ATOMIC FORCE MICROSCOPY STUDY OF EMODIN TREATED MCF-7 HUMAN BREAST CANCER CELLS             YUAN JIAN (B Eng., BUAA)               A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF MASTER OF ENGINEERING DIVISION OF BIOENGINEERING NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE   2010       ACKNOWLEDGEMENTS    I would like to express my sincere appreciation to the following people:  Dr. Lim Chwee Teck for his patient supervision and valuable guidance  throughout the project, also for his kind support and help.  Mr. Li Qingsen for his valuable discussion, technical support and assistance to  this project, besides for his constant support and help throughout the project.   Dr. Ong Choon Nam and Dr. Alan Prem Kumar for providing the human breast   cancer cell lines  Dr. Huang Qing for sharing her knowledge in the study of emodin effects  Fellow laboratory mates for their help, encouragement and friendship.  My parents and all others who have made this project possible.             i      TABLE OF CONTENTS     ACKNOWLEDGEMENTS i TABLE OF CONTENTS ii SUMMARY v LIST OF FIGURES vii LIST OF TABLES ix CHAPTER INTRODUCTION 1.1 Background 1.1.1 Cancer and metastasis 1.1.2 Atomic force microscopy 1.1.3 Anti-cancer properties of emodin 1.2 Objectives 1.3 Scope of thesis   CHAPTER LITERATURE REVIEW 2.1 Micromechanical properties of cells 2.2 Cytoskeleton and chemotherapy 2.3 Chemical compounds affecting actins 2.5 Atomic force microscopy for cell biology 2.6 AFM in cancer cell research 12       ii      CHAPTER MATERIALS AND METHODS 15 3.1 Human breast cancer cell line 15 3.2 Anti-cancer drug, emodin 15 3.3 Sample preparation 16 3.4 Atomic force microscopy 17 3.5 AFM imaging 17 3.6 AFM force curves 18 3.7 Young’s modulus calculation of the cells 19   CHAPTER AFM IMAGING STUDY OF MCF-7 CELLS 21 4.1 Introduction 21 4.2 Optimizing experimental parameters 21 4.3 Results 28 4.4 Discussion 31   CHAPTER AFM INDENTATION STUDY OF MCF-7 CELLS 34 5.1 Introduction 34 5.2 Experimental parameters 34 5.3 Results 36 5.4 Discussion 37   CHAPTER AFM STUDY OF THE EFFECTS OF EMODIN ON THE MICROMECHANICAL PROPERTIES OF MCF-7 CELLS 41 6.1 Introduction 41 6.2 Results 41 6.3 Discussion 45     iii      CHAPTER CONCLUSIONS AND FUTURE WORK 48   REFERENCES 51   APPENDIX OPTIMIZATION OF AFM INDENTATION 62                                               iv      SUMMARY   Cancer has long been one of the most fatal diseases worldwide. A substantial  understanding of cancer cells will lead to improved strategies in cancer diagnosis and  treatment. Atomic force microscopy (AFM) has recently provided great progress in  the study of cancer cells. This emerging technique allows the study of the  morphology and mechanical properties of cells in aqueous environment with high  spatial resolution and force sensitivity.    In this study, AFM was used to probe the cell cortical filamentous network as well as  the elasticity of living MCF‐7 cell, a human breast cancer cell line. The effects of  emodin, an anti‐cancer drug on cell cortex and cell elasticity were also investigated.  Using an optimized scanning setting, it was found that a scanning force of 1 nN was  effective in probing the cell cortical filamentous network. Quantitative cell elasticity  measurement was done based on AFM indentation test. Young’s modulus values  were extracted from AFM force curves using Hertz’s contact model, and were found  to be 437.0 ± 208.2 Pa.   Comparing with control samples, the pre‐treatment of 20µM emodin for 1 hour  reduced the mean Young’s modulus values of MCF‐7 cells from 437.0 ± 208.2 Pa to  380.1 ± 138.2 Pa. According to corresponding AFM images, the main reason was that  emodin treatment decreased the density of cortical filamentous network, thus  reducing the mechanical strength of MCF‐7 cells.  v      AFM technique as a surface analyzing tool has the limitation of not being able to  probe the cell interior. However, it can still be a powerful method in detecting anti‐ cancer drug effects on cancer cell mechanics.                                     vi        LIST OF FIGURES   Figure Cancer metastasis Figure Principle and implementation of AFM 11 Figure The chemical formula of emodin 16 Figure An illustration of the AFM indentation test on cells 20 Figure The effects of deformation force on AFM images of cell cortex 23 Figure The effects of scan direction on AFM images of living MCF-7 cells 25 Figure Illustration of photodiode detection mechanism 26 Figure The effects of tip sharpness on AFM images of living MCF-7 cells 27 Figure Contact mode AFM images of a living MCF-7 cell 29 Figure 10 Correlated AFM and CFM of cells double stained for actin and vimentin 30 Figure 11 Micromechanical architecture of the mammalian cell cortex 33 Figure 12 Force curve and Z sensor signal collected in AFM indentation on living MCF-7 cells 35 vii      Figure 13 Force versus indentation curves for AFM indentation on living MCF-7 cells 37 Figure 14 The effects of emodin on the micromechanical properties of MCF-7 cells 43 Figure 15 AFM images reveal the effects of emodin on the cortical filamentous network of living MCF-7 cells 44  viii      LIST OF TABLES Table Obtained Young’s modulus values for living MCF-7 cells 43                                           ix    CONCLUSIONS AND FUTURE WORK                                                                                                                                                                            Finally, quantitative analysis of cortical filamentous network should be carried out.  Typical characterization parameters like side length and area of polygonal mesh can  be measured and analyzed to provide quantitative results.                       50    APPENDIX                                                                                                                                                                            REFERENCES Alberts, B. (2008). Molecular biology of the cell. New York, Garland Science.  Ashkin, A. and J. M. Dziedzic (1989). "Internal cell manipulation using infrared laser  traps." Proc Natl Acad Sci U S A 86(20): 7914‐8.  Ayscough, K. R., et al. (1997). "High rates of actin filament turnover in budding yeast  and roles for actin in establishment and maintenance of cell polarity revealed  using the actin inhibitor latrunculin‐A." J Cell Biol 137(2): 399‐416.  Binnig, G., et al. (1986). "Atomic force microscope." Phys Rev Lett 56(9): 930‐933.  Braet, F., et al. (1998). "Imaging surface and submembranous structures with the  atomic force microscope: a study on living cancer cells, fibroblasts and  macrophages." J Microsc 190(Pt 3): 328‐38.  Bubb, M. R., et al. (1994). "Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin  polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F‐ actin." J Biol Chem 269(21): 14869‐71.  Butt, H.‐J., et al. (2005). "Force measurements with the atomic force microscope:  Technique, interpretation and applications." Surface Science Reports 59(1‐6):  1‐152.  51    REFERENCES                                                                                                                                                                            Carl, P. and H. Schillers (2008). "Elasticity measurement of living cells with an atomic  force microscope: data acquisition and processing." Pflugers Arch 457(2):  551‐9.  Chambers, A. F., et al. (2002). "Dissemination and growth of cancer cells in  metastatic sites." Nat Rev Cancer 2(8): 563‐72.  Chen, Y. and J. Y. Cai (2003). "[Morphological observation on fibronectin fibrils  surrounding human breast carcinoma cells by atomic force microscopy]."  Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) 35(8): 752‐5.  Coluccio, L. M. and L. G. Tilney (1984). "Phalloidin enhances actin assembly by  preventing monomer dissociation." J Cell Biol 99(2): 529‐35.  Cooper, J. A. (1987). "Effects of cytochalasin and phalloidin on actin." J Cell Biol  105(4): 1473‐8.  Costa, K. D. (2003). "Single‐cell elastography: probing for disease with the atomic  force microscope." Dis Markers 19(2‐3): 139‐54.  Costa, K. D. and F. C. Yin (1999). "Analysis of indentation: implications for measuring  mechanical properties with atomic force microscopy." J Biomech Eng 121(5):  462‐71.  Coue, M., et al. (1987). "Inhibition of actin polymerization by latrunculin A." FEBS  Lett 213(2): 316‐8.  52    REFERENCES                                                                                                                                                                            Crick, F. H. C. and A. F. W. Hughes (1950). "The physical properties of cytoplasm : A  study by means of the magnetic particle method Part I. Experimental."  Experimental Cell Research 1(1): 37‐80.  Cross, S. E., et al. (2007). "Nanomechanical analysis of cells from cancer patients."  Nat Nanotechnol 2(12): 780‐3.  Duncan, M. D., et al. (1996). "Actin disruption inhibits bombesin stimulation of focal  adhesion kinase (pp125FAK) in prostate carcinoma." J Surg Res 63(1): 359‐63.  Elson, E. L. (1988). "Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and  function." Annu Rev Biophys Biophys Chem 17: 397‐430.  Entschladen, F., et al. (2004). "Tumour‐cell migration, invasion, and metastasis:  navigation by neurotransmitters." Lancet Oncol 5(4): 254‐8.  Frimmer, M. (1977). "Mode of action of phalloidin." Curr Probl Clin Biochem 7: 29‐36.  Goldmann, W. H. and R. M. Ezzell (1996). "Viscoelasticity in wild‐type and vinculin‐ deficient (5.51) mouse F9 embryonic carcinoma cells examined by atomic  force microscopy and rheology." Exp Cell Res 226(1): 234‐7.  Goldmann, W. H., et al. (1998). "Differences in elasticity of vinculin‐deficient F9 cells  measured by magnetometry and atomic force microscopy." Exp Cell Res  239(2): 235‐42.  Hanahan, D. and R. A. Weinberg (2000). "The hallmarks of cancer." Cell 100(1): 57‐70.  53    REFERENCES                                                                                                                                                                            Haydon, P. G., et al. (1996). "Membrane deformation of living glial cells using atomic  force microscopy." J Microsc 182(Pt 2): 114‐20.  Heidemann, S. R., et al. (1999). "Direct observations of the mechanical behaviors of  the cytoskeleton in living fibroblasts." J Cell Biol 145(1): 109‐22.  Heidemann, S. R. and D. Wirtz (2004). "Towards a regional approach to cell  mechanics." Trends Cell Biol 14(4): 160‐6.  Heinz, W. F. and J. H. Hoh (1999). "Spatially resolved force spectroscopy of biological  surfaces using the atomic force microscope." Trends in Biotechnology 17(4):  143‐150.  Heinz, W. F. and J. H. Hoh (2005). "Getting physical with your chemistry:  Mechanically investigating local structure and properties of surefaces with  the atomic force microscope." Journal of Chemical Education 82: 695.  Henderson, E., et al. (1992). "Actin filament dynamics in living glial cells imaged by  atomic force microscopy." Science 257(5078): 1944‐6.  Heuser, J. E. and M. W. Kirschner (1980). "Filament organization revealed in platinum  replicas of freeze‐dried cytoskeletons." J Cell Biol 86(1): 212‐34.  Hochmuth, R. M. (2000). "Micropipette aspiration of living cells." J Biomech 33(1):  15‐22.  54    REFERENCES                                                                                                                                                                            Hofmann, U. G., et al. (1997). "Investigating the cytoskeleton of chicken cardiocytes  with the atomic force microscope." J Struct Biol 119(2): 84‐91.  Hoh, J. H. and P. K. Hansma (1992). "Atomic force microscopy for high‐resolution  imaging in cell biology." Trends Cell Biol 2(7): 208‐13.  Hoh, J. H. and C. A. Schoenenberger (1994). "Surface morphology and mechanical  properties of MDCK monolayers by atomic force microscopy." J Cell Sci 107  ( Pt 5): 1105‐14.  Huang, Q., et al. (2007). "Anti‐cancer properties of anthraquinones from rhubarb."  Med Res Rev 27(5): 609‐30.  Huang, Q., et al. (2004). "Inhibitory effect of emodin on tumor invasion through  suppression of activator protein‐1 and nuclear factor‐kappaB." Biochem  Pharmacol 68(2): 361‐71.  Huang, Q., et al. (2005). "Emodin inhibits tumor cell migration through suppression  of the phosphatidylinositol 3‐kinase‐Cdc42/Rac1 pathway." Cell Mol Life Sci  62(10): 1167‐75.  Huang, Q., et al. (2006). "Emodin inhibits tumor cell adhesion through disruption of  the membrane lipid Raft‐associated integrin signaling pathway." Cancer Res  66(11): 5807‐15.  55    REFERENCES                                                                                                                                                                            Ingber, D. E. (1993). "Cellular tensegrity: defining new rules of biological design that  govern the cytoskeleton." J Cell Sci 104 ( Pt 3): 613‐27.  Ingber, D. E. (1998). "The architecture of life." Sci Am 278(1): 48‐57.  Ingber, D. E. (2000). "Opposing views on tensegrity as a structural framework for  understanding cell mechanics." J Appl Physiol 89(4): 1663‐70.  Janmey, P. A. and C. Chaponnier (1995). "Medical aspects of the actin cytoskeleton."  Curr Opin Cell Biol 7(1): 111‐7.  Janmey, P. A., et al. (1994). "The mechanical properties of actin gels. Elastic modulus  and filament motions." J Biol Chem 269(51): 32503‐13.  Jordan, M. A. and L. Wilson (1998). "Microtubules and actin filaments: dynamic  targets for cancer chemotherapy." Curr Opin Cell Biol 10(1): 123‐30.  Kane, R. E. (1975). "Preparation and purification of polymerized actin from sea urchin  egg extracts." J Cell Biol 66(2): 305‐15.  Kedrin, D., et al. (2007). "Cell motility and cytoskeletal regulation in invasion and  metastasis." J Mammary Gland Biol Neoplasia 12(2‐3): 143‐52.  Kuznetsova, T. G., et al. (2007). "Atomic force microscopy probing of cell elasticity."  Micron 38(8): 824‐33.  Lazarides, E. (1975). "Immunofluorescence studies on the structure of actin filaments  in tissue culture cells." J Histochem Cytochem 23(7): 507‐28.  56    REFERENCES                                                                                                                                                                            Lee, G. Y. and C. T. Lim (2007). "Biomechanics approaches to studying human  diseases." Trends Biotechnol 25(3): 111‐8.  Lekka, M., et al. (1999). "Elasticity of normal and cancerous human bladder cells  studied by scanning force microscopy." Eur Biophys J 28(4): 312‐6.  Lekka, M., et al. (2001). "The effect of chitosan on stiffness and glycolytic activity of  human bladder cells." Biochim Biophys Acta 1540(2): 127‐36.  Lekka, M., et al. (1999). "Local elastic properties of cells studied by SFM." Applied  Surface Science 141(3‐4): 345‐349.  Leporatti, S., et al. (2009). "Cytomechanical and topological investigation of MCF‐7  cells by scanning force microscopy." Nanotechnology 20(5): 55103.  Li, Q. S., et al. (2008). "AFM indentation study of breast cancer cells." Biochem  Biophys Res Commun 374(4): 609‐13.  Li, S. and X. Luo (2003). Compendium of materia medica (Bencao gangmu). Beijing,  Foreign Languages Press.  Lyubimova, A., et al. (1997). "Autoregulation of actin synthesis responds to  monomeric actin levels." J Cell Biochem 65(4): 469‐78.  Mahaffy, R. E., et al. (2000). "Scanning probe‐based frequency‐dependent  microrheology of polymer gels and biological cells." Phys Rev Lett 85(4): 880‐ 3.  57    REFERENCES                                                                                                                                                                            Nagao, E. and J. A. Dvorak (1998). "An integrated approach to the study of living cells  by atomic force microscopy." J Microsc 191(Pt 1): 8‐19.  Niederman, R., et al. (1983). "Three‐dimensional structure of actin filaments and of  an actin gel made with actin‐binding protein." J Cell Biol 96(5): 1400‐13.  Oliveira, C. A., et al. (1997). "Latrunculin A is a potent inducer of aggregation of  polymorphonuclear leukocytes." Life Sci 61(6): 603‐9.  Park, S., et al. (2005). "Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts." Biophys J  89(6): 4330‐42.  Parot, P., et al. (2007). "Past, present and future of atomic force microscopy in life  sciences and medicine." J Mol Recognit 20(6): 418‐31.  Pesen, D. and J. H. Hoh (2005). "Micromechanical architecture of the endothelial cell  cortex." Biophys J 88(1): 670‐9.  Pesen, D. and J. H. Hoh (2005). "Modes of remodeling in the cortical cytoskeleton of  vascular endothelial cells." FEBS Lett 579(2): 473‐6.  Petersen, N. O., et al. (1982). "Dependence of locally measured cellular deformability  on position on the cell, temperature, and cytochalasin B." Proc Natl Acad Sci  U S A 79(17): 5327‐31.  Pollard, T. D. (1976). "The role of actin in the temperature‐dependent gelation and  contraction of extracts of Acanthamoeba." J Cell Biol 68(3): 579‐601.  58    REFERENCES                                                                                                                                                                            Radmacher, M. (2002). Measuring the elastic properties of living cells by AFM.  Methods in Cell Biology: Atomic Force Microscopy. B. Jena and H. Hörber,  Academic Press.  Radmacher, M., et al. (1992). "From molecules to cells: imaging soft samples with  the atomic force microscope." Science 257(5078): 1900‐5.  Rao, J. and N. Li (2004). "Microfilament actin remodeling as a potential target for  cancer drug development." Curr Cancer Drug Targets 4(4): 345‐54.  Rotsch, C., et al. (2001). "EGF‐stimulated lamellipod extension in adenocarcinoma  cells." Ultramicroscopy 86(1‐2): 97‐106.  Rotsch, C. and M. Radmacher (2000). "Drug‐induced changes of cytoskeletal  structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study."  Biophys J 78(1): 520‐35.  Schaus, S. S. and E. R. Henderson (1997). "Cell viability and probe‐cell membrane  interactions of XR1 glial cells imaged by atomic force microscopy." Biophys J  73(3): 1205‐14.  Spector, I., et al. (1989). "Latrunculins‐‐novel marine macrolides that disrupt  microfilament organization and affect cell growth: I. Comparison with  cytochalasin D." Cell Motil Cytoskeleton 13(3): 127‐44.  59    REFERENCES                                                                                                                                                                            Spector, I., et al. (1983). "Latrunculins: novel marine toxins that disrupt  microfilament organization in cultured cells." Science 219(4584): 493‐5.  Sporn, M. B. (1996). "The war on cancer." Lancet 347(9012): 1377‐81.  Stingl, J., et al. (1992). "In vitro screening of crude extracts and pure metabolites  obtained from marine invertebrates for the treatment of breast cancer."  Cancer Chemother Pharmacol 30(5): 401‐6.  Stossel, T. P. and J. H. Hartwig (1976). "Interactions of actin, myosin, and a new actin‐ binding protein of rabbit pulmonary macrophages. II. Role in cytoplasmic  movement and phagocytosis." J Cell Biol 68(3): 602‐19.  Wainwright, S. A. (1982). Mechanical design in organisms. Princeton, N.J., Princeton  University Press.  Weisenhorn, A. L., et al. (1993). "Deformation and height anomaly of soft surfaces  studied with an AFM." Nanotechnology 2.  Wolosewick, J. J. and J. Condeelis (1986). "Fine structure of gels prepared from an  actin‐binding protein and actin: comparison to cytoplasmic extracts and  cortical cytoplasm in amoeboid cells of cortical cytoplasm in amoeboid cells  of Dictyostelium discoideum." J Cell Biochem 30(3): 227‐43.  60    REFERENCES                                                                                                                                                                            Yin, H. L. and T. P. Stossel (1979). "Control of cytoplasmic actin gel‐sol transformation  by gelsolin, a calcium‐dependent regulatory protein." Nature 281(5732): 583‐ 6.  Zahalak, G. I., et al. (1990). "Determination of cellular mechanical properties by cell  poking, with an application to leukocytes." J Biomech Eng 112(3): 283‐94.  61    APPENDIX                                                                                                                                                                            APPENDIX OPTIMIZATION OF AFM INDENTATION The optimization of parameters was started based on my colleagues’ settings (Li et  al., 2008). The typical settings are 3µm ramp size, 0.3Hz scan rate, relative trigger  mode, and 200pN trigger threshold. However, the force curves were not quite  repeatable in my experiments. These testing results showed that the probe was  probably stuck to the cell after engaging in relative trigger mode, with either 200pN  or 1nN trigger threshold (Fig. A and B). Also, the piezo tube movement in Z direction  is not symmetrical. After increasing the ramp size to 10 µm, switching trigger mode  to absolute, setting trigger threshold to 1nN, the ideal force curves on living MCF‐7  cells can be acquired constantly. The piezo tube movement showed a nice inverted  ‘V’ shape. Scan rates of 0.5Hz and 1Hz were tested. Since the force curves collected  did not have significant differences, 1Hz was chosen to speed up data collection.  However, this optimization led to another problem that the trigger force cannot be  well controlled. It can be as high as 3.5nN although the setting is 1nN.       62    REFERENCES                                                                                                                                                                              Figure A Force curve and Z sensor signal collected under 200pN relative trigger mode The black line represents the approaching curve, and the gray line is the retracting curve The continuous line before tip-cell contact is missing in approaching region, and the bending direction of contact part is different from ideal force curve The Z sensor signal is not a nice inverted ‘V’ shape This result shows that the tip was stuck with cell before collecting the force curve 63    REFERENCES                                                                                                                                                                              Figure B Force curve and Z sensor signal collected under 1nN relative trigger mode The black line represents the approaching curve, and the gray line is the retracting curve By increasing the trigger force, the approaching curve gets close to ideal force curve The Z sensor gets close to a nice inverted ‘V’ shape The left part of the approaching curve bends into the opposite direction compared with ideal force curve, while the right part does not reach fully contact yet 64