BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỪ MEN RƯỢU ĐỂ LÊN MEN CỒN TRÊN CƠ CHẤT BÃ MÍA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN BÙI THỊ NGỌC HÂN PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV:3108489 LỚP:VI SINH VẬT HỌC Cần Thơ, Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỪ MEN RƯỢU ĐỂ LÊN MEN CỒN TRÊN CƠ CHẤT BÃ MÍA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN BÙI THỊ NGỌC HÂN PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV:3108489 LỚP:VI SINH VẬT HỌC Cần Thơ, Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Võ Văn Song Toàn Bùi Thị Ngọc Hân Trần Nhân Dũng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… ……...…………………………………………………………………………………… ……...…………………………………………………………………………………… ……...…………………………………………………………………………………… ……...…………………………………………………………………………………… ……...…………………………………………………………………………………… ……...…………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày ...... tháng ...... năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn, đó chính là động lực giúp tôi vượt qua khó khăn hoàn thành đề tài luận văn. Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Thầy Trần Nhân Dũng, thầy Võ Văn Song Toàn, người thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này. Tôi cũng chân thành cám ơn tất cả các thầy cô trong Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tận tình truyền dạy những kiến thức hữu ích giúp cho việc thực hiện đề tài được thuận lợi cũng như định hướng cho nghề nghiệp của tôi trong tương lai. Cô Nguyễn Thị Pha, cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học Khóa 36 đã động viên và khích lệ tinh thần trong suốt thời gian học tập tại trường. Cám ơn các cô chú công nhân viên của Viện đã giúp đỡ trong quá trình làm việc trong và ngoài giờ để tôi hoàn thành đề tài đúng tiến độ quy định Tôi cũng vô cùng biết ơn tất cả các thành viên trong phòng CNSH Enzyme, các anh chị K35 TT, các bạn VSV K36, CNSH K36 đã tận lực giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Thân gửi đến tập thể lớp Vi sinh vật học Khóa 36 lời cảm ơn chân thành, đã tiếp thêm động lực cho tôi hoàn thành đề tài này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống. Cuối lời, kính chúc mọi người luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, vui vẻ và thành đạt. Xin trân trọng cám ơn! Bùi Thị Ngọc Hân Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT TÓM LƯỢC - Đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ chất bã mía” được thực hiện nhằm mục đích tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng lên men cồn trên cơ chất bã mía. Kết quả đã phân lập được 18 dòng nấm men từ các viên men khác nhau ở 3 tỉnh (thành phố) Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang. Các dòng nấm men được khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase: có 10 dòng (H5, H6, H7, H9, H10, H12, H13, H15, H16, H18) có hoạt tính exoglucanase, hoạt tính endoglucanase chưa thể hiện ở 18 dòng nấm men được phân lập. Kết quả lên men trong ống Durham của 18 dòng nấm men cho thấy bốn dòng nấm men H6, H9, H10, H13 có khả năng lên men một số loại đường D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose lần lượt là 30 cm, 30 cm, 30 cm, 30 cm (D-Glucose), 30 cm, 25,67 cm, 17, 33 cm, 17,67 cm (D-Mannose) và 25 cm, 21,33 cm, 28,33 cm, 30 cm (D-Galactose) . Bốn dòng nấm men này được chọn để đánh giá khả năng sử dụng bã mía cho quá trình lên men cồn, thông qua một số chỉ tiêu như thể tích khí, độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, hàm lượng DM và CF giảm đi. Chúng tôi kết luận rằng NT14 (dòng nấm men H13 và tổ hợp vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32) có khả năng lên men trên cơ chất bã mía tốt nhất. Kết quả lên men của dòng nấm men H13 qua các chỉ tiêu khí CO2, nồng độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, lượng DM và CF mất đi đạt các giá trị cao nhất so với các dòng còn lại còn lại, kết quả lần lượt là 44 ml, 4,33, 2,23 g/ls, 0,483 g/l, 9,62% và 27,57%. Từ khóa:, bã mía, ethanol, lên men, nấm men, vi khuẩn. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC................................................................................................................ i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. v TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................................... vi CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU........................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1. Giới thiệu chung về men rượu. .............................................................................. 3 2.2. Giới thiệu chung về nấm men ............................................................................... 4 2.2.1 Hình dạng và kích thước của nấm men ....................................................... 4 2.2.2. Cấu tạo của nấm men................................................................................. 6 2.2.3. Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men ................................................. 6 2.2.4. Vai trò và ứng dụng của nấm men ............................................................. 7 2.3. Sự lên men ethanlol .............................................................................................. 7 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men ..................... 11 2.5 Ethanol sinh học .................................................................................................. 12 2.5.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước.................................... 12 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước ................................... 14 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 16 3.1. Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................... 16 3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 16 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ....................................................................... 16 3.1.3. Nguyên vật liệu ....................................................................................... 16 3.1.4. Xử lý số liệu, phân tích thống kê ............................................................. 17 3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ............................................ 17 3.2. Phương pháp nghiên cứu. .................................................................................... 18 3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nâm men từ men rượu .......................... 18 3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men ....................... 19 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men ..................... 19 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường ................. 20 3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với các dòng vi khuẩn .................................................................. 20 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 23 4.1. Phân lập các dòng nấm men từ men rượu ........................................................ 23 4.2. Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men ..................................................... 25 4.3. Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men. .................................................. 26 4.4. Khảo sát khả năng lên men một số loại đường. ............................................... 26 4.5 Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với vi khuẩn ..................................................................................................................... 30 4.5.1 Thể tích cột khí ......................................................................................... 30 4.5.2 Đo pH trước và sau lên men ..................................................................... 31 4.5.3 Định lượng đường khử ............................................................................. 32 4.5.4 Định tính độ cồn bằng cồn kế ................................................................... 33 4.5.5 Chuẩn độ dung dịch sau chưng cất............................................................ 34 4.5.6 Kết quả phân tích DM............................................................................... 35 4.5.7 Kết quả phân tích CF ................................................................................ 36 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 38 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 38 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 38 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 39 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC 3: PHỤ LỤC THỐNG KÊ Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần hóa học của nấm men .................................................................. 6 Bảng 2. Thành phần môi trường Potato Glucose Agar (PGA) .................................... 17 Bảng 3. Thành phần môi trường Potato Glucose (PG)................................................ 17 Bảng 4. Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bò ................................ 18 Bảng 5. Thành phần môi trường cải tiến nuôi sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò ................. 18 Bảng 6. Bảng phân bố NT ......................................................................................... 21 Bảng 7. Đặc điểm của các dòng nấm men phân lập .................................................... 24 Bảng 8. Chiều cao cột khí CO2 (mm) trong ống Durham ............................................ 27 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Tế bào nấm men .............................................................................................. 4 Hình 2. Các dạng tế bào nấm men khác nhau quan sát dưới kính hiển vi điện tử .......... 5 Hình 3. Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2 ............................. 10 Hình 4. Biểu đồ đường kính vòng halo của các dòng nấm men .................................. 25 Hình 5. Biểu đồ chiều cao cột khí sau 168 giờ ........................................................... 31 Hình 6. Biểu đồ đường khử sau lên men .................................................................... 32 Hình 7. Biểu đồ độ cồn sau chưng cất ........................................................................ 33 Hình 8. Biểu đồ lượng ethanol (g/l)............................................................................ 34 Hình 9. Biểu đồ lượng DM giảm sau lên men ............................................................ 35 Hình 10. Biểu đồ lượng CF giảm sau lên men ............................................................ 36 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CF Crude fibre, xơ thô CMC Carboxymethyl cellulose DM Dry matter, khối lượng vật chất khô DC Đối chứng g Gram ml Mililiter mm Milimeter NM Nấm men nm Nanometer NT Nghiệm thức OD Optical density TN Thí nghiệm µl Microliter Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Mỹ và Brazil đã thành công trong việc sản xuất ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía. Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học. Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam. Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nông nghiệp. Trong đó, bã mía là loại phụ phẩm có chứa đáng kể hàm lượng cellulose và các loại lignocellulose khác. Theo kết quả của Tổng cục thống kê, năm 2012 cả nước có khoảng 297,9 nghìn ha trồng mía với sản lượng cả nước đạt khoảng 19040,8 nghìn tấn. Vì thế lượng bã mía thải ra hàng năm rất lớn, gây nguy cơ ô nhiễm môi trường cao. Để tận dụng nguồn bã mía thải ra hằng năm và góp phần giảm thiểu tác động đến môi trường cũng như giải quyết vấn đề năng lượng, sử dụng bã mía như nguồn nguyên liệu đầu vào để sản xuất ethanol là hướng đi mới đầy tiềm năng và triển vọng ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay. Việc nghiên cứu sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu hợp chất carbonhydrat làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu có sử dụng sự trợ giúp của các vi sinh vật đang là một trong những giải pháp đầy hứa hẹn cho việc thay thế cho nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt, giảm thiểu sự tác động của môi trường là một trong những hướng nghiên cứu đang dần thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Trong lên men ethanol sinh học, giai đoan lên men là một giai đoạn quan trọng. Trong đó nấm men giữ vai trò quyết định trong quá trình lên men. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi, đặc biệt hiện diện nhiều trong đất trồng hoa quả và các nhà máy chế biến đường. Ngoài ra, chúng còn xuất hiện trong trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang. Nấm men lên men ethanol thường được phân lập từ quá trình lên men rượu, bã quả, mật rỉ của củ cải đường hay mía đường,... Trên bánh men là sản phẩm hỗn hợp phong phú của vi sinh vật, trong đó có nấm men. Các loài Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 1 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT nấm men thường gặp là Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Pichia anomada,… và một số nấm men dại khác. Đây là nguồn phân lập nấm men cho quá trình lên men ethanol. Do đó đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ chất bã mía” được tiến hành. 1.2. Mục tiêu đề tài Tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sử dụng cơ chất bã mía để lên men cồn. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về men rượu. Thực chất men rượu là môi trường không thuần khiết của hệ sinh vật có khả năng sinh trưởng, tổng hợp hệ enzyme đường hóa và lên men rượu. Nói cách khác, hệ vi sinh vật trong men rượu rất đa dạng. Trong đó, có ba loài phổ biến nhất, có số lượng đông đảo nhất và có vai trò quan trọng nhất: nấm men, nấm mốc và vi khuẩn. Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy các giá trị pH bánh men rượu ở Việt Nam trong khoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,6, hàm lượng vi sinh vật trong nấm men tương ứng là vi khuẩn 2,6 × 106, nấm mốc 3,4 × 10 6, nấm men 5,8 × 107 CFU/gram bánh men rượu. Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào nấm mốc, 51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn. Nấm mốc thường có mặt trong bánh men chủ yếu là các chủng Rhizopus, Mucor, Aspergilluls, Amylomyces. Chúng giữ vai trò đường hóa( Trần Thị Thanh,2001). Loài Mucor, đặc biệt là Mucor rouxii có khả năng chịu nhiệt cao (32-35oC), chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Nấm men gồm hai chi khác nhau là Endomycopsis fibuligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamilase, do đó chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa; và Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccarose, maltose, fructose, raffinose, galactose. Chúng có khả năng lên men ở nhiệt độ cao (khoảng 36-40 oC) và có khả năng chịu được acid. Đặc biệt có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,020,025% và có khả năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12-14% có khi đến 16-18%. Nồng độ rượu trong dịch lên men là 10-12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28-32oC. Ngoài hai chi nấm men kể trên, trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loài nấm men hoang dại khác nhau. Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển hóa đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hóa này còn rất thấp. Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao có khi tới 60-65oC và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,05-1% (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Ngoài ra trong bánh men thuốc bắc còn có sự hiện diện của một số loài vi khuẩn phát triển, trong đó chủ yếu là các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Các loài vi Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT khuẩn thường làm chua môi trường. Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm mốc phát triển, tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men. Mặt khác nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic. Quá trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành (Nguyễn Thị Hiền, 2004) 2.2. Giới thiệu chung về nấm men. Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào sản xuất các loại thực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì… Hình 1. Tế bào nấm men (* Nguồn: http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8485043/1/, ngày 20.7.2013) 2.2.1. Hình dạng và kích thước của nấm men Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: do cấu tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn lạc có những đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường tròn, không đều hoặc hình thoi, bìa của khuẩn lạc thường là bìa nguyên, chia thùy, gợn sóng hoặc răng cưa (Huỳnh Xuân Phong, 2010). Hình dạng tế bào: Nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình ovan và có cả Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 4 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT dạng hình dài. Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur, 2006). Kích thước tế bào: Nấm men là loài vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích thước của nấm men khác nhau tùy theo loài và thời kỳ sinh trưởng của nấm men. Saccharomyces cerevisiae là nấm men thường được sử dụng trong lên men rượu, bia có kích thước chiều rộng khoảng 2,5 – 10µm và chiều dài 4,5 – 21µm, có thể thấy rõ dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Hình 2. Các dạng tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử. (*Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm, ngày 20/07/2013) 2.2.2. Cấu tạo của nấm men Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) nấm men có thành phần hóa học như sau: Bảng 1: Thành phần hóa học của nấm men Các chất Thành phần (%) Các chất Thành phần Carbon 49,8 Na2O - Nitơ 12,4 MgO 0,42 Hydro 6,7 CaO 0,38 P2O5 3,54 Fe2O3 0,035 K2O 2,34 SiO2 0,09 SO3 0,04 (*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 5 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm, chiếm 15 – 30% trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối lượng thành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid. Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau, được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và một ít polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme. Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,… 2.2.3. Sự sinh sản và phát triển của nấm men Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. - Sinh sản vô tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans). - Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales. Nấm men là các vi sinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển. Nguồn carbon được nấm men sử dụng hầu hết là đường sáu carbon như glucose và fructose hoặc các đường đôi như sucrose hoặc maltose. Một số loài có thể sử dụng đường năm carbon (đường ribose). Nguồn nitrogen cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitrogen của tế bào là các hợp chất hữu cơ hay vô cơ có sẵn trong môi trường. Nấm men có khả năng tổng hợp tất cả acid amin. Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat. Song, giống Hansenula và giống Pichia lại đồng hóa được chất này. Một số loài thuộc giống Brettanomyces cũng đồng hóa được nitrat. Về nhu cầu dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ, phospho là nguyên tố được quan tâm nhiều nhất, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh,.. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 6 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Nấm men có thể tồn tại được trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí với khoảng nhệt độ tương đối rộng và pH acid thích hợp cho sự phát triển của nấm men. 2.2.4. Vai trò và ứng dụng của nấm men Nấm men có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùng trong sản xuất ethanol, bánh mì, rượu vang, bia, tạo sinh khối protein và vitamin, sản xuất enzyme, acid citrid… Trong đó việc ứng dụng nấm men vào việc lên men các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất đáng được quan tâm, nguồn ethanol giá thành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về nhiên liệu và ô nhiễm môi trường. 2.3. Sự lên men ethanol Lên men ethanol là quá trình chuyển hóa đường thành ethanol được thực hiện bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhưng chủ yếu là nấm men. Trong công nghiệp cồn, bia, rượu, các loại nước uống có cồn, người ta thường sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces trong quá trình lên men tạo ethanol. Ethanol được sản xuất chủ yếu từ các loại nguyên liệu từ thực vật có chứa đường, hoặc tinh bột và cellulose thông qua phản ứng trung gian thủy phân tạo đường. - Các cơ chất có hàm lượng đường cao thường được dùng để lên men ethanol thường là: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín; sự lên men từ các nguyên liệu này được thực hiện trực tiếp mà không thông qua quá trình thủy phân tạo đường. - Những cơ chất giàu tinh bột như: gạo, lúa mì, ngô, khoai mì, khoai tây, khoai lang…, đối với các loại nguyên liệu này cần phải có quá trình thủy phân tinh bột tạo đường cho nấm men sử dụng để lên men tạo ethanol. (C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6 (tinh bột) (glucose) C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 (glucose) (ethanol) - Các nguồn nguyên liệu chứa cellulose như: gỗ, giấy, bã mía… cũng có thể sử dụng để sản xuất ethanol nhưng việc xử lý để phân cắt cellulose tạo glucose khó khăn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 7 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT và tốn kém. Các phương pháp xử lý được áp dụng gồm có xử lý cơ học, hóa học và sinh học (dùng vi sinh vật). Quá trình chuyển hóa sinh khối cellulose thành ethanol yêu cầu việc xử lý nguyên liệu thành đường đơn sẵn sàng cho quá trình lên men. Thủy phân hỗn hợp cellulose khó hơn thủy phân tinh bột vì hỗn hợp cellulose là tập hợp các phân tử đường liên kết với nhau thành mạch dài (polyme carbonhydrat) gồm khoảng 40 - 60% cellulose và 20 - 40% hemicellulose, có cấu trúc tinh thể bền. Hemicellulose chứa hỗn hợp các polyme có nguồn gốc từ xylose, mannose, galactose kém bền hơn cellulose. Nói chung hỗn hợp cellulose khó hòa tan trong nước. Phức polyme thơm là lignin (10 - 25%) không thể lên men vì khó phân hủy sinh học. Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ thể là tiền xử lý, thủy phân và lên men. Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn với các enzyme sau khi tiền xử lý. Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó là cơ chất cho quá trình lên men. Cellulose là thành phần quan tâm chính và có thể xử lý bằng phương pháp hóa học hoặc thủy phân bằng enzyme để tạo thành glucose làm chất nền chính trong quá trình lên men ethanol. Hemicellulose có cấu trúc nhỏ gọn hơn so với cellulose và có thể bị phân hủy đáng kể hoặc hòa tan trong tiền xử lý. - Tiền xử lý cellulose: Nhằm tạo ra một dạng cellulose đơn giản hơn để cho quá trình thủy phân dễ dàng hơn, các enzyme có thể tiếp xúc tối đa với cơ chất tương thích. Phương thức và hiệu quả của quá trình tiền xử lý thay đổi nhiều tùy thuộc vào đặc tính cấu trúc của nguồn nguyên liệu được lựa chọn. Các phương pháp xử lý được áp dụng gồm có xử lý cơ học, hóa học và sinh học (dùng vi sinh vật). Xử lý cơ học làm giảm kích thước nguyên liệu, các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Trong đó phương pháp xử lý bằng hơi nước được xem là hiệu quả hơn hết. Sử dụng tác động của hóa chất. Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid. Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nó rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 8 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH. Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hóa chất khác. Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp. Detroy et al (1992) cho thấy rằng amonia lỏng có phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine có thể còn hiệu quả hơn. Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2, NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên xử lý bằng phương pháp hóa học gây nhiều tốn kém và ảnh hưởng nặng đến môi trường, do đó hiện nay phương pháp sinh học đang dần được được hoàn thiện để thay thế toàn phần hay sử dụng kết hợp với các phương pháp hóa học. Phương pháp xử lý sinh học sử dụng loại nấm như Cyathus sp, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida và Peurotus cornucopiae có khả năng thủy phân lignin và hỗ trợ một phần thủy phân nguồn nguyên liệu cellulose. - Thủy phân bằng enzyme: Quá trình tạo hỗn hợp đường từ cellulose bắt đầu bằng giai đoạn vi khuẩn phân giải cellulose tổng hợp enzyme nhằm phân cắt mạch polymer của cellulose thành các cấu trúc đơn giản hơn và theo sau đó là quá trình thuỷ phân các cellulose đơn giản thành hỗn hợp đường. Quá trình này gây tiêu tốn nhiều chi phí trong giai đoạn sản xuất cồn. Bằng kỹ thuật di truyền, các nhà nghiên cứu đang hướng đến tạo ra một tổ hợp enzyme có thể thủy phân nguồn nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất. Thủy phân hoàn toàn nguồn lignocellulose cần có những sự chuyển đổi các nhóm polysaccharide sau: Chuyển hóa cellulose: Cellulose là loại polysaccharide đồng hình được cấu tạo từ -D-glucose thông qua liên kết -(1-4) glycoside thành từ các đơn phân Quá trình thủy phân bằng tổ hợp enzyme cellulase bao gồm exoglucanase (-cellobiohydrolase), endoglucase, –glucosidase và sản phẩm cuối cùng là glucose. Chuyển hóa hemicellulose: hemicellulose là thành phần dồi dào nhất thứ 2 trong nguồn nguyên liệu lignocellulose (25-30%). Hemicellulose là một loại polymer dị hình được tạo bằng các đơn phân pentose (D-xylose, D-arabinose), đơn phân hexose (D-mannose, D-glucose, D-galactose) và các acid đường. Xylan là thành phần thường Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 9 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT thấy trong các thân gỗ cứng, tuy nhiên glucomanan lại là thành phần chính trong các loại thực vật thân mềm. Tổ hợp enzyme để thủy phân hemicellulose cũng rất phức tạp. Ví dụ -xylanse để thủy phân xylan thì tổ hợp enzyme cần thiết là endo-1,4-Larabinofuranosidase, -glucuronidase và -xylosidase. Nguồn enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay là từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger. Đa số vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose cũng có khả năng tổng hợp xynalase để phân hủy xylan. Khả năng này thường thấy ở vi sinh vật sống trong dạ cỏ động vật nhai lại như: Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio, Ruminococus và các vi khuẩn chi Clostridium. Hiện nay, người ta đang thay thế dần các hệ enzyme chịu nhiệt, chịu các điều kiện hóa học quá hạn. Hơn hết là các nghiên cứu về phức hợp cellulosome của các vi khuẩn kỵ khí đang dần mở ra một con đường mới nhằm tăng hiệu quả thủy phân của tổ hợp trên các loại nguyên liệu lignocellulose. - Cơ chế của quá trình lên men ethanol từ glucose Lên men ethanol là quá trình trao chuyển hóa dưới tác dụng của chất xúc tác là enzyme. Đây là quá trình lên men kỵ khí dưới sự có mặt của nấm men tạo thành ethanol và giải phóng khí CO2. Quá trình lên men rượu của nấm men gồm hai giai đoạn chính: - Tăng sinh khối nấm men: tế bào nấm men phát triển và tăng sinh khối, giai đoạn này cần sự hiện diện của oxy. - Lên men chuyển hóa đường thành rượu: quá trình này xảy ra dưới điều kiện kỵ khí theo sơ đồ sau:` Hình 3. Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2 (*Nguồn: Norr et al, 2003) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 10 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men - Dinh dưỡng Nitơ và nguồn carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men. Sự tương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Các chất bổ sung vào môi trường sinh trưởng có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm tăng sinh khối và sự sản sinh ethanol (Helena de Cruz et al, 2003). - Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men. Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28 – 30°C. Nhiệt độ khoảng hơn 50°C và dưới 0°C thì sự lên men hầu như bị đình trệ. Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũng như ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm. Trong công nghiệp lên men thực phẩm, nhiệt độ tối ưu của quá trình lên men có thể không trùng khớp với nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. - pH Nồng độ của ion H+ có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và ảnh hưởng lên sự phát triển của nấm men. Năng suất lên men ethanol cao nhất thường dao động ở pH 4,5 – 4,7. Khi pH được điều chỉnh lên 7 hoặc cao hơn thì acid acetic được tạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al, 2001). - Khí oxy và carbonic Nấm men là vi sinh vật vừa kỵ khí vừa hiếu khí. Trong điều kiện kỵ khí, chúng lên men đường tạo thành rượu và khí carbonic (CO2). Còn trong điều kiện đầy đủ oxy, chúng có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và nước, đồng thời sinh sản và phát triển mạnh. Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men. Trong điều kiện nhiệt độ cao, lượng khí hòa tan trong dung dịch lên men sẽ giảm xuống, tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men của nấm men. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 11 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) - Trường ĐHCT Nồng độ ethanol Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độ ethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men. Việc chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các dòng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men. Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 dòng nấm men từ viên men rượu, 9 dòng được chọn để khảo sát khả năng chịu độ cồn. Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy 7 dòng có khả năng chịu độ cồn trong khoảng 5 – 6% (w/v) ethanol và 2 dòng có khả năng chịu độ cồn thấp hơn từ 2,4 – 3% (w/v) ethanol. - Nồng độ dịch lên men Nồng độ dịch lên men được xác định bằng khối lượng đường sucrose trong dung dịch (độ Brix). Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi độ nhớt của môi trường tăng áp suất dẫn đến mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Nồng độ ethanol được sản sinh tăng cao cũng gây ức chế nấm men. Tuy nhiên nếu nồng độ dịch đường quá thấp thì sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất lên men, hao phí trong quá trình chưng cất. 2.5. Ethanol sinh học Ethanol sinh học (bio-ethanol) là một loại nhiên liệu sinh học dạng lên men và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, thường được sản xuất từ các loại cây nông nghiệp hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, lúa mạch, mía. Ngoài ra, ethanol sinh học còn được sản xuất từ cây có chứa cellulose. Cellulose đã được sản xuất thành công và đưa vào sử dụng làm nhiên liệu nhiều nước trên thế giới. Hiện nay, việc sản xuất ethanol từ các loại cây nông nghiệp có thể ăn được đang gây lo lắng về vấn đề an ninh lương thực. Chính vì vậy, thế giới đang đi theo hướng sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa hợp chất cellulose. 2.5.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước. Trần Diệu Lý (2008) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ bằng phương pháp nổ hơi, thủy phân bằng cellulase và lên men với Saccharomyces cerevisiae. Kết quả cho thấy từ 1 kg rơm thô sẽ thu được 204,16g glucose, qua đó thu được 113,72 g ethanol tương đương 144 ml ethanol. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 12 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Nguyễn Thị Hằng Nga (2009) nghiên cứu khả năng sản xuất ethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp. Đề tài đã xác định được điều kiện cho quá trình thủy phân bằng acid: H2SO4 2%, 121°C trong 1h, tỉ lệ nguyên liệu: acid là 1: 10 (w/v) thu được dịch sau thủy phân có hàm lượng đường khử là 4 g/l. Đề tài đã chọn chủng xạ khuẩn ACT 06 làm tác nhân cho quá trình thủy phân bằng vi sinh vật và chủng SA.03 là chủng nấm men có khả năng lên men cao làm tác nhân cho quá trình lên men. Kết quả cho thấy cần 7.787 kg thân cây ngô sau thu hoạch để sản xuất được dịch giấm chín chứa 1 lít ethanol. Nguyễn Xuân Cự (2010) nghiên cứu khả năng thủy phân bằng axít loãng và bước đầu đánh giá hiệu quả sản xuất ethanol sinh học từ thân cây ngô. Quá trình thủy phân thân cây ngô bằng H2SO4 2 % ở 121°C trong 60 phút có hàm lượng đường khử hình thành khá cao (4,2 g/l) khi tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 (w/v). Đây được xem là điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân thân cây ngô bằng acid loãng. Sử dụng Saccharomyces cerevisiae lên men có thể chuyển hóa khoảng 70% lượng đường khử trong dung dịch và lượng ethanol tạo thành có nồng độ 2,5% thể tích. Dựa trên các kết quả nghiên cứu này, có thể tính sơ bộ để sản xuất 1 lít etanol sinh học cần khoảng 3,24 kg nguyên liệu từ thân cây ngô. Đoàn Thị Ngọc Hân (2010) báo cáo đề tài luận văn “Bước đầu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm” đã khảo sát các điều kiện để tối ưu các quá trình lên men ethanol từ rơm. Qua đó kết luận bổ sung 2% H2O2 (v/v) trong 5% (w/v) cơ chất và xử lý mẫu ở 37°C trong 23 giờ, sau khi tiền xử lý, rơm được thủy phân ở điều kiện 3% (v/v) enzyme, 50°C, pH % trong 72 giờ sẽ thu được lượng đường khử là 0,455g/g rơm. Để thu được ethanol, bổ sung 0,3% (v/v) nấm men Saccharomyces cerevisiae vào dịch đường khử, sau 3 ngày lên men, lượng ethanol thu được là 3% (v/v). Tại Việt Nam, mẻ sản phẩm cồn sinh học ethanol đầu tiên được sản xuất dùng để pha vào xăng đã xuất xưởng ngày 5.8.2010. Đây là sản phẩm của nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học ethanol đầu tiên của Việt Nam, hoàn thành và đưa vào sản xuất tại Công ty cổ phần Đồng Xanh, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam. Từ năm 2011, Việt Nam có chính sách sử dụng xăng sinh học E5 (hàm lượng ethanol 5%) làm nguyên liệu thay thế cho xăng A92 truyền thống. Năm 2011, Việt Nam, đã sản xuất ethanol khoảng 0,3 triệu tấn/ năm. Mục tiêu của chính phủ tới Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 13 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT năm 2015 là 1,5 triệu tấn. Quy trình công nghệ sinh học sản xuất ethanol từ phế thải nông nghiệp của giáo sư Trần Đình Toại (2012) được xem là một sáng chế tiêu biểu của khoa học Việt Nam. Theo nghiên cứu thử nghiệm, cứ 1 kg rơm rạ sẽ thu được khoảng 0,4 kg cellulose, nếu chọn được các chủng vi sinh có hệ enzyme với hoạt tính cao thì hiệu suất của giai đoạn thủy phân có thể đạt 80-90%, có nghĩa là từ 0,4 kg cellulose sẽ thu được trung bình là 0,34 kg glucose, từ đó sản xuất ra ethanol. Bằng phương pháp trên, với lượng lớn phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) hiện nay của nước ta, nếu sử dụng 30% để sản xuất ethanol với hiệu suất 15%, chúng ta đã có thể thu được từ 3,6 đến 4,5 triệu tấn ethanol, vượt mục tiêu mà Chính phủ đặt ra tới năm 2015. 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước. Keikhosro Karimi et al (2006) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ bằng phương pháp tiền xử lý với acid loãng, thủy phân và lên men đồng thời với Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae. Một nghiên cứu của Rajeev Sukumaran và cộng sự (2009) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ nguồn sinh khối bã mía. Cơ chất bã mía được đường hóa với chủng vi sinh vật là Trichoderma reesei RUT C30 và Aspergillus niger MTCC 7956, sau đó được lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên men rắn. Kết quả sản xuất được 0,093 g ethanol trên mỗi gram rơm. Năm 2010, M.Lever và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học thành công từ rơm lúa mì bằng phương pháp lên men rắn với Saccharomyces cerevisiae, trước đó họ dùng dịch enzyme thô từ nấm mốc Trichoderma reesei để thủy phân vật liệu lignocellulose. Nasim Shaibani (2011) nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol sinh học từ bã mía. Kết quả nghiên cứu tiền xử lý bằng NaOH hiệu quả hơn Ca(OH)2, thủy phân bã mía bằng nấm Aspergillus niger hiệu quả hơn so với nấm Trichoderma longibrachiatum. Sau đó dùng phương pháp lên men rắn với Saccharomyces cerevisiae, kết quả có thể chuyển hóa 81% cơ chất bã mía cho quá trình sản xuất ethanol. Công trình nghiên cứu của Firoz Ahmed và cộng sự (2012) đã tiền xử lý bã mía bằng NaOH ở pH 4, 50°C trong 24 giờ, sau đó trích dịch enzyme thô từ Trichoderma viride cho quá trình thủy phân bã mía, nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng để lên men sau đó. Quy trình này đã sản xuất ra ethanol với nồng độ 0,579 % và Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 14 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 1,15%. Đây là báo cáo đầu tiên ở Bangladesh về sản xuất cellulose ethanol sử dụng các chủng vi sinh vật địa phương. Mặc dù nồng độ sản xuất ethanol là rất thấp, nhưng đây là một động lực lớn trong lĩnh vực này có thể tối đa hóa sản xuất, qua đó đáp ứng nhu cầu nhiên liệu trong tương lai. Hiện nay, tình hình sản xuất và sử dụng ethanol trên thế giới phát triển rất mạnh mẽ, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nhiên liệu sinh học là sản phẩm nông nghiệp, các loại hạt có dầu, rong tảo, cellulose và một phần nhỏ từ các loại mỡ cá, mỡ động vật nói chung. Tại Đông Nam Á, Thái Lan là nước đứng đầu về sản xuất và sử dụng ethanol làm nhiên liệu, khoảng 1,5-1,6 triệu tấn/năm. Brazil: sản lượng tiêu thụ ethanol đạt tới 14-15 triệu tấn/năm đứng đầu thế giới. Mỹ: Hình thành vành đai nông nghiệp gồm nhiều ban chuyên sản xuất ngô, làm nhiêu liệu cho hơn 50 nhà máy sản xuất ethanol sinh học với sản lượng tiêu thụ 13 triệu tấn/năm. Các nước Canada, Mexico, Pháp, Thụy Điển, Úc, Nam Phi, Trung Quốc... đều đã tùng bước phát triển công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học, chủ yếu là nhiên liệu hóa thạch pha ethanol sinh học. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 15 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Thời gian: từ tháng 8.2013 đến tháng 12.2013. 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), máy đo OD, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -4°C Akira (Việt Nam), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. Dụng cụ: Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500 ml, đĩa petri đường kính 10cm (Đức), ống nghiệm 10ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: ống Durham, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,… Hóa chất: Ethanol 95%, agar, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Xylose, CaSO4, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, sodium hidroxide (NaOH), K2Cr2O7 , Na2S2O3, H2SO4, KI,.. 3.1.3. Nguyên vật liệu Thu bã mía từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70 oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,1 mm. Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc nhiều lần để loại đường. Nguồn vi khuẩn: 3 dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ bò Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS321 do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ cung cấp. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 16 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Nguồn men rượu: men rượu được mua tại 3 tỉnh (thành phố) Cần Thơ (71/2, phường An Bình, quận Ninh Kiều, TP.Cần Thơ), Hậu Giang (ấp Tân Phú, xã Tân Bình, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang), Bến Tre (209, xã Phú Lễ, huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre). Viên men được nghiền mịn thành bột trước khi chủng vào môi trường. 3.1.4. Xử lý số liệu, phân tích thống kê Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Stagraphic XV. Kết quả ghi nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2007. 3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1) Bảng 2. Thành phần môi trường PGA Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml) Khoai tây 20 ml D-Glucose 20 (g) Agar 20 (g) Nước cất 1000 ml (*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003). Môi trường Potato Glucose (PG) (M2) Bảng 3. Thành phần môi trường Potato Glucose (PG) Hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml) Khoai tây 20 ml D-Glucose 20 (g) Nước 1000 ml (*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 17 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Bảng 4. Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bò (M3) Tên hóa chất K2HPO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O NaCl Bã mía Agar Nước cất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml) 1 (g) 1(g) 0,5 (g) 0,001 (g) 10 (g) 20 (g) 1000 (ml) (* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh., 2010) Bảng 5. Thành phần môi trường cải tiến nuôi sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò (M4) Tên hóa chất Khối lượng/ Thể tích Bột bã mía 10 (g) (NH4)2SO4 1 (g) KH2PO4 1 (g) K2HPO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Nước 1000 (ml) (* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010) 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nấm men từ men rượu Mục đích: Phân lập các dòng nấm men từ nguồn men Vật liệu: Bột viên men rượu thu về từ một số tỉnh (thành phố): Cần Thơ, Bến Tre, Hậu Giang. Tiến hành: - Chủng 1 g men rượu vào 100 ml môi trường M2, ủ lắc 38°C, lắc ngang 45 lần/phút, 48h. - Sau đó được cấy ria trên đĩa môi trường M1 ở 38°C trong 24 - 48 giờ. - Tiếp tục cấy ria trên đĩa petri đến khi xuất hiện khuẩn lạc rời rạc, quan sát trên kính hiển vi quang học ở vật kính 40X. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 18 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Chỉ tiêu theo dõi - Quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước, dạng bìa,… của khuẩn lạc nấm men. - Quan sát hình dạng, kích thước của tế bào nấm men. 3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men. Mục đích: Khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp exoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose. Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men), 3 lần lặp lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men. Tiến hành thí nghiệm: - Bơm 15 µl dịch nấm men có mật số 106 tế bào/ml vào mỗi giếng có đường kính lỗ đục 5 mm của môi trường M3. Ủ lắc ở 38°C, 24 giờ. - Khảo sát đường kính vòng tròn phân giải bã mía bằng cách nhuộm màu với Congo red. Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải bã mía Đường kính vòng tròn phân giải bã mía = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men. Mục đích: khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose. Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men), 3 lần lặp lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men. Tiến hành thí nghiệm: - Bơm 15 µl dịch nấm men có mật số 106 tế bào/ml vào mỗi giếng có đường kính lỗ đục 5mm của môi trường M3 (cơ chất CMC). Ủ ở 38°C, 24 giờ. - Khảo sát đường kính vòng tròn phân giải CMC bằng cách nhuộm màu với Congo red. Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải CMC Đường kính vòng tròn phân giải CMC = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 19 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường. Mục đích: tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men tốt nhất 4 loại đường tìm nguồn carbon nào là phù hợp nhất cho các dòng nấm men Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (nấm men:), 3 lần lặp lại. Tiến hành thí nghiệm: Chủng 10% v/v dịch huyền phù nấm men (mật số 106 tế bào/ml) vào 9 ml dung dịch các loại đường (D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Xylose) (2% w/v) vào ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ phòng.. Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao (mm) cột khí trong ống Durham sau 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ. 3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với vi khuẩn Mục đích: tuyển chọn được một số dòng nấm men có khả năng phối hợp với vi khuẩn để lên men cho hiệu suất cao Giống nấm men: các dòng nấm men lên men tốt từ các thí nghiệm trước. Vi khuẩn: 3 dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS321. Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 14 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 20 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Bảng 6. Bảng phân bố NT: NT Thành phần NT1 (DC) - VK - NM NT2 + VK - NM NT3 + VK (121°C) + H6 NT4 + VK (121°C) + H9 NT5 + VK (121°C) + H10 NT6 + VK (121°C) + H13 NT7 - VK + H6 NT8 - VK + H9 NT9 - VK + H10 NT10 - VK + H13 NT11 + VK + H6 NT12 + VK + H9 NT13 + VK + H10 NT14 + VK + H13 Trong đó: NT: Nghiệm thức. -VK không bổ sung vi khuẩn. + VK: Vi khuẩn nuôi trong môi trường M4 trong 3 ngày, ủ ở điều kiện kỵ khí, nhiệt độ 38°C. + VK (121°C): Vi khuẩn nuôi trong môi trường M4 trong 3 ngày, ủ ở điều kiện kỵ khí, nhiệt độ 38°C. Sau đó đem khử trùng ở 121°C, 20 phút. - NM: không bổ sung nấm men. Tiến hành thí nghiệm: - Chủng 1% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 tế bào/ml vào 100ml môi trường M3. Ủ ở điều kiện kỵ khí ở 38°C, 3 ngày vào các NT được phân bố như Bảng 6. - Chủng 10% (v/v) dịch nấm men có mật số 106 tế bào/ml vào bình 100ml vào các NT được phân bố như Bảng 6. - Tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng (22°C (đêm), 32°C (ngày)). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 21 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Chỉ tiêu theo dõi: - Số ml khí CO2 sinh ra sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ. - pH môi trường trước và sau khi lên men. - Hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men bằng phương pháp Nelson - Đo độ cồn bằng cồn kế. - Định lượng ethanol bằng Kali dicromat. - Hàm lượng DM, CF giảm của bã mía sau khi lên men. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 22 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập các dòng nấm men từ men rượu. Mười tám dòng nấm men được phân lập từ các nguồn men rượu ở ba tỉnh (thành phố) Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang. Các dòng nấm men phân lập không có sự khác biệt lớn về hình thái, kích thước khuẩn lạc: kích thước nhỏ (từ 1 đến 4 mm) đa số đều có bìa nguyên, trừ dòng H1, H5, H6, H15 (bìa gợn sóng), H7 (bìa răng cưa); màu trắng đục hoặc trắng trong; độ nổi phẳng (H12, H15, H16, H17), lài (H7, H8, H9, H10, H11, H18), 8 dòng nấm men còn lại khuẩn lạc mô. Khi quan sát qua kính hiển vi (ở vật kính 40X), tế bào nấm men có kích thước nhỏ, từ 1,01 đến 4,05 µm, các hình dạng quan sát được có sự khác biệt không lớn, đa số là hình tròn hoặc ovan, một số dòng hinh elip (H2, H7, H15) (Bảng 7). . Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 23 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Bảng 7. Đặc điểm của các dòng nấm men phân lập Tên STT mẫu Nguồn phân lập Đường kính khuẩn lạc (mm) Kích thước tế bào (µm) Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Hình dạng tế bào 1 H1 Bến Tre 2 - 2,5 1,01 × 2,03 Gợn sóng Mô Trắng đục Ovan 2 H2 Bến Tre 1,5 - 2 1,01 × 3,04 Nguyên Mô Trắng đục Elip 3 H3 Bến Tre 1,5 - 2,5 1,01 × 1,21 Nguyên Mô Trắng đục Tròn 4 H4 Bến Tre 1,5 - 2,5 1,01 × 1,52 Nguyên Mô Vàng nhạt Tròn 5 H5 Bến Tre 2 - 2,5 1,01 × 2,53 Gợn sóng Mô Vàng nhạt Ovan 6 H6 Bến Tre 1 - 1,5 1,32 × 1,52 Gợn sóng Mô Trắng đục Tròn 7 H7 Cần Thơ 2-3 1,01 × 4,05 Răng cưa Lài Vàng nhạt Elip 8 H8 Cần Thơ 1 - 1,5 1,01× 1,52 Nguyên Lài Trắng đục Tròn 9 H9 Cần Thơ 2 2,53 × 3,54 Nguyên Lài Trắng đục Ovan 10 H10 Cần Thơ 1,5 - 2 1,52 × 3,06 Nguyên Lài Trắng đục Ovan 11 H11 Cần Thơ 1,5 - 2 1,01 × 1,52 Nguyên Lài Trắng đục Tròn 12 H12 Cần Thơ 2 - 2,5 1,21 × 1,52 Nguyên Phẳng Trắng đục Tròn 13 H13 Hậu Giang 1-2 1,01 × 2,53 Nguyên Mô Trắng đục Ovan 14 H14 Hậu Giang 1 - 1,5 1,52 × 2,53 Nguyên Mô Trắng trong Ovan 15 H15 Hậu Giang 3-4 1,21 × 3,24 Gợn sóng Phẳng Vàng nhạt Elip 16 H16 Hậu Giang 2 - 2,5 1,01 × 1,21 Nguyên Phẳng Trắng đục Tròn 17 H17 Hậu Giang 1,5 - 2 1,11 × ,32 Nguyên Phẳng Trắng sữa Tròn 18 H18 Hậu Giang 1,5 - 2 1,01 × 1,52 Nguyên Lài Trắng đục Tròn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 24 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 4.2. Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men. Kết quả khảo sát định tính khả năng phân giải bã mía bằng phương pháp đo đường kính vòng tròn phân giải bã mía trên đĩa thạch có cơ chất bã mía của các dòng nấm men cho thấy hoat tính thủy phân khác nhau giữa các dòng nấm men (Hình 4). Cụ thể, 8 dòng nấm men H1, H2, H3, H4, H8, H11, H14, H17 không thể hiện hoạt tính thủy phân trên cơ chất bã mía, 10 dòng nấm men còn lại đều thể hiện đường kính tròn halo khác biệt có ý nghĩa thống kê. Dòng nấm men H13 có đường kính thủy phân lớn nhất 34,67mm, kết quả này có khác biệt ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại ở mức độ 5%. Bên cạnh đó, các dòng H10, H16, H5, H9, H12 cũng thể hiện hoạt tính thủy phân mạnh với đường kính vòng halo lần lượt là 30,33 mm, 29,33 mm, 29,33 mm, 28,67 mm và 27 mm. Ba dòng H7, H6, H15 có khả năng phân giải bã mía yếu hơn, đường kính vòng tròn halo nhỏ, có giá trị lần lượt là 24,67 cm, 22,33 cm và 20,67 cm. Hoạt tính phân giải yếu nhất là dòng H18 (3,33 cm). Theo Lj-Jung et al. (2010) ủ dịch enzyme cellulase với cơ chất cellulose là cách để xác định hoạt tính enzyme exoglucanase trong phức hệ enzyme cellulase. Điều này chứng tỏ H13, H10, H16, H5, H9, H12 là những dòng nấm men có hoạt tính exoglucanases mạnh. 40.00 a bc 30.00 e b bc d e 25.00 f g 20.00 15.00 10.00 h i i i i H2 H3 H4 5.00 H1 Đường kính vòng tròn halo (mm) 35.00 i i i i H18 H17 H16 H15 H14 H13 H12 H11 H10 H9 H8 H7 H6 H5 0.00 Dòng nấm men Hình 4. Đường kính vòng halo trên cơ chất bã mía của các dòng nấm men *Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sư khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, CV= 7,22%. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 25 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Theo Ahmed (1968), một số loài nấm men đã được kiểm tra sự hiện diện của glucanase. Dịch chiết được thu bằng cách phá vỡ tế bào của nấm men Saccharomyces cerevisiae, Fabospora fragilis và Hansenula anomala, thủy phân laminarin và pustulan tạo glucose. Hoạt tính enzyme cũng đã được phát hiện trong dịch môi trường của F. fragilis và H. anomala phát triển hiếu khí trong môi trường khoáng đệm với nguồn carbon là glucose. Mặc dù β-glucanase đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn và nấm (Reese, 1963), nhưng việc nghiên cứu ở nấm men thì ít được chú ý. Năm 1965, Brock đã tinh sạch được exo-glucanase từ men khô bánh mì. Tuy nhiên, hoạt tính của glucanse không tìm thấy ở dịch môi trường lỏng, điều này đã làm gián đoạn các nghiên cứu về glucanase. Qua thí nghiệm 2, có thể kết luận, các dòng nấm men H13, H10, H16, H5, H9, H7, H6, H15 là những dòng nấm men có hoạt tính exoglucanase mạnh trên cơ chất bã mía 4.3. Khảo sát hoạt tính endoglucanase của nấm men. Các dòng nấm men không thể hiện vòng halo trên môi trường cơ chất CMC, có thể kết luận các dòng nấm men chưa thể hiện hoạt tính endoglucanase với phương pháp nuôi cấy hiện tại. 4.4. Khảo sát khả năng lên men một số loại đường. Trong quá trình lên men của nấm men, hai sản phẩm chính là ethanol và CO2, để xác định hoạt lực của nấm men có thể dựa trên khả năng sinh khí CO2 trong quá trình lên men (Nguyễn Đức Lượng et al, 2003). Theo phương pháp này, hoạt lực của nấm men có thể được đánh giá thông qua lượng khí được sinh ra trong ống Durham, điều này giúp đánh giá sơ bộ được khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập. Kết quả lên men trong ống Durham được trình bày trong Bảng 8. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 26 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Bảng 8. Chiều cao cột khí CO 2 (mm) trong ống Durham D-Glucose D- Mannose D-Galactose Nấm men Chiều cao (mm) Nấm men Chiều cao (mm) Nấm men Chiều cao (mm) H12 0,2g H3 0,00i H3 0,00k H4 0,2g H12 0,00i H7 0,00k H3 0,2g H8 0,00i H18 0,00k H8 1,00fg H1 2,67h H15 0,00k H18 1,00fg H16 2,67h H1 0,00k H15 2,33ef H4 3,33h H17 0,00k H16 3,33e H18 6,00g H8 0,00k H1 3,33e H15 6,33g H4 0,00k H5 5,33d H7 8,000f H16 0,00k H11 6,00d H11 11,00e H11 0,00k H7 10,33c H17 11,333e H12 0,00k H17 12,00b H5 12,67d H5 1,00g H13 28,67a H10 17,33c H14 11,0f H14 30,0a H14 17,67c H2 12,67e H6 30,0a H9 25,67b H9 21,33d H10 30,0a H2 29,67a H6 25,0c H9 30,0a H13 30,0a H10 28,33b H2 30,0a H6 30,0a H13 30,0a *Ghi chú: Chiều cao tối đa ống Durham là 30mm. Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sư khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, %CV D-Glucose, D-Mannose, DGalactose lần lượt là 12, 47%, 3,,61% và 0,57%. 4.4.1. Khả năng lên men đường D-Glucose Khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập được thể hiện qua chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham và được đánh giá tại các thời điểm sau 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ. Kết quả cho thấy, 18 dòng nấm men đều có khả năng lên men đường glucose và không đồng nhất về khả năng lên men trong dung dịch đường, trong đó 6 dòng H2, H9, H10, H6, H14, H13 có khả năng lên men mạnh nhất có khác biệt ý nghĩa thống kê 5% so với các dòng còn lại, tạo ra lượng khí CO2 chiếm đầy ống Durham sau 48 giờ. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 27 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Kết quả đo chiều cao ống Durham cho thấy chiều cao cột khí CO2 tăng dần theo thời gian do nấm men biến dưỡng đường glucose và tăng sinh khối. Sau 12 giờ, đa số các dòng nấm men chưa lên men, số ít lên men yếu. Sau 24 giờ, một số dòng nấm men thể hiện khả năng lên men mạnh, trong khi đó một số dòng khác chưa lên men hoặc lên men ít tại thời điểm này. Các dòng nấm men tiếp tục phát triển và lên men làm tăng cột khí CO2. Đến mốc thời gian 48 giờ, 5 dòng nấm men đạt được chiều cao cực đại của ống Durham (30 mm) là H2, H9, H10, H6, H14. Đến 60 giờ, có thêm dòng H13 cho giá trị cực đại. Do đến mốc 48 giờ có 6 dòng nấm men lên men đầy ống Durham nên ta chọn mốc thời gian này để phân tích thống kê. 4.4.2. Khả năng lên men đường D-Mannose Kết quả cho thấy, 18 dòng nấm men này không đồng nhất về khả năng lên men trong dung dịch đường, trong đó 3 dòng H2, H13, H6 có khả năng lên mạnh nhất có khác biệt mang ý nghĩa thống kê 95% so với các dòng còn lại, tạo ra lượng khí CO2 chiếm đầy ống Durham sau 60 giờ. Kết quả đo chiều cao cột khí cho thấy lượng CO2 tăng dần theo thời gian do nấm men biến dưỡng đường mannose và tăng sinh khối. Khả năng lên men mannose của nấm men nhìn chung chậm hơn so với glucose. Sau 12 giờ, đa số các dòng nấm men chưa lên men, số ít lên men rất yếu. Sau 24 giờ, xuất hiện thêm bọt khí trong các ống Durham, trong khi phần lớn các dòng nấm men vẫn chưa lên men được. Sau 48 giờ, các dòng nấm men tiếp tục phát triển và lên men làm tăng cột khí CO2, trong khi có một số dòng bắt đầu lên men, riêng dòng nấm men H6 đã đẩy ống Durham hoàn toàn. Đến 60 giờ, có thêm dòng H13 cho giá trị cực đại, dòng H2 đạt giá trị 29,67 mm. Theo kết quả thống kê, 3 dòng H6, H13 và H2 có khả năng lên men D-Mannose mạnh nhất, đạt 30,00 cm. Bên cạnh đó, dòng H9, H10, H14 lên men D-Mannose khá mạnh, chiều cao đo được lần lượt là 25,67 mm, 17,33 mm và 17,33 mm sau 60 giờ. Có 3 dòng nấm men là H3, H8, H12 không lên men được đường D-Mannose. 4.4.3. Khả năng lên men đường D-Galactose Bảng kết quả cho thấy chỉ có 7 dòng nấm men có khả năng lên men đường DGalactose, đó là các dòng H13, H10, H6, H9, H2, H14, H5, H12, chiều cao của các dòng khác biệt có ý nghĩa thông kê ở mức tin cậy 95%. Các dòng nấm men trên đều bắt đầu lên men sau 24 giờ, và tiếp tục lên men đẩy chiều cao cột khí lên cao. Sau 60 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 28 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT giờ, chỉ có dòng nấm men H13 đẩy cột khí lên tối đa. Bên cạnh đó, các dòng H10, H6, H9 cũng có khả năng lên men D-Galactose khá mạnh, chiều cao cột khí sau 60 giờ lần lượt là 28,33 mm, 25 mm và 21,33 mm. 4.4.4. Khả năng lên men đường D-Xylose Sau 60 giờ, không thấy xuất hiện cột khí CO2 trong ống Durham, có thể kết luận các dòng nấm men không lên men được đường D-Xylose. Qua thí nghiệm 4, có thể nhận xét rằng tốc độ lên men của các dòng nấm men còn chậm. Do các dòng nấm men tăng sinh khối trong thời gian đầu, sau đó quá trình lên men diễn ra nên chiều cao của ống Durham trong thời gian đầu (12 giờ, 24 giờ) tăng chậm, sau đó quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ (36 giờ hoặc 48 giờ), đẩy nhanh cột khí trong ống Durham. Sau 60 giờ, quá trình lên men diễn ra chậm lại, do môi trường đã không còn nhiều dinh dưỡng, hoặc nấm men đã bước vào pha suy vong. Đối với đường hexose (D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose), đa số các dòng nấm men đều lên men được, riêng đối với D-Galactose chỉ có 7 dòng nấm men có thể men được loại đường này: H2, H5, H6, H9, H10, H13, H14. Galactose được xem là nguồn dinh dưỡng không thuận lợi cho nấm men, tuy nhiên, chúng có thể sử dụng D-Galactose như là nguồn carbon duy nhất khi glucose không hiện diện trong môi trường. Khi môi trường có glucose, gen phân giải galactose GAL sẽ bị ức chế, nếu môi trường thiếu nguồn dinh dưỡng glucose, gen này sẽ được hoạt hóa tăng gấp 1000 lần. Ba enzyme cần thiết cho quá trình phân giải galactose là Galactokinase, Galactose-1- puridyltransferase và UDP-glucose-4-epimaerase (Horst Feldmma, 2005). Ngoài đường hexose, nấm men có thể sử dụng một số nguồn carbon được xem là không thuận lợi như biopolymer, pentose, rượu, polyol, hydrocarbon, acid béo và acid t hữu cơ. Tất cả các dòng nấm men phân lập được đều không lên men được pentose. Trong tự nhiên, có rất ít các loài nấm men có thể lên men đường pentose mặc dù nhiều nấm men có thể phát triển trong môi trường giàu pentose trong điều kiện hiếu khí. S. cerevisiae không có khả năng sử dụng xylose như là một cơ chất (ví dụ như xylose có nguồn gốc từ hemicellulose). Xylose có thể bị phá vỡ bởi gen xylose reductase và xylitol dehydrogenase để lên men từ loài Pichia bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Tuy nhiên, hiệu quả của quá trình lên men xylose còn thấp, Cũng theo Horst Feldmma, một Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 29 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT số nấm men có thể sử dụng xylose để lên men tạo ethanol hoặc methanol. Các nấm men có thể lên men methanol đã được tìm thấy, ví dụ Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, một số loài Candida, và Torulopsis sonorensis. Từ các kết quả thí nghiệm trên, có 3 dòng nấm men chỉ lên men được một loại đường (D-Glucose): H3, H4, H12; có 15 dòng nấm men có thể lên men 2 loại đường (D-Glucose và D-Mannose): H1, H2, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11, H13, H14, H15, H16, H17, H18; có 7 dòng nấm men có thể lên men cả 3 loại đường: H2, H5, H6, H9, H10, H13, H14. Tuy nhiên dòng nấm men H2 và H14 không thể hiện hoạt tính exoglucanase trên cơ chất bã mía (thí nghiệm 2), khả năng lên men 3 loại đường của dòng nấm men H6 tốt hơn so với dòng H5, thể hiện qua các giá trị chiều cao cột khí lần lượt là 30,00 cm và 5,33 cm, 30,00cm và 12,67 cm, 25,00 cm và 1,00 cm. Do đó, chúng tôi tuyển chọn 4 dòng nấm men là H6, H9, H10 và H13 là những dòng nấm men tốt nhất, vừa có hoạt tính exoglucanase mạnh, vừa có khả năng lên men mạnh các loại đường. Bốn dòng nấm men này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. 4.5. Khảo sát khả năng phối hợp lên men của dòng nấm men với vi khuẩn 4.5.1. Thể tích cột khí Sau khi chủng nấm men mỗi nghiệm thức được theo dõi chiều cao cột khí sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ. Thể tích cột khí trong pit-tông tăng dần qua từng ngày, tuy nhiên tốc độ tăng còn chậm, các nghiệm thức tăng nhanh trong 24 giờ hoặc 48 giờ đầu đo nấm men có thể sử dụng cơ chất glucose có sẵn trong môi trường. Theo kết quả thống kê, thể tích cột khí có sự khác biệt mang ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. NT1 (DC) và NT2 không tạo bọt khí vì NT này không lên men tạo khí CO2 được. Biểu đồ bọt khí cho thấy NT14 tạo nhiều khí nhất (44ml), chúng tỏ quá trình lên men ở NT này diễn ra mạnh nhất, NT11, NT13 và NT12 lên men khá mạnh, có thể tích cột khí đo được sau 168 giờ lần lượt là 33 ml, 32 ml và 29,33 ml, các NT còn lại lên men khá yếu, có thể tích trong khoảng từ 14,33 ml đến 24,67 ml. Chỉ tiêu đo thể tích khí giúp đánh giá sơ bộ mức độ và tốc độ lên men của các NT, qua đó có thể nhận xét những NT có kết hợp lên men với vi khuẩn (NT11, NT12, NT13, NT14) thì hiệu quả hơn so với những NT còn lại. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 30 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 50.00 a 45.00 Thể tích khí (ml) 40.00 b 35.00 30.00 c d d 25.00 g 20.00 b e f fg h h 15.00 10.00 5.00 i i 0.00 Nghiệm thức Hình 5. Thể tích khí trong bình lên men sau 168 giờ. *Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sư khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, CV= 4,41%. 4.5.2 pH trước và sau lên men Mỗi nghiệm thức được đo pH trước và sau lên men. pH của môi trường trước lên men là 4,78. Sau khi lên men 7 ngày, mỗi nghiêm thức được đo pH, có sự thay đổi pH của môi trường trước và sau lên men. Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), các giá trị pH khác nhau của môi trường lên men sẽ thu nhận các sản phẩm khác nhau, trong môi trường acid (pH 4-5), nấm men sẽ lên men đường tạo phẩm chính là ethanol, trong môi trường kiềm, nấm men tạo glyceril là sản phẩm chính. Sau lên men, pH của NT1 là 4,89, pH của NT2 là 5,68 - khoảng pH này thích hợp với vi khuẩn phân giải cellulose ở điều kiên kỵ khí. pH của 13 NT còn lại dao động trong khoảng từ 3,75 đến 4,96 (Phụ lục 2), pH này nằm trong khoảng pH tối ưu của nấm men là 4-6, trong khi pH tối ưu cho quá trình lên men là khoảng 3,8- 4. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 31 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT 4.5.3. Hàm lượng đường khử trong dịch lên men sau 168 giờ Mẫu sau lên men được định lượng đường khử bằng phương pháp Nelson, Từ kết quả đo OD, ta tính được nồng độ đường khử (g/l) trong dung dịch. H Hình 6. Hàm lượng đường khử trong dịch lên men sau 168 giờ. *Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sư khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, CV= 9,55%. Kết quả phân tích thống kê lượng đường khử sau lên men giữa các NT: NT14, NT13, NT6, NT12, NT5 có lượng đường khử tạo ra nhiều nhất, lần lượt là 0,484 g/l, 0,460 g/l, 0,450 g/l, 0,433 g/l, 0,426 g/l, có khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 95% với các NT còn lại. Trong khi NT1 có lượng đường khử rất thấp (0,085) g/l, NT2 có lượng đường khử là 0,301 g/l, đây là lượng đường khử do vi khuẩn có hoạt tính cenlulase, thủy phân cơ chất cellulose trong môi trường tạo ra. Tất cả NT có lượng đường khử cao hơn NT đối chứng, điều này có thể giải thích là nấm men có thể thủy phân được cơ chất cenlulose đồng thời có sự kết hợp giữa vi khuẩn và nấm men trong quá trình thủy phân cơ chất. Các NT4, NT5, NT6 có lượng đường khử cao chứng tỏ vi khuẩn có đóng góp không nhỏ trong quá trình thủy phân, lượng đường khử sau lên men còn lại là 0,421 g/l, 0,426 g/l, 0, 450 g/l. NT7, NT8, NT9, NT10 có lượng đường khử khá cao, lượng đường khử theo tính toán lần lượt là 0, 342 g/l, 0,417 g/l, 0,371 g/l, 0,416 g/l, các giá trị này chứng minh rằng nấm men có thể thủy phân và lên men khá Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 32 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT tốt trên cơ chất bã mía dù không có sự kết hợp thủy phân của vi khuẩn. Nhìn chung, lượng đường khử sinh ra rất thấp so với các nghiên cứu trước đây. Luận văn của Nguyễn Thị Hằng Nga (2010) đã báo cáo lượng đường khử tạo ra sau quá trình thủy phân là 4 g/l. Theo báo cáo của Nguyễn Xuân Cự (2010) kết luận lượng đường khử tạo ra sau thủy phân thân cây ngô là 4,2 g/l. Lượng đường khử sinh ra nhiều là do có sự kết hợp thủy phân bằng hóa chất (H2SO4 2 %) và vi sinh vật. Rajeev Sukumaran và cộng sự (2009) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ bã mía được đường hóa với chủng vi sinh vật là Trichoderma reesei RUT C30 và Aspergillus niger MTCC 7956. Lượng đường khử thu được sau thủy phân rất cao ( 17,79 g/l). Fatma (2010) đã dùng phương pháp thủy phân bột rơm bằng nấm Trichoderma reesei F418, lượng đường khử thu được sau 16 giờ xử lý là 1 g/l. Tuy nhiên, mục đích của luận văn là khảo sát khả năng sử dụng cơ chất giàu cellulose cũng như khả năng kết hợp giữa vi khuẩn và nấm men trong quá trình thủy phân và lên men. Qua đó, có thể kết luận rằng, dù lượng đường khử ít, nhưng nấm men có thể sử dụng được cơ chất bã mía cho quá trình lên men. Các NT có sự kết hợp với vi khuẩn thì có lượng đường còn lại nhiều, trong đó cao nhất là NT14 (vi khuẩn và dòng H13), có lượng đường khử là 0,483 g/l. 4.5.4 Định tính độ cồn bằng cồn kế 5.00 a 4.50 4.00 b b bc 3.50 Độ cồn cd 3.00 d de 2.50 ef ef ef NT4 NT5 2.00 ef g NT7 NT8 1.50 1.00 0.50 h h 0.00 NT1 NT2 NT3 NT6 NT9 NT10 NT11 NT12 NT13 NT14 Nghiệm thức Hình 7. Độ cồn được tạo ra sau 168 giờ lên men *Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sư khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, CV= 13,85 %. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 33 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT Dung dịch sau lên men được chưng cất và đo độ rượu bằng cách đo tỷ trọng rượu (cồn kế). Độ rượu NT1 và NT2 rất thấp, có giá trị 0 khi đo bằng cồn kế, Kết quả độ cồn được trình bày qua biểu đồ Hình 7. Kết quả phân tích thống kê cho thấy dòng NT14 có độ rượu cao nhất (4,33), khác biệt có ý nghĩa 5% với 13 NT còn lại; các NT13 và NT6 có độ rượu 3,73 % và 3,66%, không có khác biệt ý nghĩa ở mức 5%. NT12 có độ cồn khá cao là 3,5%; 8 nghiệm thức còn lại có độ cồn thấp, dao động từ 2 đến 3%. Giá trị này có thể so sánh với đề tài Nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu cenlulose của Nguyễn Xuân Bình (2010), báo cáo kết quả sản xuất ra được ethanol có nồng độ là 5%, kết quả này cao hơn nghiên cứu của đề tài. Nghiên cứu của Giáo sư Nguyễn Xuân Cự với phương pháp thủy phân bằng acid loãng sản xuất được ethanol 2,5% từ thân cây ngô. Có thể kết luận, độ cồn của đề tài có kết quả không cao, dù đã qua chưng cất. Bên cạnh đó có thể nhân xét rằng NT có sự kết hợp giữa vi khuẩn và nấm men tạo thuận lợi cho quá trình lên men nhất. Tuy nhiên, phương pháp đo tỷ trọng có thể định tính sơ bộ lượng ethanol trong dung dịch, độ chính xác của phương pháp chưa cao, do độ rươu quá thấp ([...]... tài Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ chất bã mía được tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài Tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sử dụng cơ chất bã mía để lên men cồn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về men rượu Thực chất men rượu. .. men Kết quả khảo sát định tính khả năng phân giải bã mía bằng phương pháp đo đường kính vòng tròn phân giải bã mía trên đĩa thạch có cơ chất bã mía của các dòng nấm men cho thấy hoat tính thủy phân khác nhau giữa các dòng nấm men (Hình 4) Cụ thể, 8 dòng nấm men H1, H2, H3, H4, H8, H11, H14, H17 không thể hiện hoạt tính thủy phân trên cơ chất bã mía, 10 dòng nấm men còn lại đều thể hiện đường kính tròn... đáng kể cho quá trình lên men vì các dòng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 dòng nấm men từ viên men rượu, 9 dòng được chọn để khảo sát khả năng chịu độ cồn Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy 7 dòng có khả năng chịu độ cồn trong khoảng 5 – 6% (w/v) ethanol và 2 dòng có khả năng chịu độ cồn thấp hơn từ 2,4 – 3% (w/v) ethanol... 3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nấm men từ men rượu Mục đích: Phân lập các dòng nấm men từ nguồn men Vật liệu: Bột viên men rượu thu về từ một số tỉnh (thành phố): Cần Thơ, Bến Tre, Hậu Giang Tiến hành: - Chủng 1 g men rượu vào 100 ml môi trường M2, ủ lắc 38°C, lắc ngang 45 lần/phút, 48h - Sau đó được cấy ria trên đĩa môi trường M1 ở 38°C trong 24 - 48 giờ - Tiếp tục cấy ria trên đĩa petri đến... w/v) vào ống nghiệm Ủ ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao (mm) cột khí trong ống Durham sau 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ 3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với vi khuẩn Mục đích: tuyển chọn được một số dòng nấm men có khả năng phối hợp với vi khuẩn để lên men cho hiệu suất cao Giống nấm men: các dòng nấm men lên men tốt từ các... đoan lên men là một giai đoạn quan trọng Trong đó nấm men giữ vai trò quyết định trong quá trình lên men Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi, đặc biệt hiện diện nhiều trong đất trồng hoa quả và các nhà máy chế biến đường Ngoài ra, chúng còn xuất hiện trong trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang Nấm men lên men ethanol thường được phân lập từ quá trình lên men rượu, bã. .. của chất xúc tác là enzyme Đây là quá trình lên men kỵ khí dưới sự có mặt của nấm men tạo thành ethanol và giải phóng khí CO2 Quá trình lên men rượu của nấm men gồm hai giai đoạn chính: - Tăng sinh khối nấm men: tế bào nấm men phát triển và tăng sinh khối, giai đoạn này cần sự hiện diện của oxy - Lên men chuyển hóa đường thành rượu: quá trình này xảy ra dưới điều kiện kỵ khí theo sơ đồ sau:` Hình 3 Cơ. .. trước và sau khi lên men - Hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men bằng phương pháp Nelson - Đo độ cồn bằng cồn kế - Định lượng ethanol bằng Kali dicromat - Hàm lượng DM, CF giảm của bã mía sau khi lên men Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 22 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 (2010-1014) Trường ĐHCT CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập các dòng nấm men từ men rượu. .. phân giải bã mía Đường kính vòng tròn phân giải bã mía = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men Mục đích: khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men) , 3 lần lặp lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men. .. thủy phân và lên men đồng thời với Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae Một nghiên cứu của Rajeev Sukumaran và cộng sự (2009) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ nguồn sinh khối bã mía Cơ chất bã mía được đường hóa với chủng vi sinh vật là Trichoderma reesei RUT C30 và Aspergillus niger MTCC 7956, sau đó được lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên men