Thông tin tài liệu
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này ngoài nỗ lực của bản thân em còn
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ cá nhân và tập thể.
Em xin trân trọng cảm ơn nhà trường và các thầy cô trong Khoa Công nghệ
Thực phẩm nói chung và thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm nói riêng đã trang
bị cho em kiến thức bổ ích về chuyên ngành trong những năm học qua giúp em có
nền tảng để thực hiện tốt đề tài.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ
sinh học, phòng thí nghiệm Hóa phân tích, phòng thí nghiệm Công nghệ cao, các anh
chị, bạn bè cùng làm đề tài đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện
nghiên cứu.
Em xin đặc biệt cảm ơn cô Trần Thị Huyền đã giành nhiều thời gian, công sức
tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Cuối cùng em muốn giành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân trong
gia đình em luôn giành sự cảm thông chia sẻ và tạo điều kiện giúp đỡ em có đủ nghị
lực, kinh phí để hoàn thành tốt đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 6 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Dung
ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT TẮT
GIẢI THÍCH
ĐLC
Độ lệch chuẩn
NL/DM
Nguyên liệu/dung môi
OD
Optical density (mật độ quang)
TB
Trung bình
TN
Thí nghiệm
VTM
Vitamin
PTN
Phòng thí nghiệm
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................vi
LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 3
1.1.
Tổng quan về cây mã đề .............................................................................. 3
1.1.1. Tên gọi và phân loại ................................................................................ 3
1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản lượng ............................................ 4
1.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 5
1.1.4. Thành phần hoá học ................................................................................ 6
1.1.5
Tác dụng dược học và công dụng của cây mã đề .................................. 12
1.1.6
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây mã đề...................... 16
1.2. Tìm hiểu về quá trính chống oxy hóa ............................................................ 19
1.2.1. Quá trình oxy hóa và gốc tự do ............................................................. 19
1.2.2. Chất chống oxy hóa ............................................................................. 22
1.3. Phương pháp chiết các chất có hoạt tính sinh học ......................................... 27
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 32
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 32
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 32
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................... 32
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 32
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................. 32
2.2.2. Dụng cụ ................................................................................................. 32
2.2.3. Thiết bị................................................................................................... 33
2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 33
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 33
2.4.2. Bố trí thí nghiệm. ................................................................................... 36
iv
2.4.3. Các phương pháp phân tích.................................................................... 45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 46
3.1 Tỷ lệ khối lượng các bộ phận của cây mã đề.................................................. 46
3.2 Hàm lượng ẩm của nguyên liệu...................................................................... 47
3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của thành phần cây mã đề ........................ 47
3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết
mã đề
.............................................................................................................. 50
3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã
đề ......................................................................................................................... 52
3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chông oxy hóa của dịch chiết mã đề 53
3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết mã đề ................................................................................................... 55
3.8. Đề xuất quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ mã đề ............................ 58
3.8.1. Sơ đồ quy trình ....................................................................................... 58
3.8.2. Thuyết mình quy trình ............................................................................ 59
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 60
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 60
4.2. Kiến nghị....................................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 61
PHỤ LỤC
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại học ............................................................................................. 3
Bảng 3.1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phận cây mã đề. ................................................ 46
Bảng 3.2. Hàm lượng ẩm của nguyên liệu lá mã đề khô ........................................ 47
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây mã đề .................................................................................................. 4
Hình 1.2. Hình thái cây mã đề.................................................................................... 6
Hình 1.3. Acid béo được phân lập trong lá mã đề ....................................................... 8
Hình 1.4. Cấu trúc alkaloids trong mã đề ................................................................... 9
Hình 1.5. Một số dẫn xuất axit caffeic trong mã đề ................................................ 10
Hình 1.6. Một số loại Flavonoid trong mã đề.......................................................... 10
Hình 1.7. Một số Iridoid glycoside trong mã đề ....................................................... 11
Hình 1.8. Cấu tạo của BHA và của BHT .................................................................. 27
Hình 2.1. Sơ đồ bố thí thí nghiệm tổng quát ............................................................. 34
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ các
bộ phận cây mã đề........................................................................................... 36
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính
chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. ............................................................... 38
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống
oxi hóa của dịch chiết mã đề. .......................................................................... 40
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính oxi hóa
của dịch chiết mã đề. ....................................................................................... 42
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nguyên liệu/ dung môi đến hoạt
tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề. ....................................................... 44
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các thành phần cây đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở
dịch chiết mã đề. ............................................................................................. 48
Hình 3.2. Ảnh hưởng của các thành phần cây đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã
đề. ................................................................................................................... 48
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng khử gốc tự do DPPH của
dịch chiết mã. .................................................................................................. 50
Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến tổng năng lực khử của dịch chiết
mã đề.). ........................................................................................................... 50
vii
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở dịch chiết
mã đề............................................................................................................... 52
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã đề.. ....... 52
Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở dịch chiết
mã đề............................................................................................................... 54
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã đề. ....... 54
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khả năng khử gốc tự do
DPPH ở dịch chiết mã đề.. .............................................................................. 56
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến tổng năng lực khử ở
dịch chiết mã đề. ............................................................................................. 56
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ lá mã đề ..................... 58
1
LỜI MỞ ĐẦU
Các hợp chất chống oxy hóa, kháng khuẩn hiện nay là đối tượng được nghiên
cứu rất nhiều trước tình trạng bệnh tật liên quan đến quá trình oxy hóa đang là một
vấn đề cấp thiết. Theo thuyết về gốc tự do xuất phát từ ý kiến của BS. Denham
Harman (Trường đại học Nebraska) đưa ra năm 1950 thì các gốc tự do là nguyên
nhân chính gây xáo trộn hoạt động của các ty lạp thể (mitochondries), bám vào các
DNA là nguyên liệu chính của các mật mã di truyền, gây đột biến bên trong các tế
bào… Nói một cách khác các gốc tự do là nguyên nhân của sự tự hủy hoại và sự lão
hóa ở cấp tế bào.
Con người hiện nay luôn cố gắng tìm kiếm những loại thuốc quý hiếm ngăn
ngừa các bệnh mãn tính, có lợi cho sức khỏe, làm đẹp, chống lão hóa… Tuy nhiên
chúng ta lại không biết rằng những cây rau cỏ nhỏ bé dễ kiếm trong vườn cũng là
những loại thuốc chữa bách bệnh nhưng lại bị lãng quên. Trong đó, mã đề là một loại
rau mọc hoang được biết đến với rất nhiều công dụng chữa bệnh như giải nhiệt, lợi
tiểu, kháng khuẩn, trừ đờm, sáng mắt, hạ huyết áp,… Mã đề (Plantago major) được
sử dụng với nhiều mục đích trong y học cổ truyền trên toàn thế giới như có tác dụng
tốt với bệnh lao, ung thư và đặc biệt với các thể nặng của viêm loét dạ dày. Trên thế
giới các hoạt tính sinh học của cây mã đề cũng được đánh giá cao. Tuy nhiên ở Việt
Nam việc sử dụng loại cây này trong thực phẩm, dược phẩm cũng như các ứng dụng
khác còn rất hạn chế.
Từ những phân tích đó, kết hợp những kiến thức đã học bước đầu làm quen
với công tác nghiên cứu ứng dụng. Được sự hướng dẫn của ThS.TRần Thị Huyền,
em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát hoạt tính chống
oxy hóa của dịch chiết mã đề (Plantago major )”. Đây là nghiên cứu cơ bản có thể
bổ sung nguồn dữ liệu khoa học về cây mã đề làm cơ cở cho các nghiên cứu khác và
thúc đẩy việc ứng dụng nguồn nguyên liệu này.
2
Mục đích và ý nghĩa của đề tài
Mục đích của đề tài
-
Nghiên cứu các điều kiện (Nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian,
nhiệt độ chiết,…) ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa từ dịch chiết mã đề.
-
Đề xuất qui trình thu dịch chiết từ mã đề có hoạt tính chống oxy hóa.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
-
Là cơ sở để áp dụng việc tách chiết chất chống oxy hóa từ các loại dược liệu.
-
Thành công của đề tài sẽ tạo ra chất chống oxy hóa ứng dụng trong y học.
-
Nâng cao giá trị của cây mã đề, từ đó mở rộng diện tích gieo trồng, nâng cao giá
trị kinh tế của loại cây này.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây mã đề
1.1.1. Tên gọi và phân loại [15], [22]
1.1.1.1. Tên gọi
Tên tiếng Việt: Mã đề, xa tiền, mã tiền á.
Tên tiếng anh: Chinese plantain, obako, arnoglssa.
Tên khoa học: Plantago asiatica L.
Tên đồng nghĩa: Plantago major, plantago major subsp. major.
1.1.1.2. Phân loại
Bảng 1.1. Phân loại học
Bộ (order)
Hoa môi ( Lamiales)
Họ (familia)
Mã đề (plantaginaceae)
Chi (genus)
Mã đề ( plantago)
Loài (species)
Plantago asiatica
Phân loài ( subspecies)
Có nhiều phân loài
Nói về loài mã đề (Plantago spp…) việc phân chia giữa các loài (species),
phân loài (subspecies) và giống (varieties) chưa được thống nhất, còn nhiều tranh cãi.
Tuỳ theo quan điểm của các hệ thống phân loại khác mà cây mã đề có hai cách phân
loại khác nhau.
Có 2 loài mã đề khác nhau ở Việt Nam
Một: Loài Plantago major (mã đề lớn) chủ yếu được dùng làm rau, được trồng
phổ biến.
Trong loài này có 3 phân loài (subspecies) là:
-
Plantago major subsp. major.
-
Plantago major subsp. intermedia (DC.) Arcang.
-
Plantago major subsp. winteri (wirtg.) W. Ludw.
Hai: Loài Plantago asiatica (mã đề, mã đề á hay xa tiền) chủ yếu được dùng
làm thuốc.
4
Về công dụng dược liệu của hai loài tương tự nhau nhưng ở loài mã đề lá lớn thì
có chất lượng kém hơn.
Chỉ có 1 loài (species) mã đề ở Việt Nam.
Đó là loài Plantago asitica với nhiều phân loài (subspecies) khác nhau, phân loài
Plantago major subsp. major chính là loài Plantago major (mã đề lớn) nêu trên do
quá trình trồng trọt, thuần dưỡng mà thành.
Hình 1.1. Cây mã đề
1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản lượng
1.1.2.1. Nguồn gốc [14], [15]
Hiện nay chưa rõ ràng về nguồn gốc xuất phát của chi mã đề (Plantago). Người
ta cho rằng cây mã đề có nguồn gốc từ các nước Bắc Âu. Năm 1983, Jonsson đã tìm
thấy hóa thạch của cây mã đề nguyên thủy cách đây gần 4000 năm ở châu Âu. Ông
cho rằng con người đã mang loại cây này đến khắp mọi nơi trên thế giới. Người Ấn
Độ đặt tên cho nó là “Dấu chân của người da trắng” vì chúng xuất hiện ở khắp mọi
nơi có người châu Âu sinh sống. Điều này phù hợp với cái tên “Plantago”, vì theo
tiếng latin “Planta” có nghĩa là “ Bàn chân”.
1.1.2.2. Phân bố [15]
Các loài mã đề mọc ở nhiều nơi trên thế giới, bao gồm châu Mỹ, châu Á, Úc,
New Zealand, châu Phi và châu Âu. Nhiều loài trong chi phân bổ rộng khắp trên thế
giới như một dạng cỏ dại.
5
Riêng loài mã đề Plantago asiatica (tên đồng nghĩa là Plantago major subsp.
major hay plantago major) có nguồn gốc ở vùng cận nhiệt đới ở Nam Á, được dùng
làm thuốc từ lâu đời ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Ở Việt Nam
cây mã đề lá lớn được trồng phổ biến làm rau ăn và cây mã đề lá nhỏ mọc hoang dại
trên khắp cả nước chủ yếu được dùng để làm thuốc.
Mã đề thường mọc ở ven đường, ven lạch nuớc, ruộng ẩm ướt, vùng cỏ mọc,
ven vườn, ven làng xóm. Mã đề thích ứng rộng với điều kiện sinh thái, cây ưa sáng,
chịu bóng, thích ứng được khí hậu và đất đai của hầu khắp các vùng trong cả nước.
Mã đề mọc hoang khắp nơi, từ vùng cao Sapa (Lào Cai), Đà Lạt (Lâm Đồng) đến các
vùng trung du và đồng bằng…
1.1.2.3. Tình hình sản lượng
Hiện nay chưa có con số thống kê về diện tích gieo trồng cũng như sản lượng
song cây mã đề đang được áp dụng gieo trồng tại nhiều nơi như Cao Bằng, Lạng Sơn,
Điện Biên, Phú Yên, Khánh Hòa,… Vùng đã sản xuất mã đề dược liệu hàng hoá có
Nghĩa Trai (Hưng Yên), Thanh Trì (Hà Nội), Tuy Hoà (Phú Yên)…
1.1.3. Đặc điểm hình thái [15]
Chi mã đề (Plantago) là một chi chứa khoảng 200 loài thực vật có kích thước
nhỏ, được gọi chung là mã đề. Phần lớn là loài cây thân thảo, mặc dù có một số ít loài
là dạng cây bụi nhỏ, cao tới 60 cm. Lá của chúng không có cuống, nhưng có một phần
hẹp gần thân cây, là dạng cuống lá giả. Chúng có 3 hay 5 gân lá song song và toả ra
ở các phần rộng hơn của phiến lá. Các lá hoặc là rộng hoặc là hẹp bản, phụ thuộc vào
từng loài. Các cụm hoa sinh ra ở các cuống thường cao 5-40 cm, và có thể là một nón
ngắn hay một cành hoa dài. Được thụ phấn nhờ gió.
6
Hình 1.2. Hình thái cây mã đề
+ Thân: Mã đề là cây thân thảo, sống lâu năm, tái sinh bằng nhánh và hạt, thân cao
khoảng 10-15cm.
+ Lá: Lá có cuống dài, hình trứng dài 5-12 cm, rộng 3,5-8 cm, đầu tù, hơi có mũi
nhọn. Mã đề rất dễ nhận ra bởi phiến lá hình thìa, đôi khi hình trứng, có gân hình
cung dọc theo sống lá và đồng qui ở ngọn và gốc lá.
+ Hoa: Hoa mọc thành bông có cán dài 10-15 cm, xuất phát từ kẽ lá, hoa dài lưỡng
tính, đài 4, xếp chéo, hơi dính ở gốc, tràng màu nâu tồn tại, gồm 4 thuỳ nằm xen kẽ
ở giữa các lá đài. Nhị 4 chỉ nhị mảnh, dài, 2 lá noãn chứa nhiều tiểu noãn. Mùa hoa
nở trong tháng 7-8. Hoa thụ phấn nhờ gió và phát tán bằng hạt.
+ Quả: Quả hộp trong chứa nhiều hạt màu nâu đen bóng.
+ Hạt: Hạt rất nhỏ nhưng có thể thu hoạch và nghiền nát để trích lấy dung dịch keo
bột. Một cây có thể sản sinh hàng ngàn hạt, hạt khuếch tán nhờ gió.
1.1.4. Thành phần hoá học [14]
Năm 2009, Beara, I.N. và cộng sự tại Đại học Novi Sad, Novi Sad, Serbia đã
kiểm tra các tính chất chống oxy hóa của dịch chiết từ methanol ở một số loài mã đề
bằng các phương pháp (DPPH, gốc hydroxyl, anion superoxide, và kiểm tra năng lực
oxit nitric…) cho thấy hiệu quả chống oxy hóa của dịch chiết mã đề mạnh hơn so với
BHT, một chất chống oxy hóa tổng hợp nổi tiếng. Bên cạnh đó dịch chiết được kiểm
7
tra tổng lượng phenolic (dao động 38,43 ÷ 70,97 mg GAE/g ) và tổng hàm lượng
flavonoid từ 5,31 ÷ 13,10 mg QE/g.
Theo đánh giá công dụng truyền thống, thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học ở cây mã đề của Anne Berit Samuelsen, bộ phân nghiên cứu nguồn gốc tự nhiên
của cây thuốc, đại học Oslo, Na Uy, năm 2002 chỉ ra rằng mã đề có chứa các hợp
chất có hoạt tính sinh học như polysaccharides, lipid, dẫn xuất của acid caffeic,
flavonoids, glycosid iridoid, terpenoids, alkaloids và một số axit hữu cơ có hoạt động
chữa bệnh liên quan đến các vết thương, chống viêm, giảm đau, antiulcerogenic,
antileukemic và hạ huyết áp.
1.1.4.1. Cacbonhydrate
Theo Ahmed và cộng sự (1965), hạt mã đề chứa glucose monosacarit, fructose,
xylose và rhamnose cũng như disaccharide sucrose và trisaccharide planteose.
Planteose như một carbohydrate dự trữ trong hạt. Vỏ hạt bên ngoài có chứa
polysaccharides trương nở khi tiếp xúc với nước và có dạng chất nhầy, có độ nhớt
cao. Polysaccharides chiết xuất từ hạt bằng nước lạnh được chứa 61% xylose,
arabinose 13,2% và 24% axit galacturonic, và chiết nước nóng của phần còn lại chứa
78% xylose, arabinose 13,2%, 3% và galactose 6,2% axit galacturonic. Năm 1999,
Samuelsen và cộng sự thấy rằng các polysaccharides của dịch chiết từ nước ở nhiệt
độ 500C được cấu tạo 39,7% xylose, arabinose 13,1%, 17,2% galacturonic axit,
15,5% acid glucuronic, 2,1% rhamnose, 2,5% galactose và glucose 9,9%. Trong lá
có chứa trisaccharit raffinozơ, tetrasccharit stachyozơ, stachyozơ đóng vai trò là
cacbonhydrat dự trữ trong thực vật.
Năm 1966, Gorin đã phân lập một vài polysaccharide gồm axit galacturonic,
galactose, arabinose và rhamnose ngoài ra là một lượng nhỏ glucose và xylose.
polysaccharide axit pectic, galactoarabinan galactan đã bị cô lập. Những chất này đôi
khi được gọi là 'plantaglucid' và đã được sử dụng để điều trị viêm loét với liều lượng
1,5-3 g/ngày. Trong một liều lượng 1mg/kg, plantaglucid giảm chỉ số loét dạ dày ở
chuột xuống 20 lần. Plantaglucid giảm các cơn co thắt trong ruột thỏ và cũng có tác
dụng chống co thắt. Nó giúp làm giảm kích ứng phù nề sinh ra bởi formalin và
dextran. Theo Obolent-seva và Khadzhai (1966) thì không có tác dụng độc hại đã khi
8
điều trị kéo dài trên đường ruột của chuột và chó. Một số dạng pectin đã este hoá có
phân tử lượng lớn (46-48 kDa) có tác dụng hoạt hoá đại thực bào ở người (in vitro)
làm tăng sinh TNFα (tumornecrosis α ).
1.1.4.2. Lipit
Hầu hết các axit béo thường tìm thấy trong hạt bao gồm axit Myristic, axit
Plamitic, axit Stearic, axit Oleic, axit Linoleic, axit Linolenic, axit arachidic, axit
Behenic, axit Lignoceric, axit 9-Hydroxy-cis-1octadecenoic. Nhưng chiếm nhiều là
axit Oleic 37,4%, axit Linolenic 0,9%, axit 9-Hydroxy-cis-1octadecenoic 1,5%.
Lipit trong lá tươi chiếm 0,18%. Năm 1996, Guil và cộng sự đã phân lập được
một số loại lipid trong lá được thể hiện ở Hình 1.3. Trong đó phần lớn là các axit béo
omega 3, omega 6 và omega 9.
Hình 1.3. Acid béo được phân lập trong lá mã đề
1.1.4.3. Alkaloid
Theo Rojas (1968) và Smolenski (1974), mã đề được kiểm tra định tính và
phát hiện có chứa các alkaloid. Schneider (1990) xác định chúng là indicain và
plantagonin.
9
Hình 1.4. Cấu trúc alkaloids trong mã đề (Trong đó R=CHO là Indicain,
R=COOH là Plantagonin)
1.1.4.4. Dẫn xuất Caffeic acid
Năm 1969, Pailer và Haschke Hofmeister đã phân lập được các ethyl và methyl
este của axit caffeic trong mã đề từ dịch chiết methanol. Năm 1971, Maksyutina đã
phân lập được chlorogenic và acid neochlorogenic từ dịch chiết dung môi nước. Theo
Noro và cộng sự (1991), plantamajoside là axit caffeic chính trong cây mã đề.
Plantamajoside cũng là một chất có hoạt tính sinh học được biết đến. Nó có tác dụng
ức chế acid arachidonic gây ra phù nề tai ở chuột tức hay nói cách khác nó có khả
năng kháng viêm.
Nó còn có khả năng chống oxy hóa. Skari và cộng sự (1999) thấy rằng
plantamajoside là một chất khử gốc tự do DPPH (diphenylpicrylhydrazyl).
Plantamajoside cũng được biết là có một số hoạt tính kháng khuẩn (theo Rxcavn và
Brimer, 1988).
Acteoside được tìm thấy với một lượng nhỏ trong mã đề, nó cũng có hoạt tính
chống oxy hóa, có khả năng khử gốc tự do DPPH, superoxide anion, và chống lipid
peroxy (Theo Xiong, 1996; Miyase, 1991; Zhou và Zheng, 1991; Skariet, 1999). Nó
còn có tính kháng khuẩn (Theo Shoyama và cộng sự, 1987) và các hoạt động giảm
đau (Theo Andary và cộng sự, 1982). Acteoside có tác dụng hạ huyết áp, với liều 10
mg/kg đối với chuột (Theo Ahmad, 1995).
10
Hình 1.5. Một số dẫn xuất axit caffeic trong mã đề (Trong đó (A) Cafeic acid,
(B) Chlorogenic acid, (C) Plantamajoside R=Glc, Acteoside R=Rha.)
1.1.4.5. Flavonoid
Một số flavonoid đã được phân lập từ mã đề (Hình 1.6). Ta thấy những chất
flavonid này đều có nhóm OH- trong cấu tạo do đó chúng sẽ tan tốt trong các dung
môi có gốc ancol.
Hình 1.6. Một số loại Flavonoid trong mã đề
Nhiều flavonoids là chất chống oxy hóa ( Rice-Evans và cộng sự, 1996; Bohm
và cộng sự, 1998). Ví dụ như các hợp chất chính trong mã đề như Baicalein,
Hispidulin và Plantaginin ( Theo Yuting, 1990; Yokozawa, 1997; Skari, 1999 vàcộng
sự của họ).
11
Một số flavonoids cũng được biết là có hoạt tính khử gốc tự do (Theo
Kandaswami và Middleton, 1994). Baicalein, hispidulin, scutallarein và plantaginin
khử gốc tự do và chống lipid peroxy (Theo Sanz, 1994; Yoshino, 1997; Gao, 1999;
Skari, 1999 và cộng sự của họ). Cả Baicalein và Hispidulin có hoạt động chống viêm,
Baicalein ức chế carrageenan gây ra phù chân ở chuột (Theo Lin và Shieh, 1996),
trong khi Hispidulin đã được chứng minh là một chất ức chế 5-lipoxygenase ( Theo
Moongkarndi và cộng sự, 1991).
Baicalein có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan CCl4 gây ra ở chuột
(Theo Lin và Shieh, 1996). Baicalein có thể gây chết tế bào ung thư biểu mô tế bào
(Theo Matsuzaki và cộng sự, 1996), Scutallarein và Baicalein có các hoạt động chống
dị ứng (Theo Kawasaki, 1994 và Toyoda , 1997). Ngoài ra, chúng là những chất ức
chế enzyme sao chéo ngược HIV trong ống nghiệm tương ứng với giá trị IC50
(2,5mM và 5,6 mM). Theo Nishibe, 1997, các Glucosides Plantaginin, Luteolin 7glucoside và Homoplantaginin cũng là các chất ức chế enzyme sao chép ngược HIV
mạnh (IC50 9,8, 40,2 và 43,3 mM, tương ứng).
1.1.4.6. Iridoid glycosides
Các glycosid iridoid phân lập từ mã đề được liệt kê trong Hình 1.7.
Hình 1.7. Một số Iridoid glycoside trong mã đề
12
Glycoside iridoid chính được tìm thấy là aucubin, nhưng hàm lượng của nó
thay đổi qua các mùa. Mức aucubin cao nhất (1,3% trong lá khô) là vào tháng sáu.
Aucubin có đặc tính kháng viêm, khi bôi tại chỗ aucubin có tác dụng ức chế TPA
(12-O tetradecanoylphorbol acetate) ở chuột làm giảm phù nề tai với liều tối đa 1 mg/
tai (Theo Recio và cộng sự, 1994).
Aucubin cũng có đặc tính chống co thắt do acetylcholine gây ra co thắt tử cung
và ống dẫn tinh ở chuột (Theo Oritz de Urbina, 1994).
Aucubin có hoạt tính giải độc cho nấm Amanita gây độc ở chuột bằng cách
bảo vệ chống lại các tổn thương gan gây ra bởi amanitin. Cơ chế được cho là do hiệu
ứng cạnh tranh của aucubin trên amanitin ức chế tổng hợp RNA gan (Theo Chang và
cộng sự, 1984). Nó cũng có hoạt tính bào vệ gan chống lại CCl4 gây ra tổn thương về
gan ở chuột (Chang, 1998), thêm vào đó là hoạt động kháng virus, chống lại virus
viêm gan B (Chang, 1997).
1.1.4.7. Vitamin
Mã đề lớn đã được sử dụng như một nguồn cung cấp thực phẩm, đặc biệt trong
mùa xuân khi thu hoạch. Mã đề chứa các loại vitamin. Đã được báo cáo có chứa 6
mg b-carotene (Tiền vitamin A) và acid ascorbic 19 mg trong 100g (Theo Zennie và
Ogzewalla, 1977). Như vậy, mã đề có thể được coi như là một nguồn thực phẩm tốt
giàu vitamin C và carotenoids.
1.1.5. Tác dụng dược học và công dụng của cây mã đề [ 14], [15 ], [19]
1.1.5.1. Chống viêm loét
Mã đề đã được sử dụng ở Thổ Nhĩ Kỳ trong điều trị viêm loét. Bột lá khô được
trộn cùng với mật ong vào bữa ăn sáng hàng ngày. Năm 1993, Yesilada và cộng sự
đã tiến hành một thử nghiệm trên chuột để kiểm tra khả năng để ức chế viêm loét của
dịch chiết mã đề. Sau 7 giờ nhúng trong nước, những con chuột đã thiệt mạng và dạ
dày đã được đưa ra để kiểm tra. Dịch chiết từ methanol pha với nước (1,2 g/kg) ức
chế hình thành loét chiếm 40% so với nhóm kiểm soát. Dịch chiết từ nước (1 g/kg)
ức chế sự hình thành vết loét bằng 37% và dịch chiết methanol ức chế nó bằng 29%.
13
1.1.5.2. Chống ung thư
Năm 1976, Bhakuni và cộng sự tiến hành một cuộc kiểm tra hoạt tính chống
ung thư của cây mã đề ở vùng Chile. Chiết xuất từ lá, thân và hạt của mã đề bằng
dung môi ethanol 50% không có hoạt động chống lại bệnh bạch cầu lymphocytic ở
chuột.
Tuy nhiên năm 1990, báo cáo của Yaremenko cho rằng dịch chiết mã đề có
hiệu quả trong hệ thống kiểm soát ung thư học dự phòng. Các hiệu ứng bao gồm các
hoạt động chống di căn trong khối u ở chuột. Nhưng chi tiết trong nghiên cứu này
không được mô tả.
Trong một nghiên cứu khác, một chiết xuất dung dịch nước đã được chứng
minh là có tác dụng dự phòng trên ung thư vú ở chuột (Lithander, 1992). Lá mã đề
được trích ly với đệm phosphat pH 7 có chứa 0,9% NaCl và được dùng cho nhưng
con chuột của chủng khỏe mạnh bị tiêm subcutaneously. Trong số những con chuột
bị nhiễm virus. Sau 60 tuần, 93,3% của không được điều trị và 18,2% số chuột được
điều trị phát hiện có khối u. Lithander kết luận rằng hiệu quả quan sát được cho có lẽ
là do dịch chiết có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch hơn là ảnh hưởng trực tiếp
đến virus. Do đó, dịch chiết mã đề chủ yếu có tác dụng tốt đối với con người chứ
không có tác dụng trực tiếp lên vi rút herpes trong vitro.
1.1.5.3. Hoạt động Antigiardiasic
Mã đề được sử dụng tại Mexico chống lại tiêu chảy và ký sinh trùng. Dung
dịch mã đề nấu với nước muối được ủ với dưỡng thể của vi khuẩn Giardia duedenalis.
Tỷ lệ tử vong là 76 ± 1,2 trong khi đó thuốc kháng sinh Tinidazol là (79 ± 1,9) (Theo
Ponce-Ma-cotela và cộng sự, 1994).
1.1.5.4. Chống sốt rét
Mã đề lớn đã được sử dụng trong điều trị bệnh sốt rét ở Tanzania. Trong vitro
hoạt động chống lại trùng sốt rét Plasmodium falciparum chủng K1 được thực hiện
bằng cách đo khả năng của các chất chiết xuất để ức chế sự kết hợp của [ 3H]hypoxantine vào ký sinh trùng sốt rét. Các chiết xuất dichloromethane của mã đề đã
có một số tác dụng (IC50 10-49 mg/ ml), dịch chiết ether dầu hỏa và dịch chiết
14
methanol có ít tác dụng hơn (IC50 100-499 mg/ ml và 499 mg/ ml), (Theo Weenen
và cộng sự, 1990).
1.1.5.5. Kháng viêm và giảm đau
Các chiết xuất từ dung dịch nước (720C, 30 phút) của lá mã đề khô khi uống
đã thể hiện sự chống viêm và các hoạt động liên quan đến thuốc giảm đau ức chế tổng
hợp prostaglandin ở chuột. Hoạt tính kháng viêm ở chuột đã được chứng minh bởi sự
ức chế phù nề chân gây ra bởi carrageenan. (Guille'n và cộng sự, 1997).
1.1.5.6. Chống oxi hóa
Khả năng chống oxy hóa bằng cách làm mất màu của độ hấp thụ của 2,2%
azinobis (acid 3-ethylben-zthiazolinesulfonic). Nước trà mã đề gồm một lượng nhỏ
chất có khả năng quét gốc tự do so với trà đen. Khả năng chống oxy hóa của lá mã đề
còn xanh thì cao hơn của trà mã đề, điều này cho thấy rằng quá trình chế biến làm
giảm hoạt tính chống oxy hóa của mã đề (Campos và Lissi, 1995).
1.1.5.7. Tác dụng lợi tiểu
Ở Guatemala, lá được sử dụng có công dụng lợi tiểu. Trong một nghiên cứu
với của 67 cây thuốc trong đó chiếm 10% là lá mã đề khô đã được thử nghiệm trên
chuột với liều 1 g/kg. Nó đã có tác dụng lợi tiểu trung gian, lượng nước tiểu tăng
108.944% sau 6 giờ. Hydrochlorothiazide tăng lượng nước tiểu bằng 286.938%
(Ca'ceres, 1987).
Ở Việt Nam, các dịch chiết hạt mã đề uống được cho là có tác dụng lợi tiểu.
Một hoạt động lợi tiểu có thể được thử nghiệm trên người tình nguyện khỏe mạnh
trong thử nghiệm “double-blind”. Tuy nhiên, không có sự khác biệt giữa thuốc và giả
dược (Theo Doan và cộng sự, 1992).
1.1.5.8. Tác dụng hạ huyết áp
Ở Miến Ðiện, dịch chiết mã đề được dùng để uống nhằm giảm huyết áp. Trong
một nghiên cứu khác, chuột huyết áp bình thường được tiêm dịch chiết mã đề vào
tĩnh mạch. Các chiết xuất 70% ethanol đã được đông khô hòa tan trong dung dịch
sinh lý. Hiệu quả tối đa là quan sát 0,2 phút sau khi tiêm và kéo dài trong 0,5 phút.
Các mức giảm huyết áp động mạch là không trọng đáng kể (Schmeda Hirschmann,
1992).
15
1.1.5.9. Hoạt động hạ đường huyết
Rodriguez và cộng sự (1994) đã thử nghiệm dịch chiết từ ethanol 70% cho
hoạt động của hạ đường huyết ở chuột normoglycaemic mà không tìm thấy bất kỳ
ảnh hưởng đáng kể. Dịch chiết được cho uống với liều 500 mg/kg. Nền tảng của thử
nghiệm này là người da đỏ Mapuche ở Chile đã sử dụng nước sắc từ mã đề trong việc
điều trị bệnh tiểu đường (Theo Houghton và Manby, 1985).
1.1.5.10. Công dụng của cây mã đề
Cây mã đề dùng để làm rau ăn
Ở Việt Nam: Lá cây mã đề non được dùng làm rau như các loại rau cải khác.
Lá mã đề non còn được dùng để ăn sống với khác loại rau ghém khác nhất là ăn chung
với các loại rau rừng. Lá mã đề non cũng được dùng để xào, nấu các món canh rau
mặn và chay rất ngon và có tác dụng giải nhiệt, tiểu tiện dễ dàng.
Ở nước ngoài: Nhiều nước Châu Á và vùng Đông Nam Á đều dùng lá non để
làm rau, ở Nhật Bản dùng để ăn sống với các món súp hải sản truyền thống, ở Bắc
Mỹ và Nam Mỹ dùng để làm salad hoặc hầm, nấu với thịt.
Cây mã đề dùng để làm thuốc
Theo y học cổ truyền
Lá mã đề có vị nhạt, tính mát, hạt có vị ngọt, nhạt, nhớt. Quy vào 4 kinh can,
phế, thận, tiểu trường. Có tác dụng thanh nhiệt lợi phế, tiêu thũng, thông tiểu tiện.
Mã đề được dùng chữa ho lâu ngày, viêm khí quản, viêm thận và bàng quang, bí
tiểu tiện, tiểu tiện ra máu hoặc ra sỏi, phù thũng, đau mắt sưng đỏ, tiêu chảy, lỵ,
chảy máu cam, ra nhiều mồ hôi.
Dùng ngoài, lá mã đề tươi đắp làm mụn nhọt chóng vỡ, mau lành.
Hạt mã đề dùng điều trị đái tháo đường, khó tiêu, ho, bệnh vô sinh, chữa một số
bệnh về mắt.
Trong y học cổ truyền Ấn Độ, mã đề có tác dụng cầm máu, trị vết thương, viêm
các mô; các bệnh về biểu bì, mụn nhọt mưng mủ, ngứa da, chốc lở loét. Lá mã
đề là thuốc mát có tác dụng lợi tiểu, làm săn, chữa sốt, ho, nhức đầu, đau tai và
răng, trị trĩ và tiêu chảy.
16
Ở Nhật Bản và Trung Quốc, mã đề được dùng trị ho, hen, viêm phế quản mãn,
viêm màng phổi, bệnh tiết niệu, tiêu thũng, tiêu viêm và bệnh thận mãn tính.
Theo y học hiện đại
Nước ép cây mã đề có tác dụng tăng tiết dịch vị. Có tác dụng tốt với bệnh lao, ung
thư và thể loét dạ dày nặng trên thực nghiệm.
Qua thực nghiệm và lâm sàng thấy mã đề có một số tác dụng sau: lợi tiểu do làm
tăng lượng nước tiểu, ure, axit uric và muối trong nước tiểu; trừ đờm, chữa ho;
làm tăng niêm dịch phế quản, ống tiêu hoá; ức chế trung khu hô hấp, làm thở sâu
và chậm, kháng khuẩn với một số chủng vi khuẩn gây bệnh ngoài da.
Cao cồn mã đề có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt với tổn thương gan gây bằng carbon
tetrachlorid ở động vật thí nghiệm. Hoạt chất aucubin phân lập được có tác dụng
bảo vệ gan và chống độc tố của nấm amanita.
Trên lâm sàng đã sử dụng dạng viên phối hợp terpin và mã đề cho thấy tác dụng
điều trị ho rất hiệu quả và các bệnh viêm đường hô hấp trên do siêu vi khuẩn.
Hạt mã đề được dùng điều trị bệnh sỏi đường tiết niệu.
Các polysacharid trong hạt mã đề có tác dụng nhuận tràng tốt và hạ đường máu,
cholesterol máu.
Hoạt chất plantamajosid phân lập được, có tác dụng ức chế tụ cầu vàng, trực
khuẩn E.coli …
1.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây mã đề
1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta các công bố nghiên cứu khoa học về cây mã đề vẫn còn rất hạn chế.
Có một vài nghiên cứu như:
Năm 1999, Đoàn Dự Đạt và cộng sự công bố nghiên cứu tác dụng lợi tiểu khi
sử dụng riêng lẻ và khi kết hợp giữa bốn loại dược liệu truyền thống Việt Nam (râu
ngô, mã đề, rễ cỏ tranh, cỏ râu mèo).
Năm 2010, Lê Thị Lan Phương và cộng sự đã công bố xây dựng quy trình định
lượng polysacharid trong cao mã đề bằng phương pháp đo quang năm trên tạp chí y
học thành phố Hồ Chí Minh.
17
Một số công trình nghiên cứu khoa học của viên dược liệu như: Nghiên cứu
tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm chiết xuất từ mã đề (2004). Phân tích xác định
aucubin trong dược liệu mã đề (Plantago major L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng
kết hợp đo mật độ( 9TLC-scaning) phục vụ nghiên cứu tiêu chuẩn hóa, (2009). [21]
Ngoài ra còn một số bài luận văn của sinh viên như “ Nghiên cứu thành phần
hóa học cây mã đề” của Trần Thanh Hà (2014) sinh viên trường đại học Cần Thơ, đã
phân tích và phân tách một số hợp chất của cây mã đề.
Các nghiên cứu về cây mã đề ở nước ta chưa nhiều hơn nữa mới chỉ nghiên
cứu tách chiết một số hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong dược liệu, chưa
nghiên cứu nhiều về khả năng chống oxy hóa của loài cây này.
1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trong những năm gần đây, xu hướng của các nghiên cứu là tìm ra các hoạt
chất trong tự nhiên có khả năng kháng khuẩn, kháng virus, chống oxi hóa ngày càng
mở rộng. Các bệnh liên quan tới vi khuẩn, vi rút như tiêu chảy, cúm, nhiễm trùng,
uốn ván, sốt xuất huyết, ebolla, HIV…, các bệnh liên quan tới sự lão hóa, béo phì,
tiểu đường, huyết áp cao và nhất là ung thư đang là vấn đề nan giải và là mối đe dọa
không chỉ đối với các nước phát triển mà còn cả các nước đang phát triển và chậm
phát triển.
Trong số đó, cây mã đề cũng là một đối tượng được các nhà nghiên cứu quan
tâm rất nhiều. Từ lâu trên thế giới đã có nhiều công bố khoa học về thành phần hóa
học cũng như hoạt tính sinh học của loại cây này. Mã đề được biết đến với hoạt tính
nổi trội là khả năng kháng khuẩn, kháng virus.
Năm 1988, Helle Ravn và Leon Brimer, khi nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính
kháng khuẩn của Plantamajoside từ mã đề cho thấy trong môi trường thạch, khả năng
ức chế vi khuẩn của Plantamajoside là lớn nhất khi so sánh với forsythtaside và axit
chlorogenic.
Năm 2001, Chiang và cộng sự tiến hành kiểm tra khả năng kháng vi rút của
dịch chiết dung môi nước và một số chất phân lập từ mã đề trên vi rút herpesviruses
(HSV-1, HSV-2). Kết quả cho thấy dịch chiết nước mã đề có khả năng kháng yếu,
trong khi đó các chất phân lập được từ mã đề có khả năng kháng mạnh hơn, Chiang
18
kết luận thành phần hóa học trong mã đề có khả năng kháng vi rút chủ yếu là do các
hợp chất phenolic, đặc biệt là caffeic.
Một hoạt tính sinh học nữa của mã đề đáng chú ý là khả năng chống oxy hóa.
Năm 1999, Ren và cộng sự khi nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của mã đề
mọc ở những độ cao khác nhau. Mẫu được thu thập từ các độ cao khác nhau trên núi
Mahan, Trung Quốc. Kết quả cho thấy có sự tương quan giữa độ cao và khả năng
chống oxy hóa của lá và hạt của mã đề. Hoạt tính chống oxy hóa của hạt thì tăng theo
sự tăng độ cao nhưng lá thì ngược lại. Điều này cho ta thấy địa hình và điều kiên khí
hậu có ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa của mã đề. Khả năng khử gốc tự do
DPPH và superoxide (SO) của polysaccharides là 81,4% và 79,7% ở nồng độ
polysaccharides 0,75 mg/ml, trong khi đó khả năng khử gốc tự do của 0,75 mg/mL
axit ascorbic tương ứng là 83,5% và 85,1%. Điều nay cho thấy tiềm năng chống oxy
hóa của của polysaccharide trong mã đề.
Theo Jamilah, 2012 khi phân tích dịch chiết từ lá mã đề theo phương pháp GCMS. Kết quả phân tích các thành phần hóa học của mã đề trong dịch chiết từ các
dung môi (ether dầu khí, methanol, ethyl acetate, n-butanol và nước) đều cho thấy
cả năm dịch chiết trên đều có nhóm phenol, các đồng phân khác nhau của axit hữu
cơ, flavonoid và terpenoid, đây là những chất được biết đến với khả năng chống
oxy hóa cao.
Cũng năm 2012, Harput và cộng sự tiến hành kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào
và chống oxi hóa của mã đề để xác minh về những công bố về dụng truyền thống của
nó. Kết quả cho thấy, dịch chiết mã đề có khả năng quét gốc tự do DPPH, oxit nitrit
(NO), superoxide (SO) mạnh khi được so sánh với BHA và Quersetin. Ngoài ra dịch
chiết từ dung môi nước thể hiện khả năng gây độc tế bào tùy theo liều lượng sử dụng.
Từ dịch chiết mã đề với dung môi methanol 50%, đã phân lập được hai chất từ mã đề
là verbascoside và calceorioside, trong đó verbascoside trước đó chưa được phân lập
từ loài mã đề. Hai hợp chất này cũng được kiểm tra tương tư như đối với dịch chiết,
kết quả cho thấy nó cũng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh khi so sánh với BHA và
Quersetin. Hai hợp chất này cũng thể hiện được khả năng gây độc mạnh đối với tế
bào ung thư HEP-2, RD và MCF-7 (tế bào ung thư tuyến vú ở người). Tóm lại, những
19
hợp chất được phát hiện verbascoside và calceorioside có thể được sử dụng trong
phòng chống ung thư.
1.2. Tìn hiểu về quá trính chống oxy hóa [3], [16], [17]
1.2.1. Quá trình oxy hóa và gốc tự do
1.2.1.1. Quá trình oxy hóa
Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học trong đó electron được
chuyển sang chất oxy hóa.
1.2.1.2. Gốc tự do
Theo định nghĩa, gốc tự do (Free radical) là bất cứ chất nào chỉ có một điện tử
duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử.
Đôi khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử
đó trở thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử. Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ nên
rất bất ổn, dễ tạo ra phản ứng. Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu
từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn
cho sinh hoạt bình thường của tế bào
Chính do chứa điện tử độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn
mang tính "huỷ hoại", sẵn sàng thực hiện tính oxy hoá, cướp điện tử của chất mà nó
tiếp xúc để ghép đôi với điện tử độc thân của nó và làm chất bị nó oxy hoá bị huỷ
hoại nặng nề. Phản ứng oxy hoá thường thấy hàng ngày là phản ứng đốt cháy, còn
trong cơ thể phản ứng của chất oxy hoá của gốc tự do êm ái hơn nhưng lại gây huỷ
hoại tế bào đặc biệt ở màng tế bào hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào, nó phá
huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá.
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là
khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây
ra những tổn thương cho tế bào. Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ có ở
ngoài cơ thể.
1.2.1.3. Nguồn gốc hình thành các gốc tự do
Nguồn gốc hình thành các gốc tự do như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm
không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên
nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh
20
nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch… Do đó, để tránh sự gây hại
của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống
oxy hóa bổ sung như VTM A, VTM C, VTM E, polyphenol,…
1.2.1.4. Ảnh hưởng của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới
sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi
trung niên, cơ thể khỏe mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc
tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ. Nếu không bị kiểm soát,
kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm
suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ
phận người cao niên.
Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dường thất thoát, tế bào không tăng
trưởng, tu bổ, rồi chết. Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết
đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân
tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào. Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm
thể, ở DNA, RNA. Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn
nheo, cơ khớp cứng nhắc.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây:
Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp
nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung
cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố,
enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được.
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử
vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào. Theo bác
sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già
và sự chết cuả các sinh vật. Ông ta cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn
thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên
bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng. Do quan sát, người ta thấy gốc tự
do có ít ở các sinh vật chết non, có nhiều hơn ở sinh vật sống lâu. Người cao tuổi có
nhiều gốc tự hơn là khi người đó còn trẻ.
21
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh,
đáng kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục
thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan.
Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại. Đôi khi chúng cũng có
một vài hành động hữu ích. Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng
cho cơ thể; tạo ra chất màu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất
prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ
dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt.
1.2.2. Chất chống oxy hóa
1.2.2.1. Khái niệm chất chống oxy hóa là gì
Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá
trình oxi hóa chất khác. Sự oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được
chuyển sang chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền
phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách
khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng.
1.2.2.2. Sự chống oxy hóa
Sự khử gốc tự do của chất chống ôxi hóa, trong đó các electron không ghép
đôi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống oxy hóa để tạo thành các
electron ghép đôi bền vững.
1.2.2.3. Tác dụng của chất chống oxy hóa
Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống "chất
oxy hoá nội sinh" không đủ sức cân bằng để vô hiệu hoá, các nhà khoa học đặt vấn
đề dùng các "chất chống oxy hóa ngoại sinh" (tức là từ bên ngoài đưa vào cơ thể) với
mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khoẻ, chống lão hoá. Các chất chống oxy hoá
ngoại sinh đó đã được xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất
flavonoid, polyphenol... Các chất oxy hoá ngoại sinh đó thật không xa lạ, chúng có
từ các nguồn thiên nhiên là thực phẩm như rau cải, trái cây tươi và một số loại dược
thảo. Ngoài ra trong thực phẩm, các loại phụ gia vừa tạo mùi vị cho sản phẩm còn
đóng vai trò là chất chống oxy hóa giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa
của các chất khác có trong thực phẩm.
22
Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy bằng cách khử đi các gốc tự do,
kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng.
1.2.2.4. Các chất chống oxy hóa có trong tự nhiên
a) Nhóm polyphenol
Polyphenols là một trong những nhóm nhiều và phổ biến nhất của các chất
chuyển hóa thực vật. Chúng là một phần tích hợp của cả hai chế độ ăn của con người
và động vật trong đó có một phổ cao của các hoạt tính sinh học, bao gồm tính chống
oxy hóa, chức năng kháng viêm, kháng khuẩn, và kháng virus. Nhiều công trình lớn
nghiên cứu tiền lâm sàng và xây dựng dữ liệu dịch tễ học cho thấy polyphenol thực
vật có thể làm chậm sự lan triển của ung thư, giảm nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh
thoái hóa thần kinh, tiểu đường, hoặc loãng xương. Các thông tin cũng cho thấy
polyphenol thực vật có hoạt động như tiền chất ngăn ngừa và chống ung thư ở người.
b) Nhóm carotene
Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài
sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn. Hiện
nay người ta đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophylls
và carotene. Khác với cây cỏ, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử
dụng carotenoid từ việc ăn thực vật nhằm bảo vệ bản thân mình. Carotenoid giúp
chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài. Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại
carotenoid khác nhau, trong đó có 50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm. Thế
nhưng trong máu của người có khoảng 15 loại được tìm thấy và chúng đang được
chứng minh là đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người. Carotenoid không
phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một nhóm các hợp chất có công thức
cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể cũng tương tự nhau. Carotenoid khá
quen thuộc với chúng ta là beta-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A. Trong
mấy năm gần đây người ta còn nói nhiều đến các carotenoid khác như lycopen, lutein
và zeaxanthin,…
Beta carotene là một tenpen. Nó là một trong hơn 600 loại caorenoid tồn tại
nhiều trong tự nhiên. Carotenoid là những chất có màu vàng, cam và hơi pha đỏ. Nó
có nhiều trong thực vật mà không hề xuất hiện trong động vật cũng như các thực
23
phẩm có nguồn gốc từ động vật, tính số miligam trong 100g thức ăn được thì cao nhất
là gấc với kỷ lục 91,6mg%, tiếp đó là cà rốt 5mg%, beta-carotene là tiền chất của
vitamin A khi hấp thụ vào cơ thể nó được chuyển hóa thành vitamin A với tỷ lệ 1mcg
betacarotene thì được 0,167 mcg vitamin A. Ngoài những tác dụng như vitamin A
nó không hề gây độc tính quá nhiều như vitamin A và điều đặc biệt là beta-carotene
khử các gốc tự do tốt hơn vitamin A. Trên 50 công trình dịch tễ học tiền cứu và hậu
cứu được thực hiện trong mấy thập niên gần đây đã chứng minh tỷ lệ beta caroten
trong thức ăn gắn liền với việc giảm nguy cơ của nhiều căn bệnh ung thư. Ngoài ra
nó còn giúp làm trẻ hóa làn da, giảm tử vong do bệnh tim mạch...
c) Nhóm vitamin
Vitamin E là chất chống oxy hóa chiến lược nhất hiện nay. Có rất nhiều công
trình nghiên cứu tập trung vào vitamin E. Các thực phẩm nguồn gốc thực vật giàu
vitamin E như: đậu xanh (4-6mg%), xà lách (3mg%), lạc, lúa mì, ngô hạt, cà rốt...
Đặc biệt có rất nhiều ở mầm của các loại hạt: giá đỗ xanh, giá đỗ tương, mầm hạt ngô
(15-25mg%), mầm lúa mì (25mg%)... Vitamin E cũng có trong một số thực phẩm
nguồn gốc động vật: trứng gà, thịt bò, cá mè... Vitamin E có vai trò chính là chống
oxy hóa thông qua. Việc loại trừ sự oxy hóa các lipid và sự xuất hiện các gốc tự do
làm phân hủy các acid béo chưa bão hòa. Ngoài ra, vitamin E còn có tác dụng rất rõ
trong việc phòng ngừa bệnh tim mạch, giảm sự mệt mỏi, suy nhược.
Vitamin C xuất hiện khá phổ biến trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật: rau
ngót (185mg%), cần tây (150mg%), rau đay (77mg%), súp lơ, cà chua, su hào, mồng
tơi, rau muống... Nó cũng có nhiều trong một số loại quả chín như: bưởi (95mg%),
xoài (60mg%), nhãn (58mg%), đu đủ (54mg%), cam, chanh, quất, quýt... Vitamin C
tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa quan trọng trong cơ thể.
Chuyển hóa vitamin C có liên quan với nhiều vitamin khác, nó cũng bảo vệ
vitamin C tránh sự oxy hóa. Vitamin C giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sức
đề kháng của cơ thể. Khi thiếu nó, nhiều phản ứng miễn dịch sinh học của cơ thể
giảm xuống. Vitamin C rất hiệu quả trong việc khử gốc tự do trong môi trường nước,
máu, bào tương…
24
d) Peptide
Peptide là một chuỗi các axít amino tương tự như protein nhưng ngắn mạch
hơn hơn. Peptide không kèm theo các hóa chất khác và hình thành từ các amino axit
có nguồn gốc tự nhiên. Chúng cũng kích thích sản xuất collagen và làm tăng tác dụng
của chất chống oxy hóa. Trong cơ thể động vật và thực vật peptide làm nhiệm vụ bảo
vệ cho cơ thể. Loại peptide đầu tiên phải kể đến ở động vật có xương sống là các
peptide kháng thể trong máu, chúng là những yếu tố nhận biết đắc lực các tác nhân
vi khuẩn, virus và các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể và để loại trừ chúng ra khỏi cơ
thể. Ngoài ra trong máu của động vật trên còn có các interferon với nồng độ nhỏ có
khả năng chống lại sự xâm nhiễm của virus. Trong máu của động vật còn có các
peptide chống chảy máu như fibrin… Ở thực vật có nhiều loại tạo ra những peptide
độc tố, chỉ với liều lượng nhỏ cũng có khả năng giết chết người và động vật. Ngoài
ra trong cơ thể động vật, thực vật và các sinh vật khác nói chung đều tồn tại một hợp
chất có bản chất peptide làm nhiệm vụ bảo về đó là lectin. Vì có khả năng liên kết
đường ruột một cách đặc hiệu và chọn lọc nên lectin có thể kết tủa các tác nhân hay
tế bào lạ có cấu trúc đường xâm nhập vào cơ thể để bảo vệ cơ thể.
e) Selen
Selen (Tên Latinh selenium) là nguyên tố hóa học thuộc nhóm VI trong hệ
thống tuần hoàn các nguyên tố Mendeleyev. Selen có nhiều trong cá biển và sau đó
là các thực phẩm: lòng đỏ trứng, dầu ô liu, gan động vật, các hạt ngũ cốc nguyên hạt
(có nhiều ở lớp vỏ lụa), và nấm ăn...
Trước đây, trong dinh dưỡng người ta ít quan tâm tới selen. Nó chỉ mới được
biết tường tận vào những năm gần cuối thế kỷ 20. Có nhiều công trình nghiên cứu về
selen mà đặc biệt nhất là vai trò khử các gốc tự do. Giáo sư G. Simonoff, người Pháp
(giảng dạy môn vật lý hạt nhân thuộc Viện đại học Bordeauc) đã ví von: “Selen chính
là “tay điệp báo” săn lùng những “trái bom” các gốc tự do để “tháo ngòi nổ” hữu hiệu
nhất”. Selen ngoài tác dụng hoạt hóa vitamin E (giúp vitamin E “bẫy” các gốc tự do
một cách rất hiệu quả), còn có mặt trong một số enzym dọn sạch lipo - peroxide ngăn
cản sự sản sinh các gốc tự do thứ cấp.
25
f) Các alkaloid
Polonopski định nghĩa Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ,
thường có dược tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử
chung của alkaloid. Alkaloid có phổ biến trong thực vật, tập trung ở một số họ:
Apocynaceae (họ Trúc đào) có gần 800 alkaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần
400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid, Solanaceae (họ Cà) gần 200 alkaloid.
Ở nấm có alkaloid trong nấm cựa khỏa mạch (Claviceps purpurea), nấm Amanita
phalloides. Ở động vật, cũng đã tìm thấy alkaloid ngày càng tăng, alkaloid
samandarin, samandaridin, samanin có trong tuyến da của loài kỳ nhông. Bufotenin,
bufotenidin, dehydrobufotenin lấy từ nhựa cóc. Trong cây, alkaloid thường tập trung
ở một số bộ phận nhất định. Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alkaloid duy nhất
mà thường có hỗn hợp nhiều alkaloid, trong đó alkaloid có hàm lượng cao được gọi
là alkaloid chính. Các alkaloid ở trong những cây cùng một họ thực vật cũng thường
có cấu tạo rất gần nhau. Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, Một số dược
liệu chứa 1-3% alkaloid đã được coi là hàm lượng khá cao. Trong cây, alkaloid ít khi
ở trạng thái tự do (alkaloid base),mà thường ở dạng muối của các acid hữu cơ như
citrat, tactrat, oxalat, acetat… Có một số ít trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo
ra dạng glycoalkaloid như solasonin và solamacgin trong cây Cà lá xẻ (Solanum
laciniatum).
Công dụng của alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloid.
Tác dụng lên hệ thần kinh. Kích thích thần kinh trung ương: strychnine, caffeine; ức
chế thần kinh trung ương: morphin, codeine; kích thích thần kinh giao cảm:
ephedrine; liệt giao cảm: yohimbin; kích thích phó giao cảm: pilocarpin; liệt phó giao
cảm: atropine; gây tê: cocaine; tác dụng hạ huyết áp: reserpine, serpentin; tác dụng
chống ung thư: taxol, vinblastine, vincristine; tác dụng diệt ký sinh trùng, diệt khuẩn:
quinine, berberine, arecoline, emetine… ngoài ra một vài alkaloid có khả năng chống
oxy hóa rất cao. Các gốc tự do ngoài nguyên nhân gây nên sự lão hóa cơ thể, còn là
đồng phạm gây ra nhiều bệnh khác (tim mạch, xương khớp, đái tháo đường, đục thủy
tinh thể, ung thư...) bởi vậy rất cần ăn nhiều thực phẩm chống oxy hóa.
26
Tuy người ta còn nói tới những chất chống lão hóa khác nhưng trong ăn uống
thì 4 chất chống oxy hóa: beta- carotene, vitamin E, vitaminC, selen là quan trọng
hơn cả. Cùng với hoạt tính riêng của từng chất nên trong ăn uống nếu có được hỗn
hợp cả 4 thứ này chúng sẽ có tác dụng tương hỗ bảo vệ nhau chống sự phá hủy, giúp
tái tạo, khiến cho khả năng chống oxy hóa càng đạt hiệu quả cao.
1.2.2.5. Các chất chống oxy hóa tổng hợp.
Các chất chống oxy hóa tổng hợp phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
-
Không độc.
-
Có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ thấp.
-
Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu.
-
Bền trong điều kiện kỹ thuật của quá trình chế biến thực phẩm.
Các chất chống oxy hóa tổng hợp thường sử dụng là: BHT (Butylated
hydroxxytoluen), BHA ( Butylate hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ
(Tertbutyl hydroquinone), doecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate,…
a) BHT (Butylated hydroxxytoluen)
Còn được goi là 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene;methyl-di-tertbutylphenol;
-
2,6-di-tert-butyl-para-cresol. BHT được tạo thành ohanr ứng của p-cresol (4methylphenol) với isobutylene (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric.
-
Công thức phân tử C15H24O
-
Bột màu trắng
BHT ngăn ngừa oxy hóa chất béo. Nó được sử dụng để bảo quản thực phẩm có
mùi, màu sắc và hương vị. Nhiều vật liệu đóng gói kết hợp BHT. Nó cũng được bổ
sung trực tiếp để bảo quản ngũ cốc và các loại thực phẩm chứa chất béo và dầu.
b) BHA (Butyllated hydroxytoluen)
-
BHA là một hỗn hợp của các đồng phân 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole và 2-tertbutyl-4-hydroxyanisole.
- Công thức phân tử C11H16O2
- Màu trắng hoặc hơi vàng
- Mùi thơm đặc trưng
- BHA thường được sử dụng để giữ chất béo khỏi bị ôi
27
- BHA được tìm thấy trong bơ, thịt, ngũ cốc, kẹo cao su, đồ nướng, thực phẩm
snack, khoai tây khử nước và bia. Nó cũng được tìm thấy trong thức ăn động vật,
bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, sản phẩm cao su và các sản phẩm dầu khí.
Hình 1.8. Cấu tạo của BHA (A) và của BHT (B)
c) TBHQ (Terbutyl hydroquinone)
-
TBHQ là một chất chống oxy hóa được dùng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm,
cao su, đặc biệt là trong bảo quản các loại dầu và chất béo. Nó còn được sử dụng
như một chất ổn định để hạn chế sự trùng hợp tự động của các peroxit hữu cơ.
-
TBHQ là một tinh thể màu trắng có mùi đặc trưng, không tan trong nước nhưng
hòa tan trong rượu và ete.
1.3. Phương pháp chiết các chất có hoạt tính sinh học [18]
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô
thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất
hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan
trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:
- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
- Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi.
- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi,
nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ
quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
28
Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra về mặt thực vật xem có đúng
loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không. Cần ghi rõ nơi thu hái,
thời gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề về thời vụ thu hái, để đảm
bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Dược liệu sau đó có thể làm
khô hoặc để tươi mà chiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình
làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym. Kích thước của
bột dược liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả
của quá trình chiết.
Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương
pháp chiết trên như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường)
hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết với các thiết bị như
soxhlet, kumagawa... tùy yêu cầu, điều kiện mà lực chọn kỹ thuật chiết thích hợp.
Các phương pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phương pháp ngâm
dược liệu được ngâm trong 1 lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để
các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra
và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi
lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp ngấm kiệt, dung mội được dịch
chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong
quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung
dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt
là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối
dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy
quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về
nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp
chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém
phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử
dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung
môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ
29
tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn
sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với
sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất
cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất.
Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng
hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 KHz thường được sử dụng. Sóng siêu
âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình
khuyếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào,
thúc đẩy quá trình chiết.
Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử dụng tng chuẩn bị mẫu
phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển. Khi đó, người
ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các
đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết siêu âm,
hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Tuy nhiên, người ta cũng có thể
gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn. Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu
phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Do khả năng
xuyên sâu kém nên việc sử dụng thường ở quy mô phòng thí nghiệm.
Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của
dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2
tác động đó là sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường.
Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt
nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống.
Trong chiết xuất, trong chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân
dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao
động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi.
Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất
tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa
30
tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết
nhiều tạp chất hơn.
Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu ở quy mô phòng thí
nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet)
do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Cũng đã có
những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có
nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp
tiếp theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu
bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm
lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc
với nhiệt ngắn. Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương
pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alkaloid...
Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn
Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá tới hạn
(super-critical fluid extraction,SFC) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính
cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên.
Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường,
khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên,
nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và
một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là
chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường
mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng.
Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng quá tới hạn có
khả năng hòa tan các chất đồng thời có độ nhớt thấp và khả năng khuếch tán cao có
thể dùng để hòa tan các chất và ứng dụng vào chiết xuất các chất trong dược liệu. Các
đặc tính của chất lỏng quá tới hạn (khả năng hòa tan các chất, độ nhớt...) phụ thuộc
vào nhiệt độ và áp suất. Thay đổi các điều kiện này sẽ làm thay đổi đặc tính (độ phân
cực, khả năng hòa tan) của chất lỏng quá tới hạn. Trong thực tế, người ta thực hiện
chiết trong điều kiện cao hơn điểm tới hạn một ít.
31
Chất lỏng thông dụng nhất hiện nay là CO2 lỏng quá tới hạn. Chiết chất lỏng
quá tới hạn hiện nay được ứng dụng trong nhiều ngành ở quy mô công nghiệp (từ
những năm 1978), trong nghiên cứu và phân tích kiểm nghiệm. Trong phạm vi nghiên
cứu cây thuốc, tác giả đầu tiên ứng dụng nghiên cứu này là Stahl và cộng sự. Các
nhóm hợp chất thích hợp nhất để chiết bằng chất lỏng quá tới hạn là tinh dầu, chất
béo, carotenoid và các chất kém phân cực khác.
Chiết dưới áp suất cao
Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết suất hiện đại là chiết
dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction-PLE). Khả năng hòa than của các chất
trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan
các chất tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm
lượng dung môi sử dụng và giả thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình
thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi.
Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều
này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ
sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới
áp suất.
Khi nhiệt độ tăng lên 100C, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi.
Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với
vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của
dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80-2000C
và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết.
32
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu là cây mã đề đang độ tuổi thu hoạch trong
tháng 3/2015, đảm bảo chất lượng, được thu mua tại chợ Xóm Mới, thành phố Nha
Trang, tỉnh Khánh Hòa.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, phòng
thí nghiệm công nghệ cao, phòng thí nghiệm hóa phân tích thuộc Trung tâm thí
nghiệm thực hành, trường Đại Học Nha Trang.
Thời gian thực hiện: 15/3/2015 – 7/6/2015.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
-
Dung môi ethanol sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết 99.5% ( Nhiệt
độ sôi 78.9oC)
-
Hóa chất Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCL3COOH 10%, FeCl3 0.1% sản
xuất tại Guanghua Chemical Factory Co. Ltd.
-
Các hóa chất trên được mua từ cửa hàng hóa chất Hoàng Trang số 42- Hoàng
Hoa Thám- TP Nha Trang, đạt tiêu chuẩn dùng trong phòng thí nghiệm.
-
1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH) được mua từ công ty Sigma – Aldrich
INC, PO.Box 14508,st. Louis, MO63178 USA + 1-314-771-5750.
2.2.2. Dụng cụ
-
Cốc sấy
-
Ống nghiệm
-
Cốc thủy tinh 50 ml, 100ml, 250 ml
-
Bình tam giác 100ml, 250ml
-
Phễu thủy tinh
-
Bóp cao su
-
Pipet 10 ml
33
-
Ống đong 50ml, 100ml, 250 ml
-
Giấy lọc
2.2.3. Thiết bị
Tủ lạnh LG 595 lít, 5951,model GR-S592 QTC/BSIPCTT,
Cân phân tích điện tử Shimadzu AY 120, Nhật.
Bể ổn nhiệt Memmert Model WB29, Đức.
Cân phân tích AY220.
Cân kỹ thuật BL3200.
Máy đo quang phổ kế UV-Vis Carry 50.
Tủ sấy vuông, Trung Quốc.
Micropipet 100-1000 μl, NPX-1000, Nhật Bản.
2.3. Nội dung nghiên cứu
-
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề từ các bộ phận
cây.
-
Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết từ cây mã đề.
-
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy
hóa của dịch chiết từ cây mã đề.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thực nghiệm yếu tố từng phần cổ điển (thay đổi một yếu tố trong
khi cố định các yếu tố còn lại).
34
2.4.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát
CÂY MÃ
ĐỀ TƯƠI
XỬ LÝ
TÁCH RIÊNG RỄ, LÁ,
HOA
PHƠI KHÔ
XAY
CHIẾT
Khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng: Bộ phân cây, nồng
độ dung môi, nhiệt độ, thời
gian, tỷ lệ NL/DM.
LỌC
DỊCH
CHIẾT
Phân tích hoạt tính chống
oxy hóa:
- Khả năng khử gốc tự do
DPPH.
- Tổng năng lực khử.
Kết luận
Hình 2.1. Sơ đồ bố thí thí nghiệm tổng quát
35
Thuyết minh quy trình
Xử lý: Nguyên liệu tươi đảm bảo độ đồng đều, chất lượng tốt, được loại bỏ
các phần bị già úa, hư thối sau đó rửa sạch loại bỏ đất cát rồi tách riêng phần lá,
hoa, rễ.
Phơi khô: Nguyên liệu tươi sẽ rất khó khăn trong việc bảo quản, vận chuyển
nguyên liệu tươi có hàm lượng nước cao, dưới tác dụng của enzyme và vi sinh vật
nguyên liệu nhanh chóng bị hư hỏng và thất thoát các chất có hoạt tính. Do đó đem
phơi khô làm giảm hàm ẩm đồng thời diệt enzyme giúp bảo quản được lâu hơn.
Xay: Nguyên liệu khô được xay nhỏ với mục đích làm tăng diện tích tiếp xúc
giữa dung môi và nguyên liệu, tăng khả năng khuếch tán và thẩm thấu của các chất vào
dung môi, làm tăng khả năng trích ly. Sử dụng máy xay sinh tố, cối xay khô. Sau khi xay
xong chia thành nhiều phần nhỏ đựng trong túi PE, tất cả các túi nhỏ đựng trong túi PA
lớn. Nguyên liệu này được sử dụng cho hết quá trình nghiên cứu.
Chiết: Là công đoạn quan trọng sử dụng dung môi dựa trên sự thẩm thấu của
dung môi vào tế bào, các chất hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra ngoài tế bào.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: Phương pháp, loại dung môi, nồng độ
dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, số lần chiết.
Phương pháp chiết: Sử dụng phương pháp chiết tĩnh trong nghiên cứu này,
phương pháp chiết tĩnh đơn giản, không cần máy móc phức tạp, có thể tiến hành được
ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay.
Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ càng cao làm tăng vận tốc và hiệu quả của quá trình,
tuy nhiên cần lưu ý để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm mất hoạt tính của các
chất cần trích ly.
Thời gian trích ly: Thời gian càng tăng thì hiệu suất trích ly càng tăng. Tuy
nhiên nếu thời gian quá dài thì khả năng trích ly lại giảm.
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: Tỉ lệ này càng nhỏ thì hiệu suất trích ly của quá
trình càng cao. Tuy nhiên sử dụng nhiều dung môi sẽ làm giảm hiệu suất trích ly.
Loại dung môi: Sử dụng dung môi ethanol cho nghiên cứu này, dung môi
ethanol rẻ, dễ kiếm và ít độc hại, có hiệu quả cao trong việc tách chiết các chất chống
oxi hóa trong các nghiên cứu trước đây.
Lọc: Mẫu sau khi chiết xong được lọc qua giấy lọc loại bỏ bã và thu được dịch
chiết. Dịch chiết sau đó được đem đi kiểm tra khả năng chống oxy hóa bằng phương
pháp khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
36
2.4.2. Bố trí thí nghiệm.
2.4.2.1. Thí nghiệm 1: khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của của dịch chiết mã đề
từ các bộ phận cây.
CÂY MÃ
ĐỀ TƯƠI
TÁCH RIÊNG BỘ PHẬN
CÂY
PHƠI KHÔ
XAY
CHIẾT (Ethanol)
RỄ
Nồng độ dung môi:
40%
Nhiệt độ: 500C
Thời gian: 30 phút
Tỷ lệ NL/DM: 1/20
(g/ml)
LÁ
LỌC
DỊCH
CHIẾT
HOA
Phân tích hoạt tính
chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc
tự do DPPH.
- Tổng năng lực
khử.
Kết luận
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ
các bộ phận cây mã đề.
37
Cách tiến hành
Nguyên liệu sau khi tách riêng các bộ phận, phơi khô và đem xay được tiến
hành sử dụng cho thí nghiệm 1. Dùng 3 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác
2g lần lượt là nguyên liệu rễ, lá, hoa. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol nồng độ 40%
khi bắt đầu chiết. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 (g/ml), tức (40ml ethanol), đậy
miệng cốc bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt
đến nhiệt độ 500C trong thời gian 30 phút.
Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước
mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban
đầu là 40ml.
Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa để xác định được
bộ phận nào của cây cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Thí nghiệm 3 lần lặp lại.
38
2.4.2.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính
chống oxi hóa của dịch chiết mã đề.
MÃ ĐỀ
KHÔ
XAY
Bộ phận cây: TN1
Nhiệt độ: 500C
Thời gian: 30 phút
Tỷ lệ NL/DM: 1/20
(g/ml)
CHIẾT
Nồng độ ethanol
30%
40%
50%
LỌC
DỊCH
CHIẾT
60%
70%
Phân tích hoạt tính
chống ox y hóa:
- Khả năng khử gốc
tự do DPPH.
- Tổng năng lực
khử.
Kết luận
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính
chống oxi hóa của dịch chiết mã đề.
39
Cách tiến hành
Dùng 5 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g nguyên liệu khô, đã
xay. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 30%,
40%, 50%, 60%, 70%. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 g/ml (40ml ethanol), đậy
miệng cốc bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa tất cả các cốc vào bể ổn nhiệt đã
nâng đến 500C, trong thời gian 30 phút.
Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước
mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban
đầu là 40ml.
Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa để lựa chọn được
dung môi thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Thí nghiệm 3 lần lặp lại.
40
2.4.2.3. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống
oxi hóa của dịch chiết mã đề.
LÁ MÃ
ĐỀ KHÔ
XAY
Bộ phận cây: TN1
Nồng độ ethanol: TN2
Thời gian: 30phút
Tỷ lệ NL/DM: 1/20
(g/ml)
CHIẾT
NHIỆT ĐỘ CHIẾT
T0thường
400C
500C
600C
700C
800C
LỌC
DỊCH
CHIẾT
Phân tích hoạt tính
chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc
tự do DPPH.
- Tổng năng lực khử.
Kết luận
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính
chống oxi hóa của dịch chiết mã đề.
41
Cách tiến hành
Dùng 6 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g nguyên liệu khô, xay.
Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol nồng độ đã được xác định ở thí nghiệm 2 khi bắt
đầu chiết. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 g/ml, tức 40ml ethanol. Đậy miệng
cốc bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến
những nhiệt độ khảo sát lần lượt là 400C, 500C, 600C, 700C, 800C và nhiệt độ thường
trong thời gian 30 phút.
Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước
mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban
đầu là 40ml.
Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa để lựa chọn nhiệt
độ chiết thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Thí nghiệm 3 lần lặp lại.
42
2.4.2.4. Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống
oxi hóa của dịch chiết mã đề.
MÃ ĐỀ
KHÔ
XAY
Bộ phận cây: TN1
Nồng độ dung môi: TN2
Nhiệt độ: TN3
Tỷ lệ NL/DM: 1/20
(g/ml)
CHIẾT
THỜI GIAN CHIẾT
0,5 giờ
1,5 giờ
2,5 giờ
3,5 giờ
4,5 giờ
LỌC
DỊCH
CHIẾT
Phân tích hoạt tính
chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc
tự do DPPH.
- Tổng năng lực khử.
Kết luận
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính
oxi hóa của dịch chiết mã đề.
43
Cách tiến hành
Dùng 5 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g nguyên liệu khô, đã
xay. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol nồng độ xác định ở thí nghiệm 2. Tỷ lệ
nguyên liệu/ dung môi là 1/20( g/ml), tức 40ml ethanol Đậy miệng cốc bằng giấy bạc,
dùng đây su cột chặt, đưa tất cả cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến nhiệt độ xác
định ở thí nghiệm 3. Cứ sau khoảng thời gian tính từ lúc bắt đầu chiết lần lượt là
0,5giờ, 1,5 giờ, 2,5 giờ, 3,5 giờ, 4,5 giờ thì lấy một cốc ra.
Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước
mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban
đầu là 40ml.
Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa, lựa chọn được thời
gian chiết thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Thí nghiệm 3 lần lặp lại.
44
2.4.2.5. Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến
hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề.
MÃ ĐỀ
KHÔ
XAY
Bộ phận cây:TN1
Nồng độ dung môi: TN2
Nhiệt độ: TN3
Thời gian: TN4
CHIẾT
TỶ LỆ NL/DM (g/ml)
1/20
1/40
1/30
1/50
LỌC
DỊCH
CHIẾT
Phân tích hoạt tính
chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc
tự do DPPH.
- Tổng năng lực khử.
Kết luận
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nguyên liệu/ dung môi đến
hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề.
45
Cách tiến hành
Dùng 4 bình tam giác 250ml, mỗi bình cân chính xác 2g nguyên liệu khô, xay.
Mỗi bình cho vào dung môi ethanol nồng độ xác định ở thí nghiệm 2. Tỷ lệ nguyên
liệu/ dung môi (g/ml) lần lượt là 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, đậy miệng bình bằng giấy
bạc, dùng dây su cột chặt, đưa tất cả mẫu vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến nhiệt độ
xác định ở thí nghiệm 3 trong thời gian xác định ở thí nghiệm 4. Sau khi chiết xong
thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước mát rồi đem lọc mẫu qua
giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi vào tất cả các mẫu cho cùng thể tích 100ml.
Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa, lựa chọn được tỷ lệ
nguyên liệu/dung môi thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Thí nghiệm 3 lần lặp lại.
2.4.3. Các phương pháp phân tích
2.4.3.1 Xác định tỷ lệ khối lương các bộ phận cây.
Các bộ phận cây mã đề được tiến hành xác định tỷ lệ khối lượng ở cả tươi và
khô được trình bày ở phụ lục 1.
2.4.3.2. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Độ ẩm của nguyên liệu được phân tích theo phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C
đến khối lượng không đổi theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3700-79 được trình bày
chi tiết ở phụ lục 1.
2.4.3.3. Phân tích khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2pycrylhydrazyl (DPPH)
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề được phân tích theo
phương pháp của Fu và cộng sự (2002) được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.
2.4.3.4. Phân tích tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử của dịch chiết từ mã đề được phân tích theo phương pháp
Oyaizu (1986) được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.
2.4.3.5. Phương pháp xử lí số liệu
Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần để đảm bảo tiến hành phân tích
ANOVA.Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm xử lý số liệu thống kê
chuyên dụng SPSS 16.0. Kiểm định (Tukey HSD, Tamhane, Dunnett t3, Dunett C)
được thực hiện để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị với mức ý
nghĩa P < 0,05. Vẽ đồ thị được thực hiện với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft office
Excel 2007.
46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phận của cây mã đề
Kết quả tỷ lệ khối lượng các bộ phận cây mã đề được thể hiện trong Bảng 3.1
Bảng 3.1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phận cây mã đề. (Kết quả trong bảng là giá trị
trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiêm)
TƯƠI
BỘ PHẬN
CÂY
KHÔ
KHỐI
LƯỢNG (g)
TỶ LỆ (%)
KHỐI
LƯỢNG (g)
TỶ LỆ (%)
RỄ
58,25 ± 1,78
15,16 ± 0,7
13,52 ± 0,81
21,63 ± 1,47
LÁ
281,65 ± 13,9
73,22 ± 1,99
38,66 ± 0,72
61,84 ± 3,09
HOA
45,59 ± 4,53
11,62 ± 1,43
10,47 ± 2,97
16,57 ± 3,86
TB TỔNG
384,36
100
62,63
100
Kết quả ở Bảng 3.1 cho biết lá là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất 73,22% theo
khối lượng tươi và 61,84% theo khối lượng khô. Tiếp đến là rễ chiếm 15,16% theo
khối lượng tươi, 21,63% theo khối lượng khô. Hoa chiếm 11,62% theo khối lượng
tươi, 16,57 theo khối lượng khô. Trong thực tế, lá là bộ phận có nhiều công dụng và
được ứng dụng nhiều nhất. Rễ và hoa là các bộ phận có tỷ lệ thấp hơn, nhưng cả hai
thành phần này lại chiếm đến 26,78% theo khối lương tươi và 38,2% theo khối lượng
khô. Tỷ lệ này cos ựu thay đổi tùy theo độ tuổi, mùa vụ. Rễ và hoa tuy chiếm tỷ lệ
thấp nhưng có nhiều công dụng khác nên vẫn được tận dụng. Tuy nhiên, do khó khăn
cho việc đồng nhất mẫu giữa các bộ phận do đó cần nghiên cứu thêm về hoạt tính
chống oxi hóa của rễ, lá, hoa để chọn ra thành phần có hoạt tính chống oxy hóa cao
nhất phục vụ cho các thí nghiệm sau.
47
3.2. Hàm lượng ẩm của nguyên liệu
Bảng 3.2. Hàm lượng ẩm của nguyên liệu lá mã đề khô
Thành phần
Hàm lượng
Hàm lượng ẩm (%)
13,84 ± 1,46
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy hàm lượng ẩm của lá mã đề khô là 13,84%. Kết
quả này cho thấy rằng nguyên liệu sau khi được phơi khô có độ ẩm thấp, do đó thuận
tiện trong quá trình bảo quản, tránh được các yếu tố gây hư hỏng như vi sinh vật,
enzyme… Khi phơi khô thì dung môi dễ dàng thấm vào trong nguyên liệu hơn sự
chênh lệch nồng độ chất tan giữa bên trong và bên ngoài. Tuy nhiên theo thời gian,
nguyên liệu dễ bị hút ẩm trở lại dẫn đến có thể bị nấm mốc, hư hỏng ảnh hưởng đến
chất lượng cũng như sai số kết quả của các thí nghiệm khác, do đó cần chia nhỏ lượng
nguyên liệu vừa đủ đựng trong các bao bì PE sau đó cho vào bao bì PA, buộc chặt để
tránh hiện tượng hút ẩm trở lại.
3.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của bộ phận cây mã đề
Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa của các bộ phận cây mã
đề được trình bày ở đồ thị Hình 3.1 và 3.2.
48
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các bộ phận cây đến khả năng khử gốc tự do DPPH
của dịch chiết mã đề. Chữ cái trong cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
(P hoa với giá trị tương ứng
(49,08> 38,89> 19,4). Điều này chứng tỏ khả năng chống oxy hóa của lá là tốt nhất.
Giải thích cho điều này có lẽ bởi vì trong lá chứa các thành phần hóa học có
hoạt tính chống oxy hóa cao như flavonoid, iridoid glucoside, và các dẫn xuất của
cafeic acid… nhiều hơn ở các bộ phận khác. Các bộ phận khác như rễ, hoa và hạt
chứa phần lớn là cacbonhydrate và chất béo. So sánh với kết quả nghiên cứu của
Mohamed và cộng sự trong nghiên cứu hóa sinh của mã đề (lá, hạt) và đậu guar, 2010.
Trong nghiên cứu của Mohamed, các thành phần có hoạt tính sinh học của lá mã đề
cao hơn của hạt mã đề và đậu guar. Cụ thể như tổng số phenol (mg gallic/g) của lá>
rễ> đậu guar với giá trị tương ứng là (13,05mg/g, 7,43mg/g, 3,76 mg/g). Tổng số
Plavonoid (mg Quercetin/g) của lá> rễ> đậu guar ( 6,41mg/g>3,03mg/g > 0,83mg/g),
Tannin (mg Catechine /g) của lá 5,63mg/g>rễ 2,43 mg/g > đậu guar 0,76mg/g. Cũng
trong nghiên cứu của Mohamed, khả năng chống oxy hóa được xác định bằng phương
pháp khử gốc tự do DPPH cũng chỉ ra lá mã đề là thành phần có hoạt tính chống oxy
hóa cao nhất.
Những kết quả trên cho thấy phần lá không chỉ chiếm tỷ lệ khối lượng cao nhất
mà còn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, kết quả này góp phần lý giải vì sao trong
thực tế người ta thường ứng dụng phần lá nhiều hơn (trà mã đề, sản xuất dược liệu từ
lá mã đề). Từ kết quả này kết hợp với tỷ lê khối lượng cao mà chọn lá để thí nghiệm
tiếp theo.
50
3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch
chiết mã đề
Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chống oxy hóa của
dịch chiết mã đề được thể hiện qua đồ thị Hình 3.3 và hình 3.4.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng khử gốc tự do DPPH
của dịch chiết mã. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa
thống kê (P[...]... biệt là caffeic Một hoạt tính sinh học nữa của mã đề đáng chú ý là khả năng chống oxy hóa Năm 1999, Ren và cộng sự khi nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của mã đề mọc ở những độ cao khác nhau Mẫu được thu thập từ các độ cao khác nhau trên núi Mahan, Trung Quốc Kết quả cho thấy có sự tương quan giữa độ cao và khả năng chống oxy hóa của lá và hạt của mã đề Hoạt tính chống oxy hóa của hạt thì tăng theo... (Guille'n và cộng sự, 1997) 1.1.5.6 Chống oxi hóa Khả năng chống oxy hóa bằng cách làm mất màu của độ hấp thụ của 2,2% azinobis (acid 3-ethylben-zthiazolinesulfonic) Nước trà mã đề gồm một lượng nhỏ chất có khả năng quét gốc tự do so với trà đen Khả năng chống oxy hóa của lá mã đề còn xanh thì cao hơn của trà mã đề, điều này cho thấy rằng quá trình chế biến làm giảm hoạt tính chống oxy hóa của mã đề (Campos... Thơ, đã phân tích và phân tách một số hợp chất của cây mã đề Các nghiên cứu về cây mã đề ở nước ta chưa nhiều hơn nữa mới chỉ nghiên cứu tách chiết một số hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong dược liệu, chưa nghiên cứu nhiều về khả năng chống oxy hóa của loài cây này 1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trong những năm gần đây, xu hướng của các nghiên cứu là tìm ra các hoạt chất trong tự... quả chống oxy hóa của dịch chiết mã đề mạnh hơn so với BHT, một chất chống oxy hóa tổng hợp nổi tiếng Bên cạnh đó dịch chiết được kiểm 7 tra tổng lượng phenolic (dao động 38,43 ÷ 70,97 mg GAE/g ) và tổng hàm lượng flavonoid từ 5,31 ÷ 13,10 mg QE/g Theo đánh giá công dụng truyền thống, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở cây mã đề của Anne Berit Samuelsen, bộ phân nghiên cứu nguồn gốc tự nhiên của. .. người) Tóm lại, những 19 hợp chất được phát hiện verbascoside và calceorioside có thể được sử dụng trong phòng chống ung thư 1.2 Tìn hiểu về quá trính chống oxy hóa [3], [16], [17] 1.2.1 Quá trình oxy hóa và gốc tự do 1.2.1.1 Quá trình oxy hóa Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa 1.2.1.2 Gốc tự do Theo định nghĩa, gốc tự do (Free radical)... hình và điều kiên khí hậu có ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa của mã đề Khả năng khử gốc tự do DPPH và superoxide (SO) của polysaccharides là 81,4% và 79,7% ở nồng độ polysaccharides 0,75 mg/ml, trong khi đó khả năng khử gốc tự do của 0,75 mg/mL axit ascorbic tương ứng là 83,5% và 85,1% Điều nay cho thấy tiềm năng chống oxy hóa của của polysaccharide trong mã đề Theo Jamilah, 2012 khi phân tích dịch. .. chậm quá trình oxy hóa của các chất khác có trong thực phẩm 22 Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng 1.2.2.4 Các chất chống oxy hóa có trong tự nhiên a) Nhóm polyphenol Polyphenols là một trong những nhóm nhiều và phổ biến nhất của các chất chuyển hóa thực vật Chúng là một phần tích hợp của cả hai chế độ ăn của con... tra hoạt tính chống ung thư của cây mã đề ở vùng Chile Chiết xuất từ lá, thân và hạt của mã đề bằng dung môi ethanol 50% không có hoạt động chống lại bệnh bạch cầu lymphocytic ở chuột Tuy nhiên năm 1990, báo cáo của Yaremenko cho rằng dịch chiết mã đề có hiệu quả trong hệ thống kiểm soát ung thư học dự phòng Các hiệu ứng bao gồm các hoạt động chống di căn trong khối u ở chuột Nhưng chi tiết trong nghiên. .. dịch chiết từ lá mã đề theo phương pháp GCMS Kết quả phân tích các thành phần hóa học của mã đề trong dịch chiết từ các dung môi (ether dầu khí, methanol, ethyl acetate, n-butanol và nước) đều cho thấy cả năm dịch chiết trên đều có nhóm phenol, các đồng phân khác nhau của axit hữu cơ, flavonoid và terpenoid, đây là những chất được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao Cũng năm 2012, Harput và cộng... tiến hành kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào và chống oxi hóa của mã đề để xác minh về những công bố về dụng truyền thống của nó Kết quả cho thấy, dịch chiết mã đề có khả năng quét gốc tự do DPPH, oxit nitrit (NO), superoxide (SO) mạnh khi được so sánh với BHA và Quersetin Ngoài ra dịch chiết từ dung môi nước thể hiện khả năng gây độc tế bào tùy theo liều lượng sử dụng Từ dịch chiết mã đề với dung môi ... 2.3 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ mã đề từ phận - Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ mã đề - Nghiên cứu ảnh hưởng... công tác nghiên cứu ứng dụng Được hướng dẫn ThS.TRần Thị Huyền, em thực đề tài Nghiên cứu trình chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết mã đề (Plantago major )” Đây nghiên cứu bổ sung... 3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa thành phần mã đề 47 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết mã đề 50 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính
Ngày đăng: 09/10/2015, 09:30
Xem thêm: Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề (plantago major), Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề (plantago major)