Nghiên cứu tác dụng của aslem lên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào lympho máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

81 245 0
  • Loading ...
1/81 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 07/10/2015, 16:59

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘÌV :.----------------„„oOo------ ’---------NGUYỄN TIẾN THÀNHNGHIÊN c ú u TÁC DỤNG CỦA ASLEM LÊN KHẢNẢNG CHUYỂN DẠNG VÀ CHẾ TIÊT CYTOKINCỦA TẾ BÀO LYMPHO MÁU NGOẠI VI ởBỆNHNHÂN UNG THƯ ĐẠITRựCTRÀNG•••(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 1998-2003)Giáo viên hướng dẫn1. PGS.TS Đào Kim Chi2. ThsNơi thực hiệnNguyễn Hoàng Anh1. Labo Trung tâm Y sinh học, Đại học Y Hà nội2. Khoa Phẫu thuật Tiêu hóa, Bệnh viện Việt Đức3. Khoa Huyết học và Truyền máu, Bệnh viện Việt ĐứcThcd gian thực hiệnTháng 6 năm 2002 - Tháng 4 năm 2003Hà nội tháng 6 - 2003 LỜI CẨM ƠNEm xin bày tỏ lòng biết ơn sâu ỗắc tói PGS.T5 Đào Kim Chi, TheNguyễn Hoàng Anh, những người thầy luôn tận tình hướng dẫn em thựchiện luận văn nầy.Em xin cảm ơn 5ự hướng dẩn, hấ trợ kỹ th uậ t của GS.T5KH PhanThị Phi Phi, TS Bạch Khánh Hòa cùng các cán bộ, kỹ th u ậ t viền tạiLabo Trung tâm y sinh học- Đại học Y Hà nội.Em xin cảm ơn ỗự giúp đỡ của GS.TS Đẽ Đức Vằn, tập th ể các bácõTvà y tá Khoa Phẫu th u ậ t tiêu hóa, cắc bác sĩ và y tá Khoa Huyếthọc và Truyền máu E3ệnh viện Việt Đức.Cuối cùng em xin cầm ơn I3an giám hiệu, cấc phòng ban, bộ môntrường Đậ\ học Pược Hà nội ảã tạo mọi điểu kiện thuận lợi cho emtrong ơịuấ trình học tập và thực hiện khóa luận tạ i trường.Hà Nội tháng 6 năm 2003Nguyấn Tiấn Thành CÁC CHỮ VIẾT TẮTADCC A. Phản ứng gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể '1/ j (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)^“BCGFYếu tố phát triển tế bào B (B Cell Growth Factor)CDCụm biệt hóa (cluster of differenciation)CMIĐáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Cell Mediated Immuneresponse)CRPProtein c Phản ứng (C Reactive Protein)cscộng sựĐTBĐại thực bàoĐTTĐại trực tràngICAMPhân tử kết dính tế bào (Inter-Cellular Adhesion Molecule)ELInterleukinLAKCác tế bào diệt được hoạthóa bởi lymphokin (Lymphokin ActivatedKiller cell)LFAKháng nguyên chức năng của tế bào lympho (Lymphocyte FunctionalAntigen) ị-lNKPhức hơp hòa hơp tổ chức (Major Histo-compatibility Complex)fc Tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer Cell)PBMCTế bào đơn nhân máu ngoại vi (Peripheral blood mononuclear cell)RPMIRoswell Park Memorial InstituteTAAKháng nguyên liên kết vói khối u (Tumor Associated Antigen)TcTế bào lympho T gây độc (T Cytotoxic)TCGFYếu tố phát triển tế bào T (T Cell Growth Factor)TCRReceptor của tế bào T (T cell receptor)TGFYếu tố kích thích chuyển dạng và phát triển (Transform Growth Factor)ThTế bào T trợ giúp (T Helper)TsTế bào T ức chế (T Suppressor)TSAKháng nguyên đặc hiệu cho khối u (Tumor Specific Antigen)MHC MỤC LỤCTrangDanh mục các chữ viết tắtĐẬT VẤN ĐỀPHẦN 1. TỔNG1.1.Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch.................................111.1.1.Tếbàolym phoT..................................................................11.1.2.Các tế bào trình diện khángnguyên.......................................21.1.3.Tế bào lympho B ..................................................................41.1.4.Các tế bào hiệu ứng của đápứng miễn dịch tế bào.................5Cytokin........................................................................................51.2.1.2.1.Khái niệm về cytokin ..........................................................61.2.2.Cytokin receptor...................................................................91.2.3.Cytokin type I và cytokin type n ...........................................121.2.4.Interleukin-2 ........................................................................141.2.5.IFNy......................................................................................151.2.6.Interleukin-4 ........................................................................161.2.7.Interleukin-10......................................................................17 1.3.Miễn dịch trong ung thư ..............................................................181.3.1.Kháng nguyên ung thư ........................................................181.3.2.Đáp ứng miễn dịch chống lại khối u .....................................191.3.3.Suy giảm miễn dịch trong ung thư........................................23Miễn dịch trị liệu trong ung thư....................................................251.4.1.4.1.Mục đích của miễn dịch trị liệu............................................251.4.2.Cơ chế chung của các thuốc kích thích miễn dịch..................261.4.3.Aslem...................................................................................27PHẦN 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u302.1.Đối tượng nghiên cứu..................................................................302.2.Phương pháp nghiên cứu........................... ...................................312.2.1.Ghi nhận thông tin và lấy m ẫu..............................................312.2.2.Tách và nuôi cấy PBMC........................................................322.2.3.Thu hoạch môi trường và tế bào sau 48giờ nuôi cấy..............342.2.4.Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng........................................342.2.5.Định lượng cytokin trong môi trường nuôi cấy......................352.2.6.Sử lý số liệu ..........................................................................37 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u383.1.Đặc điểm nhóm bệnh nhân và nhóm chứng.................................383.2.Tỷ lệ chuyển dạng tế bào lympho sau 48 giờ nuôi cấy..................403.3.Nồng độ cytokin trong nước nổi nuôi cấy....................................41PHẦN 4. BÀN LUẬN504.1.50Về suy giảm đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng4.1.1.Suy giảm đáp ứng chuyển dạng............................................504.1.2.Rối loạn cân bằng T hl-T h2...............................................514.2.Về tác dụng của thuốc...................................................................KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤTTÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC5459 ĐẶT VẤN ĐỂUng thư là bệnh lý ác tính đang chiếm tỷ lệ khá cao và tử vong là chắc chắnnếu không được điều tn tốt. Mặc dù có nhiều tiến bộ trong từng lĩnh vực điều trị:phẫu thuật, tia xạ và hóa chất, song cho tới nay tiên lượng bệnh vẫn chưa đượccải thiện đáng kể. Vì vậy, xu hướng của thế giới hiện nay là sử dụng phác đồ đatrị liệu để phối hợp và nâng cao hiệu quả cao nhất của mỗi phương pháp.Kể từ khi Bumet đưa ra thuyết “cảnh giác miễn dịch” (1957), miễn dịch trị liệuđã chính thức được công nhận là một trong những phương pháp bổ trợ chủ yếuđiều trị ung thư.Với sự phát triển của sinh học phân tử và miễn dịch học, người ta đã hiểu biếtnhiều hơn về cấu tạo cũng như chức năng của hệ thống miễn dịch, cơ chế bệnhsinh cũng như vai trò của miễn dịch trong sinh bệnh học ung thư. Đây cũng là cơsở để sử dụng các chất kích thích miễn dịch, đặc biệt là những chất kích thíchmiễn dịch không đặc hiệu trong điều trị ung thư.Ở Việt Nam, Aslem là một aminoacylsteroid tổng hợp đã được sử dụng trênlâm sàng ung thư từ hơn 20 năm nay với tác dụng kích thích miễn dịch không đặchiệu, cho thấy những kết quả rất đáng khích lệ. Tuy nhiên, những nghiên cứu vềdược lý đặc biệt là miễn dịch còn rất khiêm tốn.Vì vậy, với mong muốn nghiên cứu sâu thêm về dược lý miễn dịch lâm sàngcủa Aslem trong ung thư đại trực tràng, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứuảnh hưởng của Aslem lên khả năng chuyển dạng và chê tiết cytokine của tếbào lympho máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng” vời hai mục tiêucụ thể như sau: 1. Nghiên cứu tình trạng suy giảm miễn dịch ở bệnh nhân ung thư đại trựctràng thông qua khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào lymphomáu ngoại vi.2. Nghiên cứu in vitro khả năng phục hồi đáp ứng miễn dịch nói trên củaAslem ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. PHẦN 1. TỔNG QUAN1.1.Các tê bào tham gia vào đáp ứng miễn dịchCon người sống được và tồn tại được trong môi trường có rất nhiều tác nhângây bệnh chính là nhờ có hệ thống miễn dịch. Miễn dịch là khả năng nhận biết vàloại bỏ các tác nhân lạ đối với cơ thể để giúp cho cơ thể chống đỡ lại bệnh tật.Có hai hình thức đáp ứng miễn dịch: đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và đáp ứngmiễn dịch không đặc hiệu.- Miễn dịch không đặc hiệu là đáp ứng chung đối vói mọi kháng nguyên xâmnhập vào cơ thể thông qua các cơ chế không đặc hiệu, trong đó có sự tham giacủa các yếu tố thể dịch (lysozome, protein c phản ứng, bổ thể, interferon...) và tếbào (đại thực bào, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưabazơ, tế bào diệt tự nhiên..).- Miễn dịch đặc hiệu là đáp ứng đặc hiệu với kháng nguyên, có sự tham gia vàtương tác giữa các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, trong đó tế bào lympho T trợgiúp (Th) đóng vai trò trung tâm điều khiển các đáp ứng.1.1.1. Tế bào lympho TLympho T phát triển từ tế bào gốc ở tủy xương thành tiền tế bào T, được gọi làtế bào tiền ức; sau đó được “huấn luyện”, chọn lọc và biệt hóa tại tuyến ức thànhcác dưới nhóm tế bào T trưởng thành, đưa vào lưu hành trong máu ngoại vi.Màng tế bào lympho T có các thụ thể gọi là TCR (T Cell Receptor) có chứcnăng gắn kháng nguyên đã được bộc lộ trên bề mặt các tế bào trình diện khángnguyên. TCR đặc hiệu cho từng tế bào T, có nhiều dòng tế bào T trong máungoại vi đủ để đáp ứng với sự đa dạng của kháng nguyên. Dấu ấn kháng nguyên CD3+ (CD: Cluster of Differentiation) đặc trưng cho cáclympho T. Ngoài ra, các dưới nhóm lympho T có thêm những dấu ấn đặc trưngriêng:• TCD4+ là tế bào T trợ giúp (THelper- TH). Phân tử CD4 có chức năng nhândiện kháng nguyên được trình diện bởi phức hợp hòa hợp tổ chức lớp II, (MHC n- Major Histocompatibility Complex class n).• TCD8+ biệt hóa thành tế bào T gây độc (Tcyt0t0xic-Tc) hoặc tế bào T ức chế(Tsuppressor-Ts). Phân tử CD8 có chức năng nhận diện kháng nguyên được trình diệnbởi phức hợp hòa hợp tổ chức lớp I, (MHCI).Sau khi trưởng thành từ tuyến ức, mỗi tế bào T chỉ mang một dấu ấn của dướinhóm CD4 hoặc CD8.Quần thể tế bào T trợ giúp được phân chia thành hai dưới nhóm là Thl và Th2,điều hòa đáp ứng miễn dịch đặc hiệu theo hai hướng khác nhau và điều biến lẫnnhau: đáp ứng miễn dịch thể dịch (HI - Humoral Immune Response) và đáp ứngmiễn dịch qua trung gian tế bào (CMI - Cell Mediated Immune Response).Ngoài các cụm biệt hóa, màng tế bào lympho T còn có các phân tử đồng kíchthích (Costimulator molecule), receptor của bổ thể, cytokin, hormon...1.1.2. Các tế bào trình diện kháng nguyên (APC - Antigen Presenting Cell)Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu được khởi động bởi việc thâu tóm và trình diệnkháng nguyên của các tế bào trình diện kháng nguyên, quá trình này có thể đặchiệu hoặc không đặc hiệu.APC là những tế bào có khả năng xử lý, trình diện kháng nguyên cho lymphoT bao gồm đại thực bào, lympho B, tế bào tua (dendritic cell),... Chức năng trìnhdiện kháng nguyên được thực hiện bởi các phức hợp hòa hợp tổ chức cùng với các phân tử đồng kích thích trên màng tế bào. MHC n trình diện kháng nguyêncho tế bào T CD4+, MHCI trình diện kháng nguyên cho tế bào T CD8+.• Đại thực bào (ĐTB)ĐTB thuộc loại đơn nhân thực bào (mononuclear phagocyte), phát triển từ tếbào gốc ở tủy xương thành monoblast, promonocyte sau đó trở thành monocytelưu hành trong máu ngoại vi. Các monocyte di chuyển vào các mồ phát triểnthành đại thực bào. Tại các tổ chức, đại thực bào mang nhiều tên gọi khác nhau:tế bào histocyte, tế bào Kuffer, tế bào microglia... Đại thực bào tham gia vào đápứng miễn dịch không đặc hiệu, đổng thời trình diện kháng nguyên để khởi độngđáp ứng miễn dịch đặc hiệu.Các kháng nguyên lạ bị đại thực bào nuốt vào nội bào, chứa trong phagosome.Sau đó các lyzosome tiến tói hòa màng vói phagosome tạo thành phagolyzosome.Lyzosome giải phóng ra enzym, các yếu tố gây độc với kháng nguyên để tiêu diệtkháng nguyên, thủy phân kháng nguyên phức tạp thành các mảnh nhỏ.Sau khi được thâu tóm và sử lý, các mẩu kháng nguyên đặc trưng cho tác nhângây bệnh sẽ được trình diện lên màng ĐTB tại nơi có MHC lớp n.Các .nhóm quyết định kháng nguyên này được gắn đặc hiệu với TCR của tếbào T thích hợp tạo thành liên kết KN-TCR giữa đại thực bào và tế bào T. Phântử CD4 trên màng tế bào T cũng đến gắn với MHC trến màng ĐTB, tạo thànhphức hợp bền vững. Tuy nhiên, phức hợp này chưa đủ để kích thích tế bào T màcòn cần có thêm liên kết giữa các phân tử đồng kích thích với phối tử (ligand)tương ứng trên màng hai tế bào như:■LFA1 (Lymphocyte Functional Antigen: kháng nguyên chức năng của tếbào lympho) trên màng tề bào T gắn với ICAM 1 (Intercellular AdhesionMolecule: phân tử liên kết tế bào) trên màng đại thực bào. t-■ CD2 trên màng tế bào T gắn với LFA3 trên màng đại thực bào.Phức hợp tạo thành sẽ kích thích đại thực bào giải phóng IL-1 đồng thời kíchthích lympho T giải phóng IFNy và IL-2. IFNy hoạt hóa đại thực bào, làm tăngđộc tính của ĐTB vói kháng nguyên, tăng tổng hợp và biểu hiện MHC lớp n đểtăng cường trình diện kháng nguyên. IFNy cũng kích thích các đại thực bào khácsẵn sàng tiêu diệt kháng nguyên. IL-2 được tế bào T chế tiết hoạt động theo kiểuautocrin kích thích phát triển dòng tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên đó. Quátrình này được gọi là “nhân dòng tế bào” (colonal expansion). IL-2 cũng tác dụngtheo kiểu paracrin, kích thích đại thực bào, gây tăng độc tính sẵn sàng tiêu diệtkháng nguyên.1.1.3. Tế bào lympho BTế bào lympho B đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch thể dịch. Tếbào lympho B lưu hành trong máu chưa có khả năng sinh kháng thể, chỉ khi cóđáp ứng với sự kích thích của kháng nguyên thì mới phát triển và biệt hóa thànhcác tương bào (plasma cell) có khả năng tổng hợp và tiết kháng thể đặc hiệu.Màng tế bào lympho B có thụ thể của lympho B (BCR: B Cell Recetor), các phântử MHC lớp I và MHC lớp n. BCR là các globulin miễn dịch bề mặt (SIg-SurfaceImmunoglobulin) hoạt động như các thụ thể tiếp nhận kháng nguyên đặc hiệuvới tế bào B.Các kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (thường là các polysaccarid cócác nhóm quyết định kháng nguyên lặp lại nhiều lần) có thể trực tiếp kích thíchlympho B biệt hóa và sinh kháng thể. Lympho B đáp ứng với các kháng nguyênphụ thuộc tuyến ức qua trung gian của tế bào lympho TH.KN vào cơ thể cũng bị thâu tóm bởi lympho B thích hợp do liên kết đặc hiệucủa kháng nguyên với BCR trên màng lympho B. Kháng nguyên bị nuốt vào nội-4- bào, xử lý và trình diện trên màng tế bào cùng với phân tử MHC lớp n. Quá trìnhdiễn ra như đối với ĐTB, nghĩa là cũng tạo ra phức hợp liên kết bền vững MHCKN-TCR và CD4. Tuy nhiên có sự khác biệt về các phân tử đồng kích thích vàcytokin tham gia vào đáp ứng, ví dụ :■ LFA1 trên màng lympho T gắn với ICAM 1 trên màng lympho B■ CD40 ligand trên màng lympho T gắn với CD40 trên màng lympho B■ CD28 trên màng lympho T gắn vói CD80 trên màng lympho BPhức hợp tạo thành có tác dụng kích thích lympho T tiết IL-4, IL-6 và IL-10.Các cytokin này sẽ hoạt hóa lympho B, kích thích sự biệt hóa thành tương bàosản xuất ra kháng thể đặc hiệu.1.1.4. Các tế bào hiệu ứng (effector cell) của đáp ứng miễn dịch đặc hiệuCác tế bào được coi là có tác dụng gây đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bào gồm :- Lympho B phát triển thành các tương bào sản xuất kháng thể đặc hiệuchống lại kháng nguyên, gây ra đáp ứng miễn dịch thể dịch.- Các tế bào như đại thực bào, NK, tế bào Tc gây ra đáp ứng miễn dịch quatrung gian tế bào.1.2. CytokinKhi nghiên cứu hiện tượng tế bào chống lại sự xâm nhập của virus lần thứ haisau lần nhiễm đầu tiên, hai nhà khoa học người Anh là Isaac và Lindenmann đãphát hiện ra một protein có tác dụng kháng virus. Họ đã chứng minh rằng nếuthêm vào mồi trường nuôi cấy tế bào các virus chết thì mồi trường nuôi cấy đó cốkhả năng kích thích các tế bào khác chống lại sự xâm nhập của virus đó. Sau đố,năm 1957 họ đã tách được protein có tác dụng kháng virus nói trên và đặt tên làinterferon . Đó là Cytokin đẩu tiên được phát hiện [61]. Hình 1.1. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào1.2.1. Khái niệm về cytokin- Định nghĩa, vai tròKhi gặp một tín hiệu kích thích (các kháng nguyên vi khuẩn, virus, ung thư,..),tế bào miễn dịch chế tiết ra các protein truyền tin đóng vai trò điều hòa đáp ứngmiễn dịch. Các protein đó được gọi là cytokin [20],[43],[61].Cytokin là những glycoprotein có trọng lượng phân tử thấp (8-80 kDa), donhiều loại tế bào trong đó có tế bào lympho sản xuất khi có đáp ứng với một sựtrình diện kháng nguyên. Cytokin kích thích sự phát triển, biệt hóa và hoạt hóacác tế bào có thẩm quyền miễn dịch, điều hòa (âm hay dương) các đáp ứng miễndịch thể dịch và đáp ứng miễn dịch tế bào.-6- - về danh phápCytokin là từ ghép của “cyto” và “kin” (Kinin like), nghĩa là các chất có nguồngốc tế bào và có tác dụng kiểu kinin. Các cytokin được đặt tên dựa theo nguồngốc. Những cytokin được lymphocyte chế tiết gọi là lymphokin, được monocytechế tiết gọi là monokin. Song cũng có các cytokin do nhiều loại tế bào chế tiết, vìvậy danh từ cytokin vẫn được ưa dùng hơn cả. Mặt khác, do được sản xuất chủyếu bởi bạch cầu (leucocyte) và có tác dụng lên các bạch cầu khác trong hệ thốngmiễn dịch nên một số cytokin được gọi là Interleukin (EL) (yếu tố trung gian giữacác bạch cầu). Tuy nhiên cũng có những cytokin có nguồn gốc và tác dụng tươngtự nhưng không được gọi là Interleukin (ví dụ các interferon, các yếu tố hoại tửkhôi u TNF,..), ngược lại có các cytokin được gọi là interleukin nhưng lại cónguồn gốc và tác dụng lên các tế bào khác chứ không phải bạch cầu. Vì vậyInterleukin không thể thay thế hoàn toàn thuật ngữ cytokin.Để tạo thuận lợi trong thông tin và cho các nghiên cứu sau này, hội nghị quốctế về Miễn dịch học lần thứ 6 (1986) đã qui định giữ nguyên danh pháp ban đầucủa các cytokin (thường được đặt theo tác dụng sinh học khi mói phát hiện), saukhi đã xác định được cấu trúc phân tử và trình tự acid amin thì các cytokin đó sẽđược đặt thêm một tên gồm hai thành phần kiểu IL-X trong đó X là chữ số chỉthứ tự của các cytokin mới được phát hiện.Hiện nay, cytokin được sử dụng ngày càng nhiều trong các nghiên cứu cũngnhư ứng dụng trên lâm sàng với tác dụng kích thích hoặc ức chế miễn dịch. Vìvậy chúng còn được xếp vào nhóm các chất điều biến sinh học (biologicalresponse modifiers). - Đặc điểm của cytokin• Sản xuất và chế tiết : Trong cơ thể các cytokin thường được sản xuất vóilượng nhỏ, hơn nữa lại có thời gian bán hủy ngắn nên nồng độ trong máu ngoạivi thường rất thấp, nhiều khi không thể phát hiện được. Chỉ khi có tín hiệu kíchthích tới tế bào thì gen mã hóa cho cytokin mới được hoạt hóa, sao mã và giảimã. Cytokin được tổng hợp trong khoảng thòi gian rất ngắn và nhanh chóng giảiphóng ra ngoại bào để có những đáp ứng thích hợp.• Nguồn gốc và tác dung: Cytokin có thể tác dụng lên nhiều loại tế bào, gâyra các đáp ứng sinh học khác nhau. Đây là một trở ngại lớn khi đưa cytokin vàotrị liệu bởi để có được một tác dụng mong muốn thì thuốc có bản chất cytokin sẽgây ra nhiều tác dụng không mong muốn. Ngược lại, có nhiều cytokin có thểcùng thể hiện một tác dụng lên một loại tế bào. Do đó nếu phát triển một thuốcđối kháng đặc hiệu với một cytokin nào đó thì sẽ khó thu được tác dụng mongmuốn vì sẽ có tác dụng bù trừ của các cytokin khác.• Mốt cvtokin thường cổ ảnh hưỏng tới sư tổng hơp và tác dung của cáccvtokin khác. Nó. có thể kích thích hoặc ức chế tổng hợp các cytokin khác, gây ra“dòng thác” các đáp ứng sinh học (cascade of biological effects). Các cytokinchế tiết sau có thể điều hòa (âm hoặc dương) tác dụng của cytokin được chế tiếttrước đó. Hai cytokin có thể có tác dụng đối lập (antagonize) hoặc hiệp đồngcộng (additive effect) hoặc hiệp đồng tăng cường (synergistic effect)• Cvtokin tác dung lẽn tế bào đích thống qua các receptor đăc hiẽu. Receptorcủa cytokin gắn ligand với ái lực cao, hằng số phân ly Kd khoảng 10'12 đến 10'10M (thấp hơn nhiều so với hằng số phân ly của phức hợp KN-KT khoảng 10'11 10-7M). Vì vậy chỉ cần có một lượng nhỏ cytokin gắn vào receptor là đã gây ra tác dụng sinh học. Thông thường mỗi tế bào có khoảng 100 đến 1000 receptorcủa cytokin.Các túi hiệu ngoại bào điều hòa sự biểu hiện receptor của cytokin sẽ làm thayđổi đáp ứng của tế bào với cytokin.Phần lớn cytokin gây tác dụng thông qua thay cách đổi biểu hiện gen của cáctế bào đích, dẫn đến thay đổi chức năng, kích thích hoặc ức chế sự phát triển tếbào đích. Tuy nhiên cũng có hai trường hợp ngoại lệ : các chemokin có tác dụnghóa ứng động bạch cầu, gây di chuyển các tế bào mà không cần sao mã gen vàtổng hợp protein; các yếu tố hoại tử khối u (TNF: Tumor Necrosis Factor) gâychết tế bào mà không làm thay đổi biểu hiện gen.•Vé pham vi tác dung: Các cytokin thể hiện tác dụng lên những tế bào lâncận (tác dụng kiểu paracrine), tác dụng lên chính tế bào tiết ra cytokin đó (tácdụng kiểu autocrine), ít khi gây tác dụng toàn thân (systemic) nghĩa là tác dụnglên những tế bào của các cơ quan ở xa (tác dụng kiểu telecrine như các hormon).1.2.2. Cytokin receptorĐể gây tác dụng, các cytokin phải gắn vào receptor trên màng tế bào đích. Cáccytokin receptor đều có cấu tạo chung là các proteine xuyên màng vói hai vùngchức năng (functional domain) ở ngoại bào và nội bào. Vùng ngoại bào gồm cóhai tiểu đơn vị chức năng (functional subunit), một liên kết với ligand, một đểtruyền túi hiệu vào nội bào. Vùng nội bào làm nhiệm vụ truyền tin vào tới nhântế bào.Đã có nhiều cách phân loại ra đời để hộ thống hóa các cytokin và các cytokinreceptor. Nhưng cách phân loại dựa vào cấu trúc phần ngoại bào được sử dụngrộng rãi nhất, trong đó cytokin receptor được chia thành 5 nhóm chính (bảng 1.1trang 11) [20]. Việc phân loại các cytokin receptor theo cấu trúc của vùng ngoại bào thuậntiện cho việc nghiên cứu tương tác giữa cytokin receptor và ligand, nhưng khôngnêu lên được các con đường truyền tin vì nhiệm vụ truyền tin vào tận nhân tế bàolà do vùng nội bào đảm nhiệm.Các cytokin gắn receptor và truyền tin theo nhiều cách khác nhau, trong đócon đường JAK/STAT được biết đến nhiều nhất [18],[19]. Có thể tóm tắt nhưsau: Cytokin gắn vào receptor sẽ hoạt hóa các tyrosine kinase liên kết vớireceptor JAK (Janus Kinase), sau đó dẫn đến hoạt hóa các yếu tố truyền tin vàIkích thích sao mã STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription). Cácprotein STAT đi qua màng nhân gắn trên ADN kích thích sao mã, tổng hợp cácprotein đáp ứng [18],[19].Các cytokin liên kết với receptor loại 1 và loại 2 truyền tin qua con đường này.Hình 1.2. Cytokin Receptor Bảng 1.1. Phân loại cytokin receptor theo cấu tạo phần ngoại bào (theo AbulK.A.(2000). Cellular and Molecular Immunology [20])TênCytokinreceptorloại 1Cytokinreceptorloại 2Cấu tạoMột receptor có thể cấu tạo bởi một hoặc nhiều tiểuđơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm 2 thành phần:LigandIL-2, IL-3,• Phần thứ nhất có hai cặp cystein ở hai đầu tậnEL-4, EL-5,• Phần thứ hai nằm ở phía gần màng tế bào, là đoạnIL-6, IL-7,peptid gồm tryptophan-serin-X-tryptophan-serinIL-9, IL-11,(WSXWS) trong đó X là một acid amin nào đó.IL-12, IL-13,IL-15,Receptor loại này thường gắn với những cytokin cócấu trúc 4 chuỗi xoắn a helix, sự gắn đặc hiệu phụ GM-CSF,G-CSFthuộc acid amin X của chuỗi peptid phía gần màng tếbào.Giống các receptor type I ở chuỗi peptid gồm hai cặpcystein ở hai đầu tận, tuy nhiên không có chuỗi peptidWSXWS như type I.Một receptor chỉ cấu tạo bởi một tiểu đơn vị gắnligand và một tiểu đơn vị truyền tin.ReceptorCó cấu trúc như Igkiểu IgIFNa/pIFNyIL-10.EL-1, M-CSFReceptorCó rất nhiều phân tử cysteine ở phần ngoại bào.của TNFCấu tạo bởi 7 chuỗi xoắn a helix xuyên màng có cácSerpentin đoạn xoắn từ trong ra ngoài và ngoài vào trong màngReceptor tế bào. Các receptor thuộc nhóm này gắn và truyềncác tín hiệu ngắn và nhanh từ các chemokin.- 11 -TNFa,Fas Ligand.chemokin 1.2.3.Các cytokin type I và cytokin type IINhư đã nói ở trên, hai dưới nhóm của tế bào T trợ giúp có tác dụng thúc đẩyđáp ứng miễn dịch theo hai hướng khác nhau và điều hòa lẫn nhau: Thl đẩymạnh đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, còn Th2 thì lại đẩy mạnh đáp ứngmiễn dịch thể dịch là chủ yếu. Sự tương tác giữa Thl và Th2 được thực hiệnthông qua các cytokin chức năng của hai dòng là cytokin type I và cytokin type n• Các cytokin type I gồm có: IL-2, IFNy, IL-12, TNFỊ3,..• Các cytokin type n gồm có: IL-4, IL-5, IL6, LL-10, IL-13Tương tác giữa cytokin type I và n được tóm tắt trong hình 1.3Các tế bào đơn nhân máungoại vi (PBMC)Clone tế bào T trợ giúpThl/Th2 'IFNy, DL-12 (-)IFNy (-)(-)IFNyn:-2(+)ỶĐáp ứng miễndịch qua trunggian tế bàoTh2ThlTh2ThlIL-4(-) IL-4, IL-10IL-4EL-5IL-611-10(+) ìrIFNyBL-2IL-12^'Đáp ứng miễndịch thể dịch(+)Đáp ứng miễndịch qua trunggian tế bàoHình 1.3. Cytokin type I và type n (Theo Daniel R.L [27])- 12-EL-4IL-5EL-611-10IL-13(+)1Đáp ứng miễndich thể dich Các cytokin type I và n điều hòa tương hỗ sự chế tiết và tác dụng của nhau,nhóm nào chiếm ưu thế thì đáp ứng miễn dịch sẽ phát triển chủ yếu theo xuhướng nhóm đó. Kết quả tương tác giữa Thl và Th2 không chỉ phụ thuộc vàonhững cytokin hai dòng tế bào này tự chế tiết ra mà thực tế phụ thuộc vào cáccytokin của mỗi nhóm trong môi trường xảy ra tương tác, có thể các tế bào kháccủa cơ thể tiết ra hoặc cũng có thể do chính bệnh nguyên tiết ra (khối u, vi khuẩn,virus...). Bảng 1.2 tóm tắt nguồn gốc của một số cytokin type I và n.Bảng 1.2. Các bạch cầu tiết cytokin type I và n (Theo Daniel R.L [27])CytokinNguồn gốcType IType nIL-2, IFNy, IL-12,IL-4, IL-5, IL6,TNFpEL-10, IL-13TCD8+IL-2, IFNỵEL-4, IL-5, EL-10Tế bào diệt tự nhiên (NK)IFNy, TNFỊ3Tế bào Mono/ Đại thực bàoIL-12IL6, EL-10Lympho BEL-12, TNFị3IL6, IL-10Tế bào tua (Dendritic Cell)IL-12Bạch cầu đa nhân trung tínhIL-12T CD4+Bạch cầu ưa acidIL-4, EL-5, DL6Tế bào MastIL-4, EL-5, BL6-13- Tóm lại, sự tương tác giữa Thl-Th2 giúp cho cơ thể có hình thức đáp ứng thíchhợp vói từng loại kháng nguyên, đồng thời điều hòa ngăn chặn những đáp ứngxảy ra quá mức có thể gây tổn thương cho cơ thể.1.2.4. Interleukin-2 (IL-2)Interleukin-2 được mô tả đầu tiên bởi Morgan, Ruscetti và Gallo (1976), đượcgọi là yếu tố phát triển tế bào Lympho T (TCGF-T Cell Growth Factor).IL-2 là một proteine hình cầu có phân tử lượng 15-17,5 kDa, cấu tạo bởi 133acid amin cuộn thành 4 chuỗi xoắn a helices, về mặt phân tử, receptor của EL-2gồm có 3 chuỗi polypeptid a,p,y, mỗi chuỗi đều có phần nằm ngoài tế bào gồm25 acid amin. Các chuỗi oc,ị3,Ỵcó trọng lượng phân tử 55, 75, 64 kDa và phần nộibào là các đoạn peptid gồm 13, 186, 64 acid amin. Sự kết hợp các đoạn peptiđ a,p, Ỵtạo nên 3 loại receptor của IL-2 (IL-2R) khác nhau về ái lực với IL-2 và khảnăng truyền tín hiệu vào nội bào. ctIL-2R là recetor có ái lực với JL-2 thấp nhất(lOnM), và không có khả năng truyền túi hiệu vào nội bào. P+Ỵ IL-2R có ái lựctrung bình (lnM) và phức hợp a+ị3+Y BL-2R có ái lực mạnh nhất (10 pM); chỉ cóhai loại recetor này mới có khả năng truyền túi hiệu vào nội bào, trong đó chuỗi ycó tác dụng truyền tin.Trong đáp ứng miễn dịch, IL-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trìnhphát triển và biệt hóa các dòng tế bào lympho T đặc hiệu vói kháng nguyên.Ngoài tác dụng autocrine lên chính tế bào tiết ra nó, DL-2 còn có tác dụng lên cáctế bào lân cận (paracrine), kích thích gây độc tế bào (cytotoxicity) của các tế bàoT gây độc và tế bào NK, kích thích sự phát triển và biệt hóa của tế bào lympho B,kích thích tế bào PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) tổng hợp và chếtiết các cytokin khác như : IL-1, IL6, TNF, IFNy.- 14- IL-2 có tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại vi khuẩn, virus, cảmứng kích thích sự thải loại trên mô hình ghép da và ghép tim ở chuột. Người tathấy nồng độ IL-2 tăng cao trong huyết tương ở các bệnh tự miễn như lupus banđỏ hệ thống, xơ cứng bì, viêm khớp dạng thấp. IL-2 cũng làm thoái triển một sốkhối u thực nghiệm trên chuột.JL-2 được tổng hợp và chế tiết chủ yếu bởi tế bào lympho T trợ giúp (THelper),ngoài ra cũng được chế tiết phần lớn bởi các tế bào T ung thư [19]. Khi có sựkích thích của kháng nguyên cùng vói tín hiệu từ các phân tử đồng kích thíchkhác như : MHC n, ICAMI-LFA I, LFA m-CD2,..., gen mã hóa IL-2 sẽ sao mã,tổng hợp và tiết IL-2.Sự tổng hợp IL-2 được kích thích bcd một số chất như: phytohemaglutinin(PHA), anti-CD2, anti-CD3, các hợp chất có cấu trúc tương tự như diacylglycerol (DAG). Các chất như hydrocortison, các prostaglandine, cyclosporin A ,AMP vòng ức chế sự tổng hợp IL-2.Do làm tăng độc tính của các tế bào lympho thâm nhiễm khối u (TĨL-TumorInfiltrating Lymphocyte), LAK (Lymphokin Activated Killer), NK với khối u,IL-2 đã và đang được nghiên cứu để điều trị một số bệnh ung thư như ung thưbiểu mô thận (renal adenocarcinoma), u hắc tố (melanoma) , u lympho khôngHodgkin và ung thư đại trực tràng.1.2.5. Interferon gamma (IFN y)IFNy là cytokin hoạt hóa chính của đại thực bào, có chức năng quan trọngtrong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cũng như miễn dịch đặc hiệu qua trunggian tế bào.EFNy còn được gọi là interferon miễn dịch (immune interferon) hay interferontype II trong họ các interferon được phát hiện vào năm 1957 bởi Alic Isaac [20].-15- IFNy là một homodimer protein có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa, córeceptor trên nhiều loại tế bào. Receptor của IFNy gồm hai chuỗi peptid giốngnhau về cấu trúc, thuộc nhóm cytokin receptor loại 2, một chuỗi gắn phối tử vàmột chuỗi truyền tín hiệu vào nội bào.IFNy được chế tiết chủ yếu từ Thl, TCD8+, tế bào NK. IFNỵ hoạt hóa đại thựcbào, tăng cường biểu hiện các phân tử MHC I, MHC n, các phân tử đồng kíchthích trên màng tế bào trình diện kháng nguyên (APC), kích thích biệt hóaTCD4+ thành Thl, ức chế sự phát triển của Th2, hoạt hóa bạch cầu trung tính,tăng cường độc tính của tế bào NK.1.2.6. Interleukin-4 (IL-4)Lần đầu tiên năm 1982 người ta phân lập được yếu tố tăng trưởng tế bào B,BCGF (B Cell Growth Factor), sau đó giải mã được gen mã hóa cho cytokin nàyvà đặt tên là interleukin 4.IL-4 là một glycoprotein có trọng lượng phân tử 20 kDa, được chế tiết bởi tếbào Th2 hoạt hoá, hoạt động như một cytokin cảm ứng theo kiểu autocrine cũngnhư là một cytokin chức năng của tế bào Th2. IL-4 receptor có cấu tạo gồm mộtchuỗi ec thuộc nhóm receptor loại 1 có chức năng gắn phối tử và một chuỗi ygiống receptor Ỵcủa IL-2 có chức năng truyền tín hiệu vào nội bào. IL-4 truyềntin qua con đường JAK/STAT.IL-4 tác dụng lên nhiều loại tế bào như lympho T, lympho B, đại thực bào, tếbào Mast; kích thích TCD4+ biệt hóa thành Th2 đồng thời kìm hãm sự phát triểncủa tế bào Thl, kích thích tế bào lympho B phát triển, biệt hoá và chế tiết Ig, chủyếu là IgE ; ức chế độc tính của đại thực bào, ức chế sự hoạt hóa đại thực bào củaIFNy. IL-4 đối kháng tác dụng của phần lớn các cytokin type I.-16- 1.2.7. Interleukin-10 (EL-10)IL-10 lần đầu tiên được, mô tả vào năm 1989 như là một yếu tố được sản xuấtbởi tế bào T trợ giúp nhóm 2 (Th2) và ức chế tế bào Thl tổng hợp các cytokinkích thích miễn dịch khác. Người ta gọi nó là yếu tố kìm hãm tổng hợp cytokin(CSEF : Cytokin Synthesis Inhibitory Factor). IL-10 được sản xuất bởi các tế bàolympho B, T, đại thực bào (macrophage), các bạch cầu đơn nhân (monocyte)...EL-10 có phân tử lượng 18kDa, cấu tạo bởi 178 acid amin có cấu trúc 3 chiềulà một homodimer, hai monomer liên kết vói nhau bằng dây nối không đổng hóatri (non-covalent) tạo thành phân tử hình chữ V, mỗi cánh tay của chữ V đượccấu tạo từ 6 chuỗi xoắn a-helices.IL-10 receptor là một heterodimer: IL-10R1 và IL-10R2. IL-10R2 thuộc nhómcytokin receptor loại 2. IL-10 gắn vào recetor theo hai giai đoạn : đầu tiên IL-10heterodimer liên kết chuỗi IL-10R1 với ái lực lớn, sau đó gắn IL-10R2 với ái lựcthấp hơn để tạo thành phức hợp IL-10/ EL-10R1/ IL-10R2 có hoạt tính sinh học.Được sản xuất từ tế bào Th2, IL-10 ức chế sự phát triển và biệt hóa của dòng tếbào Thl, ức chế sự tổng hợp và chế tiết của IL2 và EFNy, ức chế biểu hiện củaphức hợp hòa họp tổ chức lóp n (MHC n), các phân tử đồng kích thích trên ĐTBvà các tế bào trình diện kháng nguyên. Ngược lại, IL-10 kích thích sự phát triểnvà họat hóa chức năng của tế bào lympho B.Do có khả năng ức chế tế bào lympho Thl và các bạch cầu đơn nhân khác,IL-10 có thể được dùng như một chất đàn áp miễn dịch tế bào, áp dụng trongđiều trị các trường hợp thải ghép cơ quan, cảm ứng sự dung nạp miễn dịch. 1.3.Miễn dịch trong ung thưUng thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân gâyung thư, tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức vượt ra khỏi các cơ chế kiểm soátsự phát triển của cơ thể.Khác với các khối u lành tính thường chỉ phát triển rất chậm tại chỗ, các khốiu ác tính phát triển, xâm lấn vào các tổ chức bình thường của cơ thể. Các tế bàou ác tính có khả năng di căn tới các tạng ở xa để hình thành khối u mới, cuốicùng dẫn đến tử vong.Quan điểm tồn tại một đáp ứng miễn dịch chống lại khối u đã được đề cập tớitừ cách đây gần 100 năm. Vào đầu thế kỷ XX, Ehrlich (1912) và Bashforsd(1913) là những người đầu tiên cho rằng khối u là những thành phần lạ đối với cơthể, giống như trường hợp ghép cơ quan, bị phát hiện và đào thải bởi hệ miễndịch. Từ đó người ta đã tìm cách kích thích các đáp ứng miễn dịch để chống lạikhôi u.Ý tưởng của Ehrlich sau đó được tiếp tục phát triển bởi Bumet (1957) vớithuyết “cảnh giác miễn dịch” (Immune Surveillance). Thuyết này cho rằng hệmiễn dịch của cơ thể có chức năng phát hiện và tiêu diệt những tế bào bất thườngkhông cho chúng tạo thành khối u và triệt tiêu những khối u đã được hình thành.1.3.1. Kháng nguyên ung thưQuá trình hình thành ung thư có các đột biến gen, từ đó tạo ra các protein lạvới cơ thể, một số protein này được biểu hiện trên bề mặt tế bào thành các khángnguyên ung thư. Kháng nguyên ung thư có thể chia thành hai nhóm là khángnguyên đặc hiệu khối u (TSA) và kháng nguyên liên kết với khối u (TAA).•Kháng nguyên đặc hiệu khối u (TSA - Tumor Specific Antigen) : là khángnguyên duy nhất chỉ có ở tế bào ung thư, không có ở tế bào bình thường.-18- •Kháng nguyên liên kết với khối u (TAA - Tumor Associated Antigen) : làkháng nguyên có ở tế bào ung thư và một số tế bào thường.1.3.2.Đáp ứng miễn dịch chống lại khối uCác kháng nguyên TSA, TAA có thể bong ra khỏi màng tế bào ung thư, đổ vàotuần hoàn, gây ra đáp ứng miễn dịch chống lại khối u. Cơ thể đáp ứng với khángnguyên ung thư thông qua cơ chế đặc hiệu và không đặc hiệu, cả miễn dịch thểdịch và miễn dịch qua trung gian tế bào, trong đó miễn dịch qua trung gian tế bàođóng vai trò quan trọng nhất. Các tế bào chính tham gia vào miễn dịch chống lạikhối u bao gồm : Tc, NK và ĐTB.a. Tế bào T gây độc (Tc : Cytotoxic T Lymphocyte):Là những tế bào lympho T có khả năng nhận dạng và ly giải các tế bào biểuhiện kháng nguyên lạ. Đa số các tế bào Tc là T CD8+, tế bào T CD4+ chiếmkhoảng 10%. Tế bào T CD8+nhận diện kháng nguyên trình diện bởi MHCI.b. Tê bào NK (Natural Killer Cells) và tế bào K (Killer Cells)Các tế bào NK là những lymphocyte có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư màkhông cần phải mẫn cảm trước. Sau khi được hoạt hóa bởi IL2 và IFNy, tế bàoNK có'thể ly giải được nhiều loại tế bào ung thư, kể cả những tế bào được coi làcó tính kháng nguyên thấp đối vói tế bào T. Tế bào NK tác dụng tốt trên nhữngkhối u không biểu hiện MHC lớp I. Ngược lại, các phân tử MHC lớp I ức chế độctính với tế bào ung thư của các tế bào NK do gắn với các Receptor ức chế gâyđộc (KIR : Killer Inhibitory Receptor) trên màng tế bào NK.-19- IFN-VMacrophageHình 1.4. Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch chống lại khối u(Theo Neville Woolf. Pathology: Basic and systemic (1998) [39])Tế bào NK nhận dạng tế bào đích thông qua các receptor trên bề mặt tế bàonhư CD2, CD 16, CD 69. Phân tử CD 16, còn gọi là Fc Recetor (FcyRin), gắnvào kháng thể trên tế bào đích, là bước trung gian trong phản ứng gây độc quatrung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC: Antibody-Dependent Cellmediated Cytotoxicity).-20- • Cơ chế gây độc tê bào của tê bào Tc và NK:Tc và NK có thể tiêu diệt tế bào đích bằng cách truyền tin trực tiếp khi tiếp xúcgiữa tế bào - tế bào thông qua các phân tử trên bề mặt tế bào, hoặc truyền tin giántiếp thông qua các cytokin. Ngoài ra, tế bào CD8+ và NK còn mang các hạt chứaprotein, protein này có thể tiêu diệt tế bào đích khi được giải phóng trực tiếp vàomàng tế bào đích. Quá trình gây độc là sự phối hợp của ba cơ chế, trên mỗi loạitế bào có sự phối hợp riêng.- Tiêu diẽt tế bào đích bằng các hat mang perforin và granzvmeTế bào Tc và NK mang các hạt chứa perforin và granzyme (các enzyme gắnvới h ạ t: granule-associated enzymes). Khi tiếp xúc với tế bào đích, các thànhphần chứa trong hạt được giải phóng vào khe tiếp xúc giữa hai tế bào.Perforin là một protein có khả năng tạo thành các lỗ trên màng tế bào, có cấutrúc và chức năng giống với bổ thể C9. Sau khi được giải phóng, với sự có mặtcủa ion Ca++, các monomer được polymer hóa tạo thành các kênh protein xuyênmàng (Transmembrane channel). Các lỗ này làm thay đổi áp lực thẩm thấu nộibào, nước và các ion tràn vào tế bào làm tế bào trương phồng và vỡ. Đồng thời,các enzyme được giải phóng từ tế bào gây độc vào tế bào đích, phá hủy tế bàođích. Tuy tiếp xúc với perforin nhưng các tế bào Tc và NK không bị tiêu diệt lànhờ có phân tử proteoglycan chứa trong các hạt, gắn và bất hoạt perforin.Granzyme là tổ hợp các enzyme serine protease, trong đó granzyme B làenzyme quan trọng nhất, phân hủy các cơ chất protein ở đầu tận acid aspartic.Granzyme xâm nhập vào tế bào đích thông qua các lỗ trên màng tế bào được tạobởi perforin. Trong bào tương của tế bào đích, granzyme B thủy phân, hoạt hóacác enzyme caspase. Sau đó enzyme caspase thủy phân hàng loạt cơ chất khác,đưa tế bào chết theo chương trình (apoptosis). Ngoài ra, các enzyme caspase còn-21- phân hủy các nucleoprotein, hoạt hóa các enzyme khác phân hủy ADN của tếbào đích.- Tiêu diêt tế bào đích thông qua quá trình truyền tin tế bàoKhi hoạt hóa, các tế bào Tc biểu hiện các phân tử protein trên bề mặt gọi là Fasligand (FasL). Các phân tử này gắn lên Fas protein trên màng tế bào đích (proteinFas có ở nhiều loại tế bào). Việc gắn Fas ligand lên Fas protein có tác dụng khởiđộng quá trình truyền tin vào nội bào, hoạt hóa các enzyme caspase làm phânhủy ADN và dẫn đến apoptosis.Tế bào T CD8+ tiêu diệt tế bào đích bằng cách giải phóng các hạt chứaperforin , Granzyme và thông qua Fas ligand.Tế bào T CD4+ không có cấu tạo hạt, tiêu diệt tế bào đích thông qua Fasligand.Tế bào NK tiêu diệt tế bào đích thông qua giải phóng hạt chứa Perforin vàGranzyme.c. Đại thực bào (Macrophage)Các đại thực bào có tính độc khá đặc hiệu với tế bào ung thư. Tế bào lympho Tvà NK cùng tham gia với đại thực bào chống lại khối u thông qua việc chế tiếtIFNỵ, một cytokin có tác dụng kích thích sự phát triển hoạt tính của đại thực bào.Đại thực bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu có vai trò bảo vệcơ thể ngay từ lúc xuất hiện những kháng nguyên lạ đầu tiên. Sau đó, chúng cóvai trò giống như tế bào APC : sử lý kháng nguyên và trình diện kháng nguyêncho tế bào lympho T. Cuối cùng, đại thực bào đóng vai trò như một tế bào hiệuứng (effector cell), tiêu diệt tế bào ung thư qua nhiều cơ chế khác nhau: các phântử trung gian có tính oxy hóa (ROI-Reactive Oxygen Intermediates ) như H20 2,OBr, NO,..; các enzyme (protease, arginase,..)--22- 1.3.3. Suy giảm miễn dịch trong ung thưHệ miễn dịch có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại ung thư. Tuy nhiên, thực tếlà các khối u vẫn phát triển, xâm lấn và di căn. Như vậy, đáp ứng miễn dịch củacơ thể là không đủ hoặc khối u đã lẩn tránh và thậm chí đàn áp đáp ứng miễndịch [20],[43].Khối u lẩn tránh đáp ứng miễn dịch bằng cách làm giảm biểu hiện khángnguyên: hoặc biểu hiện các kháng nguyên có tính sinh miễn dịch kém, hoặc pháttriển các phân tử che dấu kháng nguyên (như sialomucin). Các tế bào ung thư lẩntránh hệ miễn dịch ngay từ giai đoạn phát triển tại chỗ (insitu stage). Còn khi đãhình thành u thì khối u lớn sẽ phát triển các cơ chế ức chế hệ miễn dịch.Tình trạng suy giảm miễn dịch trong ung thư (trên thực nghiệm cũng như ởngười) đã được nhiều tác giả nghiên cứu và thường là suy giảm miễn dịch tế bào.Sự suy giảm này được thể hiện dưới nhiều hình thức: giảm số lượng các tế bào cóthẩm quyền miễn dịch, giảm đáp ứng tăng sinh và chuyển dạng lympho bào,giảm khả năng gây độc tế bào, giảm sản xuất cytokin,...Sự suy giảm này đượcquan sát thấy cả ở các tế bào máu ngoại vi cũng như ở các tế bào miễn dịch thâmnhiễm vào khôi u. Trên lâm sàng, tình trạng suy giảm này thường đi kèm với tiếntriển cua bệnh, tái phát hoặc di căn . Bảng 1.3 tóm tắt các thông số đánh giá chứcnăng miễn dịch qua trung gian tế bào.Khối u khi đã đạt đến kích thước nhất định, không còn khả năng che dấukháng nguyên thì lại phát triển nhiều cơ chế đàn áp hệ miễn dịch. Khối u chế tiếtprostaglandin, nitric oxid có tác dụng ức chế miễn dịch. Một số khối u chế tiếtcác cytokin tác dụng kiểu autocrine kích thích tế bào ung thư phát triển như yếutố kích thích chuyển dạng beta (TGF p - Tranforming Growth Factor Beta).-23- Bảng 1.3. Các thông số đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bàotrong ung thư (Theo Harvey W.Baker-1986) [32].In vivoTest quá mẫn muộn vớiTuberculinkháng nguyên (test da)CandidaDinitrochlorobenzen (DNCB)Kháng nguyên ung thưIn vitroSố lượng tế bào máu ngoại viTổng số tế bào lymphoCác dưới nhóm lympho, các tế bào đơnnhânTest thử nghiệm chức năngĐáp ứng chuyển dạng với PHA, EL2.của tế bào LymphoTest gây độc vói tế bào ung thưThử nghiệm ức chế di chuyển bạch cầuThử nghiệm ức chế khả năng kết dính củabạch cầuKhả năng sản xuất cytokinKhả năng sản xuất kháng thểMột số khối u có khả năng chế tiết các cytokin type n như DL-10, làm thay đổicân bằng giữa cytokin type I và type n, ức chế đáp ứng miễn dịch qua trung giantế bào- đáp ứng miễn dịch quan trọng chống lại khối u, dẫn đến đáp ứng miễndịch thể dịch là chủ yếu. Đôi khi các kháng thể lưu hành trong máu lại là yếu tố-24- tạo thuận cho khối u phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có nhũng khángthể gắn với kháng nguyên ung thư nhưng không liên kết với bổ thể để ly giải tếbào u, không gắn với các thụ thể của Fc để tiêu diệt tế bào u thông qua phản ứngđộc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), che dấu sự nhận diện kháng nguyên bởicác tế bào Tc.1.4. Miễn dịch trị liệu trong ung thư (Immunotherapy)1.4.1.Mục đích của miễn dịch trị liệuDựa trên lý thuyết về cảnh giác miễn dịch, miễn dịch tri liệu trong ung thưđược Bumet khởi xướng từ năm 1957 nhằm mục đích :• ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào u và các vi di căn.• Ngăn ngừa, làm giảm suy tủy hoặc phục hồi lại hoạt động của tủy xươngsau hóa trị liệu hoặc xạ trị.• Tăng cường đáp ứng miễn dịch chống lại các nhiễm trùng cơ hội.Cho đến nay, nhiều liệu pháp miễn dịch đã và đang được nghiên cứu áp dụngvào điều tri ung thư bên cạnh các phương pháp khác như phẫu thuật, hóa chất, tiaxạ. Nhiều chất kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu ra đời, đồng thòimô hình kết hợp phẫu thuật, hóa chất, miễn dịch (Immunochemosurgery) đượcáp dụng rộng rãi đã cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị ung thư.Các liệu pháp miễn dịch điều tri ung thư được tóm tắt trong bảng 1.4-25- Bảng 1.4. Tóm tắt các liệu pháp miễn dịch điều tri ung thư(Theo Ivan Roitt-1998 [43])Chủ độngKhông đặc hiệuBCG, Levamisole, Aslem(Active)Đặc hiệuVaccin chống ung thưKhông đặc hiệuTế bào LAK trị liệu, cytokin trị liệuBị độngĐặc hiệuPhức hợp thuốc gắn kháng thể đặc hiệu(Passive)Hỗn hợpTế bào LAK gắn kháng thể1.4.2.Cơ chế chung của các thuốc kích thích miễn dịchCó nhiều biện pháp điều trị miễn dịch trong ung thư đã được ứng dụng trênlâm sàng, trong đó việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch đặc hiệu và khôngđặc hiệu được coi là có tác dụng hỗ trợ cho các phương pháp điều trị chính thống.Các chất kích thích miễn dịch là những chất làm tăng về số lượng hay chất lượnghoặc cả hai của các thành phần trong hệ thống miễn dịch.Mỗi chất kích thích miễn dịch có cơ chế tác động riêng, nhưng nhìn chung cơchế tác động của chúng là có tác dụng:• Thúc đẩy quá trình phát triển và biệt hóa của các tế bào có thẩm quyền miễndịch.• Hoạt hóa chức năng của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.• Điều chỉnh lại mối quan hệ điều hòa giữa các tế bào miễn dịch theo chiềuhướng có lợi cho cơ thể.-26- 1.4.3. AslemTại Việt nam, Aslem (Glycyl Funtumin Hydroclorid) là một aminoacyl steroidđược tổng hợp toàn phần tại Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà nội và đãđược sử dụng như một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu.Tên khoa học: N-(aminoetanoyl)-3a-pregnan-20-on hydrocloridHình 1.5. Công thức cấu tạo của AslemNăm 1958, Khương Hữu Quý và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được mộtsteroid có tên là Funtumin từ lá cây Funtumia latifolia Stapf.(Apocynaceae) cónguồn gốc ở châu Phi [58]. Sau đó, Nguyễn Đăng Tâm (1967) đã bán tổng hợpGlycyl Funtumin HBr từ Funtumin tại Viện Nghiên cứu hóa học các hợp chất tựnhiên ở Gif-Sur-Yvette (Cộng hòa Pháp) và đặt tên là LH1 [59]. Năm 1977 ĐặngHanh Phức và cs cũng đã bán tổng hợp được Glycyl Funtumin H ơ tại Việt namvà đặt tên là Aslem. Năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóatrường Đại học Tổng hợp Leiden (Hà Lan), Glycyl Funtumin HC1 đã được tổnghợp toàn phần tại Labo tổng hợp thuốc của trường Đại học Dược Hà nội do tổchức NUFFIC tài trợ. Hiện nay, các nghiên cứu sản xuất Aslem đã được hoàn-27- thiện, chế phẩm đã được Cục quản lý Dược cấp số đăng ký lưu hành trên thịtrường Việt nam [5].Tác dụng kích thích miễn dịch của Glycyl Funtumin đã được chứng minh quamột số thử nghiệm sinh học tiến hành ở trong và ngoài nước [6],[7],[14],[16],[26],[29],[40],[57]. Aslem đã được nghiên cứu về tác dụng kích thích miễn dịchtrên thử nghiệm Jeme Cunningham [6],[17],[57], đánh giá khả năng kích thíchmiễn dịch tế bào trên test phục hồi tạo Rosette E bị ức chế bởi Theophylline[6],[14], tác dụng hoạt hóa đại thực bào và ảnh hưởng lên chức năng thực bào củađại thực bào [9],[16], tác dụng lên sự chuyển dạng bạch cầu lympho [7], tác dụnglên màng hồng cầu và lyzosome [1], tác dụng tăng sức đề kháng chống nhiễmkhuẩn invitro và tác dụng đối với mẫu viêm phúc mạc thực nghiệm do trực khuẩnmủ xanh kháng kháng sinh [2],[17]. Kết quả thử độc tính cấp, bán cấp, bántrường diễn của Aslem cũng đã được công bố [10],[11].Trên lâm sàng ung thư, Aslem đã được sử dụng từ hơn 20 năm nay và chonhững kết quả rất đáng khích lệ. Tôn Thất Tùng và cs (1973) đã sử dụng LH1điều trị bổ trợ ung thư gan nguyên phát sau phẫu thuật cắt gan hoặc thắt độngmạch gan, kết quả cho thấy điều trị bổ trợ LH1 đã tăng rõ rệt thời gian sống thêmsau mổ của các bệnh nhân giai đoạn Duke m [52],[62]. Hoàng Đình Cầu,Nguyễn Đình Kim, Nguyên Việt Cồ và cs nghiên cứu sử dụng phác đồ điều trịmiễn dịch LH1 phối hợp với vitamin c liều cao và tam thất sau mổ ung thư phếquản nguyên phát thấy rằng tỷ lệ sống thêm sau mổ 6 tháng, 1 năm, 2 năm ở 31bệnh nhân được điều trị miễn dịch cao hơn rõ ràng so với nhóm 47 bệnh nhânkhông được điều trị miễn dịch, chỉ cắt khối u. Trong số 10 bệnh nhân được điềutrị miễn dịch và 20 bệnh nhân không được điều tri miễn dịch được theo dõi lâudài thì tỷ lệ sống thêm sau 3 năm ở nhóm được điều trị là 7/10 (70%) trong khiđó tỷ lệ này là 6/20 (33%) ở nhóm không được điều tri, p = 0,056. Sau 4 năm, tỷ-28- lệ sống là 6/10 (60%) ở nhóm được điều tậ so với 4/20 (20%) ở nhóm khôngđược điều trị, p = 0,045 [4],[12]. Cho đến nay, Aslem tiếp tục được sử dụng rộngrãi trên các ung thư đường tiêu hóa ở bệnh viện Việt Đức và Khoa Ngoại bệnhviện Saint-Paul, ung thư vú ở bệnh viện K, ung thư phế quản phổi ở viện Lao vàbệnh phổi Trung ương.Tôn Đức Lang (1979) sử dụng LH1 và Aslem với tác dụng kích thích miễndịch không đặc hiệu trong điều tri và ngăn ngừa nhiễm trùng ngoại khoa, làmtăng sức đề kháng với vi khuẩn, kết hợp với kháng sinh và các phương pháp ngoạikhoa cho kết quả điều trị tốt [13].Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu trên in vitro cũng như trên lâm sàng, cơchế tác dụng của thuốc vẫn cần được tìm hiểu sâu hơn ở mức độ tế bào và phântử. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này vói mong muốn làm sáng tỏ thêm phầnnào cơ chế tác dụng của Aslem lên các tế bào miễn dịch.-29- PHẦN 2.2.1.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ uĐối tượng nghiên cứu :Nghiên cứu được thực hiện trên hai nhóm : bệnh nhân ung thư đại trực tràng vàngười cho máu.A. Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràngCác bệnh nhân ung thư đại trực tràng được chẩn đoán và điều tri tại khoa Phẫuthuật Tiêu hóa Bệnh viện Việt Đức trong thời gian từ tháng 6 năm 2002 đếntháng 4 năm 2003.• Tiêu chuẩn lựa chọn- Tuổi dưới 80- Không phân biệt về giới, nghề nghiệp và địa dư cư trú.- Được phẫu thuật cắt bỏ khối u.- Tổn thương ung thư được chẩn đoán xác định dựa vào kết quả giải phẫubệnh• Tiêu chuẩn loại trừ- Trên 80 tuổi.- Đã điều trị hóa chất hoặc tia xạ trước phẫu thuật.- Không được phẫu thuật cắt bỏ khối u.- Được truyền máu trong quá trình điều tri.- Mắc các bệnh suy giảm miễn dịch khác như lao, AIDS...-30- B. Nhóm chứngNhững người hiến máu tại khoa Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Việt Đức.• Tiêu chuẩn lựa chọn- Tuổi và giới tương đương với nhóm bệnh nhân.- Không phân biệt nhóm máu, nghề nghiệp và địa dư cư trú.- Không mắc các bệnh cấp tính hoặc mãn tính tại thời điểm lấy máu (lao,AIDS, viêm gan B,..).2.2. Phương pháp nghiên cứuLà nghiên cứu tiến cứu. Tác dụng kích thích miễn dịch của Aslem được nghiêncứu in vitro dựa trên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào đơnnhân máu ngoại vi (PBMC-Peripheral Blood Mononuclear Cell) ở hai nhóm :bệnh nhân ung thư đại trực tràng và nhóm chứng là những người cho máu cócùng phân bố tuổi và giới.Thử nghiệm được chia thành 2 lô:• Lô chứng : môi trường có PHA (3|ig/ml)• Lồ thử: môi trường có PHA (3|^g/ml) và Aslem nồng độ (0,15 ịig/ml)Cụ thể các bước tiến hành như sau:2.2.1. Ghi nhận thông tin và lấy mẫuA. Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng- Bệnh nhân nhập viện được ghi nhận thông tin tuổi, giói, khám lâm sàng,các xét nghiệm huyết học, sinh hóa, chẩn đoán hình ảnh .- Ghi nhận mô tả tổn thương, cách thức phẫu thuật của phẫu thuật viên cũngnhư xét nghiệm đại thể và vi thể của khối u, hạch phẫu tích.-31- - Phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống phân loại Duke [8]• Dukes A : ung thư ở lớp niêm mạc, dưới niêm hoặc ăn xuống lớp cơ của đạitrực tràng.• Dukes B: ung thư đã ăn xuống tới thanh mạc hoặc qua thanh mạc nhưngchưa di căn.• Dukes C: đã có di căn (hạch vùng hoặc di căn xa).- Lấy 6 ml máu tĩnh mạch cánh tay sau phẫu thuật vào tube chống đôngbằng Heparin. PBMC được tách và nuôi cấy trong vòng 3 giờ kể từ khi lấymáu.B. Nhóm chứng- Ghi nhận các thông tin về tuổi, giới, xét nghiệm huyết học.- Lấy 6 ml máu tĩnh mạch cánh tay vào tube chống đông bằng Heparin.PBMC được tách và nuôi cấy trong vòng 3 giờ kể từ khi lấy mẫu.2.2.2. Tách và nuôi cấy PBMCPBMC được tách khỏi máu chống đông Heparin, nuôi cấy trong môi trườngRPMI .1640 có 20% FCS trong 48 giờ ở điều kiện 37°c và 5% C02. Cụ thể tiếnhành như sau:• Tách PBMC bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng (Densitygradient centrifugation) [45]- Pha loãng máu chống đông với dung dịch RPM I1640 (Gibco) tỷ lệ 1:1.- Hút 3 ml máu đã pha loãng cho chảy nhẹ nhàng theo thành ống nghiêm vàoống nghiệm 5ml (Grenier Bio-one) đã chứa sẵn 1 ml dung dịch Ficoll Hypacque(tỷ trọng 1,077; PTL 400 000; Lymphoprep™), tạo thành 2 lớp rõ rệt.-32- -Ly tâm 2500 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c (máy Beckman Avanti 30 -EuropContinent, Rotor S0410), sẽ xuất hiện 4 lớp rõ rệt : dưới cùng là hồng cầuvà bạch cầu đa nhân, rồi đến khối Ficoll, trên bề mặt Ficoll là một lớp màng tếbào màu trắng (còn gọi là đám mây tế bào) và trên cùng là huyết tương (hình 6)w (Chất béo)- Hút nhẹ nhàng lớp tế bào trắng sang ống nghiệmSERUM/media(Huyết thanh.)khác, rửa 2 lần bằng dung dịch RPMI (mỗi lần rửaPBMC- Đếm số lượng tế bào trên buồng đếm bạch cầu.ly tâm 1800 vòng/phút 4°c trong 10 phút).RC0LL-HỈPầOU£RfMATjNWHFEINCGEU3m&mjLSHình 2.1. Sự tách lớp tế bào bằng phương pháply tâm chênh lệch tỷ trọngHổag cầu và bạcbLcẩu đa ataâa• Nuôi cấy tế bào PBMC theo tài liệu của Shigenori Goto 1999 [31]Mỗi mẫu được cấy thành 2 lô: lô có Aslem 0,15|ig/ml và lô chứng không cóAslem. Mỗi lô cấy 3 giếng (sử dụng plate 12 giếng nuôi cấy của Nunc). Thànhphần có trong mỗi giếng được mô tả trong bảng 2.1.-33- Bảng 2.1. Thành phần của một giếng nuôi cấyLô 1Lô 2PHA 3p.g/mlPHA 3pg/ml + Aslem 0,15p,g/ml- lml RPMI20% FCS- lml RPMI20% FCS-1 X 106tế bào PBMC1 X 106tế bào PBMC-- 3|il dung dịch PHA lmg/ml- 3|il dung dịch PHA lmg/ml- 0.5 |Lil dung dịch Aslem 0,3mg/mlTế bào được nuôi cấy 48 giờ trong điều kiện 37°c 5% C02 luôn được làm ẩmsử dụng tủ cấy C02 Incubator (Sanyo).2.2.3. Thu hoạch môi trường và tế bào sau 48 giờ nuôi cấy- Gộp dung dịch nước nổi nuôi cấy tại 3 giếng của mỗi lô và bảo quản trong cácống Eppendoff ở -70°c đến khi sử dụng.- Gộp tế bào tại 3 giếng nuôi cấy lên lam kính, để khô tự nhiên sau đó nhuộmGiemsa xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng.2.2.4. Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng.- Cố định tế bào trên các lam bằng cồn tuyệt đối, để khô tự nhiên.- Nhỏ thuốc nhuộm Giemsa lên mặt lam kính, để 15 phút, rửa, để khô tự nhiên.- Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng trên kính hiển vi với độ phóng đại 10x100.- Tỷ lệ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trên 100 tế bào được đếm.-34- 2.2.5. Định lượng cytokỉn trong môi trường nuôi cấy- Các mẫu nước nổi nuôi cấy tế bào bảo quản ở-70°c được để tan tự nhiên ởnhiệt độ thường trước khi định lượng.- Cytokin trong môi trường nuôi cấy được định lượng bằng kỹ thuật miễn dịchhấp phụ enzyme, ELISA (Enzym linked immunosorbant assay).- Các bước định lượng được tiến hành theo quy trình định lượng của hãng.Nguyên tác kỹ thuât ELISA đinh lương cvtokinPhản ứng ELISA định lượng cytokin được tiến hành theo kỹ thuật Sandwichứng dụng để định lượng cytokin trong huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào và cácdịch sinh học khác. Kháng thể đơn dòng kháng cytokin được gắn trên pha rắn(thành giếng định lượng). Kháng nguyên cytokin trong môi trường nuôi cấy gắnđặc hiệu với kháng thể trên pha rắn, sau khi rửa, cho thêm kháng thể thứ 2 gắnBiotin tạo thành phức hợp KT-KN-KT-Biotin. Enzym oxy hóa được gắn lên phứchợp thông qua liên kết Biotin-Streptavidin tạo phức hợp KT-KN-KT-BiotinStreptavidin-HRP (Horse Radish Peroxydase) gắn trên thành ống nghiệm. Phứchợp được phát hiện nhờ phản ứng giữa cơ chất và TMB (TetraMethylBenzidine)tạo sản. phẩm màu xanh, chuyển thành màu vàng ở môi trường acid. Đo quang ởbước sóng 450nm, cường độ màu tỷ lệ với lượng cytokin cần xác định trong dịchnuôi cấy tế bào.Kit được sử dụng để định lượng IL-4, IL-10, IFNy là các kit có độ nhạy cao(high sensitivity), sử dụng chất mang là Amdex, một chất được cấu tạo bởi mộtchuỗi Dextran mạch thẳng có gắn hàng trăm phân tử HRP và khoảng 10 phân tửStreptavidine. Amdex cho phép phát hiện các cytokin ở nồng độ rất thấp nhờ khảnăng khuyếch đại tín hiệu.-35- Hình 2.2. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA1: pha rắn ị thành giếng định lượng)2: kháng thể thứ nhất gắn lên pha rắn3: kháng nguyên (cytokin)4: kháng thể thứ hai gắn biotin5: biotin6: streptavidin7: men oxy hóa8: đo quangĐịnh lượng IL-4, IL-10, IFNy được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich 2 giaiđoạn với các kit có độ nhạy cao của hãng Amersham Biosciens. IL-2 được địnhlượng bằng kỹ thuật Sandwich 1 giai đoạn của cùng hãng Amersham Biosciens .-36- 2.2.6. Xử lý số liệuSố liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học vói sự trợ giúp của phầnmềm SPSS 10.0- Thống kê mô tả được biểu diễn dưới dạng trung bình ±độ lệch chuẩn đối vớicác biến số phân bố chuẩn, trung vị (median) đối với các biến số không tuân theophân bố chuẩn, giá trị lớn nhất, giá trị nhỏ nhất, tỷ lệ phần trăm.- So sánh giá tri trung bình của các mẫu sử dụng test T Student đối với các biếnphân bố chuẩn, sử dụng testu Mann-Whitney với số liệu không tuân theo phânbố chuẩn.So sánh các tỷ lệ sử dụng test %2.- Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨUTừ tháng 6 năm 2002 đến tháng 4 năm 2003 có 21 bệnh nhân và 12 người bìnhthường khoẻ mạnh tham gia vào nghiên cứu, trong đó có 4 bệnh nhân bị loại khỏinhóm nghiên cứu do phải truyền máu trong quá trình phẫu thuật.3.1. Đặc điểm của nhóm bệnh và nhóm chứngHai nhóm nghiên cứu đã được khảo sát về đặc điểm dịch tễ học (bảng 3.1) vàcác thông số miễn dịch trong máu ngoại vi (bảng 3.2).Bảng 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân và nhóm chứngBệnh nhânNhóm chứng(n=17)(n=12)50,7+2,4.(24-5-70)48,4+3,7 (41 - 57)0,765*Nam12 (70,6 %)8 (66,7 %)0,822**Nữ5 (29,4 %)4(33,3 %)Đại tràng7 (41,2%)Trực tràng10 (58,8%)Giai đoạn Duke A-B7 (41,2%)TuổipGiớiVị trí ubệnhDuke c10 (58,8%)* So sánh sử dụng test T Student. ** So sánh sử dụng test khi bình phươngNhân x ét:-Sự phân bố theo tuổi và giói giữa nhóm bệnh và nhóm chứng là tương đốiđồng đều và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Trong số 17 bệnh nhân nghiên cứu có 10 bệnh nhân ung thư trực tràng(58,8%) và 7 bộnh nhân ung thư đại tràng (41,2%) bao gồm 1 ung thư đại tràngtrái, 2 ung thư đại tràng phải và 4 ung thư đại tràng sigma.- Có 1 bệnh nhân ở giai đoạn Duke A; 6 bệnh nhân ở giai đoạn Duke B và 10ở giai đoạn Duke c.Bảng 3.2. Các thông số miễn dịch trong máu ngoại viBạch cầu (106tb/cm3)Bệnh nhânNhóm chứng(n=17)(n=12)8,5 ±3,8 (4,6 4-16,7)7,2 ±2,1 (4,4+ 9,8)p0,304*Tỷ lệ lymphocyte (%) 23,9 ± 9,8 (11 -ỉ- 50,3) 29,8 ±8,3 (17,3-46,7) 0,109*Số lượng lymphocyte(106tb/cm3)CEA (ng/ml)2,1 ±0,7 (1,3-3,9)4(1-177)**2,2 ±1,1 (1,1-4,4)0,618*-* So sánh sử dụng test T Student** Nồng độ CEA trong máu không tuân theo phân bố chuẩn nên được biểu diễntheo trùng vị của mẫu. Tri số trong ngoặc là giá tri lớn nhất và nhỏ nhất của mẫu.Nhân x ét: Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy- Số lượng bạch cầu ở nhóm bệnh nhân hơi cao hơn nhóm chứng (8,5 so với 7,2)tuy nhiên tỷ lệ lymphocyte lại thấp hơn so với nhóm chứng (23,9% với 29,8%).Số lượng lymphocyte ờ hai nhóm tương đương nhau và khác biệt không có ýnghĩa thống kê (p>0,05).- Nồng độ CEA trong máu bệnh nhân phân bố tương đối rộng (1 H-177), 11 bệnhnhân (64,7%) có nồng độ CEA < 10ng/ml, 6 bệnh nhân (35,3%) có nồng độ CEA tăng cao >10 ng/ml.3.2. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào lympho sau 48 giờ nuôi cấySau 48 giờ nuôi cấy, tế bào PBMC trong 3 giếng của mỗi lô được gộp chunglại, nhỏ trên lam kính, để khô rồi nhuộm Giemsa. Tế bào chuyển dạng được quansát và xác định trên kính hiển vi với độ phóng đại 100x10 (hình 3.1), đó là các tếbào lớn hơn tế bào bình thường, có thể quan sát thấy nhiều hạt trong bào tương.Tỷ lộ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trong số 100 tế bào được đếm.Bảng 3.3. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào của PBMC sau 48h nuôi cấy (%)Bệnh nhân(n=17)Nhóm chứng(n=12)Lô 1Lô 2PHA 3|ig/ffilPHA 3|Ẳg/ml+Aslem 0,15|j.g/ml(1) 21,6±7,8 (11 -ỉ- 38)(3)33,6± 8,2 (21 - 56)(2) 26,7±5,9 (18-Ỉ-40)(4)36,3±7,5 (26-54)p 1_2= 0,05p J.3 < 0,001ỹ 3A = 0,367p 2.4 = 0,002* Kết quả trong bảng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (nhỏ nhất -ỉ- lớn nhất),so sánh 2 giá trị trung bình theo test T Student.Nhân xét:- Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh có xu hướng thấp hơn so vói nhóm chứngkhi không có Aslem trong môi trường nuôi cấy (Pj.2 = 0,05).- Đáp ứng chuyển dạng ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng khi có Aslem cao hơn cóý nghĩa so với không có Aslem (p!_3<0,001 ở nhóm bệnh, p 2-4 = 0,002 ở nhóm-40- chứng).- Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh thấp hon không có ý nghĩa thống kê so vớinhóm chứng trong môi trường có Aslem (p 3.4= 0,367).3.3. Nồng độ cytokin trong nước nổi nuôi cấyCác cytokin được lựa chọn trong nghiên cứu này là IL-2, IFNy, IL-4, IL-10,được định lượng theo kỹ thuật Sandwich một và hai giai đoạn, sử dụng kit củaAmersham Biosciens.Nồng độ các cytokin trong môi trường nuôi cấy phân bố khá rộng, không tuântheo phân bố chuẩn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng giá trị trung vị để đại diện chomẫu. Các phép so sánh sử dụng test u MannWhitney.Nồng độ cytokin type I trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng3.4và 3.5.Bảng 3.4. Nồng độ EL-2 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bàoBệnh nhân(n=17)Nhóm chứng(n=12)Lô 1Lô 2PHA 3ịj.g/mlPHA 3|ig/ml +Aslem 0,15|ig/ml(1)98,4 (51,1-5-132)(3)105,6 (52,0 H-129,3)(2)104,3 (80,2-5-125,6)(4)114,3 (56,6-ỉ-123,8)p !_2= 0,18p 1-3 = 0,563p 3-4= 0,74p 2.4 = 0,298Nhân x ét:- Nồng độ IL-2 khi không có Aslem ở nhóm bệnh nhân có xu hướng giảm so-41- Ivói nhóm chứng (98,4 so với 104,3), p !_2 = 0,18.- Sự khác biệt về nồng độ IL-2 khi có Aslem và không có Aslem ở cả nhómbệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê (p J.3 = 0,563 vói nhómbệnh, p 2_4= 0,298 với nhóm chứng).Bảng 3.5. Nồng độ IFNy (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bàoBệnh nhân(n=17)Nhóm chứng(n=12)Lô 1Lô 2PHA 3ịig/mlPHA 3ịj.g/ml +Aslem 0,15ịu.g/ml(1)68,2 (43,3 - 1983,1)(3)(2)70,8 (48,1-292,0)(4) 57,7 (52,5 4-132,8)p 1-2= 0,948p 1-3 = 0,683p 3.4 = 0,347p 2-4 = 0,88764,3 (45,5-2126,2)Nhân x ét:- Khi không có Aslem, chúng tổi không thấy có sự khác biệt về nồng độ IFNygiữa nhóm bệnh và nhóm chứng, p ^2= 0,948.- Sự khác biệt về nồng độ IFNy khi có và không có Aslem ở cả nhóm bệnh vànhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kêp2-4= 0,887 với nhóm chứng).-42-(Pj.3= 0,683 với nhóm bệnh, #0%A%®00••Hình 3.1. Hình ảnh chuyển dạng tế bào lympho.Cấc tế bào đánh số 1 được đọc là chuyển dạng.Cắc tế bào đánh số 0 được đọc là chưa chuyển dạng.-43- Phân bố nồng độ IL-2 và IFNy được mô tả trong hình 3.2. Gạch ngang thể hiệngiá trị trung vị của mẫu.IL-2 (ịỊgảul)IL-2 (pg.mi)140°"1NUóm clxứu.2«50.D-0 Jữ 'Aslem(-)IFN gamma (pg/uxi)IFN gaaiuia (p$/ml)2mô-rÀsleiìiB*)Bệtili alỉáaNiióm cliứua;ÍS0.0'2000.01500.0'0JIV"Asleiii(-)Asleiu.(+)AsleuU -)AslemH)Hình 3.2. Nồng độ IL-2 và IFNy trong nước nổi nuôi cấy PBMC-44- Xu hướng tác dụng của Aslem lên sự chế tiết cytokin được đánh giá thông quasự tăng giảm nồng độ cytokin trong môi trường nuôi cấy có Aslem so với khôngcó Aslem. Bảng 3.6 thể hiện xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưới tácdụng của Aslem theo số lượng và tỷ lệ (%) cắc mẫu biến đổi.Bảng 3.6. Xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưói tác dụng của AslemXu hướngBệnh nhânn=17Nhóm chứngn=12IL-2IFNybiến đổin%n%Tăng741,2635,3Không thay đổi524,9952,9Giảm524,9211,8Tăng758,3433,3Không thay đổi216,7216,7Giảm325650Theo quv ước chung trong miễn dịch học, nồng độ cytokin biến đổi > 10% đượccoi là có ý nghĩa, chênh lệch nồng độ nhỏ hơn 10% được coi là không thay đổi.Nhân x ét:- Trong số 17 mẫu nuôi cấy PBMC của bệnh nhân ung thư ĐTT, Aslem làmtăng chế tiết JL-2 ở 7 mẫu (41,2%) và tăng IFNy ở 6 mẫu (35,3%).- Trong số 12 mẫu nuôi cấy PBMC của người khỏe mạnh, Aslem làm tăng chếtiết IL-2 ở 7 mẫu (58,3%) và tăng IFNy ở 4 mẫu (33,3%)- - Có một số mẫu không đáp ứng vói Aslem và một số mẫu giảm chế tiết IL-2,IFNy khi có thêm Aslem trong môi trường nuôi cấy.Nồng độ cytokin type n trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng3.7 và 3.8 .Bảng 3.7. Nồng độ IL-4 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bàoBệnh nhân(n=17)Nhóm chứng(n=12)Lô 1Lô 2PHA 3ịj.g/mlPHA 3ịig/ml +Aslem 0,15p,g/ml(1) 40,2 (32,7-5-47,2)(3)37,4 (28,1 - 215,7)(2) 36(4)36,5 (26,7(27,1-48,1)Pl.2= 0,069p 1.3 = 0,150p 3_4= 0,556p 2-4= 0,799225,5)Nhân x ét:- Khi không có Aslem, nồng độ IL-4 có xu hướng tăng cao ở nhóm bệnh nhânso với nhóm chứng (p J.2= 0,069).- Khi có Aslem, nồng độ IL-4 không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhómchứng (p3_4= 0,556).- Nồng độ IL-4 khi có và không có Aslem ở nhóm bệnh và nhóm chứng khácbiệt không có ý nghĩa thống kê= 0,15 vói nhóm bệnh, p2_4 = 0,799 vói(P j.3nhóm chứng).-46- Bảng 3.8. Nồng độ EL-10 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bàoBệnh nhân(n=17)Nhóm chứng(n=12)Lô 1Lô 2PHA3ịig/mlPHA 3[j.g/ml +Aslem 0,15ịj,g/ml(1) 148,1 (45,9 - 530,2)(3)145,9 (35,8 - 508,4)(2) 47,4 (30,5-5-197,2)(4)55,6 (28,1 - 242,1)p J_2 = 0,003p 1.3 = 0,643p 3-4= 0,043p 2.4 = 0,755Nhân xét:- Khi không có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh tăng cao có ý nghĩa thốngkê so với nhóm chứng (pt_2= 0,003).- Khi có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng có ý nghĩathống kê (p3_4= 0,003).- Sự khác biệt về nồng độ IL-10 khi có và không có Aslem không có ý nghĩathống "kê ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng (Pi.3 = 0,643 vói nhóm bộnh,P2-4= 0,755 với nhóm chứng). Phân bố nồng độ IL-4 và EL-10 được mô tả trong hình 3.3. Gạch ngang thểhiện giá trị trung vị của mẫu.IL-4 {pgầiii)IL-4 (pg/mi)Nlióiii clúnia:200 .0 '1501D0D'50.0 ‘_ ^rI*0.Dcủa tế bào Lympho Test gây độc vói tế bào ung thư Thử nghiệm ức chế di chuyển bạch cầu Thử nghiệm ức chế khả năng kết dính của bạch cầu Khả năng sản xuất cytokin Khả năng sản xuất kháng thể Một số khối u có khả năng chế tiết các cytokin. .. gen và tổng hợp protein; các yếu tố hoại tử khối u (TNF: Tumor Necrosis Factor) gây chết tế bào mà không làm thay đổi biểu hiện gen • Vé pham vi tác dung: Các cytokin thể hiện tác dụng lên những tế bào lân cận (tác dụng kiểu paracrine), tác dụng lên chính tế bào tiết ra cytokin đó (tác dụng kiểu autocrine), ít khi gây tác dụng toàn thân (systemic) nghĩa là tác dụng lên những tế bào của các cơ quan ở. .. ức chế sự phát triển và biệt hóa của dòng tế bào Thl, ức chế sự tổng hợp và chế tiết của IL2 và EFNy, ức chế biểu hiện của phức hợp hòa họp tổ chức lóp n (MHC n), các phân tử đồng kích thích trên ĐTB và các tế bào trình diện kháng nguyên Ngược lại, IL-10 kích thích sự phát triển và họat hóa chức năng của tế bào lympho B Do có khả năng ức chế tế bào lympho Thl và các bạch cầu đơn nhân khác, IL-10 có... tế bào Tc là T CD8+, tế bào T CD4+ chiếm khoảng 10% Tế bào T CD8+nhận diện kháng nguyên trình diện bởi MHCI b Tê bào NK (Natural Killer Cells) và tế bào K (Killer Cells) Các tế bào NK là những lymphocyte có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không cần phải mẫn cảm trước Sau khi được hoạt hóa bởi IL2 và IFNy, tế bào NK có'thể ly giải được nhiều loại tế bào ung thư, kể cả những tế bào được coi là có... lympho B, đại thực bào, tế bào Mast; kích thích TCD4+ biệt hóa thành Th2 đồng thời kìm hãm sự phát triển của tế bào Thl, kích thích tế bào lympho B phát triển, biệt hoá và chế tiết Ig, chủ yếu là IgE ; ức chế độc tính của đại thực bào, ức chế sự hoạt hóa đại thực bào của IFNy IL-4 đối kháng tác dụng của phần lớn các cytokin type I - 16 - 1.2.7 Interleukin-10 (EL-10) IL-10 lần đầu tiên được, mô tả vào... cơ chế đặc hiệu và không đặc hiệu, cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào, trong đó miễn dịch qua trung gian tế bào đóng vai trò quan trọng nhất Các tế bào chính tham gia vào miễn dịch chống lại khối u bao gồm : Tc, NK và ĐTB a Tế bào T gây độc (Tc : Cytotoxic T Lymphocyte): Là những tế bào lympho T có khả năng nhận dạng và ly giải các tế bào biểu hiện kháng nguyên lạ Đa số các tế bào. .. ADN và dẫn đến apoptosis Tế bào T CD8+ tiêu diệt tế bào đích bằng cách giải phóng các hạt chứa perforin , Granzyme và thông qua Fas ligand Tế bào T CD4+ không có cấu tạo hạt, tiêu diệt tế bào đích thông qua Fas ligand Tế bào NK tiêu diệt tế bào đích thông qua giải phóng hạt chứa Perforin và Granzyme c Đại thực bào (Macrophage) Các đại thực bào có tính độc khá đặc hiệu với tế bào ung thư Tế bào lympho. .. mới có khả năng truyền túi hiệu vào nội bào, trong đó chuỗi y có tác dụng truyền tin Trong đáp ứng miễn dịch, IL-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển và biệt hóa các dòng tế bào lympho T đặc hiệu vói kháng nguyên Ngoài tác dụng autocrine lên chính tế bào tiết ra nó, DL-2 còn có tác dụng lên các tế bào lân cận (paracrine), kích thích gây độc tế bào (cytotoxicity) của các tế bào T... diệt kháng nguyên 1.1.3 Tế bào lympho B Tế bào lympho B đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch thể dịch Tế bào lympho B lưu hành trong máu chưa có khả năng sinh kháng thể, chỉ khi có đáp ứng với sự kích thích của kháng nguyên thì mới phát triển và biệt hóa thành các tương bào (plasma cell) có khả năng tổng hợp và tiết kháng thể đặc hiệu Màng tế bào lympho B có thụ thể của lympho B (BCR: B Cell... chỉ có ở tế bào ung thư, không có ở tế bào bình thư ng - 18 - • Kháng nguyên liên kết với khối u (TAA - Tumor Associated Antigen) : là kháng nguyên có ở tế bào ung thư và một số tế bào thư ng 1.3.2.Đáp ứng miễn dịch chống lại khối u Các kháng nguyên TSA, TAA có thể bong ra khỏi màng tế bào ung thư, đổ vào tuần hoàn, gây ra đáp ứng miễn dịch chống lại khối u Cơ thể đáp ứng với kháng nguyên ung thư thông ... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Đối tượng nghiên cứu : Nghiên cứu thực hai nhóm : bệnh nhân ung thư đại trực tràng người cho máu A Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Các bệnh nhân ung thư đại. .. bệnh nhân ung thư đại trực tràng vời hai mục tiêu cụ thể sau: Nghiên cứu tình trạng suy giảm miễn dịch bệnh nhân ung thư đại trực tràng thông qua khả chuyển dạng chế tiết cytokin tế bào lympho máu. .. muốn nghiên cứu sâu thêm dược lý miễn dịch lâm sàng Aslem ung thư đại trực tràng, tiến hành đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng Aslem lên khả chuyển dạng chê tiết cytokine tế bào lympho máu ngoại vi bệnh
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu tác dụng của aslem lên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào lympho máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, Nghiên cứu tác dụng của aslem lên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào lympho máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, Nghiên cứu tác dụng của aslem lên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào lympho máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn