BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • *ỉ# •!*#Ị% •!#wỊ+ *1#0Ẹ9 #Ị% rỊ% rỊ% rỊ% #Ị% #J* #J% • rf% rỊ% NGUYỄN XUÂN BÁCH NGHIÊN CỨU ĐIỂU CHẾ GLUCOSE TỪ TINH BỘT VÀ TỔNG HỢP MỘT s ố DAN c h ấ t c ủ a g l u c o s e Dự• ĐOÁN CÓ TÁC DỤNG SINH HỌC • • {KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHÓA 1998-2003} Cán bộ hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện TS. Giang Thị Sơn Bộ môn Hóa hữu cơ Trường Đại học Dược Hà Nội 3/2003 - 5/2003 HÀ NỘI, 5 -2 0 0 3 LỜI CẢM ƠN Em xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Giang Thị Sơn, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện khoá luận này. Em xỉn chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Hóa hữu cơ Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, động viên em trong quá trình thực hiện khoá luận tại bộ môn. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Ngọc Thanh và cán bộ Phồng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội; GVC. Nguyễn Lệ Phi cùng cán bộ bộ môn vỉ sinh trường Đại học Dược Hà Nội; TS. Lê Ngọc Vân, KS. Lê Thị Tập Khoa Vi sinh, Viện lao và bệnh phổi TW. Cuối cùng em xin bầy tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ trong trường vê những giúp đỡ trong suốt 5 năm học qua. Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2003 Sinh viên Nguyễn Xuân Bách MỤC LỤC Đặt vấn đ ề ................................................................................................... 1 Phần 1 : Tổng quan...................................................................................2 1.1. Glucose và các phương pháp điều chế.............................................. 2 1.1.1. Sơ lược về Glucose................................................................... 2 1.1.2. Phương pháp điều chế Glucose............................................... 3 1.1.3. Chất lượng Glucose.................................................................. 6 1.2. Dẫn chất hydrazon............................................................................10 .1.2.1.Tác dụng sinh học của hydrazon........................................... 10 1.2.2. Các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon.....................13 Phần 2 : Thực nghiệm và Kết quả........................................................ 15 2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.........................................15 2.2. Điều chế Glucose.............................................................................. 15 2.2.1. Thủy phân tinh bột................................................................. 16 2.2.2. Tinh chế dịch thủy phân ....................................................... 16 2.2.3. Kết tinh, phân ly, tạo sản phẩm cuối cù n g ...........................17 2.3. Tổng hợp dẫn chất hydrazon của Glucose...................................... 19 2.3.1 Tổng hợp isonicotinoyl hydrazon ....................................... 19 2.3.2. Tổng hợp Thiosemicarbazon............................................... 20 2.3.3. Tổng hợp semicarbazon.......................................................21 2.3.4. Tổng hợp 2,4-dinitro phenylhydrazon ................................23 2.3.5. Tổng hợp oxazon..................................................................24 2.4. Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học ................................................ 25 2.5. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được....................... 29 2.5.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng n ấ m ...............................29 2.5.2. Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao .....................................31 2.6. Bàn luận và nhận xét kết q u ả......................................................... 35 Kết luận và đề x u ấ t................................................................................36 Tài liệu tham khảo Phụ lục CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT : IR uv SKLM MeOH EtOH DMF M GA a ( Ị3,y )-a : Phổ hồng ngoại : Phổ tử ngoại : Sắc ký lớp mỏng : Methanol : Ethanol : Dimethylformamid : Khối lượng phân tử : Gluco Amyĩase : a ( p,y )-amylase ĐẶT VẤN ĐỂ Từ trước đến nay, Glucose đã và đang được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, kỹ nghệ rượu bia, kỹ nghệ đồ hộp... và một ngành mà ta không thể không nhắc tới đó là : Công Nghiệp Dược Phẩm. Trong ngành Dược, Glucose được dùng để pha huyết thanh nhân tạo, dùng làm tá dược trong công nghệ bào chế thuốc viên ... Ngoài ra Glucose còn được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng sinh học đang lưu hành trên thị trường như [9,18]: 1 - Glucametacin với các biệt dược Teoremac ( Sanfer - Italia ), Euminex ( Lacer-Tây Ban N h a)... có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. 2 - Glucosamin, có biệt dược: Dona của Ofermann - Đức và Rottapharm Italia. Có tác dụng trị thấp khớp. 3 - Streptozocin, có biệt dược là Zanoar của Upjohn. Là một kháng sinh tổng hợp chống khối u. 4 - Metrizamide có biệt dược là Amipaque của Sanofi. Là thuốc cản quang chứa iod. Tại Việt Nam đã có nhiều cơ sở sản xuất Glucose đi từ nguồn nguyên liệu là tinh bột trong đó chỉ có 1 nhà máy sản xuất Glucose dược dụng là Nhà máy đường 19-5 tại Sơn Tây-Hà Tây với công suất 200 tấn/năm (Theo số liệu thống kê năm 2002 của nhà máy). Với công suất này chưa thể đáp ứng đủ cho cả hệ thống Y-Dược của chúng ta. Trong đề tài này, với hy vọng là có thể góp một phần nhỏ bé vào công việc điều chế Glucose dược dụng cũng như tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng sinh học, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với những mục tiêu sau : - Điều chế Glucose từ tinh bột. - Tổng hợp một số dẫn chất của Glucose. - Thăm dò tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được. 1 PHẢN 1: TONG QUAN 1.1. Glucose và các phương pháp điều chế 1.1.1. Sơ lược về Glucose Glucose (hay Dextrose) tồn tại dưới dạng tự do trong quả mật của một số loài thực vật (nho) và cả trong cơ thể động vật: Trong máu người luôn có từ 0.08%- 0.1% Glucose. Ngoài ra người ta còn thấy Glucose dưới dạng kết hợp như trong Glucosid, trong oligosaccarid, polysacarid, cellulose, tinh bột và trong Glycogen ở tổ chức gan [1,17]. Glucose tồn tại dưới dạng bột kết tinh mầu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%. Trong môi trường nước, DGlucose kết tinh ở dạng a bền vững, ở dung dịch acid loãng D-Glucose sẽ kết tinh dưới dạng ị3, tuy nhiên dạng này không bền vững nên khi gặp vết nước sẽ chuyển ngay sang dạng a [1,17]. Về cấu trúc hoá học, Glucose có mạch gồm 6 nguyên tử carbon không phân nhánh, chứa 5 chức alcol, 1 chức aldehyd : H—c —c —c —c —c —c = 0 OH OH OH OH OH Tuy nhiên khi nghiên cứu sâu hơn, ngưòi ta thấy Glucose còn có một số cấu trúc dạng vòng, khi đó nhóm aldehyd kết hợp với hidro của nhóm OH alcol để tạo thành bán acetal: /O H /O H H-CrOH H Ò CH2OH Dạng vòng của Glucose Dạng aldehyd của Glucose 2 l/ Công thức vòng của Glucose do Colley (1870) và Tollens (1884) đề nghị, đến năm 1912 được Fisher công nhận và đến năm 1926, W.N. Haworth xác định bản chất của vòng : Sau này bằng phương pháp phân tích tinh thể học vói tia X, người ta nhận ra Glucose còn có cấu dạng không gian như sau : Với một số quan niệm như trên về công thức cấu tạo, Glucose có những tính chất hóa học sau [1]: + Phản ứng của nhóm aldehyd (oxi hóa, tạo osazon, tạo cyanhydrin). + Phản ứng của dạng vòng bán acetal (tạo Glucosid với một alcol thấp). + Phản ứng của toàn phân tử monosacarid (tác dụng với kiềm, phản ứng lên men). Về tác dụng dược lý, Glucose được làm thức ăn dinh dưỡng và trợ lực, còn dùng làm thuốc lợi tiểu. Được chỉ định trong phòng và chữa mất nước trong và ngoài tế bào, mất nước do ỉa chảy cấp tính, bệnh nhân bị kiệt sức, giảm đường huyết. Phòng và chữa chứng tích ceton khi thiếu dinh dưỡng. Làm giảm áp ở tuỷ sống-não, phù não do mê sảng rượu cấp hay ngộ độc rượu cấp tính. [11]. 3 1.1.2. Phương pháp điều chế Glucose Để thu được Glucose, ta có thể đi từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như tinh bột, cellulose; tuy nhiên trong thực tế nguyên liệu hay được sử dụng hơn cả là tinh bột, đây là một nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú có trong gạo, ngô, khoai, sắn ... Tinh bột cấu tạo bởi hai mạch polysacarid: Amylose và Amylopectin. + Phân tử Amylose là một mạch gồm hàng nghìn đơn vị Ot-DGlucose nối với nhau theo dây nối a-l,4-glucosid, đa số mạch thẳng, ít phân nhánh : Công thức cấu tạo của Amylose + Amylopectin có phân tử lượng lớn hơn, phân nhánh nhiều hơn, cũng cấu tạo bởi những đơn vị a-D- Glucose. Các đơn vị a-D- Glucose cũng nối với nhau theo dây nối a-l,4-glucosid, chỗ phân nhánh nối với nhau theo dây nối a - l,6-glucosid. Trong tinh bột trung bình tỉ lệ Amylose là 25%, còn Amylopectin là 75%. Tất cả tinh bột đều được tạo nên bởi hai dạng này, nhưng tỉ lệ giữa chúng tuy thuộc vào nguồn gốc thưc v â t. Để thu được Glucose từ tinh bột, sử dụng phản ứng thủy phân tinh bột với các tác nhân hóa học (H2S04, H ơ , H2C204 ) hay vi sinh (enzym ). Dựa vào tác nhân xúc tác trong quá trình thủy phân tinh bột mà có hai phương pháp chính để sản xuất Gluose : ♦ Phương pháp acid : Dùng acid thủy phân tinh bột. Đây là phương pháp được áp dụng từ những năm 1920. Dưới tác dụng của acid, tinh bột thủy phân thành D- Glucose kết tinh dưới dạng ngậm nước với điều kiện nhiệt độ dưới 50°c. Còn trong điều kiện nhiệt độ 50°c - 60°c Glucose kết tinh dưới dạng không ngậm nước [7]. + Phương pháp enzym : Đây là một phương pháp tiên tiến được quan tâm từ những năm 1970. Các enzym có khả năng thủy phân tinh bột gồm : a-a, Ị3-a, enzym trong nấm mốc aspegillus niger, Rhizopus delemar như GA, Ỵ- a. Enzym phosphorylase có trong đậu, khoai tây, trong lá và bộ phận dự trữ của thực vật bậc cao. Isoamylase có trong men bia và R-enzym [10]. Trong số những enzym trên, a-a và GA là hay được sử dụng hơn cả, chúng được sử dụng trong quy trình gồm hai giai đoạn : 2^ Giai đoạn hồ hóa và dịch hóa bằng a-a. Đây là enzym có khả năng phá vỡ các liên kết cx-l,4-Glucosid tạo thành các dextrin có trọng lượng phân tử nhỏ làm cho độ nhớt tinh bột giảm nhanh, về sau dextrin mới phân hủy dần để chuyển thành maltose, isomaltose, dextrose. >- Giai đoạn đường hóa bằng GA, enzym này có khả năng phân cắt cả liên kết a-1,4 và a-1,6- Glucosid để tạo Glucose. 5 + Ngoài hai phương pháp kể trên, người ta còn kết hợp hai phương pháp acid và enzym gọi là phương pháp acid - enzym: Giai đoạn đầu dùng acid, giai đoạn sau dùng enzym. Sau đây là quy trình tiêu chuẩn sản xuất Glucose ở quy mô công nghiệp của Nhà máy Đường 19-5 được chúng tôi đưa ra để minh hoạ : Trong quy trình 1 theo phương pháp acid, tinh bột được hòa loãng 35%, acid hóa bằng acid HC1, trung hòa bằng NaHC03 hay Na2C 0 3, tẩy mầu bằng than hoạt tính (Sơ đồ 1 trang 7). Trong quy trình 2 theo phương pháp enzym, hai enzym được sử dụng là a-a và GA, trước khi dịch hóa cần điều chỉnh pH tạo điều kiện cho oc-a hoạt động tốt nhất. Sau khi đường hóa xong diệt men bằng cách nâng nhiệt độ (Sơ đồ 2 trang 8). 1.1.3. Chất lượng Glucose Glucose được sử dụng rộng rãi trên thế giới, vì vậy hầu hết dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về Glucose. Chúng tôi xin nêu ra một số chỉ tiêu về Glucose cho ngành Dược theo ba dược điển: Dược điển Việt Nam III(DĐVN III), Dược điển Anh 98(BP 98), Dược điển Mỹ 24(USP XXIV). Các tiêu chuẩn về chất lượng Glucose được tổng kết trong bảng 1.1 trang 9. Nhận xét: qua bảng trên chúng ta thấy DĐVN III, BP 98, USP XXIV đều quy định một số tiêu chuẩn thử giống nhau nhưng mỗi dược điển cũng có quy định khác nhau cho từng nước. Nhìn chung các tiêu chuẩn trong USP XXIV có phần cao hơn trong DĐVN III, còn trong BP 98 gần tương tự như trong DĐVNIII. 6 Sơ đồl:(Lưij/trình công nghệ sản xuất Glucose tinh thể theo phương pháp acid 7 Sơ đồ 2: Quy trình sản xuất Glucose theo phương pháp enzym Bảng 1.1 : Tiêu chuẩn của Glucose trong dược điển của một số nước Tiêu chuẩn Góc quay cực riêng DĐVN III +52,5° đến +53,3° BP 98 +52,5° đến +53,3° 2 Đô trong và mầu sắc dd Không đậm hơn mẫu NV7 Không đậm hơn mẫu XV7 3 Giới hạn acid 4 Đường ít tan 5 Tinh bột tan 6 7 Arsen Tro sulfat Chuẩn độ acid-base ^NaOH 0,02N íí 0 ,3 ml Chế phẩm phải tan hoàn toàn trong EtOH Không cho mầu xanh với dd iod. < lppm < 0 , 1% Chuẩn độ acid-base V nhohOjIM ^ 0,15ml Chế phẩm phải tan hoàn toàn trong EtOH Không cho mầu xanh với dd iod. < lppm < 0 , 1% 8 Clorid < 0,0125% < 0,0125% 9 Sulfat < 0 ,0 2 % < 0 ,0 2 % 10 Sulfit 11 Bari 12 Calci < 0,02% < 0,02% KQĐ 13 Nước < 1,0% < 1,0% Mất khối lượng do sấy khô ở 105°c/ 16 giờ đối với dang anhydrat < 0,5%; đối với dang hydrat từ'7 ,5 %- 9,5% STT 1 DD chế phẩm trong nước ,thêm dd iod, hồ tinh bột, dd phải có < 0,0015% Sulfit. mầu xanh. DD s :50,0g chế phẩm/ vđ DD s :50,0g chế phẩm/ vđ 100ml H2O.Yêu cầu 10ml dd s 100ml H2O.Yêu cầu 10ml dd s + lml dd H2S0 4 không đậm + lm l dd H2S0 4 không đậm mầu hơn 10ml dd s + lml H ,0. mầu hơn 10ml dd s + lml H ,0 9 USP XXIV +52,6° đến +53,2° Không đậm hơn mẫu gồm 3ml dd T pha loãng thành 50ml.DD T gồm: lml CoCl2 , 3ml FeCl,, 2ml CuCl„ H2Ố vđ 10ml. Chuẩn độ acid-base VNaOH0 ,0 2 N < 0,3ml Chế phẩm phải tan hoàn toàn trong EtOH Cho mầu vàng với dd iod. < lppm < 0 , 1% Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml HNO3 +lm l A gN 03+ H20 vđ 50ml không đậm hơn mẫu chứa 0,5ml HC1 0,020N Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml H ơ + 3ml B a ơ 2 + H20 vđ 50ml không đậm hơn mẫu chứa 0,5ml H,S0 4 0,020N Cho mầu vàng với dd iod. KQĐ 1.2. Dẫn chất hydrazon 1.2.1. Tác dụng sinh học của dẫn chất hydrazon + Tác dụng kháng khuẩn Đây là tác dụng quan trọng nhất của dẫn chất hydrazon, đáng chú ý nhất là dẫn chất hydrazon của 5- nitrofurfural có công thức chung [3]: I 0 2n / I xc h = n —n h - r Vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) là loại vi khuẩn rất khó tiêu diệt nên tác dụng kháng lao của các hydrazon là một đặc tính quý ỡ giá. sJ Năm 1948 G. DẤnayk đã tổng hợp được Tibion (Thiosemicarbazon của aldehyd para- acetylaminobenzoic) có tác dụng chống lao và đã áp dụng vào thực tế lâm sàng có kết quả tốt với các tên biệt dược như TBI, Corteben, Livazon[9,12,18]: o s J H3C — c —HN—Y II y - C H = N —NH—C —NH 2 Năm 1948 MN. Soulina và E. Michina đã tổng hợp được một dẫn chất khác của Thiosemicarbazon có tác dụng chống lao lấy tên là Cutizon có công thức như sau[9,12,18]: ? H3/ = \ H 3C—H C ^ s C H = N —NH—C —NH 2 Dãy có tác dụng kháng lao mạnh thứ hai là dẫn chất isonicotinoyl như[9,12,18]: CO— NH— N = H C — | /= \ ỳ —OH OCH3 / Ftivazidỷ, Vanizid^ (Isonicotinoyl hydrazon của 3- metoxy- 4- hydroxy benzandehyd) 10 Năm 2000, các tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân, Lê Thị Tập đã nghiên cứu và thử tác dụng chống lao của một số dẫn chất Thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen isatin. Kết quả cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều có tác dụng mạnh trên chủng Mycobacterium tuberculosis H37RV. Ngoài ra có 6 dẫn chất của 3isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5- halogen isatin có tác dụng cả trên chủng vi khuẩn lao đã kháng isoniazid [4]. + Các tác dụng khác . Ngoài các tác dụng chính kể trên một số hydrazon còn có tác dụng chống khối u, chống viêm, chống virus, chống ký sinh trùng như : i^Bis thiosemicarbazon của 5- nitro furfurylglyoxan có tác dụng kìm hãm sự phát triển của các tế bào ung thư[12] : s I I O jN ' N0 NH— C —NH 2 C -C H = N -N H -C -N H 2 5^4- hydroxybenzoic acid [(5- nitro-2- furanylmethylen)] hydrazid còn có tên là Nifuroxazide, có tác dụng sát khuẩn đường ruột và sát khuẩn ngoài da[9,12,18]: 1 0 2N TI o o CH=N—NH—c —(ỵ V - OH >*Hydrazin carboximidamid, 2[ 2,6- dicloro phenyl methylen còn có tên là Guanabenz, có tác dụng điều trị tăng huyết áp[9,12,18] : C1 ■C H = N —NH— ^ ^ c —NH 2 L NH Sau đây là bảng tổng kết một số dẫn chất hydrazon được sử dụng làm thuốc (Bảng 1.2 trang 12). 11 Bảng 1.2: Một số hydrazon, thiosemicarbazon và semicarbazon được sử dụng làm thuốc[12] s T T Công thức cấu tạo Tên khoa học co —NH—N= c Isonicotinoyl hydrazon của 3metoxy-4- hydroxy benzandehyd 1 N Ố J CH 3O ồ OH Isonicotinoyl hydrazon của 3,4dimetoxy- 2carboxybenzaldehyd CO—NH—N= c 2 ộ : ? ệ > OCHị 0 5 s CH= N NH—C—NH2 ^ ___ .N-NH-ị^-NH, c y 7 1 N—NH—C—NH2 6 7 02>r 0 Vanizidy! Chống lao Saluzid Chống lao Tibion Chống lao Thiosemicarbazon của p- isopropyl benzaldehyd Cutizon Chống lao 1- Guanyl hydrazon 3- Thiosemicarbazon củaIndandion Tiogin Chống lao của aldehyd- p3 H3C—c—HN—( ^ 3 ) ~ CKF=N~NH—C—NH2 acetyl- aminobenzoic 4 Ftivazid^ Tác dụng Thiosemicarbazon s ch3 H3C—CH ^ Biệt dược CH=N—NH—-C—NH2 Ằ Ắ /= y 02N/ 0 CH=N—N N 12 Semicarbazon của 5nitro-2Furacillin furfuraldehyd Kháng khuẩn l-(5’ nitro- 2 furfuryliden amino)1,3,4-Triazon Kháng khuẩn Furazonal Xúc tác cho phản ứng có thể là acid vô cơ hoặc hữu cơ, lượng acid dùng làm xúc tác ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng. Mỗi cặp hydrazin-carbonyl có một trị số pH đặc trưng, ở pH đó nồng độ [Rr COR2].[H2N-NH-Z] đạt được cực đại và hiệu suất phản ứng là cao nhất. Tùy theo hợp chất ban đầu và hydrazon tạo thành mà chọn dung môi, xúc tác, nhiệt độ, thời gian phản ứng thích hợp. + Phản ứng kết hợp muối diazoni với hợp chất cố chứa nhóm methylen hoạt động ị Công thức z - CH2 - Z ) > Phương trình phản ứng tổng q u á t: z -C H ,-z ! AcONa ArN, * z - c = N -N H A r I z, z có thể là P-keto este, P-keto amid, este malonic, nitro alkal. + Phản ứng phân cắt liên kết đôi bằng ion hydranium hoặc muối diazoni r 2c = c r 2 + n h 2 - n h — ► r 2c h 2 + r 2c = n - n h 2 Hoặc PhCH = CHMe + ArN, PhC H -C H M e I N = NAr OHo I H2O — PhCH— CHMe PhCH I II N=NAr + N -N H A r 14 0=C H M e V \T PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ Na2C 0 3, NaCH3COO, HC1, CH3COOH đặc, Than hoạt, Ethanol 99%, Tinh bột. Các hydrazin (fh£? Isoniazid, Thiosemicarbazid, Semicarbazid, 2,4-Dinitro ĩ Y phenyl hydrazin, Phenyl hydrazin. Máy khuấy từ Heidolf, Máy đo độ chảy Gallenkamp, Bản sắc ký Silicagen Kieselgel. 60 F254 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để điều chế các chất như dự kiến: >- Điều chế Glucose từ tinh bột bằng phương pháp thủy phân acid. >- Tổng hợp các dẫn chất hydrazon của Glucose bằng phương pháp ngưng tu giữa nhóm carbonyl và các hydrazin thế. - Theo dõi quá trình/bằng SKLM. - Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy. - Xác nhận cấu trúc các chất tổng hợp được dựa trên phân tích phổ IR, u v . - Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được bằng phương pháp đục lỗ thạch theo quy định trong DĐVNIII. Thử tác dụng trên vi khuẩn lao của các chất tổng hợp dựa trên phương pháp thử độ nhậy cảm của vi khuẩn lao với chất thử theo phương pháp tỉ lệ CannettiGrosset. 2.2. Điều chế Glucose Trong các phương pháp điều chế Glucose, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi chọn phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid . >*Phương trình phản ứng tổng q u á t: (C gH nP s^ + nH20 15 nC6H120 6 Khi phản ứng xảy ra hoàn toàn thì sản phẩm cuối cùng là Glucose. Trên thực tế phản ứng xảy ra qua các giai đoạn : ( C6H10O5 ^ Tinh bột H2O ( CgHịQƠs ^ C^H^Oịi - ^ 2^ C5H12O5 Dextrin Maltose Glucose Quá trình thực nghiệm được tiến hành qua các bước sau : 2.2.1. Thuỷ phân tinh bột Hoà 20g tinh bột đã tinh chế vào 100ml nước cất trong cốc thuỷ tinh, khuấy kỹ tạo hỗn dịch. Rót hỗn dịch vào trong bình cầu dung tích 250ml, tăng nhiệt độ lên 100°c, điều chỉnh tốc độ khuấy 100 vòng/ phút để tránh tinh bột bị vón cục và bị hồ hóa đồng thời để hiệu suất đạt cao nhất [7]. Rót từ từ 5ml acid chlohydric đặc làm xúc tác. Giữ nhiệt độ ổn định trong 3 giờ 30 phút. Trong quá trình đun kiểm tra dịch thủy phân bằng thuốc thử iod và SKLM. + Định tính dịch thủy phân bằng thuốc thử iod : Cho vào ống nghiệm 5ml nước cất và 2-3 giọt thuốc thử iod, lắc đều. Thêm vào ống nghiệm 2-3 giọt dịch thủy phân, mẫu dịch chỉ đạt khi không cho mầu xanh với thuốc thử iod. + Định tính dịch thủy phân bằng SKLM : Trên bản mỏng sắc ký chấm một vết Glucose chuẩn và một vết dịch thủy phân. Thời điểm kết thúc giai đoạn thủy phân khi dịch lọc cho một vết sắc ký trùng với vết Glucose chuẩn. Dung môi hoà tan là Methanol- Nước ( 3 : 2 ) , dung môi khai triển là hệ Nước- Methanol- Acid acetic khan-(Ếthyỉẽnckmáx 10 ? ? v ' : 15 : 25 : 50 ). Hiện mầu bằng đèn tử ngoại. 2.2.2. Tinh chế dịch thủy phân Khi đã xác định được thời điểm kết thúc phản ứng, để nguội, chuyển dịch thủy phân sang cốc thủy tinh sạch, tiến hành trung hòa bằng Natri carbonat đã nghiền mịn đến khi không còn bọt khí nổi lên và pH dung dịch đạt từ 6,5 - 7,0 thì kết thúc phản ứng trung hòa và đem lọc. 16 Tẩy mầu dịch lọc bằng than hoạt : Dùng than với tỉ lệ 3% - 4%[7], giữ nhiệt độ ở 100°C/30 phút, sau đó lọc nóng lấy dịch lọc. Tiến hành tẩy mầu bằng than hoạt hai lần, dịch lọc trong suốt có ánh vàng. Dịch lọc sau khi tẩy mầu được cho đi qua lần lượt cột trao đổi cation loạiị acid mạnh và anion loại base yếu để loại các ion lạ. 2.2.3. Kết tinh, phân ly, tạo sản phẩm cuối cùng Tiền hành cô dịch lọc đến thể tích 50ml. Sau đó để dịch lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sẽ có kết tủa. Lọc hút lấy tủa, đem sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60°c trong 6 giờ. Phần dịch lọc được tái thu hồi sản phẩm. + Thu hồi sản phẩm : Trong cốc thủy tinh có chứa dịch lọc, thêm đồng lượng ethanol, khuấy cho hai lớp đồng nhất rồi để kết tinh trong ít phút, tiến hành lọc hút lấy tủa, sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60°c trong 6 giờ. Kết quả thu được 11,1 lg Glucose. Hiệu suất thu hồi là 55,6%. Quy trình điều chế Glucose được mô tả trong sơ đồ 3 trang 18. Sản phẩm chính và sản phẩm thu hồi được định tính và thử tinh khiết theo tiêu chuẩn DĐVNIII trình bày trong bảng 2.1 trang 17. Bảng 2.1: Kết quả kiểm nghiệm Glucose theo DĐVNIII STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiêu chuẩn Góc quay cực riêng Độ trong và mầu sắc dung dịch Giới han acid Đường ít tan Tinh bôt tan Arsen Tro sulfat Clorid Sulfat Sulfit Bari Calci Nước Kết quả + + + + + + + + + + + + + Sơ đồ 3: Quy trình điều chế Glucose trong phòng thí nghiệm Tinh bột r ^loãng Ả 20% h 2° ----------------Hòa HC1------------------- —►! Thủy phân Na2C 0 3 Trung hòa l Ị c hút Than hoạt ►! Tẩ^mầu 1 Lọc hút ►ị Than hoạt Tẩy mầu 2 L hút ,. Li cation Trao đổi anion Cổ^đặc Kếtịtinh ị --------------- Lọc hút---------------ị Tua Dich U-------- ị Sấy Loc hút , Sản fphẩm í T ịa EtOH Sấy « . T ......... í : sản pham thu hồi 18 2.3. Điều chế dẫn chất hydrazon của Glucose Trong các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon, căn cứ vào các chất dự kiến tổng hợp và căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã chọn phương pháp ngưng tụ Glucose với dẫn chất hydrazin thế. Phương trình phản ứng tổng q u á t: C H =0 C H = N —N H — R + h 2n - nh- r + h 20 H— ► c h 2o h c h 2o h Glucose hydrazin thế hydrazon 2.3.1.Tổng hợp isonicotinoyl hydrazon > S ơ đồ phản ứng : C H =0 H2N—NH —CO + H—C = N —NH—CO ► c h 2o h CH2OH isoniazid Glucose (I) 5>Tiến hành : Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu, cho vào hỗn hợp gồm l , 8g Glucose (0,01mol), l,37g isoniazid (0,01mol), 20ml alcol ethylic 99%, 2ml acid acetic đặc. Đun hồi lưu cách thủy trong 90 phút. Khi phản ứng kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không lấy tủa, rửa tủa bằng alcol ethylic ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi nước- ethanol ( 1 : 1 ) . Sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân không thu được 1,16g tinh thể mầu trắng. Nhiệt độ nóng chảy : 190°c - 192°c Hiệu suất : 38,8% 19 sản phẩm tan trong nước, ít tan trong EtOH, aceton. Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi hòa tan là nước-ethanol (1 : 1). Dung môi khai triển là hệ methanol- cloroform ( 10:40). Phổ tử ngoại X Sẩx = 268, 889. Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau : 3313.2 c m 1 ^CO-NH 2911.3 cm' 1 5CH2 1650.4 cm'1 VC=N 1571.3 cm'1 v c.car0matic 1 4 1 3 .0 c m ^ O l l trong mặt phẳng 1223.4 cm'1 VC_N 1079.4 c m 1 VOHalcol 1025.0 c m 1 Vpyridin 2.3.2. Tổng hợp Thiosemicarbazid 2>Sơ đồ phản ứng : C H =0 H—C = N —NH—C—NH2 + H2N —NH— C—NH2 ĩS ^ - c h 2o h Glucose s ---------* +H20 c h 2o h thiosemicarbazid (II) 5>Tiến hành : Trong bình cầu dung tích lOOml có lắp sinh hàn hồi lưu, hoà tan 0,46g Thiosemicarbazid ( 0,005 m o l) vào 20ml ethanol 99% bằng cách đun nóng đến tan hoàn toàn. Thêm từ từ vào bình phản ứng 0,9g Glucose ( 0,005 m o l) và 2ml acid acetic đặc. Đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Khi phản ứng kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản 20 phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng ethanol 99% ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng hỗn hợp nước-ethanol (1: 1 ). Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân không thu được 0,39g tinh thể mầu trắng. Nhiệt độ nóng chảy : 203°c - 205°c Hiệu suất : 30,83% Sản phẩm tan trong nước, ít tan trong EtOH, aceton. Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi hòa tan là nước-ethanol (1 : 1). Dung môi khai triển là hệ methanol- cloroform li ( 10:40). Phổ tử ngoại X nm = 265, 556. Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau : 3345.4 cm' 1 V NH 1619,7 cm' 1 V C=N 1467.4 cm' 1 ^ O H trong mặt phẳng 1288,0 cm'1 v c=s 1080,9 cm'1 ^ O H alcol 795,5 c m 1 ÔcH 2.3.3. Tổng hợp semicarbazon >“Sơ đồ phản ứng : H—C = N —NH— C—NH2 CH =0 ìr + 0 H2N—NH— C—NH2 + H20 Ồ c h 2o h c h 2o h Glucose semicarbazon (III) >*Tiến h àn h : 21 Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu, hoà tan 0,56g ( 0,005 mol ) semicarbazid hydroclorid, 0,4lg Natri acetat trong một lượng nước tối thiểu. Thêm 0,9g ( 0,005 m o l) Glucose, 1,5ml acid acetic đặc. Cho thêm alcol ethylic đến khi trong. Đun hồi lưu cách thủy trong 1 giờ. Khi phản ứng kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng ethanol 99% ba lần , mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng hỗn hợp nước-ethanol (1 : 1 ). Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân không thu được 0,56g tinh thể mầu trắng ngà. Nhiệt độ nóng chảy : 200°c - 202°c Hiệu suất : 47,26% Sản phẩm tan trong nước, không tan trong EtOH, aceton. Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi hòa tan là nước-ethanol (1:1). Dung môi khai triển là hệ methanol- cloroform ( 10:40). Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau : 3418.5 3418,5 cm' 1 V VNH 2924.0 cm' 1659.6 cm' 1460.1 cm' ^ O H trong mặt phẳng 1232,8 cm' V c-N 1103.6 cm' ^ O H a lc o l 2.3.4. Tổng hợp 2,4- dinitro phenylhydrazon 5^Sơ đồ phản ứng : C H =0 CH2OH H—C = N — NH HoN—NH I CH2OH no2 Glucose 2,4 - dinitro phenyl hydrazin 22 (IV) >*Tiến hành : Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu, hoà tan lg 2,4 dinitro phenyl hydrazin ( 0,005 mol ) vào 20ml ethanol 99% bằng cách đun nóng đến tan hoàn toàn. Thêm từ từ vào bình phản ứng 0,9g Glucose ( 0,005 m o l) và 2mlacid acetic đăc. Đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Khi phản ứng ? ? kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng ethanol 99% ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng hỗn hợp nước-ethanol (1:1). Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c thu được 0,64g tinh thể mầu vàng. Nhiệt độ nóng chảy : 85°c - 87°c Hiệu suất 35,54% : Sản phẩm khó tan trong nước lạnh, alcol ethylic lạnh. Dễ tan trong alcol ethylic nóng, nước nóng, ít tan trong aceton. Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi hòa tan là ethanol. Dung môi khai triển là hệ methanol - cloroform ( 10:40 ). Phổ tử ngoại Ằ, nm = 272, 354. Phổ hồng ngoại có những đỉnh đặc trưng sau : 3351.8 cm' 2898,5 cm' 1624.0 cm' 1517.8 cm" VC-Caromatic 1422.9 cm' V N 02 thơm 1343.1 cm1083.0 cm' ^ O H alcol 714.0 c m 1 Ô c -H 23 I 2.3.5. Tống hợp oxazon >~Sơ đồ phản ứng : CH =0 H— c =N— NH— C6H5 + 2H20 + 3C6H5—NH—NH2 — ► CH2OH _ = N —NH—C6H5 _ + 3N H 3 CH2OH Glucose (V) phenyl hydrazin >T iến h àn h : Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu cho vào lml phenyl hydrazin ( 0,005 m o l), 0,9g Glucose ( 0,005 m o l) và 2ml acid acetic đặc, 2ml natri acetat 1% . Đun hồi lưu cách thủy trong 15 phút. Khi phản ứng kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng ethanol 99% ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng ethanol. Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân không thu được 0,95g tinh thể mầu vàng. Nhiệt độ nóng chảy : 208°c Hiệu suất : 54,29% Sản phẩm không tan trong nước. Tan kém trong EtOH. Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi hòa tan là ethanol. Dung môi khai triển là hệ methanol - cloroform (10:40 ). Phổ tử ngoại À, nm = 268, 556, 889. Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau : 3308.2 c m 1 2909.2 c m 1 1601.2 cm' 1 24 1535,2 cm'1 Vex: aromatic 1389.7 c m 1 ^ O H trong mặt phẳng 1080,0 c m 1 ^ O H alcol 787.7 cm'1 Ỗc-H 2.4. Tóm tắt kết quả tổng hợp Như vậy chúng tôi đã tổng hợp được 5 dẫn chất của Glucose. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số hằng số vật lý của các chất này. Kết quả được trình bầy trong bảng 2.2 và 2.3. Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định bằng phổ hồng ngoại và phổ tử ngoại: + Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr trong vùng 4000 - 500 cm 1 tại phòng thí nghiệm trung tâmTrường Đại học Dược Hà Nội. Các kết quả trình bầy ở bảng 2.3. ♦ Phổ tử ngoại của các chất được ghi trên máy Cary IE UV- Visible DMF spectrophotometer Yarian, dung môi DMF. Các giá trị Ả max được ghi trong bảng 2.3. 25 Bảng 2.2: Các hợp chất hydrazon của Glucose tổng hợp được Chất Tên Công thức Công thức cấu tạo H - -C=N—NH—CO I Isonicotinoyl hydrazon của Glucose c ,2h 17o6n 3 Ỏ — N c h 2o h H— c: = II n— Thiosemicarbazon của Glucose nh—c—nh2 II S c 7h 15o5n 3s C:h 2o h III Semicarbazon của Glucose c7h 15o6n 3 H— c:= n —nh—c—nh2 II 0 C:h 2o h H—c: = N—NH IV 2,4- dinitro phenyl hydrazon của Glucose C12H1609N4 : [ ộ C:h2o h r ” - no2 H— C = N — NU— CgH, V Phenyl osazon_của = N— NH— C6Hj c , 8H 220 4n 4 t/ Glucose c h 2o h 26 Bảng 2.3: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại và tử ngoạỉ của các chất tổng hợp được ST T Công thức M Mầu sắc Độ chảy Dung môi (°C) kết tinh Hiệu Phổ tử suất Phổ hồng ngoại ( cm'1) (%) ngoại (nm) Vco_nh=3313,2 cm'1, 0 (^2= 2911,3 cm'1 H—-C=N—NH—CO VC=N= 1650,4 c m 1, v c.car0matic=1571,3 cm 1 I -— ch2oh Ố N 299 Trắng 190-192 Et0H -H 20 (1 : D 38,8 ^OH trongmf=1413,0 cm \V C_Nthơm= 1223,4 cm V H—c = N—NH—c—NH, II S 253 II 0 H a ic o i= 268, 889 1079,4 cm'1, Vpyridin=1025,0 cm'1 Vnh=3345,4 cm'1, v ^ l 619,7 cm 1 Trắng 203-205 EtOH-H2ơ (1 : D 30,83 265, VOH tro n g m f = 1467,4 cm'1, Vc=s=1288,0 cm'1 Ch2oh v oHaicoi=1080^ em ', ỖCH= 795,5 cm'1 27 556 ^co-NH2 ’ vnh=3418,5 cm 1, ÔCH2=2924,0 cm 1 H—c = N—NH—c—NH2 ỈÍ o 237 III Trắng 200-205 47,26 VC=N= 1659,6 cm Et0H-H20 (1 : D ngà c h2oh VOH trongmf= 1460,1 cm 1 Vc_n=1232,8 cm 1, VOII aicoi= 1 103,6 c m 1 Vnh=3351,8 cm'1, 0(^2=2898,5 cm'1 H—c = N—NH N02 IV VC=N= 1624,0 c m 1, v c.caromatic=1517,8 cm'1 360 - Vàng 121-126 EtơH-H20 (1 : D ¥ CH2OH N02 272, 35,54 VN0 2 tham=1422,9 cm'1, V (S)N02= 1343,1 c m 1 354 ^OH aicoi= 1083,0 cm 1, Ôc_h=714,0 cm 1 V nh=3308,2 cm'1, ôcm=2909,2 cm'1 H—C=N—NH—CgHc = N—NH—C6H5 V c=n= 1601,2 cm'1, V c_car0matic=1535,2 cm'1 350 V Vàng 208 EtOH 556, 54,29 ^OH trongmf= 1389,7 cm ch2oh Ôc.h=787,7 c m 1 28 268 , alcol= 1080,0 cm 1 889 2.5. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được Với mục đích tìm ra các chất có triển vọng đưa vào điều trị, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được. 2.5.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tại bộ môn Vi sinh truờng Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được với 5 chủng vi khuẩn kiểm định và 1 chủng nấm theo phương pháp đục lỗ thạch. + Nguyên tắc Dựa trên sự khuyếch tán của chất thử vào môi trường dinh dưỡng có chứa vi sinh vật kiểm định. Nếu chất thử có hoạt tính kháng khuẩn sẽ tạo ra vòng vô khuẩn tỷ lệ với logarit nồng độ tương ứng. + Môi trường Môi trường chúng tôi sử dụng gồm có ^ M ô i trường 1: Môi trường canh thang >"Môi trường 2: Môi trường thạch thường ỉ^Môi trường 3: Môi trường Sabouraud + Vi sinh vật kiểm định Chúng tôi tiến hành thử trên 4 chủng vi khuẩn Gram (+), 1 chủng Gram (-) và một chủng nấm : Bacillus cereus ATTC 21778 Bacillus pumilus ATTC 8241 Bacillus subtilis ATTC 9158 Staphylococcus aureus ATTC 1228 ATTC 75922 ATTC 10231 . Escherichia coli Candida albicans 29 Các chủng vi sinh vật nhận được từ Viện Kiểm nghiệm TW, trước khi thử 24 giờ được cấy vào môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó được chế thành nhũ dịch vi sinh vật có nồng độ khoảng 107- 108 tế bào trong lml. + Các chất đem thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm: Isonicotinoyl hydrazon của Glucose Thiosemicarbazon của Glucose Semicarbazon của Glucose 2,4-Dinitro phenylhydrazon của Glucose + Cách tiến hành Các môi trường được hấp tiệt trùng ở 120°c trong 20 phút. Sau đó để nguội đến 45°C-50°C trộn chủng vi sinh vật kiểm định vào với tỷ lệ 1% để có nồng độ khoảng 106tế bào trong lml (đối với vi khuẩn trộn trong môi trường 2, vi nấm trong môi trường 3), đổ khoảng 15ml-18ml môi trường vào các hộp petri có đường kính như nhau. Sau khi thạch nguội, dùng dụng cụ đục lỗ thạch theo quy định, cho dịch chất thử với lượng như nhau vào các lỗ. Sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 3060 phút để chất thử khuyếch tán vào môi trường. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn sau 18- 20 giờ ở 37°c bằng thước kẹp Palmer. + Kết quả Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của các chất được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn được ghi ở bảng 2.4 trang 31 (Kết quả được lấy của 3 mẫu thí nghiệm). + Nhận xét Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy: các dẫn chất hydrazon của Glucose không có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 30 Bảng 2.4: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các hydrazon ( - ) : Không có tác dụng 2.5.2. Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao[6,14] Tại khoa Vi sinh (Viện lao và bệnh phổi) chúng tôi đã tiến hành thử độ nhậy cảm của các chất tổng hợp được với vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) theo phương pháp tỷ lệ Cannetti- Grocet. Chúng tôi chọn 4 chất là dẫn chất của Glucose, đem thử với chủng Mycobacterium tuberculosis h 37r v , các chất này cũng được thử với chủng Mycobacterium tuberculosis đã kháng INH. + Nguyên tắc Tính tỷ lệ vi khuẩn lao sống sót trong môi trường có chứa chất thử so với số vi khuẩn lao trong môi trường đối chứng không có chất thử. + Môi trường Môi trường chúng tôi sử dụng để thử tác dụng vói vi khuẩn lao là môi trường Lowenstein-Jensen có thành phần như sau: KH2P 0 4 2,4g 31 Magie citrat 0,6g Glycerin 12ml Bột khoai tây 30g Nước cất 600ml MgS04.7H20 0,24g Asparagin 3,6g Malachite green 2% 20ml Trứng đồng nhất 1000ml Môi trường được đổ vào ống nghiệm (loại 20 X 150mm có nắp xoáy) và làm đông ở 85°C-90°C trong 50 phút. Sau đó tiệt trùng ở 37°c trong 48 giờ. + Vi khuẩn kiểm định Mycobacterium tuberculosis H37RV. Mycobacterium tuberculosis lấy từ bệnh nhân đã kháng INH. Các chủng vi khuẩn này được chế thành nhũ dịch có nồng độ lmg/ml. Từ nhũ dịch này pha thành các nhũ dịch có nồng độ lO 'mg/ml (tương đương 107 vi khuẩn), 10'3mg/ml (tương đương 105 vi khuẩn), 10'5mg/ml (tương đương 103 vi khuẩn). + Các chất đem thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao Chất I: Isonicotinoyl hydrazon của Glucose. Chất II: Thiosemicarbazon của Glucose. Chất III: Semicarbazon của Glucose. Chất IV: 2,4-dinitrophenylhydrazon của Glucose. Chúng tôi tiến hành thử đối chứng vói isoniazid. + Tiến hành Các ống nghiệm có chứa môi trường nuôi cấy chuẩn bị theo công thức ở trên được cho thêm dung dịch chất thử. Mỗi chất được thử ở 3 nồng độ vi khuẩn khác nhau của 1 chủng vi khuẩn (nồng độ 1 0 1, 10‘3,10"5mg/ml) bằng 32 cách cấy 0,2ml nhũ dịch vi khuẩn ở các nồng độ tương ứng vào ống môi trường đã có chất thử. Để vào tủ ấm 37°c. Kiểm tra nhiễm trùng sau 24 giờ, 48 giờ, 1 tuần. Song song trong cùng điều kiện thử với mẫu chuẩn không có dung môi và chất thử. Đọc kết quả sau 40 ngày bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc ở các ống chuẩn, ống có chất thử. Kết quả được đánh giá là có tác dụng chống vi khuẩn lao khi: Có khuẩn lạc mọc ở ống chứng (ống chuẩn). Không có khuẩn lạc mọc ở các ống có chứa chất thử. Sau đây là bảng kết quả thử test nhậy cảm trên vi khuẩn lao được tiến hành trên chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV và trên chủng đã được xác định là kháng isoniazid ( bảng 2.5,2.6 trang 34). ♦ Kết quả: - Với chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV: Chỉ có isonicotinoyl của Glucose là thể hiện tác dụng. Còn lại các chất II, III, IV đều không thể hiện tác dụng. - Với chủng vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis được xác định là kháng isoniazid: isonicotinoyl của Glucose thể hiện tác dụng ở nồng độ pha loãng cao của vi khuẩn (10'5mg/ml). Các chất II, III, IV đều không thể hiện tác dụng. 33 Bảng 2.5: Kết quả thử test nhậy cảm vói vi khuẩn lao trên chủng chuẩn H37RV Chủng H37RV ở các nồng độ pha loãng Chất thử 10-yg/ml 103|0.g/ml + I 10'5|j,g/ml + + II — — — III — — — IV — — — — — — Isoniazid Bảng 2.6: Kết quả thử test nhậy cảm vói vi khuẩn lao trên chủng kháng INH Chủng H37RV ở các nồng độ pha loãng Chất thử lO ^g/m l 10"3|Lxg/ml 10"5|ug/ml I — — + II — — — III — — — IV — — — — — — Isoniazid (+ ): Có tác dụng; ( - ) : Không có tác dụng 34 2.6. Bàn luận và nhận xét kết quả 2.6.1. Về tổng họp hoá học - Chúng tôi đã điều chế Glucose từ tinh bột bằng phương pháp thủy phân. - Từ Glucose, chúng tôi thực hiện phản ứng ngưng tụ loại nước với 5 hydrazin thế, thu được 5 hydrazon tương ứng trong đó có 4 chất chưa thấy có trong các tài liệu tham khảo được, đó là chất I, II, III, IV. - Các hydrazon tổng hợp được đều là chất rắn kết tinh, có mầu từ trắng ngà đến vàng, dạng tinh thể hình kim. - Phản ứng ngưng tụ được thực hiện trong dung mồi ethanol tuyệt đối, đây là một dung môi phân cực có tác dụng làm tăng khả năng phân cực của liên kết carbonyl, tạo điều kiện cho phản ứng xảy ra dễ dàng hơn. - Hiệu xuất của phản ứng không chỉ phụ thuộc vào xúc tác, dung môi, 4 ung~mỏi keTtinhlaj) thời gian, nhiệt độ phản ứng mà còn phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của các hydrazin. 2.6.2. Thăm dò tác dụng sinh học + Tác dụng kháng khuẩn kháng nấm Các hydrazon tổng hợp được đều không có tác dụng trên 5 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm kiểm định. + Test nhậy cảm với vi khuẩn lao Từ kết quả có thể rút ra một số nhận xét sau: - Hydrazon của isoniazid đều thể hiện tác dụng trên hai chủng vi khuẩn. - Hydrazon của các hydrazin thế khác không có tác dụng trên hai chủng vi khuẩn. Tuy nhiên tất cả những nhận xét trên đây mới chỉ là thăm dò sơ bộ mang tính chất định tính. Để đưa ra được những kết luận chính xác cần phải lặp lại phép thử nhiều lần và mang tính chất định lượng. Nhưng vì thời gian và điều kiện không cho phép, chúng tôi chưa thể thực hiện được thử nghiệm có tính chất chuyên sâu hơn. 35 'S ' KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT • Từ những kết quả thực nghiệm đã trình bày ở trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Đã điều chế được Glucose đạt tiêu chuẩn dược điển. 2. Tổng hợp được 5 dẫn chất hydrazon của Glucose trong đó 4 dẫn chất chưa thấy công bố trong các tài liệu đã tham khảo, cụ thể là các chất I, II, III, IV. Tất cả các chất tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác nhận bằng phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại. Kết quả thu được cho phép chúng tôi kết luận rằng các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến. 3. Đã thử tác dụng kháng khuẩn của 4 chất tổng hợp được đối với 5 chủng vi khuẩn kiểm định và 1 chủng nấm Candida albicans. Kết quả cho thấy các chất đều không có tác dụng. 4. Thử test nhạy cảm với vi khuẩn lao của 4 dẫn chất isonicotinoyl hydrazon của Glucose: Đối với chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV. Kết quả chỉ có dẫn chất isonicotinoyl của Glucose có tác dụng, các dẫn chất khác không có tác dụng. Đối với chủng Mycobacterium tuberculosis đã được xác nhận là kháng isoninazid. Kết quả dẫn chất isonicotinoyl của Glucose có tác dụng ức chế vi khuẩn ở nồng độ 10"5mg/ml, ở các nồng độ khác không có tác dụng. Các dẫn chất II, III, IV không có tác dụng. Với điều kiện có hạn cả về thời gian và kinh phí, cùng với sự nỗ lực của thầy và trò, chúng tôi đã thực hiện thành công đề tài này. Chúng tôi hy vọng rằng, các hydrazon sẽ tiếp tục được nghiên cứu ở mức độ chuyên sâu hơn theo các hướng khác nhau nhằm phát hiện ra những chất có thể được ứng dụng trong lâm sàng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Hoá hữu cơ (1990), Hoá hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, tr.309-337. 2. Bộ Y tế (2000), Dược điển Việt Nam ///, Nxb Y học Hà Nội, tr.128-130. 3. Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Ngô Mai Anh, Nguyễn Thị Thủy (2000), ‘Tổng hợp và tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5-( 5 Nitro-2 -Furfuryliden)- Thỉazolidỉn-2,4-dion và dẫn chất”, Tạp chí dược học, SỐ1 0 , t r . 1 2 - 1 4 . 4. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân, Lê Thị Tập (2000), “Nghiên cứu tác dụng chống lao của một số dẫn chất thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen isatirì\ Tạp chí dược học, số 8, tr.15-17. 5. Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1984), Nguyên lý tổng hợp thuốc hữu cơ, Nxb Y học Hà Nội, tr.65-224. 6. Nguyễn Khang, Phạm Gia Khôi, Trần Mạnh Bình, Nguyễn Thị Liên, Nguyễn Thị Lý, Nguyễn Thị Như Mai (1975), ”Nghiên cứu về các isonicotinoyl hydraion cỏ tác dụng kháng vi trùng lao ”, Thông báo khoa học số 22, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 15-32. 7. Hoàng Hướng Quỳ (1986), Báo cáo kết quả nghiên cứu sản xuất đường mật tinh bột theo phương pháp enzym, Bộ công nghiệp thực phẩm, tr. 2-8. 8. Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1980), Cơ sở hoá học hữu cơ, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, tập 2, tr.98-110. 9. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thúy (2002), Thuốc biệt dược và cách sử dụng, Nxb Y học Hà Nội, tr.436-901. 10. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 1, tr.28-32. 11. Từ điển bách khoa Dược học (1999), Nxb Từ điển Bách khoa, tr.272. 12. Vũ Trần Anh (2001), Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất isoniazid và thử tác dụng sinh học, Luận văn thạc sỹ dược học, tr.6-9. 13. H er M ajetsty’s Stationery office (1998) British pharmacopoeia The Stationery office, p.642-643. 14. Cannetti G., Froman s. Grosset J. (1963), “Mycobacteria: Laboratory methods fo r testing drug sensitility and resistence”, Bull. WHO (29), p.565578. 15. Jerry March (1977), Advanced organic chemistry: Reaction, mechanism and structure, Me Graw-hill book company, Newyork, St.Louis San Francisco, Toronto, London, Sydney, p.308-1096. 16. Kathleen Parfitt (1999), Martindale-The complete drug reference Martindale, Pharmaceutical Press, p. 1343-1344. 17. Susan Budavari (2001), The Merck Index, Merck and Co, .Inc, p.5781669. 18. Swiss Pharmaceutical Society (2000), Index Norminum 2000, Med Pharm Scientific Publisher, p.494-963. 19. US Pharmacopeial Convention, Inc(1999), pharmacopeia 24 -The National formulary, p.531-532. The United States PHỤ LỤC TRANG 1 — 7 ABS 1.43077 - 0 . 0 0 0 3 _ABS____________ NM 268.889 Samp.0 1 -X . Bach/DHF Gain 109 SBU Basel ine______ OFF Page 9 May 2003 Z.0 3 4 0 0 . 0 0 ________ HU DISPLAY DATA 2.0000 1.6000. H— C = N — NH— CO 1 . 2000 . 0.8000- CH2OH 0.40000.0000J 200.00 240.00 280.00 fiBS 0.0800 -> 2.0000 B aselin e Erase Uieu R e-sca le Zoom Use the graphics cu rsor, tra ck , slo p e _____ ABS 0 . 65507 NM 265 . 556 . - 0 . 0 0 3 7 g W - 02- x -B»':J ^ nF Page •ÂBS_______________ Basel ine_____ OFF 320.00 MM Label 360.00 ZBB.B9 -> More 1— _l 400.00 489.00 9^May 2003 4 0 0 . 0 0 3__________________________________m ABS : 0.0000 -> 1.0000 MM : 200.00 -> 400.00 I Basel ilie Erase Uieu R e-sca le Zoom SCTHcfflB Label More Use the graphics cu rsor, tra ck , slo p e ___________________________________________ ABS ABS: - 0.50538 0.21600 0.0001 flBS____________ NM NM 354.444 272.222 3 May 2003 2 .0 3____________ Samp. 04-X . Bach/DMF Gain 84 SBU Page Basel ine_____OFF 5 5 0 . 0 0 ___________ tin DISPLAY DATA 1.0000 0.8000. 0.6000. 0.4000. 0 . 2000 - V 0.0000- 1 200.00 __ I 380.00 ------ 1---- ~i— ------- 1-------------1---------400.00 500.00 ftHS : 0.0008 u .m m m Z00.00 -> _ABS______________ -> l.HHHH 1.BB89_______MB_________ :: 290.00 Basel ilie Erase Ụieu R e-sca le Zoom '?TT»3ĨTĨ Label More ABS ABS ABS 0 . 55230 0 . 29992 0 .23690 NM NM NM 550.00 395.556 307.778 268.889 ♦ QQQ1 - 0 . t J c j tJ -L ABS Sanp.05-X.Bach/DMF Gairi 84 SBU B a se lin e OFF Page 9 Nay 2003 2 .0 3 5 5 0 . 0 0 NM DISPLAY DATA 1.0000 ' 0.8000. H—C=N—NH— ƠH5 : N— NH— C«H5 » 0.6000. 0.4000- / ch2oh 0 .2000 0 . 0000 200.00 300.00 400.00 1 500. 00 hBS : 0.00H0 0.0808 -> 1.0000 NM : 200.00 Z00.00 -> Basel i lie Erase Uieu R e -sc a le Zoom BTTHffl Label More Use th e graphics cu rsor, tr a c k , s lo p e ___________________ 550.00 I UJ CD CO £D ooi-d.,1 — CD ^Ơ1_1 Ẽi is ị ro C esD Ii ® j 2911.3— oGD 03/05/15 09:05 Phong TNTT-DH Duoc X: 1 scan, 4 .0 c m -l, -flat, smooth Samp. 01-X .B ach/H c ro 1500 1000 cm'1 500 H— c = N— NH— c— NH2 _u PERKIN ELM ER 2 4 .0 1 XI ch 2o h /Ạ '3: òi -0 .4 Í 4000 3500 30014 —0 3 / 0 5 / 1 5 0 9 :0 9 Phong TNTT-DH Duoc —Y: 1 s c an, 4 . 0cm -l , f l a t , smooth Samp. 02 — JK. Bach/He 0 * * 2500 Ĩs PERKIN ELM ER 3 1 .6 6 - yj — j----------------------------------r ■1.444000 3500 3000 0 3 / 0 5 / 1 5 0 9 :1 4 Phong TNTT-DH Duoc Z; 1 scan, 4 . 0CIH-1, smooth------------samp. 03“J[...]... cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều có tác dụng mạnh trên chủng Mycobacterium tuberculosis H37RV Ngoài ra có 6 dẫn chất của 3isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5- halogen isatin có tác dụng cả trên chủng vi khuẩn lao đã kháng isoniazid [4] + Các tác dụng khác Ngoài các tác dụng chính kể trên một số hydrazon còn có tác dụng chống khối u, chống viêm, chống virus, chống ký sinh trùng như : i^Bis... cơ để điều chế các chất như dự kiến: >- Điều chế Glucose từ tinh bột bằng phương pháp thủy phân acid >- Tổng hợp các dẫn chất hydrazon của Glucose bằng phương pháp ngưng tu giữa nhóm carbonyl và các hydrazin thế - Theo dõi quá trình/bằng SKLM - Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy - Xác nhận cấu trúc các chất tổng hợp được dựa trên phân tích phổ IR, u v - Thử tác dụng. .. sinh học của các chất tổng hợp được Với mục đích tìm ra các chất có triển vọng đưa vào điều trị, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 2.5.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tại bộ môn Vi sinh truờng Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được với 5 chủng vi khuẩn kiểm định và 1 chủng nấm theo phương... Cổ^đặc Kết tinh ị - Lọc hút -ị Tua Dich U ị Sấy Loc hút , Sản fphẩm í T ịa EtOH Sấy « T í : sản pham thu hồi 18 2.3 Điều chế dẫn chất hydrazon của Glucose Trong các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon, căn cứ vào các chất dự kiến tổng hợp và căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã chọn phương pháp ngưng tụ Glucose với dẫn chất hydrazin thế Phương trình phản ứng tổng q... kháng nấm của các chất tổng hợp được bằng phương pháp đục lỗ thạch theo quy định trong DĐVNIII Thử tác dụng trên vi khuẩn lao của các chất tổng hợp dựa trên phương pháp thử độ nhậy cảm của vi khuẩn lao với chất thử theo phương pháp tỉ lệ CannettiGrosset 2.2 Điều chế Glucose Trong các phương pháp điều chế Glucose, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi chọn phương pháp thủy phân tinh bột bằng... acetylaminobenzoic) có tác dụng chống lao và đã áp dụng vào thực tế lâm sàng có kết quả tốt với các tên biệt dược như TBI, Corteben, Livazon[9,12,18]: o s J H3C — c —HN—Y II y - C H = N —NH—C —NH 2 Năm 1948 MN Soulina và E Michina đã tổng hợp được một dẫn chất khác của Thiosemicarbazon có tác dụng chống lao lấy tên là Cutizon có công thức như sau[9,12,18]: ? H3/ = \ H 3C—H C ^ s C H = N —NH—C —NH 2 Dãy có tác dụng. .. lấy của 3 mẫu thí nghiệm) + Nhận xét Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy: các dẫn chất hydrazon của Glucose không có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 30 Bảng 2.4: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các hydrazon ( - ) : Không có tác dụng 2.5.2 Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao[6,14] Tại khoa Vi sinh (Viện lao và bệnh phổi) chúng tôi đã tiến hành thử độ nhậy cảm của các chất tổng hợp. .. Chế phẩm phải tan hoàn toàn trong EtOH Cho mầu vàng với dd iod < lppm < 0 , 1% Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml HNO3 +lm l A gN 03+ H20 vđ 50ml không đậm hơn mẫu chứa 0,5ml HC1 0,020N Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml H ơ + 3ml B a ơ 2 + H20 vđ 50ml không đậm hơn mẫu chứa 0,5ml H,S0 4 0,020N Cho mầu vàng với dd iod KQĐ 1.2 Dẫn chất hydrazon 1.2.1 Tác dụng sinh học của dẫn chất hydrazon + Tác dụng. .. trong mặt phẳng 1080,0 c m 1 ^ O H alcol 787.7 cm'1 Ỗc-H 2.4 Tóm tắt kết quả tổng hợp Như vậy chúng tôi đã tổng hợp được 5 dẫn chất của Glucose Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số hằng số vật lý của các chất này Kết quả được trình bầy trong bảng 2.2 và 2.3 Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định bằng phổ hồng ngoại và phổ tử ngoại: + Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật... kháng lao mạnh thứ hai là dẫn chất isonicotinoyl như[9,12,18]: CO— NH— N = H C — | /= \ ỳ —OH OCH3 / Ftivazidỷ, Vanizid^ (Isonicotinoyl hydrazon của 3- metoxy- 4- hydroxy benzandehyd) 10 Năm 2000, các tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân, Lê Thị Tập đã nghiên cứu và thử tác dụng chống lao của một số dẫn chất Thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen isatin Kết ... nhỏ bé vào công việc điều chế Glucose dược dụng tổng hợp số dẫn chất có tác dụng sinh học, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu sau : - Điều chế Glucose từ tinh bột - Tổng hợp số dẫn chất Glucose. .. 0,020N Cho mầu vàng với dd iod KQĐ 1.2 Dẫn chất hydrazon 1.2.1 Tác dụng sinh học dẫn chất hydrazon + Tác dụng kháng khuẩn Đây tác dụng quan trọng dẫn chất hydrazon, đáng ý dẫn chất hydrazon 5-... hành thử tác dụng sinh học chất tổng hợp 2.5.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tại môn Vi sinh truờng Đại học Dược Hà Nội, tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng hợp với chủng