiên cứu [95]. Đặc biệt những ngƣời trực tiếp tiếp xúc với thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, vận chuyển, phân phát và bảo quản thực phẩm [76]. Tỷ lệ mang và đặc điểm cƣ trú của S. aureus khác nhau ở các cá thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau ở cả vật chủ và vi khuẩn. 1.3.2. Đặc điểm và kiểu cách cƣ trú S. aureus có mặt ở nhiều nơi trên cơ thể nhƣ lỗ mũi, da và các hốc tự nhiên khác. Tuy nhiên, vi khuẩn này có thể tồn tại thƣờng xuyên hoặc không thƣờng xuyên trên cơ thể vật chủ, ở một số cá thể, ngƣời ta không thấy có sự tồn tại của vi khuẩn này [36]. Các cơ chế liên quan đến khả năng và đặc điểm cƣ trú của S. aureus rất phức tạp. Một nghiên cứu gần đây trên ngƣời tình nguyện đƣợc gây nhiễm với S. aureus cho thấy, ở những ngƣời không có S. aureus trên cơ thể, S. aureus gây nhiễm bị loại trừ rất nhanh khỏi cơ thể. Ở những ngƣời mà S. aureus có kiểu cách cƣ trú thƣờng xuyên, chỉ có chủng S. aureus đƣợc phân 9 lập từ chính họ có khả năng tồn tại trên cơ thể trong khi các chủng khác gây nhiễm bị loại trừ [88]. Có bốn yếu tố quyết định đến sự cƣ trú ở mũi của S. aureus: cần có sự tiếp xúc của mũi với vi khuẩn, S. aureus phải bám đƣợc vào thụ thể ở niêm mạc mũi, S. aureus phải vƣợt qua đƣợc cơ chế bảo vệ của vật chủ, cuối cùng S. aureus phải có khả năng nhân lên ở mũi [31]. Mũi là vị trí thích hợp để S. aureus cƣ trú nhờ sự gắn kết giữa carbohydrat của màng nhày mũi và protein của vi khuẩn. Mặt khác, cơ chế đề kháng tại chỗ cũng tác động đến sự mang vi khuẩn ở vị trí này. Dịch tiết của mũi đóng vai trò quan trọng trong hệ thống bảo vệ của vật chủ. Trong dịch tiết có chứa IgA, IgG, lysozyme, lactoferrin và các peptid bảo vệ. Những ngƣời mang S. aureus thƣờng là những ngƣời bị kích ứng mũi và hay có thói quen xì mũi. Điều này có thể dẫn đến những tổn thƣơng và thay đổi ở niêm mạc và màng nhày ở mũi. Hàng rào bảo vệ ở niêm mạc mũi suy yếu dẫn đến vi khuẩn dễ xâm nhập [57]. Tỷ lệ mang S. aureus liên quan đến số lần tay tiếp xúc với mũi nhƣ khi xì mũi, ngoáy mũi. Cũng có thể tay mang vi khuẩn ở ngoài môi trƣờng đến mũi. Khả năng mang vi khuẩn phụ thuộc vào thời gian, tần xuất và cƣờng độ của xì mũi. Tổn thƣơng ở mũi không phải là nguyên nhân duy nhất dẫn đến tỷ lệ mang vi khuẩn cao ở mũi. Hầu hết các trƣờng hợp mang vi khuẩn này ở mũi là nguyên nhân nội sinh. Lỗ mũi là nguồn dự trữ vi khuẩn cho nên biện pháp tốt nhất để phòng tránh bệnh do vi khuẩn này gây nên là giảm tỷ lệ mang chúng ở mũi. Hầu hết các trƣờng hợp khi giảm đƣợc tỷ lệ mang vi khuẩn ở mũi thì cũng đồng thời cũng giảm đƣợc nguy cơ nhiễm trùng. Có nghiên cứu cho thấy 100% các chủng phân lập đƣợc trong nhiễm trùng do S. aureus là thuộc vi hệ cơ thể và có đặc tính di truyền giống với các chủng phân lập đƣợc ở mũi [99]. 10 Hình 1.2: Tỷ lệ mang S. aureus ở các vị trí khác nhau trên quần thể người bình thường và trên nhóm người mang S. aureus ở mũi [57] Nhiều biện pháp ngắt quãng lƣu hành vi khuẩn làm giảm tỷ lệ mang vi khuẩn nhƣ điều trị kháng sinh tại chỗ, sử dụng hóa chất diệt khuẩn, kháng sinh hệ thống, globulin miễn dịch [64]. Ngƣời ta cũng ứng dụng biện pháp phổ biến nhƣ dùng mupirocin (pseudomonic acid) để làm giảm tỷ lệ mang S. aureus ở mũi cho những đối tƣợng có nguy cơ nhiễm trùng hoặc với mục đích phòng bệnh. Hiệu quả điều trị đạt đến 97%, tuy nhiên có hiện tƣợng kháng lại thuốc khi dùng trong thời gian dài và trên diện rộng [99]. Ngày nay probiotics ví dụ nhƣ hỗn dịch gồm các vi khuẩn Bifidobacterium sp B420, Lactobacillus CG (ATCC 53103), Lactobacillus acidophilus 145 và Streptococcus thermophilus đƣợc ứng dụng phối hợp trong điều trị với mục tiêu làm giảm khả năng cƣ trú của những vi khuẩn có khả năng gây bệnh cƣ trú ở mũi nhƣ S. aureus, S. pneumoniae, Streptococcus tan máu beta, H. influenzae [49]. 11 1.4. CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS S. aureus có nhiều yếu tố tham gia tạo độc lực. Có thể chia thành ba nhóm: thành phần cấu trúc tế bào, sản phẩm ngoại tiết và các yếu tố khác. 1.4.1. Các yếu tố độc lực là thành phần cấu trúc tế bào 1.4.1.1. Peptidoglycan Peptidoglycan là một trong những thành phần chính cấu tạo nên vách tế bào S. aureus. Đây là polymer của N-acetylglucosamine và Nacetylmuramic acid. Các chuỗi đƣợc nối với nhau bởi các cầu peptide (interpeptide bridge). Nhờ vậy mạng lƣới ba chiều tạo thành bộ khung vững chắc và đóng vai trò là kháng nguyên thân đặc hiệu [108]. Peptidoglycan đã đƣợc xác định có một số tính chất giống nhƣ nội độc tố, có khả năng hoạt hóa bổ thể. Sự hoạt hóa bổ thể có vai trò rất lớn trong cơ chế sinh bệnh của sốc và ngƣng tập tiểu cầu tự phát trong đông máu nội quản rải rác [107]. 1.4.1.2. Acid teichoic Acid teichoic đƣợc xác định có mặt ở vách và màng nguyên tƣơng của S. aureus. Acid này liên kết đồng hóa trị với các lớp peptidoglycan. Acid teichoic là kháng nguyên ngƣng kết chủ yếu của S. aureus. Đây còn là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này gắn vào polysaccharide vách S. aureus. Đây là thành phần đặc hiệu của kháng nguyên O. Acid teichoic đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoạt hóa bổ thể, kích thích sản xuất kháng thể [71]. 1.4.1.3. Protein A Protein A đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1958 bởi Klaus Jensen qua việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên này trong toàn bộ 500 mẫu huyết thanh ngƣời [65]. Năm 1983, đã giải mã đƣợc một phần gen protein A ở S. aureus. Đây là kháng nguyên bề mặt đặc trƣng cho S. aureus, có trọng lƣợng phân tử khoảng 42 kDa. Tất cả các chủng S. aureus có protein này nên nó là một tiêu chuẩn để xác định S. aureus. Protein A có khả năng gắn với phần Fc 12 của IgG dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu do là mất sự opsonin hoá, nên làm giảm thực bào, giúp cho vi khuẩn thoát khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ. Sự gắn Fc của IgG vào protein A là cơ sở của phản ứng đồng ngƣng kết đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng. Protein A cũng có khả năng hoạt hóa các bổ thể [7]. 1.4.1.4. Vỏ Chỉ có một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát đƣợc bằng phƣơng pháp nhuộm vỏ. Vỏ S. aureus có bản chất là polysaccharid. Đặc trƣng cho vỏ của S. aureus là sự có mặt của axid uron. Polysaccharide của vỏ S. aureus có ít nhất 11 serotype. S. aureus gây bệnh cho ngƣời thƣờng là những chủng có vỏ mỏng, thuộc serotype 5 hoặc 8. Vỏ có có tác dụng chống thực bào bởi che phủ lớp peptidoglycan của vách làm cho bổ thể không có chỗ bám để hoạt hóa theo con đƣờng tắt [7]. 1.4.1.5. Yếu tố bám (adhesin) Giống nhƣ nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc hiệu, có tác dụng bám vào thụ thể đặc hiệu tế bào. Adhesin có thể là các protein: laminin, fibronectin, collagen (fibronectin binding Protein A and B FnBPA, FnBPB; Clumping factor A and B, ClfA, ClfB; Collagen Binding Proteins, Bone sialprotein binding proteins, Bbp; Plasmid-sensitive Protein, Pls; Elastin binding Protein, EbpS; Extracellular matrix-binding Proteins, Ehb) [5]. 1.4.2. Các yếu tố độc lực là sản phẩm ngoại tiết 1.4.2.1. Độc tố ruột (Enterotoxin) Ngộ độc thức ăn do Staphyloccocus đƣợc phát hiện lần đầu tiên năm 1884 (Vaughn). Đến năm 1930, Dack và cộng sự mới xác định đƣợc nhiễm trùng nhiễm độc do tụ cầu có thể gây ra bởi nƣớc lọc môi trƣờng nuôi cấy tụ cầu vàng và đó chính là độc tố ruột. Độc tố ruột có thể đƣợc hình thành trong thực phẩm, trong môi trƣờng nuôi cấy và trong cơ thể ngƣời. Độc tố ruột là những protein có trọng lƣợng phân tử từ 28000-30000 dalton, có một hàm 13 lƣợng lớn lysin, asparin, glutamic và thyroxin. Đặc tính quan trọng của enterotoxin là bền vững tƣơng đối với nhiệt độ và không bị phá hủy bởi men tiêu hóa [35]. Có ít nhất 20 loại độc tố ruột của S. aureus (SE) đã đƣợc mô tả ký hiệu từ SEA tới SEV và độc tố gây sốc nhiễm độc -1 (TSST-1). SEA, SED và SEE có 70 - 90% tính tƣơng đồng về trình tự amino acid, trong khi đó SEB, SEC và TSST-1 chỉ có 40 - 60% trình tự tƣơng đồng. Chiều dài các SE xấp xỉ 220-240 amino acid tùy thuộc vào từng loại, kích thƣớc phân tử trung bình khoảng 25kD. Các SE có sự biến đổi trình tự lớn nhƣng đoạn gấp khúc có cấu trúc bậc ba giống nhau [101]. Độc tố ruột của S. aureus là các siêu kháng nguyên, có khả năng kích thích các quần thể lympho T (khoảng 20 - 30%) sản sinh một lƣợng lớn cytokine [63]. Hình 1.3: Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus [5] 1.4.2.2. Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc (Toxic shock syndrome toxin-TSST) Hội chứng sốc nhiễm độc lần đầu tiên đƣợc mô tả bởi Todd và cộng sự năm 1978. Sau này vào năm 1981, hai nhóm nghiên cứu thông báo phát hiện 2 độc tố gây bệnh này ở những bệnh nhân mắc hội chứng sốc nhiễm độc. Đó là 2 protein đƣợc xác định là pyrogenic exotoxin type C và 14 enterotoxin F của tụ cầu. Những nghiên cứu sâu hơn tiếp theo đã xác định và gọi độc tố này là TSST-1. Cả TSST-1 và các nội độc tố đều gây hội chứng sốc nhiễm độc. TSST kích thích đại thực bào giải phóng TNF và sản xuất các interleukin I, II, gây sốt, tăng tính mẫn cảm của vật chủ với tác động của các nội độc tố và làm lan rộng các thƣơng tổn ở nhiều cơ quan. Độc tố gây shock nhiễm độc thƣờng gặp ở những phụ nữ có kinh dùng băng vệ sinh bị nhiễm khuẩn hoặc những ngƣời bị nhiễm trùng vết thƣơng [63]. 1.4.2.3. Dung huyết tố Các độc tố tác động tới màng tế bào, bao gồm các dung huyết tố (staphylolysin) alpha-toxin, beta-toxin, gamma-toxin, delta-toxin có khả năng ly giải hồng cầu ngƣời, gây hoại tử da, gây độc với bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, lympho bào, tế bào thần kinh..., và một vài độc tố tái tổ hợp. Bảng 1.1: Đặc điểm các các loại dung huyết tố của S. aureus [5] Loại dung huyết tố Loại hồng cầu nhạy cảm α Thỏ, cừu bò β Cừu, ngƣời, bò γ Thỏ, cừu, ngƣời, bò, chuột, ngựa… δ Ngƣời, thỏ, ngựa, cừu, chuột… Loại bạch cầu nhạy cảm Thỏ, ngƣời Không Thỏ, chuột, ngƣời Nguồn gốc vi khuẩn Gây độc súc vật thí nghiệm Ngƣời Gây hoại tử da thỏ gây chết chuột và thỏ, gây độc tế bào nuôi cấy Động vật Liều cao gây chết thỏ, hoại tử từng đám tế bào nuôi cấy Ngƣời Hoại tử nhẹ da thỏ và da chuột, gây chết thỏ Ngƣời Làm xơ cứng da thỏ và da chuột, gây hoại tử tế bào nuôi cấy 15 1.4.2.4. Các độc tố gây hoại tử da và sinh mủ Các độc tố gây hoại tử da (exfoliatin toxin hay epidermolitic toxin) là một ngoại độc tố. Nó gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da (Scalded skin syndrome) ở trẻ em. Hội chứng này đã đƣợc biết khá lâu, nhƣng mãi đến năm 1971 ngƣời ta mới biết đến exfoliatin. Độc tố này đƣợc tạo bởi gen của 85% của các chủng tụ cầu vàng thuộc loại phage nhóm II. Nó gồm hai loại A và B và đều là polypeptide có trọng lƣợng phân tử là 24000 dalton và có tính đặc hiệu kháng nguyên riêng biệt. Sự hoạt hoá protease của độc tố exfoliatins gây bong da ở hội chứng này. Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): vào 1979, Schlivent và cộng sự đã tách biệt đƣợc một độc tố từ tụ cầu vàng. Về nhiều phƣơng diện độc tố này tƣơng tự pyogenic exotoxin của liên cầu. Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm về một số phƣơng diện đối với nội độc tố nhƣ gây shock và hoại tử gan và cơ tim. Sau đó ngƣời ta đã phân biệt đƣợc ba loại pyogenic exotoxin ký hiệu là A, B, C. Ba loại này khác nhau về trọng lƣợng phân tử (theo thứ tự 12000, 18000 và 22000 dalton), về tính đặc hiệu kháng nguyên, nhƣng giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào [5]. 1.4.3. Các yếu tố độc lực khác 1.4.3.1. Coagulase Năm 1944 Smith và Hale đã nêu lên tính chất của coagulase. Từ năm 1954 Duthie đã tiến hành những công trình so sánh giữa coagulase tự do (xác định bằng phản ứng coagulase trong ống nghiệm) và coagulase liên kết-yếu tố ngƣng kết tế bào (Clumping-factor) (xác định bằng phản ứng Clumping trên phiến kính). Coagulase không phải là chất độc, chúng có thể đóng vai trò trong quá trình gây bệnh của Staphylococci và là đặc điểm để xác định S. aureus. Tế bào Staphylococci đƣợc bao phủ bởi fibrin thoát khỏi phagocytosis (thực bào) và các fibrin lắng xuống ở vị trí nhiễm 16 Staphylococci có thể giúp cho việc phát hiện vết thƣơng [7]. 1.4.3.2. Alpha toxin Độc tố này gây ly giải các bạch cầu có nhân đa hình và tiểu cầu, từ đó gây ra các ổ áp xe, gây ra các hoại tử da và tan máu. 1.4.3.3. Độc tố bạch cầu Độc tố này gây độc cho bạch cầu ngƣời và thỏ và không gây độc cho bạch cầu các loài động vật khác. Nó cũng có tác dụng hoại tử da thỏ. 1.4.3.4. Enzym staphylokinase Nhiều chủng Staphylococcus aureus sản xuất một yếu tố hoạt hóa plasminogen gọi là là staphylokinase. Yếu tố này phân giải fibrin. 1.4.3.5. Độc tố tái tổ hợp Panton-Valentine leukocidin (PVL) Liên quan chặt chẽ với bệnh viêm phổi hoại tử ở gà, viêm phổi hoại tử nguy hiểm ở trẻ em. Gen mã hoá thành phần của PVL có mặt trên một bacteriophage tìm thấy ở chủng MRSA có liên quan tới nhiễm khuẩn ở cộng đồng. 1.4.3.6. Staphyloxanthin Một số chủng S. aureus tiết ra staphyloxathin, là một yếu tố độc lực, có tính chất nhƣ một chất chống oxy hóa giúp vi khuẩn tồn tại trong môi trƣờng bất lợi. Chúng tạo đặc tính mầu vàng cho S. aureus. 1.4.3.7. Một số enzyme ngoại bào khác Staphylococcus aureus có thể tiết ra các enzym: hyaronidase, nuclease, lipase, protease, staphylokinase, elastase, chất hoạt hóa plasminogen, enzyme deoxyrybonuclease (DNase) và enzyme thay đổi axit béo (FAME), đóng vai trò không đáng kể trong việc gây bệnh [101]. 1.5. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS Các yếu tố độc lực của S. aureus đƣợc kiểm soát bởi các gen trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Chúng góp phần quan trọng vào cơ chế bệnh 17 sinh của vi khuẩn này. Tuy nhiên, cho tới nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết một cách chắc chắn về gen nào hoặc tổ hợp các gen nào đóng vai trò quyết định trong cơ chế nhiễm trùng của S. aureus hoặc là đích tác động của các phƣơng pháp điều trị mới. Một số gen tiêu biểu nhƣ spa (liên quan đến protein A, gắn vào đầu Fc của kháng thể); sir, sbn (chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp và vận chuyển siderophore, liên quan đến việc chuyển hoá sắt); sodM (liên quan đến khả năng tồn tại của vi khuẩn trong bạch cầu đa nhân trung tính); cap (liên quan đến lớp vỏ polysaccharide); coa (liên quan đến việc sản xuất coagulase); ssp (liên quan đến sản xuất protease); srtB (liên quan đến việc gắn một số loại protein lên bề mặt vách tế bào); fib (chịu trách nhiệm cho protein gắn fibrinogen); hla (chịu trách nhiệm cho tính tan máu alpha của vi khuẩn); sbi (liên quan đến protein gắn các phân tử Ig); hlg (chịu trách nhiệm cho tính tan máu gamma); ica (liên quan đến tổng hợp protein kết dính giữa các tế bào). Ngoài các gen quan trọng hay vùng gen chính của vi khuẩn, một số chủng S. aureus còn có các gen khác liên quan đến một số yếu tố độc lực, các enzyme ngoại bào... Các gen này chỉ có ở một số chủng S. aureus nhất định [93]. Trong những năm gần đây, toàn bộ trình tự gen của một số chủng S. aureus đã đƣợc nghiên cứu hoàn chỉnh. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu sâu thêm về cấu trúc cũng nhƣ chức năng của vật liệu di truyền của S. aureus. Tất cả các yếu tố độc lực của S. aureus đều có gen hoặc các gen kiểm soát trực tiếp hoặc gián tiếp qua các enzyme. Trong mục này chúng tôi chỉ trình bày các gen độc lực có tầm quan trọng trong nghiên cứu này [98]. 1.5.1. Gen mã hoá coagulase của S. aureus Sản phẩm coagulase là một chỉ điểm mà nhiều phòng xét nghiệm vi sinh sử dụng để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. Nó còn là tiêu chuẩn phân loại các chủng S. aureus gây nhiễm khuẩn ở ngƣời [31]. Ngƣời ta đã xác định đƣợc nhiều dạng alen của gen mã hóa enzyme này ở S. aureus. Mỗi chủng S. aureus có thể tạo ra một biến thể enzyme. 18 Một số thí nghiệm phân tích trình tự DNA của các gen này từ các chủng S. aureus cho thấy nguyên nhân là do thay đổi trình tự gen trong vùng mã hóa ở vùng 3‟ của gen mã hóa coagulase [74]. Gen mã hoá coagulase của S. aureus có 6 phân đoạn cơ bản. Tín hiệu của chuỗi trình tự bắt đầu từ đầu tận N đến vùng D1, vùng D2, vùng trung tâm, vùng lặp lại (những đoạn nucleotid dài 81bp), và vùng cuối C. Tính đa hình của gen mã hoá coagulase đã đƣợc một số tác giả đề cập. Giữa các chủng S. aureus khác nhau, trình tự các nucleotid (tƣơng ứng là trình tự các acid amin trong chuỗi polypeptit) tại vùng D1, D2 khá đa dạng. Trong đó, vùng trung tâm tƣơng đối ổn định. Tại vùng lặp lại, số lƣợng các đoạn 81 bp là khác nhau giữa các chủng. Hình 1.4: Cấu trúc của gen mã hoá coagulase và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể [50] (A. Mô hình gen coagulase. B. Vị trí của gen mã hoá coagulase trên nhiễm sắc thể của S. aureus) 19 Việc phân loại các genotype của S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase có ƣu điểm đơn giản, nhanh, có khả năng phân loại chính xác các chủng S. aureus dựa vào các mảnh DNA đƣợc cắt bằng enzyme AluI [122]. Việc phân loại này có thể đƣợc ứng dụng trong xác định dịch tễ học phân tử và phân loại các chủng S. aureus phân lập từ các nguồn khác nhau [73]. vùng lặp lại vùng lặp lại Hình 1.5: So sánh vị trí cắt của AluI giữa chủng S. aureus A và chủng S. aureus B, vị trí gắn của các primer 1, 2, 3, 4, trong phản ứng PCR [50]. 1.5.2. Các gen mã hoá cho độc tố ruột của S. aureus Các gen mã hoá cho độc tố ruột của S. aureus nhƣ sea, seb, sec,…Các gen này mã hoá cho hơn 20 loại độc tố ruột khác nhau. Hầu hết các gen mã hóa cho độc tố ruột đƣợc xác định vị trí ở các yếu tố di truyền di động nhƣ : plasmid, bacteriophages, hay các gen độc lực đứng rải rác hoặc tập trung 20 thành một nhóm (gọi là cụm gen độc lực - pathogenicity island). Do đó, sự di truyền ngang giữa các chủng là phổ biến [34]. Bảng 1.2: Vị trí di truyền của một số gen sinh độc tố ruột của S. aureus [61] Vị trí Gene Tác giả sea Prophage Betley and Mekalanos, 1985; Borst and Betley, 1994 seb Chromosome, plasmid, transposon Shafer and Iandolo, 1978 Shalita et al., 1977; Altboum et al., 1985 Plasmid Altboum et al., 1985 Pathogenicity island Fitzgerald et al., 2001 sed Plasmid (pIB485) Bayles and Iandolo, 1989 see Defective phage Couch et al., 1988 seg Enterotoxin gene cluster (egc), chromosome Jarraud et al., 2001 sei egc, chromosome Jarraud et al., 2001 sec1 secbovine Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hầu hết các chủng S. aureus thu đƣợc từ ba bệnh viện khác nhau đã có nhiều hơn một gen mã hóa cho độc tố ruột. Số lƣợng trung bình các gen mã hóa độc tố ruột ở các chủng S. aureus trong nghiên cứu này là 5, một số chủng chứa tới 12 gen độc tố ruột [77]. Hiện nay kỹ thuật PCR xác định các gen sinh độc tố ruột, yếu tố độc lực đóng vai trò quan trọng trong bệnh lý ngộ độc thực phẩm do S. aureus: sea, seb, sec, sed, see, seg, she, sei, sej… của S. aureus [33]. 21 1.6. CÁC BỆNH DO S. AUREUS GÂY RA Theo số liệu thống kê trong số 16 vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp ở Việt Nam tỷ lệ S. aureus chiếm từ 18,5 - 21,7%, đứng thứ hai chỉ sau E. coli và có thể gây nên nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau. Nhiễm khuẩn do S. aureus chiếm 20,4% trong các bệnh nhiễm khuẩn tại Bệnh viện Bạch Mai [4]. Tỷ lệ tử vong ở trẻ em cao 7,6% ở viêm màng não và 11,8% trong nhiễm khuẩn hô hấp [7]. 1.6.1. Nhiễm khuẩn ngoài da và các mô mềm Vi khuẩn gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ áp xe, eczema, hậu bối… Hậu bối và viêm nang nông có thể gây nên các biến chứng nguy hiểm. Tỷ lệ nhiễm S. aureus ở tổn thƣơng da trên bệnh nhân viêm da cơ địa rất cao là 85,7%. Ở trẻ em, S. aureus có thể gây ra hội chứng phỏng da với biến chứng rất nghiêm trọng [16]. 1.6.2. Hội chứng da phồng rộp Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome-Ritter disease) đã đƣợc biết đến khá lâu. Một số chủng S. aureus tiết độc tố exfoliatin gây viêm da hoại tử, ly giải và phồng rộp. Bệnh này thƣờng gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lƣợng xấu. Các tác dụng gây phồng rộp và làm hỏng biểu bì của độc tố "gây bong da" EFT là những hình ảnh đặc biệt của bệnh mụn nhọt do S. aureus. Từ các nhiễm khuẩn da này có thể gây nên nhiễm trùng huyết. Tỷ lệ tử vong có thể đến 67% [117]. 1.6.3. Viêm tủy xƣơng Hầu hết các trƣờng hợp nhiễm trùng khớp và xƣơng có nguồn gốc từ máu lan truyền đến. Những chấn thƣơng, gẫy xƣơng, phẫu thuật chỉnh hình có thể trực tiếp làm vi khuẩn lan đến xƣơng, khớp. BSP (Bone sialoproteinbinding protein) có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh học. Theo một số nghiên cứu thì tỷ lệ bệnh nhân có ổ di ở xƣơng khớp từ 11,5% đến 27% [26], [117]. 22 1.6.4. Viêm khớp Staphylococci là nguyên nhân hay gặp nhất trong viêm khớp. Hiện nay viêm khớp này chiếm ƣu thế ở lứa tuổi trẻ. Ở Mỹ có khoảng 300 genotype của những chủng tụ cầu thƣờng gặp gây viêm khớp ở trẻ em. Vi khuẩn xâm nhập vào khoang khớp theo đƣờng máu hoặc nhiễm trùng ở vị trí khác lan truyền đến [117]. 1.6.5. Viêm nội tâm mạc Bệnh thƣờng xảy ra ở những ngƣời trƣởng thành tiêm chích ma túy hoặc bị bệnh về van tim. Các nghiên cứu cho thấy FnBP (fibronectin-binding protein), ClfA (clumbing factor A) giúp vi khuẩn cƣ trú gây tổn thƣơng nội tâm mạc, van tim. Tỷ lệ viêm nội tâm mạc do S. aureus ở các báo cáo thƣờng khác nhau từ 0 - 15%. Đặc biệt trên đối tƣợng bệnh nhân tiêm chích tỷ lệ này tăng cao từ 31,4% đến 72%. Tỷ lệ tử vong ở nhóm bệnh nhân này là 8,5% [117]. 1.6.6. Nhiễm khuẩn huyết Từ máu, vi khuẩn đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi não, tuỷ xƣơng…) hoặc viêm nội tâm mạc. Chúng có thể gây viêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mạn tính nhƣ viêm xƣơng… Độc tố siêu kháng nguyên SEA, các chủng có vỏ type 5, 8, α-hemolysin là những độc tố quan trọng đóng vai trò trong cơ chế gây bệnh. Nhiễm khuẩn huyết do S. aureus chỉ đứng thứ hai sau nhiễm khuẩn huyết do E. coli với tỷ lệ tử vong do sốc cao từ 14,7 - 49%. Ở Việt Nam là 23,5% trong bệnh viện và tỷ lệ tử vong là 22,7% [26]. 1.6.7. Viêm phổi Viêm phổi do S. aureus ít gặp thƣờng xảy ra sau viêm đƣờng hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy, cũng có viêm phổi tiên phát do vi khuẩn này ở trẻ em, ngƣời già, sau chấn thƣơng hoặc bị suy giảm miễn dịch 23 [39]. Tỷ lệ tử vong của bệnh này khá cao, vì thế nó đƣợc coi là bệnh nặng. S. aureus là nguyên nhân của 14,2% trƣờng hợp viêm phổi tái nhiễm theo một nghiên cứu ở Bệnh viện Nhi Trung ƣơng [25]. Hình 1.6: Vị trí nhiễm trùng và các bệnh do S. aureus gây ra [5] 1.6.8. Ngộ độc thực phẩm và viêm ruột cấp Khoảng 70% các vụ ngộ độc thực phẩm có căn nguyên là vi khuẩn. S. aureus là một trong những nguyên nhân quan trọng nhất. Độc tố ruột của S. aureus là nguyên nhân gây nên ngộ độc thức ăn. Trên thế giới và ở Việt Nam các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus hay gặp và có quy mô thành vụ ngộ độc tập thể. Các vụ ngộ độc thực phẩm có căn nguyên là S. aureus chiếm 16% tổng số, 25,6% ca bệnh và 17,5% ca nhập viện của các vụ ngộ độc thực phẩm, chỉ sau ngộ độc do Salmonella. Viêm ruột cấp có thể do S. aureus vốn cƣ trú ở đƣờng ruột chiếm ƣu thế về số lƣợng. Nguyên nhân là sau một thời gian dài dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các thành viên trong hệ vi khuẩn bình thƣờng của đƣờng ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và 24 tạo điều kiện thuận lợi cho S. aureus (kháng kháng sinh) tăng trƣởng về số lƣợng [129]. 1.6.9. Hội chứng sốc nhiễm độc Hội chứng sốc nhiễm độc thƣờng gặp ở phụ nữ sử dụng băng vệ sinh bị nhiễm khuẩn khi có kinh nguyệt hoặc những ngƣời bị nhiễm trùng vết thƣơng. Đa số các chủng S. aureus gây hội chứng này có độc tố siêu kháng nguyên TSST-1. Các chủng này có ít nhất một gen se (seb hoặc sec). Tỷ lệ tử vong của bệnh này khoảng 5%. Năm 2004 tại Pháp có 22 trƣờng hợp đƣợc ghi nhận. Có 5 trƣờng hợp nhiễm trùng có cả 3 độc tố siêu kháng nguyên là TSST-1, SEB, SEC [117]. 1.6.10. Nhiễm trùng bệnh viện do S. aureus Nhiễm khuẩn bệnh viện do S. aureus rất thƣờng gặp, đứng hàng thứ hai sau họ Enterobacteriaceae. S. aureus là căn nguyên gây nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng, nhiễm trùng da, tổ chức dƣới da, viêm tuỷ xƣơng, viêm phổi …từ đó dẫn tới nhiễm khuẩn huyết [121]. Tại bệnh viện Xanh Pôn nhiễm trùng vết mổ, vết thƣơng do S. aureus chiếm tỷ lệ khá cao 12,9%, riêng nhiễm trùng vết mổ chấn thƣơng sau tai nạn chiếm đến 40,6% [11]. S. aureus gây bệnh viêm cầu thận ở trẻ em 5,8%, nhiễm trùng tiết niệu 3% [8]. 1.7. CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH S. AUREUS TRONG PHÕNG XÉT NGHIỆM 1.7.1 Các kỹ thuật thông thƣờng xác định S. aureus Ngày nay đã có nhiều kỹ thuật xác định tụ cầu nhƣ: nhuộm soi, ngƣng kết hạt, Staphylatex, nuclease chịu nhiệt, lysostaphin, định typ phage, ELISA, điện di miễn dịch và thử nghiệm miễn dịch dùng chất phóng xạ…Sau đây là một số kỹ thuật chính đƣợc áp dụng trong phòng xét nghiệm để xác định và nghiên cứu S. aureus. 1.7.1.1. Kỹ thuật nhuộm soi Nhuộm Gram để sơ bộ nhận định hình thể của vi khuẩn: tiêu bản đƣợc 25 làm từ bệnh phẩm/mẫu hoặc từ khuẩn lạc. - Trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm: cầu khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính trung bình 0,8µm, đứng lẫn với tế bào mủ, hoặc tập hợp lại thành hình chùm nho, cũng có khi cầu khuẩn đứng riêng rẽ. - Trên tiêu bản nhuộm Gram từ khuẩn lạc: S. aureus có hình ảnh cầu khuẩn bắt màu Gram dƣơng xếp thành từng đám [5]. 1.7.1.2. Nuôi cấy, phân lập và xác định Tùy loại bệnh phẩm lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp. Thông thƣờng sử dụng thạch máu 5% ủ ở nhiệt độ 35-370C từ 18-24h. Tụ cầu khuẩn mọc tốt trên hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy thƣờng dùng, nhiệt độ thích hợp 370C, pH:7.2-7.4, trong khí trƣờng có oxy hoặc kỵ khí tùy tiện [33]. Trên canh thang: sau 6 giờ tụ cầu đã làm đục đều môi trƣờng, sau 24 giờ có thể có lắng cặn và có váng. Trên thạch thƣờng: Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn, bóng, đục, bờ rõ rệt. Sau 24-36 giờ xuất hiện sắc tố màu vàng. Trên thạch máu: khuẩn lạc tròn, ƣớt, bóng, có thể có vòng tan huyết hoặc không. Nếu có vòng tan huyết là vòng tan huyết hoàn toàn, tạo thành một vòng trong xung quanh khuẩn lạc (tan máu β). Trên môi trƣờng Chapman (có đƣờng mannit): S. aureus có khả năng sử dụng mannit làm cho môi trƣờng bị axit hóa, do đó màu môi trƣờng chuyển sang vàng. Khuẩn lạc S. aureus có ánh vàng [7]. Xác định sự có mặt của men coagulase: (men làm đông huyết tƣơng) tự do và liên kết. Ngoài các tính chất trên, S. aureus còn có khả năng sinh các enzyme dezoxyribonuclease, catalase, phosphatase, kháng novobiocin, gây hoại tử da thỏ. Khi các thử nghiệm khác không rõ có thể sử dụng kit API-STAPH để xác định S. aureus [98]. Kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi khuẩn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn 26 đoán xác định S. aureus. Tuy nhiên kỹ thuật này cho kết quả khá lâu (từ 3-4 ngày), cần một lƣợng vi khuẩn lớn và không xác định đƣợc các yếu tố ở mức phân tử. 1.7.1.3. Một số kỹ thuật khác - Kỹ thuật ngƣng kết: Những kit thƣơng mại dựa trên nguyên lý phản ứng ngƣng kết nhƣ: Dry Spot Staphytect Plus, Pastorex Staph Plus, Slidex Staph-Kit, Slidex Staph Plus, Staphaurex Plus, Staphylase, Xpert SA Nasal Complete Cepheid có độ nhạy, độ đặc hiệu cao 96-99% [125]. - Kỹ thuật ELISA: Ƣu điểm của phƣơng pháp: độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ứng dụng kỹ thật này để xác định độc tố ruột của S. aureus nhƣ SEA, SEB, SEC, SED….Đây là kỹ thuật đƣợc sử dụng từ vài thập kỷ trƣớc nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc sử dụng, đặc biệt để xác định căn nguyên các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [15]. - Kỹ thuật xác định bằng phage: sử dụng các nhóm phage để xác định lysotyp S. aureus ở ngƣời: + Nhóm I: 29, 52, 52A, 79, 80 + Nhóm II: 3A, 3C, 55, 71 + Nhóm III : 6, 42 E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85 + Không xếp hạng : 81, 95, 96 [7] - Xác định typ huyết thanh: Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các kháng huyết thanh có tính đặc hiệu với từng typ huyết thanh của vi khuẩn. Nói chung đây là kỹ thuật khá ổn định. 1.7.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán và nghiên cứu S. aureus. Kết quả xác định sẽ nhanh hơn, nhiều trƣờng hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao. Ngoài việc xác định nhanh căn nguyên vi 27 khuẩn với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của S. aureus. Ví dụ, trong trƣờng hợp xác định độc tố ruột của S. aureus. Việc xác định S. aureus và sự có mặt của một hoặc một số độc tố ruột có thể đƣợc phát hiện cùng một lúc bằng kỹ thuật PCR. PCR cũng cho phép xác định sự có mặt của gen liên quan đến sự kháng thuốc của S. aureus ví dụ nhƣ gen mecA, vanA [52]. Áp dụng kỹ thuật PCR để xác định và nghiên cứu các gen độc lực của S. aureus nhƣ agr, tsst-1 gây hội chứng shock nhiễm độc. Ngoài ra, sử dụng một số cặp mồi đặc hiệu có khả năng khuếch đại một vùng gen đặc trƣng của vi khuẩn có thể xác định vi khuẩn này trong một loại bệnh phẩm nào đó. Ngày nay kỹ thuật PFGE và MLST đƣợc ứng dụng để xác định nguồn gốc của S. aureus trong các vụ dịch và phân typ chúng. Trong một số trƣờng hợp, bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gen, ngƣời ta có thể biết rằng đoạn nucleotide đó là của S. aureus [98]. 1.7.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Năm 1985, nhà khoa học ngƣời Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển “phản ứng chuỗi trùng hợp‟‟ gọi là Polymerase Chain Reaction. - Nguyên lý của phản ứng PCR: Dựa theo sự sao chép theo cơ chế bán bảo tồn của DNA trong tế bào. Một đoạn của phân tử DNA chuỗi kép đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA mới. Kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôn theo chiều 5‟ đến 3‟ dƣới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase. Mạch DNA mới đƣợc hình thành với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi DNA khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lƣợng đoạn DNA cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi [27]. 28 Kỹ thuật PCR ứng dụng trong xác định S. aureus David P. Kateele và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nhân gen nuc của S. aureus đƣợc sử dụng nhƣ kỹ thuật cơ bản, là tiêu chuẩn vàng để xác định S. aureus [41]. Gonzalez V. và cộng sự ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử với mồi tác động đích 16S rRNA của S. aureus. Độ nhạy đạt đến 100%, độ đặc hiệu 99,4% [51]. Paola Cremonesi ứng dụng PCR đa mồi để xác định các gen cog, nuc, sea, seb, sec, sed, see, seg, she, sei, sej, sel. Kỹ thuật PCR đa mồi này có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn nhiều so với kỹ thuật ELISA [40]. Yu-cheng Chiang và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nghiên cứu gen độc tố tsst-1 ở Đài Loan [127]. Kỹ thuật PCR cũng đƣợc ứng dụng để xác định gen kháng kháng sinh nhƣ mecA, van A [100]. 1.7.2.2. Kỹ thuật realtime PCR - Nguyên lý: Là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR có khả năng vừa phát hiện vừa định lƣợng sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng (realtime nghĩa là đúng thời điểm). Đây là kỹ thuật phát hiện không đồng nhất, một hỗn hợp của sản phẩm PCR đƣợc phát hiện mà không phải từng thành phần đƣợc phát hiện nhƣ trong kỹ thuật điện di thông thƣờng. - Ƣu điểm: + Kiểm soát đƣợc lƣợng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định đƣợc lƣợng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại. Ở kỹ thuật PCR thông thƣờng, gel agarose có nhiều hạn chế nhƣ độ phân giải thấp do vậy định lƣợng thƣờng không chính xác. + Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại. + Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1-2h trong khi PCR truyền thống phải mất từ 3-5h 29 + Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm. Kỹ thuật realtime PCR đƣợc ứng dụng trong xác định gen kháng kháng sinh nhƣ mecA, van A của S. aureus [98]. Kỹ thuật này đã đƣợc Lance R. Peterson sử dụng để xác định MRSA ở mũi, kết quả trong vòng 2 giờ với độ nhạy từ 95-100%, độ đặc hiệu 96-99% [100]. 1.7.2.3. Kỹ thuật PCR lồng (PCR nested) - Nguyên lý: Là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi xếp lồng vào nhau. Đoạn DNA lớn sinh ra sau vòng một của PCR sẽ dùng để làm mẫu cho PCR lần thứ hai có primer nằm trong primer lần một. PCR lồng bao gồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở vòng ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho phản ứng sau cho đoạn nằm trong gene. - Ƣu điểm : Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy lên đến 104 lần so với của phản ứng PCR thông thƣờng. Mặc dù sản phẩm PCR lần 1 không rõ song các khuôn đích sẽ đƣợc khuếch đại lên nhiều lần nhờ PCR lồng tiếp theo. Còn các sản phẩm phụ trong sản phẩm PCR lần 1 sẽ ít có khả năng gắn với mồi (của PCR lồng lần 2) do vậy sẽ không đƣợc khuếch đại. Dùng cặp mồi đặc hiệu có thể xác định đƣợc gene đặc trƣng cho loài, thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Đây là lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định typ vi sinh vật trong nghiên cứu dịch tễ học. - Nhƣợc điểm : Sản phẩm PCR lần 1 không đặc hiệu song lại đủ lớn và có thể làm khuôn cho PCR lồng tiếp theo. Hiện tƣợng này dẫn đến các sản phẩm gen không đặc hiệu cũng sẽ đƣợc khuếch đại và làm sai lệch kết quả [27]. Nghiên cứu của Fred C. Tenover và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR lồng sử sụng enzyme cắt AluI phân tích gen coagulase trên 59 chủng S. aureus. Mồi phía ngoài là COAG-1 và COAG-4, mồi bên trong là COAG-2 và COAG-3 [115]. 30 1.7.2.4. Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) - Nguyên lý : Sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt sản phẩm PCR tạo nên những đoạn cắt khác nhau và xác định kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid. Ứng dụng kỹ thuật RFLP để xác định tính đa hình của gen đƣợc cắt. Ví dụ cắt bằng AluI xác định gen mã hóa coagulase của S. aureus. Tiêu chuẩn phân loại S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase (theo nghiên cứu của Su [113] và Goh [50]). Siti Salasia ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu các gen của S. aureus nhƣ hla 73%, cap8 là 91%, fnbA 100% [105]. 1.7.2.5. Kỹ thuật PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis: Điện di trường xung) - Nguyên lý: Sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt DNA tạo ra đƣợc các đoạn (thƣờng từ 10-20 đoạn) có kích thƣớc lớn (40 kb-2000 kb). PFGE tăng khả năng di chuyển của các đoạn DNA lớn trong điện trƣờng nhờ trƣờng điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thƣớc khác nhau thay đổi hƣớng di động. Các đoạn có kích thƣớc khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau, kích thƣớc càng lớn thì mức di động càng chậm qua gel tạo ra sự phân tách các băng DNA trong trƣờng điện di. - Ứng dụng : trong nghiên cứu về sự tƣơng đồng, phân loại các chủng, điều tra các vụ dịch, đóng vai trò nhƣ một phƣơng pháp tham chiếu trong xác định kiểu gen, xác định nguồn mang và phƣơng thức lây truyền của một vi khuẩn nào đó [23]. Năm 2011 Yanping Xie và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật này để phân tích sự tƣơng đồng về di truyền của 108 chủng S. aureus phân lập đƣợc ở bệnh viện tại Trung Quốc. Kết quả cho thấy có 80% các chủng tƣơng đồng [126]. 31 1.7.2.6. Kỹ thuật MLST (Multilocus sequence typing) - Nguyên lý kỹ thuật dựa trên nguyên tắc điện di đoạn gen nhiều locus. Những đoạn (khoảng 500 bp) của gen quan trọng và thiết yếu (thƣờng là 7 gen) sẽ đƣợc nhân lên và giải trình tự. Những trình tự này đƣợc so sánh với trình tự DNA là kết quả của các type của các chủng đã nghiên cứu công bố trên MLST website. - Ứng dụng: Đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu điều tra dịch tễ. Peacock và cộng sự năm 2002 cho thấy kỹ thuật này có ƣu điểm tƣơng đƣơng nhƣ PFGE để nghiên cứu trong các vụ dịch nhỏ [98]. Yanping Xie và cộng sự khi ứng dụng kỹ thuật này để phân tích tƣơng đồng về di truyền của 108 chủng S. aureus phân lập đƣợc ở bệnh viện tại Trung Quốc cho thấy kỹ thuật này ít có khả năng xác định tính tƣơng đồng hơn PFGE tuy nhiên giải trình tự gen kết hợp với PFGE hoặc MLST sẽ tăng khả năng xác định tính tƣơng đồng về trình tự gen di truyền của các chủng [126]. 1.7.2.7. Giải trình tự gen Hai phƣơng pháp chính xác định trình tự là phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phƣơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Phƣơng pháp của Sanger đƣợc ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu y sinh học [22]. Phƣơng pháp này dựa vào sự tổng hợp DNA nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ xung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định. Đặc trƣng của phƣơng pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thƣờng còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó nhóm 3‟OH đƣợc thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester, do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Kết quả phản ứng tạo ra các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Sản phẩm đƣợc đem phân tách trên gel polyacrylamide và kết quả đƣợc đọc trên máy tự ghi [27]. 32 1.8. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU CÁCH CƢ TRÖ VÀ GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS 1.8.1. Các nghiên cứu trên thế giới Ngộ độc thực phẩm do S. aureus là vấn đề nan giải ở nhiều nƣớc trên thế giới. Nhiều vụ dịch ngộ độc tập thể lớn gây nên thiệt hại nặng nề về cả sức khỏe và kinh tế. Năm 1968 tại một trƣờng học ở Mỹ có 1300 trẻ em ngộ độc do ăn salat làm từ thịt gà nhiễm vi khuẩn. Năm 2000 tại Osaka, Nhật có 13420 ngƣời ngộ độc do uống sữa ít chất béo nhiễm S. aureus. Tại Pháp năm 2008 có 47 ngƣời ngộ độc trong đám cƣới do ăn thịt nhiễm S. aureus [61]. Tình trạng mang S. aureus ở những nhân viên nhà hàng, những ngƣời làm trong cơ sở dịch vụ ăn uống, chế biến và tiếp xúc với thức ăn là nguy cơ tiềm ẩn gây nên các vụ dịch ngộ độc thức ăn. S. aureus có thể ô nhiễm thức ăn nhƣ thịt, trứng, sữa qua động vật mang vi khuẩn này khi chúng bị bệnh nhiễm trùng, viêm tuyến vú [95]. Tuy nhiên, nguồn gây ô nhiễm chính S. aureus vào thực phẩm lại là con ngƣời chiếm đến 84% các vụ dịch ngộ độc thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, tiếp xúc với thức ăn. S. aureus ô nhiễm thực phẩm thông qua tiếp xúc nhƣ bàn tay ngƣời, vết thƣơng ở tay, da, tóc, mụn nhọt, áp xe hoặc qua đƣờng hô hấp nhƣ ho, xì mũi, hắt hơi [76]. Ngày nay, với kỹ thuật PFGE chúng ta xác định đƣợc nguồn gốc các chủng, căn nguyên các vụ ngộ độc thực phẩm. Chủng phân lập trong các vụ dịch có chung nguồn gốc với chủng từ nhân viên chế biến thực phẩm. Chính vì vậy, nhân viên này là nguồn lây nhiễm vi khuẩn [123]. Tỷ lệ mang vi khuẩn ở nhóm nhân viên tiếp xúc với thực phẩm khoảng 20 - 40% theo nhiều nghiên cứu khác nhau [46], [67]. Các chủng S. aureus phân lập đƣợc từ nhân viên nhà ăn cũng cho thấy có tỷ lệ kháng kháng sinh và chứa các gen độc lực nhƣ các gen độc tố ruột se: sea, seb, sec, sed, see…(80 - 90%) [42]. 33 Những nghiên cứu cho thấy ở ngƣời bình thƣờng có khoảng 20% (dao động từ 12 - 30%) mang S. aureus thƣờng xuyên, 30% mang không thƣờng xuyên (16 - 70%) và 50% (16 - 69%) không mang S. aureus [57]. Tiêu chuẩn đánh giá kiểu cách cƣ trú vi khuẩn dựa vào sự có mặt của S. aureus ở từng lần lấy bệnh phẩm ở mũi vì lỗ mũi là vị trí cƣ trú ổn định của vi khuẩn này và ít chịu tác động của các yếu tố bên ngoài nhƣ tình trạng vệ sinh. Đây là vị trí thích hợp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu kinh điển về tình trạng mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus [119]. Nghiên cứu của Nouwen và cộng sự, so sánh giữa lấy mẫu 12 lần và 2 lần ở mũi, mỗi lần cách nhau 1 tuần để xác định kiểu cách cƣ trú của S. aureus. Kết quả cho thấy tỷ lệ mang thƣờng xuyên lần lƣợt là 29% và 30%, không thƣờng xuyên là 31% và 16% và không mang là 40% và 54%. Nếu nghiên cứu kéo dài thì tỷ lệ mang không thƣờng xuyên sẽ tăng lên và tỷ lệ mang thƣờng xuyên sẽ giảm đi. Số lần lấy mẫu tối thiểu là 3 - 4 lần để xác định là mang thƣờng xuyên [90]. Một số nghiên cứu khác cho thấy lấy mẫu 2 lần mỗi lần cách nhau 1-2 tuần là thích hợp để xác định kiểu cách cƣ trú [68], [91]. Theo những nghiên cứu điều tra ngang thì tỷ lệ mang S. aureus khoảng 27% từ năm 2000. Tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ 35% ở những nghiên cứu trƣớc từ năm 1934. Điều này có thể giải thích đƣợc là do những thay đổi tốt hơn về vệ sinh cá nhân, về kinh tế xã hội và gia đình ít thành viên hơn [57]. Các nghiên cứu trên nhân viên làm việc tại các cơ sở dịch vụ ăn uống, chế biến và tiếp xúc với thức ăn đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tỷ lệ mang và đặc điểm cƣ trú và các gen độc tố ruột của S. aureus trên nhóm đối tƣợng này có ý nghĩa quan trọng trong công tác phòng chống, kiểm soát các vụ ngộ độc thực phẩm [62]. Nghiên cứu của Jonge ở Hà Lan năm 2010 cho thấy tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay của nhân viên nhà ăn là 33% và tỷ lệ này ở ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh ở Hà Lan là 30% [67]. Kết quả của một nghiên cứu khác cùng năm của Borges tại Brazil ở nhân 34 viên chế biến thức ăn về tỷ lệ mang là ở mũi 14,7%, ở cả tay và mũi là 1,4% [37]. Nghiên cứu tỷ lệ trên tay nhân viên nhà ăn cho kết quả dao động khác nhau từ 2-20%. Tỷ lệ mang vi khuẩn này ở tay nhân viên làm việc trong quán cà phê sinh viên ở các trƣờng đại học của Gashaw Andargie năm 2008 tại Ethiopia [47] và của Soares M.J. trên nhân viên bếp ăn tại bệnh viện và trong cộng đồng năm 1997 tại Brazil là 16,5% [110]. Nghiên cứu khác của Borges J. Liana tại Brazil ở nhân viên chế biến thức ăn năm 2010 là 2,9% [37] và của Johan N. Bruun năm 1973 là 10,2% [66]. Sospedra và cộng sự năm 2012 tại Tây Ban Nha nghiên cứu 53 chủng S. aureus từ nhân viên nhà ăn cho thấy tỷ lệ mang vi khuẩn này ở tay là 8,4% [111]. Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa kích ứng mũi và mang S. aureus ở mũi, Wertheim và cộng sự nhận thấy 71,4% những ngƣời có kích ứng mũi mang S. aureus đối lại với 40% mang S. aureus ở những ngƣời không bị kích ứng mũi, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,023. Nhƣ vậy kích ứng mũi đóng vai trò quan trọng của mang vi khuẩn này ở mũi [124]. Các gen độc lực giúp S. aureus sản xuất ra các độc tố gây ra các tình trạng nhiễm trùng khác nhau trên lâm sàng [79]. Nghiên cứu của Jana Maslankova và cộng sự trên các gen sea, seb, sec, sed, see, tst-1, eta, etb, cna, spa cho thấy 75% các chủng S. aureus có chứa một trong các gen độc tố trên [84]. Một nghiên cứu khác cho thấy, 64% (101/157) số chủng S. aureus phân lập từ tủ lạnh của các hộ gia đình ở Irland có ít nhất 2 trong số những gen qui định độc tố ruột kể trên. Nghiên cứu của Morandi tại Italy xác định 16 genotype khác nhau của gen coa ở 25 chủng S. aureus [86]. Xác định căn nguyên và nguồn gốc của các vụ ngộ độc thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong công tác giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm. Wei H.L và cộng sự tại Đài Loan năm 2002 ứng dụng kỹ thuật PFGE xác định chủng S. aureus phân 35 lập đƣợc trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ngộ độc thực phẩm và chủng S. aureus phân lập đƣợc từ bàn tay bị nhiễm trùng của nhân viên nhà ăn có cùng nguồn gốc và đã xác định nguồn lây nhiễm là nhân viên của cơ sở dịch vụ ăn uống [123]. Theo nghiên cứu của Kerouanton A. năm 2006 tại Pháp 84% các vụ ngộ độc thức ăn do S. aureus có nguồn gốc từ ngƣời và 16% từ chim và các vật chủ khác không rõ nguồn gốc. Các chủng này đều mang gen độc tố ruột se [72]. Nghiên cứu của Edet E. Udo năm 2009 trên 200 nhân viên nhà hàng tại Kuwait cho thấy tỷ lệ mang gen độc tố ruột là 71% [42]. Một nghiên cứu khác của Zschock tại Đức trên các gen từ sea đến sej cho thấy 58,7% số chủng mang ít nhất 1 gen độc tố ruột nói trên [131], Fueyo J. M năm 2001 tại Tây Ban Nha cho thấy 28% các chủng phân lập từ ngƣời mang vi khuẩn này mang gen độc tố ruột se [45]. Nhiều nghiên cứu trên thế giới xác định tính đa hình của gen mã hóa coagulase. Đa phần các kết quả cho thấy có một hoặc vài genotype chiếm ƣu thế so với đa số các genotype khác của gen coagulase trong số các chủng nghiên cứu. Các nghiên cứu về các gen độc tố ruột có ngày càng đƣợc quan tâm. Bên cạnh những gen độc tố ruột cổ điển, ngày càng phát hiện nhiều gen độc tố ruột mới. Trên một chủng S. aureus phần lớn mang hai loại hoặc nhiều hơn gen độc tố ruột [75]. 1.8.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam Ngộ độc thực phẩm do S. aureus là vấn đề nan giải và gây nhiều tổn thất về sức khỏe cũng nhƣ thiệt hại về kinh tế ở nhiều nƣớc trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Tại Việt Nam những vụ dịch ngộ độc tập thể đƣợc ghi nhận ở Hà Nội 5/2008: 122 khách dự đám cƣới. Công ty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre 6/2008: 100 công nhân. Sơn La 9/2008: 581 ngƣời dân. Tiểu học Tam Bình, Q. Thủ Đức -TP HCM 11/ 2008: 51 học sinh và phụ huynh. Cty 36 Phú Nguyên, KCN An Đồng Hải Dƣơng 8/2009: 160 công nhân [10]. Tại Việt Nam, có ít nghiên cứu về tỷ lệ mang S. aureus và kiểu cách cƣ trú của vi khuẩn này. Một số nghiên cứu tỷ lệ mang S. aureus trên ngƣời khỏe mạnh, trên bệnh nhân, ở tay nhân viên bán hàng ăn, các mẫu thức ăn. Khoảng 30-50% ngƣời lành và 45% bệnh nhân điều trị tại bệnh viện mang vi khuẩn. Vũ Bảo Châu và Nguyễn Văn Dịp nghiên cứu về tình trạng mang S. aureus ở bệnh nhân ngoại khoa và mối liên quan giữa nhiễm khuẩn vết mổ với việc cƣ trú vi khuẩn này ở mũi. Kết quả cho thấy có 9,6% có mang S. aureus ở da và tỷ lệ mang S. aureus ở mũi ở bệnh nhân ngoại khoa là 36,1%. Đồng thời có mối liên quan giữa tỷ lệ mang ở mũi và mang ở da. Những ngƣời có S. aureus ở mũi có nhiều nguy cơ có vi khuẩn này ở da hơn những ngƣời không có vi khuẩn này ở mũi. Tỷ lệ nhiễm khuẩn vết mổ do S. aureus ở những ngƣời có vi khuẩn này ở mũi là 8,2%, ở những bệnh nhân không có vi khuẩn này ở mũi là 2,3% [6]. Theo nghiên cứu của Bùi Khắc Hậu nhiễm trùng vết mổ, vết thƣơng do S. aureus chiếm tỷ lệ khá cao 12,9 - 40,6% [11]. Theo nghiên cứu của Lâm Huyền Trân và Võ Hiếu Bình trên 96 ngƣời khỏe mạnh, tổng số vi khuẩn đƣợc phân lập là 84,73% trong đó S. aureus là vi khuẩn thƣờng trú hay gặp nhất ở mũi ngƣời khỏe mạnh với tỷ lệ là 33,33%. Đây cũng là vi khuẩn gây bệnh viêm mũi xoang [24]. Nguyễn Thị Lai và Lê Kinh Duệ nghiên cứu sự cƣ trú của S. aureus trên bệnh nhân viêm da cơ địa cho thấy S. aureus cƣ trú ở tổn thƣơng da của 85,7% số bệnh nhân, tỷ lệ này càng cao khi tổn thƣơng càng nặng. Tỷ lệ mang vi khuẩn này ở da lành của bệnh nhân viêm da cơ địa là 40%. Tỷ lệ mang vi khuẩn này trên da ở nhóm ngƣời bình thƣờng là 6,7%. Ở vùng da tổn thƣơng có tiết dịch, tỷ lệ phân lập đƣợc S. aureus là 100%, tại tổn thƣơng da không tiết dịch tỷ lệ này là 66,7% [16]. Hiện tại ở Việt Nam chúng tôi chƣa tìm thấy nghiên cứu nào về tình 37 trạng mang vi khuẩn này ở mũi trên nhân viên làm việc có tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm mà chỉ có một số nghiên cứu về tình trạng mang S. aureus ở tay của nhân viên bán hàng ăn. Nghiên cứu của Lý Thành Minh và Cao Thị Diễm Thúy trên 266 mẫu lấy từ bàn tay ngƣời bán thức ăn trên đƣờng phố cho thấy tỷ lệ mang S. aureus là 49,6% [18]. Nguyễn Hùng Long và cộng sự năm 2009 nghiên cứu tỷ lệ ô nhiễm vi sinh vật ở bàn tay của 245 ngƣời trực tiếp chế biến và sản xuất thực phẩm cho thấy tỷ lệ này là 3,3% [17]. Hiện nay những nghiên cứu về gen độc lực tại Việt Nam rất ít, đặc biệt là nghiên cứu về gen coagulase và gen độc tố ruột. Nghiên cứu độ nặng lâm sàng trên bệnh nhân tại Bệnh viện Nhiệt đới Hồ Chí Minh cho thấy độ nặng phụ thuộc vào kiểu gen nhƣ tổ hợp gen egc, cna của các chủng hơn là gen quy định một yếu tố quyết định đặc tính nhƣ PVL. Trong nghiên cứu của Diệp Thế Tài và cộng sự năm 2007 phát hiện đồng thời gen mã hóa độc tố ruột SEA, SEB của S. aureus trong 94 mẫu thức ăn nhanh tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy có 4% mang gen mã hóa SEA và 3,19% mang gen mã hóa SEB [21]. Nguyễn Đỗ Phúc và cộng sự tại Viện Vệ Sinh Y tế Công cộng TP Hồ Chí Minh đã xác định gen sinh độc tố ruột từ SEA đến SEE trên 124 chủng S. aureus phân lập đƣợc trong thực phẩm cho thấy 33% các chủng mang những gen này [20]. Theo Bùi Mai Hƣơng và cộng sự có tới 40% chủng S. aureus phân lập đƣợc từ thức ăn có chứa SE [38]. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú và gen độc lực của S. aureus trên đối tƣợng nhân viên cơ sở dịch vụ ăn uống, tuy nhiên ở Việt Nam những chỉ có những nghiên cứu về tình trạng nhiễm S. aureus ở các mẫu thức ăn và các gen độc tố ruột từ những chủng phân lập đƣợc trên những mẫu này mà chƣa có những nghiên cứu về tình trạng mang và các gen độc tố của S. aureus phân lập đƣợc trên nhân viên các cơ sở dịch vụ ăn uống. 38 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú của S. aureus 2.1.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn Nhân viên làm việc tại 14 cơ sở dịch vụ ăn uống ở Hà Nội từ 18 tuổi trở lên, tiếp xúc trực tiếp với thức ăn nhƣ chế biến, phân phát thức ăn, phục vụ bàn ăn, lau rửa, vệ sinh đồ dùng ăn uống (phụ lục 1). 2.1.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ Nhân viên không tự nguyện tham gia, không tham gia đủ tổng số 4 lần lấy mẫu, mắc các bệnh cấp hoặc mạn tính, đang điều trị các bệnh về mũi họng, viêm da, nhiễm trùng da và bàn tay, móng tay, đang dùng thuốc kháng sinh hoặc thuốc ức chế miễn dịch. 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu sự phân bố gen độc lực của S. aureus Chọn tất cả các chủng S. aureus phân lập đƣợc ở mũi và ở tay nhân viên làm việc tại 14 cơ sở dịch vụ ăn uống ở Hà Nội đảm bảo đủ tiêu chuẩn lựa chọn nêu ở mục 2.1.1. Cách tính cỡ mẫu và chọn mẫu đƣợc trình bày cụ thể tại mục 2.2.2. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc thiết kế theo phƣơng pháp mô tả cắt ngang [19]. 2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu - Cỡ mẫu: 39 Số lƣợng nhân viên đƣợc chọn vào vào đối tƣợng nghiên cứu tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú của S. aureus đƣợc tính theo công thức n  Z12 / 2  p(1p) (p) 2 [19] n: Cỡ mẫu nghiên cứu Z: Hệ số tin cậy, với α = 0,05 thì Z 1-α/2 = 1,96 p : Tỷ lệ mang S. aureus ở nhân viên làm việc ở cơ sở dịch vụ ăn uống theo nghiên cứu trƣớc đây (33%) [67]. ε: Độ chính xác tƣơng đối so với p Lấy ε = 0,2. Chọn giá trị này để xác định cỡ mẫu nghiên cứu phù hợp với khả năng và điều kiện cho phép. Từ đó tính đƣợc số mẫu dự kiến sẽ chọn vào nghiên cứu là n = 195. Số đối tƣợng đủ tiêu chuẩn đƣợc nghiên cứu là 212 ngƣời. + Mỗi đối tƣợng đƣợc lấy bệnh phẩm 4 lần, hai lần liên tiếp cách nhau 1 tuần. Nhƣ vậy có 848 lƣợt ngƣời đƣợc nghiên cứu. + Mẫu đƣợc tiến hành lấy cả ở mũi và ở tay. Vì vậy tổng số mẫu để phân lập là: 848 x 2 = 1696 mẫu. - Cách chọn mẫu: + Trong khu vực Hà Nội chọn 14 cơ sở dịch vụ ăn uống có đăng ký và đƣợc cấp giấy phép kinh doanh. Các nhà hàng này có quy mô phục vụ cho 200 ngƣời ăn trở lên, dịch vụ ăn uống trong siêu thị, chợ [2]. Những nhà hàng này đều có khu nhà bếp chế biến, nấu nƣớng thực phẩm và khu ăn uống của khách hàng riêng biệt. Nguồn thực phẩm có xuất xứ cụ thể và an toàn. Bàn ghế, thiết bị, dụng cụ đảm bảo vệ sinh sạch sẽ, đủ nhà vệ sinh, bồn rửa tay, tủ lƣu mẫu thức ăn 24 giờ. 40 Nhân viên phục vụ ăn uống tại các cơ sở này đƣợc tuyển dụng làm hợp đồng, kiểm tra sức khỏe định kỳ một năm một lần và đƣợc tập huấn vệ sinh an toàn thực phẩm, đảm bảo tốt thực hành vệ sinh cá nhân [3]. + Lựa chọn đủ cỡ mẫu cần nghiên cứu. Đối tƣợng đƣợc chọn theo cách chọn mẫu ngẫu nhiên đơn. Cá nhân đủ tiêu chuẩn và tự nguyện tham gia nghiên cứu sẽ đƣợc lấy mẫu lần lƣợt cho đủ cỡ mẫu. - Các chủng S. aureus đƣợc phân lập và xác định từ các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc dùng để xác định gen coagulase, gen mã hóa độc tố ruột. 2.2.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu Thu thập thông tin cá nhân theo phiếu điều tra (phụ lục 2), mẫu bệnh phẩm và thực hiện các xét nghiệm tại Bộ môn Vi sinh Trƣờng Đại học Y Hà Nội và Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng. 2.3. VẬT LIỆU 2.3.1. Thiết bị + Máy móc - Tủ ấm 370C (Incubator hãng Sanyo của Nhật). - Kính hiển vi (Olympus của Nhật). - Máy PCR (C1000 Thermal Cycler hãng Biorad của Mỹ) - Máy ly tâm tốc độ 16000 vòng/phút (hãng Eppendorf của Đức) - Máy vortex (BR-2000 Vortexer hãng Biorad của Mỹ) - Máy ủ nhiệt (Techne-Dr Blook) - Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR system 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ). - Máy ly tâm lạnh (Tomy-Seiko MX-301 của Nhật) - Bộ điện di ngang (Horizond 58 hãng Gibco-BRL của Mỹ). 41 - Máy soi và chụp gel (Geldoc hãng Biorad Mỹ). + Dụng cụ nuôi cấy phân lập vi khuẩn - Tăm bông cứng vô trùng đựng trong ống nghiệm vô trùng. - Lam kính sạch, ống nghiệm vô trùng. - Giá để mẫu - Que cấy, đèn cồn, đĩa thạch + Dụng cụ cho PCR - Các loại pippet (10µl, 200µl, 1000µl) - Các loại đầu côn tƣơng ứng - Ống eppendorf 1,5 ml sạch - Tube chạy PCR loại ≥ 50µl 2.3.2. Hóa chất + Hóa chất nuôi cấy phân lập vi khuẩn - Bộ thuốc nhuộm Gram. - Các loại môi trƣờng: thạch máu đĩa, canh thang ống, thạch thƣờng đĩa, thạch Chapman đĩa (môi trƣờng BHI, BAB, Chapman của hãng BiomeriouxPháp) - Huyết tƣơng thỏ. - Dung dịch H2O2 + Sinh phẩm, hóa chất dùng cho PCR xác định các gen độc lực của S. aureus. - Dung dịch đệm TAE (InvitroGen của Mỹ) - Cồn 96-100 % (Meck của Đức) - Kít tách chiết DNA: (QIAamp DNA Minikit 50 hãng QIAGEN của Đức) 42 + Lyzozyme + PCR buffer 10X + H2O - Hỗn hợp Master mix dùng trong PCR của hãng QIAGEN. + MgCl2 10µM + dNTP 200µM + Taq DNA polymerase 1U - Thạch agarose dùng trong điện di của hãng BBL. - Ethilium Bromide dùng để nhuộm gel. - TAE (Tris Acetate EDTA). - PBS (Phosphate Buffer Saline). - Enzyme AluI 2.4. CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU 2.4.1. Lấy mẫu - Mỗi đối tƣợng tham gia sẽ đƣợc lấy mẫu ở mũi và ở bàn tay bằng tăm bông vô trùng theo qui trình sau: + Ở mũi: Lấy mẫu ở cả hai lỗ mũi ngoài, mỗi lỗ mũi lấy bằng một tăm bông nhúng vào dung dịch NaCl 0,85%. Dùng tăm bông xoay tròn sát vào thành mỗi lỗ mũi, quay tròn 4 lần. Tăm bông đƣợc cấy ngay vào môi trƣờng thạch máu đĩa. + Ở bàn tay: Lấy mẫu ở cả hai bàn tay. Dùng một tăm bông vô trùng nhúng vào dung dịch NaCl 0,85% quệt toàn bộ bề mặt bàn tay (lấy lần lƣợt ở mu bàn tay, lòng bàn tay, kẽ ngón tay, xung quanh móng tay). Tăm bông đƣợc cấy ngay vào môi trƣờng thạch máu đĩa. - Mỗi đối tƣợng tham gia sẽ đƣợc lấy mẫu 4 lần cách nhau 1 tuần để xác định kiểu cách cƣ trú của S. aureus. 43 2.4.2. Phân lập, xác định S. aureus Hình 2.1: Sơ đồ phân lập, xác định S. aureus Mẫu tăm bông lấy ở mũi và tay đƣợc nuôi cấy, phân lập riêng biệt theo thƣờng qui vi sinh và đƣợc cải tiến dựa vào nghiên cứu của Nouwen và cộng sự [90]. Tóm tắt qui trình nhƣ sau: + Mỗi tăm bông lấy mẫu đƣợc ria thành 3 vùng lên 1 đĩa thạch máu. Đĩa thạch máu để ở điều kiện 370C trong 18 - 24 giờ. 44 + Trên thạch máu chọn khuẩn lạc nghi ngờ đục dạng S (tròn, lồi, nhẵn, bóng), có sắc tố hoặc không, có vòng tan huyết hoặc không. + Làm tiêu bản nhuộm Gram, nếu soi thấy có hình ảnh cầu khuẩn bắt màu Gram dƣơng xếp thành từng đám thì tiếp tục làm các phản ứng sinh vật hóa học để xác định S. aureus. - Lên men đƣờng Manitol: Trên môi trƣờng Chapman sau 24 - 48h S. aureus sẽ làm cho màu của môi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng. Tức là có khả năng lên men đƣờng manitol. - Xác định sự có mặt của men coagulase: + Coagulase liên kết trên phiến kính: Nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lý lên phiến kính. Lấy vi khuẩn nghi ngờ nghiền đều: nếu không thấy hiện tƣợng ngƣng kết (nghĩa là, vi khuẩn không tự ngƣng kết) thì nhỏ thêm một giọt huyết tƣơng thỏ lắc đều. Trong vòng 5 giây, nếu thấy vi khuẩn tụ lại thành các hạt nhỏ là coagulase liên kết dƣơng tính. Nếu không có gì thay đổi là coagulase liên kết âm tính. Những trƣờng hợp âm tính phải kiểm tra lại bằng kỹ thuật xác định coagulase tự do. + Coagulase tự do: Dùng nƣớc muối sinh lý, pha loãng huyết tƣơng thỏ thành ¼ Nhỏ vào 3 ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 0,5ml huyết tƣơng đã pha loãng Dùng que cấy lấy tụ cầu mẫu (chủng ATCC 25923) cho vào ống thứ nhất, ống thứ hai để nguyên làm chứng, ống thứ ba cho tụ cầu cần thử. Ủ các ống nghiệm trên ở 37oC Đọc kết quả: Sau khi ủ 6 giờ (nếu để quá lâu thì kết quả có thể trở thành âm tính giả, vì nhiều chủng tụ cầu tiết men fibrinolysin làm lỏng huyết tƣơng trƣớc đó đã đông), nếu huyết tƣơng đông lại nhƣ một cục thạch, dốc ống nghiệm lên vẫn không rơi (đông hoàn toàn) hoặc nghiêng ống nghiệm 45 nhìn thấy có cục đông, xung quanh còn một ít huyết tƣơng không đông (đông không hoàn toàn) thì gọi là coagulase dƣơng tính. Một trong bốn trƣờng hợp sau đây có thể xảy ra trong khi đọc kết quả thử nghiệm này: Trƣờng hợp 1: Ở ống 1 và ống 3, huyết tƣơng đông; ống 2, huyết tƣơng không đông: coagulase dƣơng tính. Trƣờng hợp 2: Ở ống 1 huyết tƣơng đông, ống 2 và 3 huyết tƣơng không đông: coagulase âm tính. Để thêm đến 24 giờ ở nhiệt độ phòng, nếu kết quả vẫn không thay đổi thì kết quả là âm tính thực sự. Trƣờng hợp 3: Ở cả 3 ống, huyết tƣơng đều đông: huyết tƣơng đã hỏng, phải làm lại bằng huyết tƣơng mới. Trƣờng hợp 4: Ở cả 3 ống, huyết tƣơng đều không đông: tụ cầu mẫu hoặc huyết tƣơng đã hỏng hoặc là hỏng cả hai. Phải kiểm tra riêng rẽ từng yếu tố và làm lại thử nghiệm. - Kỹ thuật xác định catalase: Dùng que vô trùng (không phải là kim loại) lấy một lƣợng vi khuẩn từ khuẩn lạc cần xác định S. aureus (đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch thƣờng sau 18-24 giờ) lên lam kính. Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% lên trên vi khuẩn ở lam kính và quan sát, nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt khí (tạo ra O2): catalase dƣơng tính; không thấy hiện tƣợng sủi bọt khí: catalase âm tính. - Các tính chất chính đã đƣợc xác định S. aureus [5], [44]. + Cầu khuẩn Gram dƣơng xếp thành từng đám. + Có men coagulase. + Có men catalase + Lên men đƣờng manit. - Tiêu chuẩn xác định S. aureus: âm tính Sau 96 giờ nuôi cấy nếu không thấy khuẩn lạc có tính chất trên xuất hiện. Mẫu xét nghiệm đƣợc coi là âm tính với S. aureus. 46 2.4.3. Lƣu giữ các chủng - Các chủng phân lập đƣợc lƣu giữ mỗi chủng trong 2 ống thạch mềm có nút xoáy cao su sử dụng thƣờng xuyên ở nhiệt độ phòng và định kỳ 1 tháng cấy chuyển chủng một lần. - Mỗi chủng đƣợc lƣu trong 3 ống canh thang glyxerol 30% bảo quản lâu dài ở tủ -700C. - Các chủng đƣợc lƣu giữ tại Bộ môn Vi sinh Trƣờng Đại học Y Hà Nội. 2.4.4. Quy trình PCR xác định gen độc lực 2.4.4.1. Tách DNA (QIAamp DNA Minikit 50 hãng QIAGEN) - Bƣớc 1: Nuôi cấy các chủng S. aureus (đã phân lập và giữ thuần trong ống thạch mềm) ra 1 đĩa thạch thƣờng, để tủ ấm 37oC, trong 16-20 h. - Bƣớc 2: Dùng que cấy lấy 1 ăng đầy vi khuẩn từ đĩa môi trƣờng thạch thƣờng cho vào 1 eppendorf chứa 200 l dung dịch đệm PBS. - Bƣớc 3: Trộn đều bằng máy Vortex cho đến khi sinh khối vi khuẩn hòa tan để tạo thành huyền dịch trong PBS. - Bƣớc 4: Hút 20l QIAGEN protease cho vào ống chứa dung dịch vi khuẩn hòa tan. - Bƣớc 5: Bổ sung 200l đệm AL và trộn đều mẫu bằng máy Vortex trong 15 giây. - Bƣớc 6: Ủ mẫu ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. - Bƣớc 7: Ly tâm nhanh ống chứa mẫu để đẩy phần dung dịch bám trên nắp ống xuống phía dƣới. - Bƣớc 8: Bổ sung 200l cồn (96-100%), trộn đều mẫu bằng vortex và ly tâm nhanh ống chứa mẫu. - Bƣớc 9: Cẩn thận chuyển hỗn dịch từ ống chứa mẫu sang cột QIAamp Mini spin (ở trong 1 ống hứng 2ml) mà không làm ƣớt miệng cột. Đóng nắp, ly tâm ở 6000xg (8000rpm) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp Mini spin 47 sang ống hứng 2ml sạch và loại bỏ ống hứng chứa phần dịch lọc. - Bƣớc 10: Cẩn thận mở nắp cột QIAamp Mini spin và thêm vào 500 µl Bufer AW1 mà không làm ƣớt miệng cột. Đóng nắp và ly tâm ở 6000xg (8000 rpm) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp Mini spin sang ống hứng 2ml sạch, và loại bỏ ống hứng chứa phần dịch lọc. - Bƣớc 11: Cẩn thận mở nắp cột QIAamp Mini spin và thêm vào 500µl Buffer AW2 mà không làm ƣớt miệng cột. Đóng nắp và ly tâm ở tốc độ tối đa (20000 xg; 14000rpm) trong 3 phút. - Bƣớc 12: Chuyển cột QIAamp Mini spin vào ống hứng 2ml mới (không đƣợc cung cấp) và loại bỏ ống hứng cũ chứa dịch lọc. Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút. - Bƣớc 13: Chuyển cột QIAamp Mini spin sang tube 1,5ml sạch (không đƣợc cung cấp) và loại bỏ ống hứng chứa dịch lọc. Cẩn thận mở nắp cột QIAamp Mini spin và thêm vào 200 µl Buffer AE hoặc nƣớc cất. Ủ ở nhiệt độ phòng (15 - 250C) trong 1 phút, và sau đó ly tâm ở 6000xg trong 1 phút. Để bảo quản lâu dài DNA, tách bằng Buffer AE và bảo quản ở -200C. 2.4.4.2. PCR xác định tính đa hình của gen coagulase (theo qui trình của Goh và cộng sự) [50] 4 loại primer: COAG1:5‟-ATACTCAACCGACGACACCG-3‟ COAG2: 5‟-CGAGACCAAGATTCAACAAG-3‟ COAG3: 5‟-AAAGAAAACCACTCACATCA-3‟ COAG4: 5‟-GATTTTGGATGAAGCGGATT-3‟ COAG1: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 1362 đến 1381 COAG2: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 1632 đến 1651 COAG3: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 2589 đến 2608 COAG4: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 2859 đến 2878 48 + Quy trình PCR vòng 1: Các thành phần cho 1 phản ứng: Nƣớc cất cho PCR 6,5 µl PCR master mix (x2) 12,5 µl Primer 1 COAG 1 (12,5 µM) 2,0 µl Primer 2 COAG 4 (12,5 µM) 2,0 µl DNA template 2,0 µl Thể tích cuối cùng 25,0 µl Chu kỳ nhiệt: 950C trong 5 phút 950C trong 30 giây 550C trong 2 phút 40 chu kỳ 720C trong 4 phút 720C trong 7 phút Giữ ở 40C + Quy trình PCR vòng 2 Các thành phần cho 1 phản ứng: Nƣớc cất cho PCR 7,5 µl PCR master mix (x2) 12,5 µl Primer 1 COAG 2 (12,5 µM) 2,0 µl Primer 2 COAG 3 (12,5 µM) 2,0 µl DNA template (sản phẩm của vòng 1) 1,0 µl Thể tích cuối cùng 25,0 µl Chu kỳ nhiệt: 950C trong 5 phút 950C trong 30 giây 550C trong 2 phút 40 chu kỳ 720C trong 4 phút 720C trong 7 phút Giữ ở 40C + Điện di sản phẩm lần 1 và lần 2 để kiểm tra 49 - Điện di các sản phẩm sau khi chạy PCR trên gel agarose 1,5% (100 ml dung dịch TAE cho 1,5 g thạch agarose) với dung dịch đệm là TAE. - Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Đun sôi cho tan hoàn toàn agarose trong đệm TAE bằng lò vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 56-600C, đổ gel vào khay nhựa điện di (6 x 5,5 cm hoặc 6 x 11 cm tuỳ theo số lƣợng mẫu cần điện di). Khay đƣợc đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lƣợc. - Để gel đông lại (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lƣợc, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE. - Dùng micropipette cho các sản phẩm PCR vào các giếng của bản gel. Với các gel sử dụng răng lƣợc nhỏ, dùng 10 l sản phẩm PCR trộn đều với 2 l loading dye. - Điện di với hiệu điện thế 120V, cƣờng độ dòng điện 100 mA trong thời gian 30 phút. - Các mẫu thực nghiệm đƣợc điện di song song cùng với chứng. - Luôn có thang DNA chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc. + Nhuộm DNA và đọc kết quả - Bản gel sau khi điện di đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 1% pha trong nƣớc cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nƣớc cất 10 phút để khử ethidium bromide bám không đặc hiệu vào thạch. Sau khi nhuộm, các vạch DNA trên bản gel sẽ phát sáng dƣới ánh đèn cực tím. - Đọc kết quả bằng máy GelDoc (BioRad) với phần mềm chuyên dụng. Chụp ảnh nếu có sản phẩm phù hợp. + Đo nồng độ DNA sản phẩm PCR 2 Đo mật độ sản phẩm PCR 2 bằng máy Spectrophotometer (Eppendorf, Đức) Tính ra nồng độ bằng ng/µl (nồng độ tối thiểu phải từ 10-50 ng/µl) 50 + Cắt bằng enzyme AluI Tiến hành cắt bằng enzyme AluI Các thành phần tham gia phản ứng cắt như sau (theo quy trình của nhà sản xuất): - Sản phẩm PCR vòng 2 10 µl - Nƣớc cất PCR 18 µl - 10x Buffer - AluI 2 µl 1,5 µl Trộn thật đều bằng pipette với đầu tip 10 µl, không để dính lên thành, nếu dính thì ly tâm nhanh trong vòng 20 giây. Để ở 370C trong 10 giờ (dùng block nhiệt) cho ổn định, phải theo dõi nhiệt độ liên tục, không để mất điện + Điện di trên agarose 1,5% + Soi và chụp ảnh + Tiêu chuẩn phân loại S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase (theo nghiên cứu của Goh [50] và Su [113]). Các genotype của S. aureus đƣợc xác định dựa vào: - Kích cỡ của băng DNA đƣợc cắt bằng enzyme AluI - Số lƣợng các đoạn DNA sau khi cắt 2.4.4.3. Kỹ thuật xác định các gen sinh độc tố ruột se. - Các thành phần tham gia phản ứng ở các mẫu bệnh phẩm đƣợc chứa trong ống nghiệm đều giống nhau, chúng chỉ khác nhau về primer. - Luôn có chứng âm và chứng dƣơng đi kèm mẫu khi làm phản ứng để kiểm tra kết quả - Các thành phần tham gia phản ứng PCR (theo hƣớng dẫn của nhà sản 51 xuất Epicentre, Canada): + Nƣớc đã khử ion 7,5 µl + PCR master mix 12,5 µl + Mồi xuôi 1,0 µl + Mồi ngƣợc 1,0 µl + DNA khuôn mẫu 3,0 µl Tổng cộng 25,0 µl - Cho các tube vào máy PCR, thực hiện chu kỳ nhiệt phù hợp với từng loại phản ứng PCR với từng đoạn DNA cần phát hiện. + Các cặp mồi xác định độc tố ruột của S. aureus (primers) Bảng 2.1: Trình tự các mồi của các gen se [103] Gene Primer Trình tự nucleotide Kich cỡ sản phẩm Tác giả SEA-1 SEA-2 tggaaacggttaaaacgaa gaaccttcccatcaaaaaca 120 bp Johnson et al. (1991) SEB-1 SEB-2 tcgcatcaaactgacaaacg gcaggtactctataagtgcc 478 bp Johnson et al. (1991) SEC-1 SEC-2 gacataaaagctaggaattt aaatcggattaacattatcc 257 bp Johnson et al. (1991) ctagtttggtaatatctcct taatgctatatcttataggg 317 bp sed SED-1 SED-2 Johnson et al. (1991) aggttttttcacaggtcatcc cttttttttcttcggtcaatc 209 bp see SEE-1 SEE-2 Merhotra et al. (2000) aagtagacatttttggcgttcc agaaccatcaaactcgtatagc 287 bp seg SEG-1 SEG-2 Omoe et al. (2002) ggtgatattggtgtaggtaac atccatattctttgcctttaccag 454 bp sei SEI-1 SEI-2 Omoe et al.(2002) SEJ-1 SEJ-2 catcagaactgttgttccgctag ctgaattttaccatcaaaggtac 142 bp Nashev et al. (2004) sea seb sec sej 52 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SIE, SEJ TT Các bƣớc Nhiệt độ [0C] Thời gian [phút] 1 Biến tính bƣớc đầu 94 5 2 Biến tính 94 2 3 Gắn mồi 50 0,5 4 Kéo dài 72 1 5 Lặp lại 30 lần từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 6 Kết thúc 72 5 7 Giữ sản phẩm 4 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi SEG Các bƣớc TT Nhiệt độ [0C] Thời gian [phút] 1 Biến tính bƣớc đầu 94 5 2 Biến tính 94 2 3 Gắn mồi 55 0.5 4 Kéo dài 72 1 5 Lặp lại 30 lần từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 6 Kết thúc 72 5 7 Giữ sản phẩm 4 53 - Điện di sản phẩm + Sau khi phản ứng PCR kết thúc, lấy 8µl sản phẩm để kiểm tra bằng điện di gel agarose 1,2% (trong 250 ml dung dịch TBE 0,5X), đem đun sôi bằng lò vi sóng, sau đó để nguội đến khoảng 500C thì đổ vào khuôn, bản gel dày khoảng 1,5 cm). Sử dụng ladder 100bp, điện di trong 30 phút. + Bản gel sau khi chạy điện di nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide trong 4 phút, vớt ra ngâm vào nƣớc 1 phút, đọc và chụp ảnh. 2.4.5. Kỹ thuật sequencing xác nhận kết quả của phản ứng PCR Do trong nghiên cứu này không có chứng dƣơng và chứng âm của nhà sản xuất, vì vậy chúng tôi thực hiện thêm kỹ thuật Sequencing nhằm mục đích xác nhận kết quả của phản ứng PCR. Sản phẩm PCR từ các chủng S. aureus đƣợc giải trình tự là : 80M2 (sea), 103M2 (seb), 110M1 (sec), 65M3 (sed, see, seg), 7M2 (sei). Các chủng này đƣợc sử dụng nhƣ chứng dƣơng và chứng âm là nƣớc cất. + Phản ứng sequencing Bảng 2.4: Thành phần phản ứng đối với ống chuẩn Thành phần Thể tích Big Dye 2,5X 4 µl Big Dye Sequencing Buffer 5X 2 µl Primer 4 µl H2O 7 µl DNA 3 µl Tổng thể tích phản ứng 20µl 54 Hình 2.2: Kết quả giải trình tự gen sec Chú thích: Chữ (A, T, G, C) là các loại nucleotide, số là vị trí các nucleotide. Bảng 2.5: Thành phần phản ứng đối với các ống chứa mẫu Thành phần Số lƣợng Big Dye 2,5X 4 µl Big Dye Sequencing Buffer 5X 2 µl Primer 1 µl H2O 10 µl DNA 3 µl Tổng thể tích phản ứng 20 µl 55 + Tinh sạch - Cho 90µl Sam Solution + 20µl Big Dye X vào ống chứa sản phẩm PCR sequence. - Lắc kỹ hỗn hợp trong 30 phút. - Ly tâm với tốc độc 1000 vòng/phút trong 2 phút. Bảng 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sequence Các bƣớc TT Nhiệt độ [0C] Thời gian [giây] 1 Khởi đầu 96 60 2 Biến tính 96 1 3 Gắn mồi 50 5 4 Kéo dài 60 240 5 Lặp lại 25 lần từ bƣớc 2 đến bƣớc 3 6 Kết thúc 4 300 7 Giữ sản phẩm 4 + Sequencing - Hút 20µl chứng chuẩn cho vào giếng đầu, sau đó hút 20µl mẫu vào mỗi giếng. - Ghi sơ đồ và cho giếng chứa mẫu vào máy Sequencing để tiến hành phân tích trình tự gen của các mẫu bằng cách đối chiếu với trình tự nucleotide trong ngân hàng gene. 2.5. CÁCH KHỐNG CHẾ SAI SỐ Tập huấn nhân viên xét nghiệm tham gia nghiên cứu, tập huấn thử nghiệm, rút kinh nghiệm. 56 Thống nhất quy trình thực hiện, quy trình xét nghiệm ở các lần lấy mẫu và xét nghiệm là nhƣ nhau. Giải thích cho đối tƣợng tham gia nghiên cứu về tính bí mật thông tin cá nhân, kết quả nghiên cứu không ảnh hƣởng đến quyền lợi và vị trí công việc của họ nhằm tăng cƣờng ý thức tham gia nghiên cứu. Thống nhất cách ghi chép, thu thập số liệu. 2.6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ KIỂU CÁCH MANG S. AUREUS Tiêu chuẩn đánh giá kiểu cách mang S. aureus dựa vào sự có mặt của vi khuẩn ở từng lần lấy mẫu ở mũi vì lỗ mũi là vị trí cƣ trú ổn định của vi khuẩn này và ít chịu tác động của các yếu tố bên ngoài nhƣ tình trạng vệ sinh. Đây là vị trí thích hợp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu kinh điển về kiểu cách cƣ trú của S. aureus [57], [90]. Bảng 2.7: Tiêu chuẩn xác định kiểu cách cư trú của S. aureus Số lần lấy mẫu có S. aureus dƣơng tính Kiểu cách cƣ trú 4 trong 4 lần xét nghiệm Thƣờng xuyên 1 – 3 trong 4 lần xét nghiệm Không thƣờng xuyên 0 trong 4 lần xét nghiệm Không mang 2.7. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN CÁC XÉT NGHIỆM - Từ tháng 7/2009 đến 3/2012 - Địa điểm: Bộ môn Vi sinh Trƣờng Đại học Y Hà Nội Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Nhiệt đới Trung ƣơng 2.8. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ SỬ LÝ SỐ LIỆU + Các kết quả số liệu đƣợc xử lý bằng phầm mềm SPSS 16. + Test 2 đƣợc sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa hai tỷ lệ. Giá trị p < 57 0,05 đƣợc coi là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. 2.9. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU Các đối tƣợng tham gia tự nguyện, đƣợc tƣ vấn trƣớc và sau xét nghiệm, đƣợc thông báo kết quả xét nghiệm cho từng cá nhân và tƣ vấn phòng tránh lây nhiễm, vệ sinh cá nhân khi tiếp xúc và chế biến thức ăn. Kết quả nghiên cứu phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, đảm bảo bí mật cá nhân không ảnh hƣởng đến công việc và việc làm của đối tƣợng tham gia nghiên cứu. 58 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. TỶ LỆ MANG, KIỂU CÁCH CƢ TRÖ CỦA S. AUREUS 3.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên 212 nhân viên làm việc tại 14 cơ sở dịch vụ ăn uống ở Hà Nội. Mỗi nhân viên đƣợc tiến hành lấy mẫu 4 lần ở mũi và ở tay, mỗi lần cách nhau 1 tuần để xác định tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú của S. aureus. Thời gian thu thập mẫu nghiên cứu từ tháng 7/2009 đến tháng 1/2011. 3.1.1.1. Phân bố đối tượng theo giới Bảng 3.1: Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới Giới n % Nam 112 52,83 Nữ 100 47,17 Tổng số 212 100,00 Trong tổng số 212 nhân viên tham gia nghiên cứu, nam 112 ngƣời và nữ 100 ngƣời. Tỷ lệ nam chiếm 52,83% và nữ 47,17%. 3.1.1.2. Phân bố đối tượng theo nhóm tuổi Bảng 3.2: Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi Nhóm tuổi n % ≤ 19 42 19,81 20-29 140 66,04 30-39 17 8,02 40-49 9 4,24 ≥ 50 4 1,89 Tổng số 212 100,00 59 Bảng trên cho thấy phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo nhóm tuổi. Nhóm tuổi 20-29 chiếm tỷ lệ cao nhất 66,04%. Thứ hai là nhóm ≤ 19 tuổi chiếm 19,81%. Tiếp theo thứ ba là nhóm 30-39 tuổi 8,02%. Nhóm 40-49 ở vị trí thứ tƣ 4,24%. Cuối cùng là nhóm ≥ 50 với 1,89%. 3.1.1.3. Phân bố đối tượng theo vị trí làm việc Bảng 3.3: Phân bố đối tượng nghiên cứu theo vị trí làm việc Vị trí làm việc n % Chế biến 79 37,27 Phân phát 25 11,79 Phục vụ 102 48,11 Rửa 6 2,83 Tổng số 212 100,00 Vị trí làm việc có số nhân viên nhiều nhất là phục vụ bàn 102/212 (48,11%). Đứng thứ hai là nhân viên làm ở bộ phận chế biến (37,27%). Bộ phận phân phát thức ăn có 25 nhân viên chiếm 11,79% ở vị trí thứ ba. Nhân viên ở bộ phận rửa 6 ngƣời và chiếm tỷ lệ ít nhất (2,83%). 3.1.1.4. Phân bố đối tượng theo thâm niên công tác Bảng 3.4: Phân bố đối tượng nghiên cứu theo thâm niên công tác Thâm niên n % < 1 năm 62 29,25 1-5 năm 30 14,15 Tổng số 212 100,00 60 Nhóm nhân viên có thâm niên từ 1 đến dƣới 2 năm đông nhất 66/212 ngƣời (31,13%). Thứ hai là nhóm có thâm niên công tác dƣới 1 năm (29,25%). Nhóm có thâm niên 2-5 năm ở vị trí thứ ba (25,47%). Chiếm tỷ lệ thấp nhất là nhóm nhân viên có thâm niên công tác trên 5 năm (15,15%). 3.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus và một số yếu tố liên quan 3.1.2.1. Phân bố tỷ lệ phân lập được S. aureus ở các lần lấy mẫu Bảng 3.5. Phân bố các chủng S. aureus theo các lần và vị trí lấy mẫu ở 53 nhân viên có mẫu dương tính STT Lần 1 Mũi Tay + 1 Lần 2 Mũi Tay Lần 3 Mũi Tay + + 2 + + + 3 + + 4 5 6 + + + + + + + + + 9 10 + + + + 7 8 + + 11 + + 12 13 + + + + + 14 15 16 + 18 + 20 21 + + + + + + + 22 23 + + + + + + + 17 19 Lần 4 Mũi Tay + + + + + + + 61 STT 24 25 Lần 1 Mũi Tay Lần 2 Mũi Tay Lần 3 Mũi Tay + + + 26 27 + + + 28 + 29 30 + + + 31 32 + + + + 33 + 34 35 Lần 4 Mũi Tay + + + + 36 + + 37 38 + 39 + + 40 + 41 42 43 45 47 + + 52 + + + + 49 51 + + + + 48 50 + + 44 46 + + + + + + + + 53 Ghi chú: +: phân lập đƣợc S. aureus + + + 62 Bảng 3.5 cho ta thấy phân bố các chủng S. aureus trong 4 lần lấy mẫu và các vị trí tƣơng ứng ở tay và ở mũi. 4 nhân viên mang S. aureus ở cả 4 lần lấy mẫu là các nhân viên số 10, 13, 19, 21. Bảng 3.6: Phân bố tỷ lệ mang S. aureus theo số lần lấy mẫu Số lần lấy mẫu n % 1 lần 28 52,83 2 lần 16 30,19 3 lần 5 9,43 4 lần 4 7,55 Tổng 53 100,00 Trong tổng số 53 ngƣời mang vi khuẩn, tỷ lệ số ngƣời phát hiện mang 1 lần trong tổng số 4 lần lấy mẫu cao nhất 52,83%, mang 2 lần 30,19%, mang 3 lần 9,43%, mang cả 4 lần 7,55%. Bảng 3.7: Phân bố tỷ lệ mang S. aureus ở các lần lấy mẫu Lần lấy mẫu n % Lần 1 20 37,74 Lần 2 19 35,85 Lần 3 9 16,98 Lần 4 5 9,43 Tổng 53 100,00 Sau mỗi lần lấy mẫu, số ngƣời mang S. aureus tăng dần. Ở lần 1 và lần 2, số nhân viên đƣợc phát hiện đƣợc chiếm tỷ lệ cao hơn 37,74% và 35,85%, lần 3 chiếm 16,98%, lần 4 chiếm 9,43%. 63 3.1.2.2. Tỷ lệ mang S. aureus 25% 75% Không mang S. aureus Mang S. aureus Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ mang S. aureus Trong tổng số 212 nhân viên các cơ sở dịch vụ ăn uống có 53 ngƣời mang S. aureus chiếm tỷ lệ 25%. Tổng số có 101 chủng S. aureus phân lập từ mũi và tay của nhân viên. 3.1.2.3 Tỷ lệ mang S. aureus theo giới Bảng 3.8: Tỷ lệ mang S. aureus theo giới Giới Tình trạng Tính Nam Nữ chung n 22 31 53 (%) (19,64) (31,00) (25,00) Không n 90 69 159 mang (%) (80,36) (69,00) (75,00) n 112 100 212 (%) (100,00) (100,00) (100,00) mang Có mang Tổng số p 0,040,05. 3.1.2.5. Tỷ lệ mang S. aureus theo vị trí làm việc Bảng 3.10: Tỷ lệ mang S. aureus theo vị trí làm việc Vị trí làm việc Tình trạng Tính Phân phát 4 Phục vụ Rửa chung n Chế biến 12 36 1 53 mang (%) (15,19) (16,00) (35,29) (16,67) (25,00) Không n 67 21 66 5 159 mang (%) (84,81) (84,00) (64,71) (83,33) (75,00) Tổng n 79 25 102 6 212 (%) (100,00) (100,00) (100,00) (100,00) (100,00) mang Có số p 0,01 < 0,05 65 Tỷ lệ mang S. aureus ở nhóm nhân viên làm việc ở bộ phận phục vụ bàn là cao nhất (chiếm 35,29%). Tiếp theo đó là các nhóm còn lại gần tƣơng đƣơng nhau, bộ phận rửa (16,67%), bộ phận phân phát (16%), bộ phận chế biến (15,19%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,01 0,05. 66 3.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số yếu tố liên quan 3.1.3.1. Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi 1,42% 20,28% 78,3% Không mang S. aureus Mang S. aureus không thường xuyên Mang S. aureus thường xuyên Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi là 21,7%, tỷ lệ mang không thƣờng xuyên là 20,28% và mang thƣờng xuyên là 1,42%. 3.1.3.2. Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi theo giới Tỷ lệ (%) 85,71 p < 0,05 90 70,00 80 70 60 50 29 40 30 12,5 20 1 1,79 10 0 Nam Không mang Mang không thường xuyên Nữ Mang thường xuyên Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi theo giới 67 Tỷ lệ mang S. aureus không thƣờng xuyên ở nam 12,5%, tỷ lệ mang thƣờng xuyên 1,79%. Ở nữ, tỷ lệ mang không thƣờng xuyên 29%, mang thƣờng xuyên 1%. Tỷ lệ mang S. aureus không thƣờng xuyên ở nữ cao hơn ở nam (29% và 12,5%). Tỷ lệ mang thƣờng xuyên ở nam cao hơn nữ (1,79% và 1%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 0,05 Tỷ lệ mang không thƣờng xuyên ở nhóm tuổi từ 20-29 tuổi chiếm (22,86%). Vị trí thứ hai là nhóm tuổi từ 30-39 tuổi (17,65%). Nhóm tuổi từ 19 tuổi và ít hơn ở vị trí thứ ba (14,29%). Tỷ lệ mang S. aureus thƣờng xuyên ở nhóm tuổi từ 30-39 tuổi cao nhất (5,88%), tiếp theo là nhóm tuổi từ 20-29 tuổi (1,43%). Nhóm tuổi từ 40-49 tuổi không có ngƣời mang S. aureus. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. 68 3.1.3.4. Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi theo vị trí làm việc Tỷ lệ (%) p < 0,05 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi theo vị trí làm việc Tỷ lệ mang S. aureus không thƣờng xuyên ở mũi của nhóm nhân viên là việc ở bộ phận phục vụ bàn cao nhất chiếm 29,41%. Sau đó là nhân viên ở bộ phận rửa 16,67%, bộ phận phân phát là 16%. Thấp nhất là ở nhóm nhân viên làm việc ở bộ phận chế biến chiếm 10,13%. Tỷ lệ mang thƣờng xuyên ở 2 nhóm nhân viên bộ phận phục vụ là 1,96% và bộ phận chế biến 1,27%. Sự khác biệt về tỷ lệ này có ý nghĩa thống kê với p0,05. Bảng 3.13: Tỷ lệ mang và kiểu cách cư trú S. aureus ở mũi theo thâm niên công tác Nhóm thâm niên Kiểu cách cƣ < 1 năm trú 1-5 năm chung Không n 51 53 38 24 166 mang (%) (82,26) (80,30) (70,37) (80.00) (78,30) n 11 12 15 5 43 (%) (17,74) (18,19) (27,78) (16,67) (20,28) n 0 1 1 1 3 (%) (0,00) (1,52) (1,85) (3.33) (1,42) n 62 66 54 30 212 Không thƣờng xuyên Thƣờng xuyên xuyên Tổng số p 0,4>0,05 (%) (100,00) (100,00) (100,00) (100,00) (100,00) 3.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan 3.1.4.1. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay tính chung Bảng 3.14: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay Kiểu cách cƣ trú n % Không mang 193 91,04 Mang không thƣờng xuyên 19 8,96 Tổng số 212 100,00 70 Tỷ lệ mang S. aureus ở tay chiếm 8,96%, không có ngƣời mang vi khuẩn này thƣờng xuyên ở tay. 3.1.4.2. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo giới Nữ giới có tỷ lệ mang S. aureus ở tay cao hơn nam (11% so với 7,14%). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. Bảng 3.15: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo giới Kiểu cách cƣ trú Giới Nam Nữ Tính chung p Không mang n (%) 104 (92,86) 89 (89,00) 193 (91,04) Không thƣờng xuyên n (%) 8 (7,14) 11 (11,00) 19 (8,96) Tổng số n (%) 112 (100,00) 100 (100,00) 212 (100,00) 0,3>0,05 3.1.4.3. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo nhóm tuổi Bảng 3.16: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo nhóm tuổi Kiểu cách cƣ trú Không mang Không thƣờng xuyên Tổng số n Nhóm tuổi Tính ≤19 20-29 30-39 40-49 ≥50 chung 39 127 15 9 3 193 - (91,04) (%) (89,82) (90,71) (88,24) (100,0) p n 3 13 2 0 1 19 0,6 (%) (7,14) (9,29) (11,76) (0,00) - (8,96) >0,05 n 42 140 17 9 4 212 (100,00) (100,00) - (100,00) (%) (100,00) (100,00) 71 Tỷ lệ mang S. aureus ở tay cao nhất là nhóm từ 30-39 chiếm 11,76%. Nhóm 20-29 tuổi 9,29% chiếm vị trí thứ hai, thấp nhất ở nhóm ≤ 19 tuổi 7,14%. Nhóm tuổi từ 40-49 không có ngƣời mang vi khuẩn này ở tay. Nhóm từ 50 tuổi trở lên có 1 ngƣời mang S. aureus trong tổng số 4 ngƣời. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. 3.1.4.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo vị trí làm việc Bảng 3.17: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo vị trí làm việc Vị trí làm việc Kiểu cách cƣ trú Chế Phân Phục biến phát vụ Tính Rửa chung p Không n 73 24 90 6 193 mang (%) (92,41) (96,00) (88,24) - (91,04) n 6 1 12 0 19 0,4 (%) (7,59) (4,00) (11,76) - (8,96) >0,05 n 79 25 102 6 212 - (100,00) Có mang Tổng số (%) (100,00) (100,00) (100,00) Nhân viên làm việc ở bộ phận phục vụ bàn có tỷ lệ mang S. aureus ở tay cao nhất chiếm 11,76%. Sau đó là nhóm nhân viên ở bộ phận chế biến 7,59%. Nhân viên ở bộ phận phân phát đứng thứ 3 với tỷ lệ mang là 4%. Bộ phận rửa không có nhân viên nào mang vi khuẩn này ở tay. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. 3.1.4.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo thâm niên công tác Nhân viên mới thâm niên từ 1 đến dƣới 2 năm có tỷ lệ mang S. aureus không thƣờng xuyên ở tay cao nhất 15,15%, tiếp theo là nhóm nhân viên thâm niên 2-5 năm 7,41%. Nhân viên có thâm niên trên 5 năm chiếm tỷ lệ 72 6,67%. Thấp nhất là nhân viên có thâm niên dƣới 1 năm 4,84%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. Bảng 3.18: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo thâm niên công tác Nhóm thâm niên Kiểu cách cƣ Tính 0,05 n 62 66 54 30 212 Không thƣờng xuyên Tổng số (%) (100,00) (100,00) (100,00) (100,00) (100,00) 3.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay Bảng 3.19: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay Kiểu cách cƣ trú Không mang Mang không thƣờng xuyên Tổng số n % 203 95,75 9 4,25 212 100,00 Số ngƣời mang S. aureus không thƣờng xuyên cả ở mũi và cả ở tay có số lƣợng ít 9/212 ngƣời chiếm 4,25%. Không có ngƣời mang thƣờng xuyên vi khuẩn này cả ở 2 vị trí. 73 3.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay và một số yếu tố liên quan 3.1.6.1. Tỷ lệ mang chung S. aureus ở mũi hoặc tay Tỷ lệ ngƣời mang S. aureus không thƣờng xuyên ở tay hoặc mũi là 23,1% (49/212). Tỷ lệ ngƣời mang S. aureus thƣờng xuyên ở tay hoặc mũi là 1,89% (4/212). Tỷ lệ mang S. aureus cả thƣờng xuyên và không thƣờng xuyên ở mũi và/ hoặc tay là 25%. Bảng 3.20: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay tính chung Kiểu cách cƣ trú n % Không mang 159 75,00 Không thƣờng xuyên 49 23,11 Thƣờng xuyên 4 1.89 212 100,00 Tổng số 3.1.6.2. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo nhóm tuổi Bảng 3.21: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo nhóm tuổi Nhóm tuổi Kiểu cách cƣ trú ≤19 20-29 n 33 102 (%) (78,57) n Không mang Không thƣờng xuyên Thƣờng xuyên Tổng số 30-39 40-49 ≥50 Tính chung 13 9 2 159 (72,86) (76,47) (100,0) - (75,00) 9 36 2 0 2 49 (%) (21,43) (25,71) (11,76) (0,00) - (23,11) 0,043 n 0 2 2 0 0 4 [...]... Staphylococcus aureus ở nhóm ngƣời làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống với hai mục tiêu sau: 1 Xác định tỷ lệ mang, kiểu cách cư trú của S aureus ở mũi và tay của nhóm người làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống tại Hà Nội 2 Xác định sự phân bố, tính đa hình của gen mã hóa coagulase và gen mã hóa độc tố ruột của các chủng S aureus phân lập được 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH... chung mang gen mã hóa độc tố ruột của S aureus 79 Bảng 3.27: Phân bố các chủng S aureus mang gen độc tố ruột ở mũi và ở tay 81 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu tỷ lệ mang S aureus ở tay nhân viên cơ sở dịch vụ ăn uống của một số tác giả 98 Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu genotype gen mã hóa coagulase của một số tác giả 104 Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu gen độc tố ruột ở S aureus của một... thức ăn luôn là nguồn gây ô nhiễm S aureus trong quá trình chế biến, sản xuất, đóng gói, vận chuyển và bảo quản thực phẩm [15] Ở nƣớc ta đã có nhiều nghiên cứu về vai trò gây bệnh và tính kháng thuốc của S aureus nhƣng chƣa có nghiên cứu về kiểu cách cƣ trú và rất ít nghiên cứu về gen độc lực của vi khuẩn này Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài „ Xác định kiểu cách cƣ trú và gen độc lực của Staphylococcus. .. bố tỷ lệ các chủng S aureus theo số lƣợng các gen mã hóa độc tố ruột của một số nghiên cứu 113 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ mang S aureus 63 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S aureus ở mũi 66 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S aureus ở mũi theo giới 66 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S aureus ở mũi theo vị trí làm việc 68 Biểu... trong việc gây bệnh [101] 1.5 CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S AUREUS Các yếu tố độc lực của S aureus đƣợc kiểm soát bởi các gen trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid Chúng góp phần quan trọng vào cơ chế bệnh 17 sinh của vi khuẩn này Tuy nhiên, cho tới nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết một cách chắc chắn về gen nào hoặc tổ hợp các gen nào đóng vai trò quyết định trong cơ chế nhiễm trùng của S aureus hoặc là đích tác động của. .. thực phẩm có căn nguyên là vi khuẩn S aureus là một trong những nguyên nhân quan trọng nhất Độc tố ruột của S aureus là nguyên nhân gây nên ngộ độc thức ăn Trên thế giới và ở Việt Nam các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus hay gặp và có quy mô thành vụ ngộ độc tập thể Các vụ ngộ độc thực phẩm có căn nguyên là S aureus chiếm 16% tổng số, 25,6% ca bệnh và 17,5% ca nhập viện của các vụ ngộ độc thực phẩm,... vật thƣờng trú có sự ổn định tƣơng đối về chủng loại và tƣơng quan số lƣợng (mật độ) giữa chúng, tùy thuộc vào vị trí cƣ trú và lứa tuổi của chủ thể Các vi sinh vật tạm trú có nguồn gốc từ môi trƣờng, chúng cƣ trú trên da và niêm mạc từ vài giờ, vài ngày đến vài tuần, chúng không có sự ổn định về chủng loại và tƣơng quan số lƣợng và không trở thành thƣờng trú Bình thƣờng các vi sinh vật tạm trú không... (A Mô hình gen coagulase B Vị trí của gen mã hoá coagulase trên nhiễm sắc thể của S aureus) 19 Việc phân loại các genotype của S aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase có ƣu điểm đơn giản, nhanh, có khả năng phân loại chính xác các chủng S aureus dựa vào các mảnh DNA đƣợc cắt bằng enzyme AluI [122] Việc phân loại này có thể đƣợc ứng dụng trong xác định dịch tễ học phân tử và phân loại... thƣờng và trên nhóm ngƣời mang S aureus ở mũi 10 Hình 1.3: Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 13 Hình 1.4: Cấu trúc của gen mã hoá coagulase và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể 18 Hình 1.5: So sánh vị trí cắt của AluI giữa chủng S aureus A và chủng S aureus B, vị trí gắn của các primer 1, 2, 3, 4, trong phản ứng PCR 19 Hình 1.6: Vị trí nhiễm trùng và các bệnh do S aureus. .. càng trở nên cần thiết [70] 8 S aureus là thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời Khoảng 20 - 30% ngƣời khoẻ mạnh mang S aureus S aureus đƣợc phát hiện thấy ở nhiều vùng của cơ thể nhƣ da ở vùng cổ, ngực, bụng, bàn tay và một số hốc tự nhiên trên cơ thể Vị trí cƣ trú hay gặp nhất của S aureus là lỗ mũi trƣớc [5] Các công trình nghiên cứu sau này cho thấy, các chủng S aureus cƣ trú ở mũi và các chủng S aureus ... cứu gen độc lực vi khuẩn Vì tiến hành nghiên cứu đề tài „ Xác định kiểu cách cƣ trú gen độc lực Staphylococcus aureus nhóm ngƣời làm việc số sở dịch vụ ăn uống với hai mục tiêu sau: Xác định. .. tỷ lệ mang, kiểu cách cư trú S aureus mũi tay nhóm người làm việc số sở dịch vụ ăn uống Hà Nội Xác định phân bố, tính đa hình gen mã hóa coagulase gen mã hóa độc tố ruột chủng S aureus phân lập... Tình trạng mang S aureus nhân viên nhà hàng, ngƣời làm sở dịch vụ ăn uống, chế biến tiếp xúc với thức ăn nguy tiềm ẩn gây nên vụ dịch ngộ độc thức ăn S aureus ô nhiễm thức ăn nhƣ thịt, trứng,