Đang tải... (xem toàn văn)
... nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng trình lên men kombucha Vì vậy, định lựa chọn đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ Mục đích nghiên cứu. .. đƣợc chủng vi khuẩn nấm men có khả lên men kombucha tốt từ trà Phú Thọ Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng thích hợp để lên men kombucha từ trà Phú Thọ Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập số chủng... men kombucha 3.5 Ảnh hưởng pH tới trình lên men kombucha 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng giống tới trình lên men kombucha 3.7 Xây dựng quy trình lên men kombucha phòng thí nghiệm Đ i tƣ ng ph m vi nghiên
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ---------- NGUYỄN THỊ CHUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ PHÚ THỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên nghành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và tiến hành thực hiên đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình, quý báu của các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hƣớng dẫn, dạy bảo, động viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài tốt nghiệp này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, những ngƣời luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Chung LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây là kết quả của riêng em. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung. Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, em xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Chung MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài .................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 2 6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................. 3 6.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 3 6.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 3 7. Đóng góp của đề tài .............................................................................. 3 N I DUNG .................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................... 4 1.1. Tổng quan về kombucha .................................................................... 4 1.1.1. Sơ lƣợc về kombucha ..................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ............................................................................ 6 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha ....................................................... 7 1.1.3.1. Vi khuẩn acetic ......................................................................... 7 1.1.3.2. Nấm men .................................................................................. 8 1.1.3.3. Vi khuẩn lactic ....................................................................... 10 1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha ......................... 11 1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha .................. 13 1.1.5.1. Thành phần hóa học của trà Kombucha .................................. 13 1.1.5.2. Công dụng của Kombucha...................................................... 14 1.1.5.3. Một số lƣu ý khi sử dụng trà ................................................... 15 1.2. Một số đặc điểm về trà Phú Thọ ...................................................... 16 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ...................... 16 1.3.1. Trên thế giới ................................................................................ 16 1.3.2. Ở Việt Nam .................................................................................. 17 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 20 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ......................................................... 20 2.1.1. Đối tƣợng ..................................................................................... 20 2.1.1.1. Mẫu thực vật ......................................................................... 20 2.1.1.2. Mẫu vi sinh vật ....................................................................... 20 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ....................................................................... 20 2.1.2.1. Hóa chất ................................................................................. 20 2.1.2.2. Thiết bị ................................................................................... 20 2.1.3. Môi trƣờng ................................................................................... 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 22 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh ..................................................................... 22 2.2.1.1. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm ......................................................... 22 2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật bằng phƣơng pháp đếm ................................................................... 24 2.2.1.3. Bảo quản chủng giống ............................................................ 25 2.2.1.4. Phƣơng pháp hoạt hóa giống .................................................. 25 2.2.1.5. Phƣơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men............ 26 2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh .................................................................. 26 2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase..................................................... 26 2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic................................... 26 2.2.2.3. Phƣơng pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1 làm ch thị .......... 26 2.2.3. Phƣơng pháp cảm quan ................................................................ 27 2.2.4. Phƣơng pháp toán học .................................................................. 29 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 30 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ ............................................................................................ 30 3.1.1. Phân lập ........................................................................................ 30 3.1.2. Hình thái tế bào của các chủng nấm men, vi khuẩn trên kính hiển vi .................................................................................................... 31 3.1.2.1. Hình thái tế bào của vi khuẩn ................................................. 31 3.1.2.2. Hình thái tế bào của nấm men ................................................ 32 3.1.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ....................................................................................................... 32 3.1.4.1. Khả năng oxy hoá acid acetic ................................................. 32 3.1.4.2. Kiểm tra hoạt tính catalase ..................................................... 33 3.1.4.3. Khả năng sinh sắc tố nâu ........................................................ 33 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ................................................................. 34 3.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha ............................................................................................... 34 3.2.1.1. Xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn ............................. 34 3.2.1.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha đƣợc lên men từ 4 chủng vi khuẩn ....................................................................... 35 3.2.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha ............................................................................................... 36 3.2.2.1. Hoạt lực lên men .................................................................... 36 3.2.2.2. Đánh giá cảm quan chất lƣơng trà kombucha đƣợc lên men từ 4 chủng nấm men ............................................................... 36 3.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 và chủng nấm men N2 .............................................. 37 3.3.1. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 ........... 37 3.3.2. Động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N2.............................. 39 3.4. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha ......................................................................................... 40 3.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của t lệ giống bổ sung ban đầu ................... 40 3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................... 43 3.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của độ pH ban đầu ........................................ 46 3.5. Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm ................. 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 52 1. Kết luận .............................................................................................. 52 2. Kiến nghị ............................................................................................ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 53 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của trà kombucha ........................................ 14 Bảng 2.1. Công thức các loại môi trƣờng ..................................................... 21 Bảng 2.2. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ....................... 27 Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng ch tiêu ............................................... 27 Bảng 2.4. Các ch tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ................ 28 Bảng 3.1. Hàm lƣợng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 4 chủng vi khuẩn Acetocbacter ............................. 34 Bảng 3.2. Chất lƣợng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter ...................................................................... 35 Bảng 3.3. Hàm lƣợng CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men ..................................................................................... 36 Bảng 3.4. Chất lƣợng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng nấm men ... 36 Bảng 3.5. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 (x106 tế bào) ............................................................................... 37 Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N2 (x106 tế bào) ........ 39 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của t lệ giống tới quá trình lên men kombucha.......... 41 Bảng 3.8. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha ................................................................................... 44 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH ban đầu tới quá trình lên men kombucha ....... 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. “Con nấm” (SCOBY) .................................................................... 7 Hình 1.2. Cơ chế phân giải đƣờng trong tế bào nấm men ............................. 11 Hình 1.3. Hình ảnh trà Phú Thọ .................................................................... 16 Hình 3.1. Mẫu phân lập nấm men ................................................................. 30 Hình 3.2. Mẫu phân lập vi khuẩn.................................................................. 30 Hình 3.3. Chủng vi khuẩn K1 trên môi trƣờng thạch nghiêng ...................... 31 Hình 3.4. Chủng vi khuẩn K4 trên môi trƣờng thạch nghiêng ...................... 31 Hình 3.5. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K1 ....................................... 31 Hình 3.6. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K2 ....................................... 31 Hình 3.7. Hình thái tế bào của chủng nấm men N1....................................... 32 Hình 3.8. Hình thái tế bào của chủng nấm men N3....................................... 32 Hình 3.9. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter ................................. 33 Hình 3.10. Chuẩn độ acid dịch lên men kombucha ....................................... 34 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng Acetobacter K1 .... 38 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N2 ..... 39 Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các t lệ giống khác nhau ........................................................................ 41 Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sótở các t lệ giống khác nhau .......................................................................... 42 Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các t lệ giống khác nhau ..................................... 43 Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................. 44 Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ở các nhiệt độ khác nhau ........................................................................ 45 Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau ......................................... 46 Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các pH khác nhau................................................................................ 47 Hình 3.20. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ở các pH khác nhau ..................................................................................... 48 Hình 3.21. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các pH khác nhau................................................. 48 Hình 3.22. Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm ............. 51 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 1. ATP Adenozin triphotphat 2. STT Số thứ tự 3. SCOBY Symbiotic colony of Bacteria and Yeast 4. NADP Nicotiamide adenine 5. Nxb Nhà xuất bản 6. TCVN Tiêu chuẩn Việt nam 7. TS Tiến sĩ MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đối với ngƣời dân Việt Nam, việc sử dụng trà đã trở thành một thói quen từ rất lâu đời. Uống trà không ch để giải khát, mà còn để phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, kéo dài tuổi thọ… Trên thị trƣờng có rất nhiều loại thức uống đƣợc chế biến từ trà nhƣng dòng sản phẩm lên men còn rất mới mẻ đối với thị trƣờng tiêu dùng Việt Nam. Trà thủy sâm , ngƣời Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm trƣờng sinh), ngƣời Nhật gọi nó là kombucha, ngƣời Trung Quốc gọi là thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà. Đây là một loại men (giống nhƣ men giấm), đƣợc nuôi trong dung dịch nƣớc trà đƣờng. Lọc nƣớc (trà giấm) để uống. Do dễ uống nên đƣợc dùng nhƣ một loại nƣớc giải khát. Đây là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn. Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ. Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B3, B5, B6, B12, vitamin C, acid folic, amino acid và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc. Kombucha còn chứa một lƣợng nhỏ cafein vì nó đƣợc lên men từ các loại trà nhƣ trà xanh, trà đen, trà ô long, trà lipton…. Ở nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ: Nhật Bản, Nga, Trung Quốc và nhiều nƣớc Đông Âu, Kombucha đƣợc sử dụng rất phổ biến. Ở Việt Nam, trên thị trƣờng đã có bán các loại kombucha dƣới dạng đóng chai, đồ hộp, nƣớc giải khát nhập khẩu từ nƣớc ngoài hoặc sản xuất kombucha với quy mô hộ gia đình. Hơn nữa, các công trình nghiên cứu về kombucha ở nƣớc ta vẫn chƣa 1 đầy đủ, hoàn ch nh. Đặc biệt là những nghiên cứu về ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đối với quá trình lên men kombucha. Vì vậy, tôi quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”. 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng lên men kombucha tốt từ trà Phú Thọ. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng thích hợp để lên men kombucha từ trà Phú Thọ. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kom bucha 3.2. Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha 3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn, nấm men đã tuyển chọn 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha 3.5. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng giống tới quá trình lên men kombucha 3.7. Xây dựng quy trình lên men kombucha trong phòng thí nghiệm 4. Đ i tƣ ng và ph m vi nghiên cứu Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp vi sinh: Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn, nấm men và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào vi sinh vật; phƣơng pháp bảo quản chủng giống; Phƣơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men… Phƣơng pháp hóa sinh: Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic; phƣơng pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1 2 làm ch thị…. Phƣơng pháp toán học. 6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 6.1. Ý nghĩa khoa học Tìm ra một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha cho sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng trên môi trƣờng nƣớc trà đƣờng Phú Thọ. 6.2. Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng trà Phú Thọ lên men kombucha tạo ra sản phẩm mới, góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng. Tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng, có lợi cho sức khỏe con ngƣời. 7. Đóng góp của đề tài Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn K1 và chủng nấm men N2 có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Đã xác định đƣợc nhiệt độ: 300C, pH: 4, t lệ vi khuẩn/nấm men bổ sung ban đầu 1/1 là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về kombucha 1.1.1. Sơ lược về kombucha Kombucha, còn đƣợc gọi là trà kombucha, trà nấm, trà Kvas, trà Mãn Châu... đã đƣợc dùng trong y học dân gian từ hàng chục thế kỷ. Sách thuốc cổ Trung Hoa đã ghi chép về một loại “Thiên Trà” từ năm 221 trƣớc Tây Lịch, trà này đƣợc xem là một phƣơng thuốc trƣờng sinh. “Tsche” hay “Trà” đƣợc đƣa vào Nhật do y sĩ Triều Tiên tên là Kombu từ năm 414 trƣớc Tây Lịch. Trà Kombu sau đó đƣợc lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nƣớc Đông Âu. Trong thập niên 60, một y sĩ Đức, ông Sklenar đã đƣa ra “một phƣơng pháp sinh học” để trị ung thƣ, sử dụng thành phần chính là Kombucha. Kombucha thật ra là một hỗn hợp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn. Từ 1928, Hermann đã ghi nhận việc định danh 2 chủng men Bacterium xylinum và B. xylinoides và một vi-khuẩn B gluconicum (đƣợc đặt tên do ở khả năng chế tạo gluconic acid). Các nhà nghiên cứu sau đó đã xác định Kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum, cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối nhƣ tổ chim: Những chủng vi sinh vật và nấm men sau đây đã đƣợc tìm thấy trong Kombucha: Acetobacter ketogenum, Pichia fermentans, Saccharomyces apiculatus, S.ludwigii, B.xylinoides, Schizosaccharomyces pombe và Acetobacter ketogenum (theo List, P.H & L.Horhammer.1973 Hagers Hand buck der Pharmazeutischen Praxis . NewYork: Sprin ger-Verlag). Khi các vi-sinh vật đƣợc nuôi trong một môi trƣờng trà dƣợc, cung cấp đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dƣỡng căn bản khác nhƣ đƣờng. Chúng phát triển và biến đổi đƣờng thành gluconic acid, 4 đồng thời sản xuất ra một lƣợng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic acid (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà một vị ngọt và có mùi chua của rƣợu táo lên men. Thành phẩm „trà‟ sau cùng chứa trung bình từ 0.5 đến 1% alcohol, một lƣợng nhỏ lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và oxalic acid. Lƣợng các Vitamin B trong thành phẩm khá cao. Ngoài ra trong môi trƣờng lên men còn có thể có hyaluronic acid, chondroitin-sulfate acid, mukoitin sulfate, heparin [27]. Các nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid acetic [19], [21], [24]. Các vi khuẩn acetic chính đƣợc tìm thấy trong các loại nấm trà: Acetobacter xylinum [14], Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus [23], Gluconobacter oxydans [18], [22]. Thành phần trà Kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ. Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, axit axetic, axit gluconic, axit glycuronic, axit L-lactic, axit cacbonic, axit caprilic, axit xitric, axit oxalic, axit usnic, nhiều vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, axit folic, amino axit, và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc. Trà Kombucha còn chứa một lƣợng nhỏ cafein vì nó đƣợc lên men từ các loại trà nhƣ trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha [27]. Nồng độ acid và rƣợu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Kết quả là kombucha có thể tƣơng đối dễ dàng lên men trong điều kiện thƣờng. Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [20]. Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại nấm mốc gây độc cho cơ thể. Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên men: môi trƣờng sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp. 5 Nếu quá trình lên men bị nhiễm, có thể nhận thấy bằng mắt thƣờng nhƣ trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dƣơng hoặc màu đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng gây ung thƣ, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dƣỡng và gây mùi khó chịu. 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo Kombucha là môi trƣờng cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter nhƣ: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum… và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thƣờng đƣợc gọi là “con nấm” hay SCOBY. Kombucha sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng nƣớc trà đƣờng, thƣờng đƣợc sử dụng để lên men dung dịch trà đƣờng. Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thƣờng gọi là “nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu (“nấm mẹ”). Hình dạng và kích thƣớc của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa. 6 Hình 1.1. “Con nấm” (SCOBY) 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 1.1.3.1. Vi khuẩn acetic Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, dấm, rƣợu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã đƣợc phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. Đặc điểm chung của chủng Acetobacter. Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trƣờng nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thƣớc thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0µm). Có thể di động, hoặc không di động. Không sinh nha bào tử. Hiếu khí bắt buộc. Chịu đƣợc độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhƣng không sử dụng đƣợc tinh bột. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi. 7 Có khả năng tạo thành váng trên môi trƣờng lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại: Acetobacter xylinum: tạo thành váng cenllulose khá dày và chắc. Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhƣng chắc. Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã. Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhƣng tạo thành váng không chắc chắn. Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số đòi hỏi có acid amin nhất định nhƣ acid pntothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S… ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa sorbit thành đƣờng sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)… 1.1.3.2. Nấm men * Hình thái và cấu t o Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…, thƣờng có kích thƣớc rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc trung bình: chiều dài: 9 – 10 m, chiều rộng: 2 – 7 m. Hình dạng và kích thƣớc tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng nhƣ nhiều loại tế bào khác đƣợc cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản sau: Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác nhƣ kitin, volutin,… 8 Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp nhƣ protein, phospholipit enzyme permeraza… Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nƣớc, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. Nhân tế bào Những bào quan khác: không bào, ty lạp thế, riboxom,… [5]. * Sự sinh sản của nấm men. Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy chồi; Sinh sản bằng cách phân đôi; Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử: Tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính. * Phân lo i nấm men Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imporfecti) Lớp nấm men thật (Ascomyces): Phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces. Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) bao gồm giống: Crytococus (toscula, tornlopsis), Mycoderma, Eandida, Geotrichum, Rhodotorula. * Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men Nấm men cũng nhƣ các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nito, phospho, kali, magie,… Dinh dƣỡng Cacbon: Nguồn Cacbon cung cấp là các loại đƣờng khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose… Dinh dƣỡng oxy, hydro: đƣợc cung cấp cho tế bào từ nƣớc của môi trƣờng nuôi cấy hay dịch. Dinh dƣỡng Nitơ: Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trƣờng mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thƣờng dùng là 9 acid amin, pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat… Các vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hƣởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rƣợu, chúng tạo ra liên kết có năng lƣợng lớn. Lƣu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme. Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rƣợu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic. Mangan: đóng vai trò tƣơng tự nhƣ magiê. 1.1.3.3. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và đƣờng đôi nhƣng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dƣỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trƣờng acid pH từ 5,5 ÷ 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn. 10 1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau: * Lên men ethanol Hình 1.2. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men Lên men rƣợu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đƣờng lên men thành ethanol và CO2. Quá trình lên men rƣợu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển đƣờng thành rƣợu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh 11 dƣỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rƣợu và CO2). Sau khi đƣợc vận chuyển vào trong tế bào chất, đƣờng hexose đƣợc chuyển hóa theo chu trình đƣờng phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic sẽ đƣợc chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đƣờng phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trƣờng pH acid, glycerol ch đƣợc tạo ra với hàm lƣợng nhỏ. Ngƣợc lại, trong môi trƣờng pH kiềm lƣợng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men. Phƣơng trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trƣờng pH acid: C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Sự chuyển hóa đƣờng hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lƣợng của nấm men trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ đƣợc nấm men thải vào môi trƣờng lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này đƣợc tìm thấy với hàm lƣợng rất nhỏ, chúng đƣợc chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rƣợu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ đƣợc tạo thành (The Moll, 1990). Một số acid hữu cơ đƣợc sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu nhƣ quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lƣợng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic... * Lên men acetic: Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rƣợu thành acid acetic dƣới tác dụng của vi khuẩn. 12 C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 + O2 CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde) → CH3COOH + H2O * Lên men lactic: Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lƣợng. Các phân tử ATP đƣợc hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ đƣợc vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trƣởng của vi sinh vật. Ngƣợc lại, các sản phẩm nhƣ acid lactic, ethanol, CO2 đƣợc vi khuẩn thải vào môi trƣờng lên men. Kết quả là hàm lƣợng acid lactic tích lũy trong môi trƣờng lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trƣờng và kéo theo những biến đổi hóa lý khác. Bản chất là quá trình chuyển hóa đƣờng thành acid lactic nhờ vi sinh vật. Phƣơng trình phản ứng: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Phƣơng trình tổng quát: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + COOH(CH2)2COOH + CO2 Lƣợng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thƣờng chiếm 40 lƣợng đƣờng đã đƣợc phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%. 1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha 1.1.5.1. Thành phần hóa học của trà Kombucha Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC tỷ lệ các chất hóa học có trong trà kombucha nhƣ sau: 13 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của trà kombucha Giá trị Đơn vị Acetic Acid 2,36 g/l Glyconic Acid 0,129 g/l Formic Acid 0,109 g/l Oxalic Acid 0,01 g/l Caffeine 0,065 g/l Vitamin B1 0,74 g/l Vitamin B6 0,52 g/l Vitamin B12 0,84 g/l Vitamin C 1,51 g/l pH 3,2 Thành phần 1.1.5.2. Công dụng của Kombucha Hội nghị khoa học quốc tế tổ chức tại Nhật Bản năm 1997 đánh giá thuỷ sâm có 3 chất cơ bản mà nếu không có các chất ấy thì con ngƣời không thể hình thành ra đƣợc và rất quan trọng trong việc chống lão hoá. Theo giáo sƣ, TS, bác sĩ Paupell ở Nhật thì thuỷ sâm Kombucha có thể trị dứt/hoặc giảm bớt các bệnh nhƣ đái tháo đƣờng hoặc tiểu đƣờng (Thủy sâm điều hoà đƣợc lƣợng đƣờng trong cơ thể đối với những ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng); trị bệnh cao huyết áp. Đối với những ngƣời cao tuổi, giảm cholestorol trong máu, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, phù thủng; bệnh tái đỏ, nổi mụn vòng quanh bụng; chống lão hoá, giảm nếp nhăn trên trán, mặt; chống ung thƣ, giảm bớt sự nhạy cảm với hoá chất, men gan cao đối với bệnh nhân điều trị xạ trị ung thƣ, các bệnh về thận; làm sáng mắt, trị bệnh mắt kéo mây (mắt có cảm giác có sợi tơ trong mắt), chữa mắt có vấng nâu xám làm mờ mắt sƣng húp; làm cơ bắp rắn chắc hơn; chữa khỏi bệnh chai mạch máu do sự chậm tiêu hoá các chất độc khi ăn uống; mỏi nhức gân cốt, xuyên, lác, ung nhọt, lở loét; sung sức về sinh lý, cơ thể cƣờng tráng; chữa các bệnh trong 14 đƣờng đông mạch máu; chữa chân tay đổ mồ hôi, đau lƣng và các khớp xƣơng; đặc trị bệnh mất ngủ (hay bị t nh giấc về đêm, đảm bảo dùng sẽ khỏi hoàn toàn) giúp ăn ngon miệng hơn; trị sạm mặt, đau gan, đau bao tử; đăc trị bệnh viêm đƣờng ruột, các bệnh mật, tiêu chảy (các bệnh về đƣờng ruột nhƣ hay ăn thức ăn lạ bị đi ngoài,viêm ruột,hay bị đi ngoai ko rõ nguyên nhân); trị táo bón làm cho nhuận tràng; trị chóng mặt do thiếu máu lên lão; trị bệnh trĩ; làm tóc bạc trở lên đen hơn, tóc mọc dày hơn; trị gan nhiễm mỡ; trị bệnh máu nhiễm mỡ, máu nhiễm mỡ, có tác dụng làm tan mỡ trong máu,gan,thanh lọc cơ thể; giải độc, trị men gan cao,giải độc bị nhiễm thuỷ ngân,tăng cƣờng sự hoạt động của gan và túi mật; trị bệnh về thận; trị bênh thấp khớp; trị bệnh đau cơ bắp, vai, cổ; trị căng thẳng thần kinh, điều hoà thần kinh; làm cân đối với những bệnh nhân béo phì, những ngƣời phì mập ( nấm có tác dụng đào thải, làm giảm cân, giảm từ 2 đến 4 kg và làm săn chắc cơ thể) [25], [28]. 1.1.5.3. Một số lưu ý khi sử dụng trà Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thƣ do xạ trị hoặc hóa trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc. Do trà chứa quá nhiều acid lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt và viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhƣng liều lƣợng thay đổi theo tuổi, cân nặng và quan trọng cần phải đƣợc pha loãng với nhiều nƣớc, không nên cho trẻ dƣới 2 tuổi uống; phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1 lƣợng cồn trong nƣớc trà, không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; ngƣời tiểu đƣờng ch nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lƣợng đƣờng bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đƣờng (dƣới 50g/l) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha vì vậy ngƣời tiểu đƣờng cũng không nên uống nhiều; trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngƣng một tuần trƣớc khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên ngƣng sử dụng trƣớc kinh kỳ tối thiểu một tuần. Men trà kombucha có thể bị hỏng và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách. 15 1.2. Một s đặc điểm về trà Phú Thọ Phú Thọ nằm trong tốp những t nh dẫn đầu cả nƣớc về diện tích, năng suất, sản lƣợng chè. Tuy nhiên sản phẩm chè tại Phú Thọ chƣa đƣợc đa dạng hoá sản phẩm [29]. Đặc điểm trà Phú Thọ Ngoại hình: xoăn chặt, màu xanh đen. Màu nƣớc xanh tƣơi hoặc xanh vàng. Hƣơng: hƣơng thơm đặc trƣng của trà tƣơi. Vị: chát đậm. Hình 1.3. Hình ảnh trà Phú Thọ 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.3.1. Trên thế giới Cavusoglu K., Gluer P. (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con ngƣời trong ống nghiệm [6].. Dutta D., Gachhui R. (2006) đã phân lập vi khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov. cố định đạm từ trà kombucha [7] Dutta D., Gachhui R. (2007) đã phân lập từ trà kombucha vi khuẩn cố định đạm và cellulose là Gluconacetobacter kombucha sp.nov. J Reiss, (1994) đã tìm hiểu ảnh hƣởng của các loại đƣờng khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà .Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E. (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm 16 trà .K.H. Steinkraus, K.B. Shapiro, J.H. Hotchkiss, R.P. Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha .Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A. (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha .Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B. (2000) đã xác định đƣợc hàm lƣợng vitamin hòa tan và khoáng trong nƣớc uống kombucha. R.A. Ledford C.J. Greenwalt, and K.H. Steinkraus đã xác định và mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lên men. Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha .Yapar K., Cavusoglu K., Oruc E, Yalcin E. (2010) viết về tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên khả năng gây độc của phenol ở chuột bạch [3]. 1.3.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất khiêm tốn và chƣa đầy đủ, hoàn ch nh về khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha cũng nhƣ những ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha. Theo Nguyễn Lân Dũng: hiện nay, lĩnh vực nghiên cứu về kombucha ở nƣớc ta còn khá mới mẻ, chƣa có một công trình nghiên cứu nào về kombucha cũng nhƣ hiệu quả chữa bệnh của loại trà này đƣợc công bố. Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải đƣợc nghiên cứu, kiểm tra và giám định chắc chắn. Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, ngƣời ta đã phổ biến cho nhau dùng nƣớc thủy hoài sâm để bồi dƣỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật. Đinh Công Bảy, Tổng thƣ ký Hội Dƣợc liệu Thành phố Hồ Chí Minh, cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chƣa nghiên cứu nên chƣa thể trả lời về công dụng thực sự của loại 17 trà này. Hà Văn Hùng, Phó Viện trƣởng Viện Y dƣợc học dân tộc Thành phố Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chƣa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó. Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, ngƣời đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nƣớc ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng nhƣ trà mà mọi ngƣời gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu đƣợc gọi tên là The Remedy for Immortality , nghĩa là Phƣơng thuốc Trƣờng sinh". Thủy sâm thực sự ch là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dƣới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trƣờng nƣớc chè (trà) pha đƣờng. Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ. Phan Đức Bình, chuyên gia về dƣợc liệu, Phó chủ tịch Hội Bảo vệ ngƣời tiêu dùng Thành phố Hồ Chí Minh cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thƣ, trị bách bệnh…” đều không có những bằng chứng xác thực [3], [4]. Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cs (2012), Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột”. Trong đề tài này nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số ch tiêu sinh lý của chuột nhƣ: cân nặng, tổng lƣợng hồng cầu, tổng lƣợng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức. Kết luận: sản phẩm trà kombucha có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe, không gây ảnh hƣởng xấu tới các ch tiêu sinh lý của chuột. Tôn Nữ Liên Hƣơng thuộc khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Cần Thơ đã có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha”, 18 tháng 3 năm 2013. Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới thiệu trà giấm kombucha, định hƣớng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha đƣợc chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lƣợng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha đƣợc chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thƣ, theo thời gian lƣu mẫu, trên từng loại trà giấm. Lê Thị Huệ, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên”. Nội dung của đề tài: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha, khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình lên men kombucha. Tuy nhiên, đề tài ch thực hiện trên đối tƣợng trà Thái Nguyên và ch tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên [4]. Lâm Thị Hồng Liên, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang”. Đề tài đã thực hiện: Phân lập và sơ bộ định loại một số chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha, nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng và phát triển nấm men trong môi trƣờng lên men, nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đối với quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình sản xuất kombucha. Đề tài ch đƣợc thực hiện trên đối tƣợng trà Shan tuyết Hà Giang và ch tuyển chọn nấm men lên men kombucha [3]. 19 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng 2.1.1.1. Mẫu thực vật Cây chè xanh Bộ phận sử dụng: lá trà Địa điểm thu mẫu: Phú Thọ 2.1.1.2. Mẫu vi sinh vật Các chủng vi sinh vật đƣợc phân lập từ kombucha và có khả năng lên men kombucha 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic... Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 ... Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4 ... Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, … H2SO4 , CaCO3 , thạch agar… 2.1.2.2. Thiết bị Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức) Nồi hấp Tommy (nhật) Box vô trùng (Haraeus) Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh) Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ) Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức) 20 Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que chang, lamen, đèn cồn, cồn kế, nhiệt kế…... 2.1.3. Môi trường Bảng 2.1. Công thức các loại môi trường ST T Thành phần Môi trƣờng vi khuẩn MT1 MT2 MT3 MT nấm men MT4 MT5 MT6 1 Glucose (g) 20 20 50 50 100 2 (NH4)2SO4 (g) 3 3 2 2 1 3 KH2PO4 (g) 2 2 3 3 2 4 MgSO4.7H2O (g) 2 2 2 2 1 5 CaCO3 (g) 5 6 Agar (g) 20 7 Pepton (g) 4 4 2 2 2 2 8 9 Acid acetic (%) (bổ sung sau khi khử trùng) Rƣợu etylic (%) (bổ sung sau khi khử trùng) 15-20 10 10 Saccharose (g) 100 11 Trà Thái Nguyên (g) 20 12 Dịch trà (ml) 13 Nƣớc máy (ml) 10 200 1000 1000 1000 1000 1000 MT1 : Môi trƣờng phân lập giống vi khuẩn MT2 : Môi trƣờng nhân giống cơ bản của vi khuẩn MT3 : Môi trƣờng lên men kombucha đối với vi khuẩn MT4 : Môi trƣờng phân lập nấm men (môi trƣờng Hanxen) MT5 : Môi trƣờng nhân giống nấm men MT6 : Môi trƣờng lên men nấm men 21 1000 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh 2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm a. Phân lập vi khuẩn theo phƣơng pháp Vinogradski Trƣớc hết chúng tôi tiến hành lên men kombucha từ trà Phú Thọ thu đƣợc mẫu màng lên men. Sau đó tiến hành phân lập để có đƣợc chủng vi khuẩn, nấm men cần thiết. Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu đƣợc huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8. Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trƣờng thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C [9], [7]. b. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản * Đối với vi khuẩn Để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn thì chúng tôi tiến hành phƣơng pháp nhuộm Gram. Nhuộm Gram là phƣơng pháp nhuộm kép để phân biệt hai nhóm vi khuẩn G+ và G- do Christian Gram (Đan Mạch) đề xƣớng năm 1884. Khi cùng nhuộm và tẩy màu tế bào theo một phƣơng pháp: Vi khuẩn G+ vẫn giữ đƣợc màu của thuốc nhuộm tím, còn vi khuẩn G- bị mất màu. Cơ sở khoa học của các bƣớc nhuộm nhƣ sau: Bƣớc nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím (gential violet hoặc Cristal violet). Tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím 22 Nhuộm tăng cƣờng: củng cố màu bằng dung dịch Lugol (KI + I2). Thuốc nhuộm này kết hợp với thuốc nhuộm Gential violet thành phức hợp bền màu hơn ở các vi khuẩn G+. Tẩy màu: dùng chất tẩy màu (thƣờng là cồn 90%) tổ hợp Gential violet và dung dịch Lugol. Ở thành tế bào G- thì liên kết giữa tổ hợp thuốc nhuộm này lỏng lẻo hơn ở vi khuẩn G+ nên dễ bị rửa trôi. Nhuộm phân biệt bằng thuốc nhộm khác (thƣờng dùng là Safranin, cũng có thể thay bằng Fuchsin bazo loãng) nhằm nhuộm các tế bào đã bị tẩy màu thành một màu tƣơng phản với màu tím để dễ phân biệt. Cách tiến hành nhuộm Bƣớc 1. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh 0,5-1 phút. Bƣớc 2. Rửa bằng nƣớc. Bƣớc 3. Nhuộm bằng dung dịch lugol từ 0,5-1 phút. Bƣớc 4. Rửa bằng nƣớc. Bƣớc 5. Tẩy màu bằng cồn 90% trong 10-20 giây. Bƣớc 6. Rửa bằng nƣớc. Bƣớc 7. Nhuộm bằng fucshin 30 giây. Bƣớc 8. Rửa bằng nƣớc. Bƣớc 9. Thấm khô, soi kính dầu. * Đối với nấm men Để quan sát hình thái tế bào nấm men, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp nhuộm đơn. Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm. Các loại thuốc nhuộm thƣờng dùng để nhuộm đơn là: Fuchsin kiềm, xanh metylen, tím gentian, đỏ trung tính. Cách tiến hành nhuộm Bƣớc 1. Làm vết bôi vi sinh vật Bƣớc 2. Làm khô vết bôi 23 Bƣớc 3. Cố định vết bôi Bƣớc 4. Nhuộm tiêu bản Bƣớc 5. Rửa tiêu bản Bƣớc 6. Thấm khô tiêu bản [6], [ 7], [10], [11]. 2.2.1.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm a. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào sống trên thạch đĩa Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức. N A. 1000 1 . 100 10 n Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu. A- Số CFU trung bình đếm đƣợc trên mỗi đĩa petri. 10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [12], [7], [11]. b. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào bằng phòng đếm Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lƣợng tế bào theo các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm. Thƣờng đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lƣợng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu: 24 N=A x 25 : V : n Trong đó: N – số lƣợng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu A – số lƣợng tế bào trung bình trong 1 ô lớn V – thể tích của 1 ô lớn n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n) 25 là số ô lớn của toàn khung đếm [6]. 2.2.1.3. Bảo quản chủng giống a. Bảo quản trên thạch nghiêng Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C. Sau đó giữ trong tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10]. b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15% Chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch lỏng ở 300C sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng. Bảo quản theo phƣơng pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [8]. 2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trƣờng tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ. 25 2.2.1.5. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Sử dụng phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng để xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men thông qua thông số hàm lƣợng CO2 thoát ra. Hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiêu thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: Dịch đƣợc lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó đƣợc coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngƣợc lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [ 2]. 2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn. Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Thạch : 20g pH : 7,0-7,2 Canxi acetat : 10g Nƣớc máy : 1000ml Quan sát hiện tƣợng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính. 2.2.2.3. Phương pháp xác định khả năng t ng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1 làm chỉ thị Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1 , chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức: 26 X Trong đó: V .K .100 (g/ ml) 10 X : Số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men V : Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men K : Lƣợng acid tổng số tƣơng ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K 0,006) 10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ 2.2.3. Phương pháp cảm quan Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm nhƣ: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha đƣợc đánh giá trên một số ch tiêu theo TCVN 3215 – 79: Số điểm chƣa có trọng lƣợng là số điểm cho tƣơng ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi ch tiêu chất lƣợng và đƣợc quy định trong bảng 2.1, hệ số quan trọng của từng ch tiêu đƣợc quy định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ở bảng 2.3. Bảng 2.2. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm STT Mức chất lƣợng Số điểm Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chƣa chung có trọng lƣợng của hội đồng cảm quan Mùi : 4,8 1 Loại tốt 18,6 – 20,0 2 Loại khá 15,2 – 18,5 3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi ch tiêu : 2,8 4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi ch tiêu : 1,8 5 Loại rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi ch tiêu : 1,0 6 Loại hỏng Vị : 4,8 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 0 – 3,9 Mỗi ch tiêu nhỏ hơn 1,0 27 Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Ch tiêu Hệ số quan trọng 1 Độ trong và màu sắc 0,8 2 Mùi 1,2 3 Vị 2,0 Tổng cộng 4,0 Bảng 2.4. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha Tên ch tiêu Điểm chƣa có trọng lƣợng 5 Độ trong và màu sắc 4 3 2 1 Vị Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trƣng cho sản phẩm. Chất lỏng trong, có tƣơng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trƣng của sản phẩm. Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trƣng của sản phẩm. Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trƣng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng 5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm. 4 Mùi Yêu cầu Chƣa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trƣng cho sản phẩm nhƣng hơi khó nhận thấy. 3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trƣng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. 5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm 28 4 3 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trƣng cho sản phẩm bình thƣờng. Chƣa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trƣng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng 2.2.4. Phương pháp toán học Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” [1] nhƣ: * Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm X 1 n Xi n i 1 * Trung bình bình phƣơng các sai lệch n (Xi X ) i 1 n 1 * Sai số đại diện của trung bình cộng m n * Hệ số biến thiên trung bình cộng: Cv x100 X n: số lần lặp lại thí nghiệm 29 2 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.1.1. Phân lập Nguyên liệu sử dụng là trà Phú Thọ và đƣờng để sản xuất kombucha. Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà Phú Thọ để trong thời gian 10-15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội. Sau khoảng 7 ngày ở 300C ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt. Tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng MT1, nấm men trên môi trƣờng MT4 theo phƣơng pháp của Vinogradski. Kết quả phân lập đƣợc thể hiện ở các hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4. Hình 3.2. Mẫu phân lập Hình 3.1. Mẫu phân lập nấm men vi khuẩn 30 Hình 3.3. Chủng vi khuẩn K1 trên môi trường thạch nghiêng Hình 3.4. Chủng vi khuẩn K4 trên môi trường thạch nghiêng Qua hình 3.1 và 3.2 cho thấy, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thƣớc trung bình của khuẩn lạc 1 – 2 mm. Khuẩn lạc nấm men trơn, lồi, bóng. Kết quả phân lập được 5 chủng vi khuẩn (ký hiệu lần lượt là K1, K2, K3, K4, K5), 4 chủng nấm men (ký hiệu lần lượt là N1, N2, N3, N4). 3.1.2. Hình thái tế bào của các chủng nấm men, vi khuẩn trên kính hiển vi 3.1.2.1. Hình thái tế bào của vi khuẩn Các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha thuộc nhiều nhóm khác nhau trong đó có vi khuẩn Gram âm (vi khuẩn Acetobacter) và nhóm vi khuẩn Gram dƣơng (vi khuẩn lactic). Tiến hành nhuộm Gram 5 mẫu vi khuẩn đã phân lập đƣợc, quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy tất cả 5 mẫu đều bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Kết quả đƣợc dẫn ra ở hình 3.5 và 3.6. Hình 3.5. Hình thái tế bào của Hình 3.6. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K1 chủng vi khuẩn K2 (độ phóng đại 1000 lần) (độ phóng 1000 lần) 31 3.1.2.2. Hình thái tế bào của nấm men Để quan sát hình thái tế bào của nấm men, chúng tôi tiến hành nhuộm đơn với thuốc nhuộm fucshin. Quan sát ở độ phóng đại 1000 lần có sử dụng dầu soi kính thấy các chủng nấm men phân lập đƣợc từ trà kombucha có hình thái tế bào hình ovan hoặc hình elip. Kết quả đƣợc dẫn ra ở hình 3.7 và 3.8. Hình 3.7. Hình thái tế bào của Hình 3.8. Hình thái tế bào của chủng nấm men N1 chủng nấm men N3 (độ phóng đại 1000 lần) (độ phóng đại 1000 lần ) 3.1.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được 3.1.4.1. Khả năng oxy hoá acid acetic Xác định khả năng tạo thành acid của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng cách cấy trên môi trƣờng thạch đĩa (môi trƣờng 1) có bổ sung thêm CaCO3 7g/l. Các mẫu vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trƣờng do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid đã đƣợc tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trƣờng từ màu trắng sang không màu theo phƣơng trình: H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2 Kết quả thu đƣợc 4 mẫu là: K1, K2, K3, K5 có xuất hiện vòng phân giải CaCO3. 32 Theo Bergey (1992) [15], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có khả năng oxy hoá lactate nhƣng ch có các vi khuẩn thuộc chi Acetobacter mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cácbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O; giải phóng ATP. 3.1.4.2. Kiểm tra hoạt tính catalase Tiến hành nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn thấy sủi bọt khí, bọt khí đó chính là O2 giải phóng ra do H2O2 đƣợc phân giải dƣới tác dụng của enzyme catalase. Catalase Phƣơng trình: H2O2 H2O + 1 O2 2 Kết quả thu đƣợc cả 4 mẫu K1, K2, K3, K5 có phản ứng catalase dƣơng tính (catalase +). Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở hình 3.9. Hình 3.9. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 3.1.4.3. Khả năng sinh sắc tố nâu Nuôi cấy 4 mẫu vi khuẩn K1, K2, K3, K5 trên môi trƣờng thạch và dịch thể đều không xuất hiện sắc tố nâu, chứng tỏ 4 chủng vi khuẩn Acetorbacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic acid và - propyonic, vì vậy dịch nuôi cấy không màu. Như vậy, từ 5 mẫu vi khuẩn phân lập được, tiến hành tuyển chọn sơ bộ được 4 mẫu thuộc nhóm Acetobacter là: K1, K2, K3, K5. 33 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả n ng lên men kombucha 3.2.1.1. Xác định hàm lượng acid t ng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn Từ 4 mẫu vi khuẩn Acetorbacter đã tuyển chọn, tiến hành nuôi trong môi trƣờng nhân giống cơ bản (MT2) ở điều kiện lắc 135 vòng/phút, 350C. Sau đó chuyển sang môi trƣờng lên men (MT3) ở 30oC trong 7 ngày. Chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% để xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo thành, lặp lại thí nghiệm 3 lần đối với từng mẫu. Kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra ở bảng 3.1. Hình 3.10. Chuẩn độ acid dịch lên men kombucha Bảng 3.1. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 4 chủng vi khuẩn Acetocbacter STT Chủng M±m δ(%) CV(%) 1 K1 6,6±0,69 0,012 0,18 2 K2 4,4±0,2 0,0034 0,079 3 K3 5,2±0,2 0,0035 0,067 4 K5 4,6±0,4 0,0069 0,15 34 Qua bảng 3.1 nhận thấy 4 mẫu vi khuẩn Acetobacter thí nghiệm đều có khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Các mẫu vi khuẩn khác nhau tạo ra hàm lƣợng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuẩn K2, cao nhất là mẫu K1. Với mục đích tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men kombucha có chất lƣợng tốt, tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ 4 chủng vi khuẩn trên bằng phƣơng pháp cảm quan. 3.2.1.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha được lên men từ 4 chủng vi khuẩn Nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn Acetorbacter trong môi trƣờng lên men (MT3), sau 7 ngày tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm kombucha dựa vào phƣơng pháp cảm quan với các tiêu chí: độ trong và màu sắc, mùi, vị. Kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter Chủng STT Chỉ tiêu đánh giá K1 K2 K3 K5 1 Độ trong và màu sắc 3,7 3,2 2,6 2,9 2 Mùi 5,2 4,8 3,6 4,4 3 Vị 8,6 7,3 7,3 8 4 Tổng điểm 17,5 15,3 13,5 15,3 5 Mức độ chất lƣợng Khá Trung bình Trung bình Trung bình Từ kết quả bảng 3.2 ta thấy,chủng K1 lên men cho sản phẩm trà có chất lƣợng cảm quan tốt nhất với số điểm là 17.5. Vì vậy, trong số 4 chủng Acetobacter là K1, K2, K3, K5 thì chủng Acetobacter được lựa chọn để nghiên cứu tiếp. 35 3.2.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả n ng lên men kombucha 3.2.2.1. Hoạt lực lên men Tiến hành lên men sau 7 ngày, xác định hàm lƣợng CO2 thoát ra từ 4 bình lên men của 4 chủng nấm men N1, N2, N3, N4 bằng phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều thì trọng lƣợng bình lên men giảm càng nhiều. Chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men Chủng nấm men N1 N2 N3 N4 Lƣợng CO2 2,6±0,17 4,22±0,55 2,7±0,5 2,2±0,2 Dựa vào kết quả bảng 3.2 tthấy trong 4 chủng nấm thì chủng N2 là có hoạt lực lên men mạnh nhất, lƣợng CO2 thoát ra nhiều nhất. 3.2.2.2. Đánh giá cảm quan chất lương trà kombucha được lên men từ 4 chủng nấm men Sau 7 ngày tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm trà kombucha đƣợc lên men từ 4 chủng nấm men. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng nấm men STT Chủng Chỉ tiêu đánh giá N1 N2 N3 N4 1 Độ trong và màu sắc 3,2 4 2,6 4 2 Mùi 5,2 5,6 4 4 3 Vị 6,6 9,3 8 7,3 4 Tổng điểm 15 18,9 14,6 15,3 5 Mức độ chất lƣợng Trung bình T t Trung bình Khá 36 Qua kết quả đánh giá cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng nấm men cho thấy chủng N2 có điểm đạt 18,9 là cao nhất Vì vậy, chủng nấm men N2 được chọn làm đối tượng nghiên cứu tiếp. 3.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 và chủng nấm men N2 3.3.1. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 Khả năng sinh trƣởng và sinh sản của vi khuẩn đƣợc phản ánh thông qua động thái sinh trƣởng của chúng trong thời gian nhất định. Có hai hình thức nuôi cấy là: nuôi cấy liên tục (môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật thƣờng xuyên đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng) và nuôi cấy không liên tục (môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật không đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng). Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn K1 trên môi trƣờng dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định số lƣợng tế bào. Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào sống trên thạch đĩa ở các thời điểm 0, 12, 24, 36, 48,60, 72, 84, 96 giờ. Kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng 3.5 và hình 3.11. Bảng 3.5. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 (x106 tế bào) Thời gian (h) Số lƣợng tế bào Δ (%) 0 2,0±0,006 0,01 12 12,3±2,9 0,05 24 34,67±3,38 0,059 36 82,67±3,76 0,065 48 127±3,21 0,0,056 60 131,67±10,04 0,17 72 138,33±4,6 0,8 84 109±6,66 0,12 96 80,67±4,37 0,076 37 Số lƣợng tế bào vi khuẩn K1 (x106) Vi khuẩn K1 150 100 Vi khuẩn K1 50 0 Thời gian (h) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter K1 Dựa vào bảng 3.5 và hình 3.11 ta thấy, sự sinh trƣởng của vi khuẩn gồm 4 pha: Trong 24 giờ đầu pha lag, số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhƣng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trƣờng, tích luỹ chất dinh dƣỡng và năng lƣợng cho các giai đoạn sinh trƣởng tiếp theo. Từ 24 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log). Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lơ lửng, số lƣợng tế bào vi khuẩn tăng nhanh. Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ổn định. Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lƣợng tế bào chết đi nhiều làm cho tổng tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh do nguồn dinh dƣỡng cạn kiệt, sản phẩm độc sản sinh trong quá trình trao đổi chất tăng. Như vậy, đối với vi khuẩn K1 số lượng tế bào đạt cực đạt ở giờ 72 và sau đó giảm dần. Do đó, khi thu sinh khối nên thu ở thời điểm 72 giờ. 38 3.3.2. Động thái sinh trưởng của chủng nấm men N2 Tiến hành nuôi cấy nấm men N2 trên môi trƣờng nhân giống cơ bản (MT2) ở điều kiện 28oC trong 24h, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác đinh số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Chúng tôi tiến hành chang dịch huyền phù nấm men ở các thời điểm 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Bảng 3.6. Động thái phát triển của chủng nấm men N2 (x106 tế bào) Thời gian (h) Số lƣợng tế bào Δ (%) 0 3,5± 0,2 0,01 12 19,67±1,76 0,03 24 31,67±3,38 0,059 36 110,33±7,54 0,13 48 104,33±3,18 0,055 60 76.67±4,8 0,083 72 63,33±6,64 0,11 Số lƣợng tế bào nấm men N2 (x106) S lƣ ng tế bào 120 100 80 Số lƣợng tế bào 60 40 20 0 Thời gian (h) 0 12 24 36 48 60 72 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng nấm men N2 Nhƣ vậy chủng nấm men N2 có khả năng phát triển tốt và theo đúng động thái phát triển. Từ kết quả trên ta xác định đƣợc động thái phát triển của 39 chủng nấm N2 gồm 4 pha: pha tiềm phát, pha logarit, pha cân bằng, pha suy vong. Ở giờ 36 số lƣợng tế bào đạt cực đại và sau đó giảm dần. Như vậy, để thu được lượng sinh khối nhiều nhất và khoẻ nhất ta sẽ nuôi cấy và tiến hành thu hoạch sinh khối sau 36 giờ. 3.4. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha Qúa trình lên men kombucha chịu sự ảnh hƣởng của rất nhiều yếu tố, trong đó điều kiện môi trƣờng là yếu tố vô cùng quan trọng có ảnh hƣởng lớn tới chất lƣợng sản phẩm lên men. Trong điều kiện phòng thí nghiệm còn hạn chế vì thế ch có thể khảo sát đƣợc ảnh hƣởng của t lệ giống bổ sung ban đầu, nhiệt độ và pH tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ. 3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống bổ sung ban đầu Hàm lƣợng giống là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình lên men, cần có hàm lƣợng giống phù hợp với quá trình lên men nhằm đạt hiệu suất lên men cao và cho ra chất lƣợng sản phẩm kombucha thơm, ngon. Thừa kế kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Thị Huệ, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên” với hàm lƣợng giống thích hợp cho quá trình lên men là 10%. Tuy nhiên, kombucha là sự cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm men, vì vậy t lệ giống của vi khuẩn và nấm men cũng ảnh hƣởng lớn tới quá trình lên men cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm kombucha. Để khảo sát ảnh hƣởng của t lệ giống, tiến hành cấy chủng vi khuẩn K1 và chủng nấm men N2 vào môi trƣờng dịch lên men với t lệ vi khuẩn: nấm men là: 1:2 ; 1:1 ; 1,5:1 ; 2:1. Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đo hàm lƣợng acid tổng số, thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 40 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống tới quá trình lên men kombucha STT T lệ Hàm lƣợng acid tổng số Hàm lƣợng Cảm đƣờng sót quan (Brix) (điểm) M±m δ( ) CV (%) 1 1:2 2±0,53 0,009 0,45 11,67±0,88 14,3 2 1:1 4,6±0,87 0,015 0,33 5,7±0,17 19 3 1,5:1 1,4±0,53 0,009 0,64 6,5±0,76 17,3 4 2:1 2,6±0,2 0,0035 0,13 7,2±0,6 15 Hàm lƣợng acid tổng số (g/l) vi khuẩn:nấm men T lệ vi khuẩn: nấm men Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số ở các tỉ lệ giống khác nhau Qua bảng 3.7 và hình 3.13 ta thấy, ở t lệ giống vi khuẩn: nấm men là 1:1 thì hàm lƣợng acid tổng số là cao nhất là 4,6±0,87 do lƣợng etanol nấm men chuyển hóa đều đƣợc vi khuẩn sử dụng để chuyển hóa thành acid acetic. Ở các t lệ men giống khác cho hàm lƣợng acid tổng số thấp hơn. Khi hàm lƣợng nấm men nhiều hơn vi khuẩn, lƣợng etanol và CO2 sinh ra nhiều, vi khuẩn không thể chuyển hóa hết sang acid acetic, ức chế khả năng sinh 41 trƣởng, chuyển hóa của vi khuẩn, nồng độ cồn khá cao. Giảm hàm lƣợng vi khuẩn xuống ít hơn nấm men thì lƣợng etanol sinh ra ít, không cung cấp đủ để Hàm lƣợng đƣờng sót (Brix) vi khuẩn chuyển hóa thành acid acetic. T lệ vi khuẩn : nấm men Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ở các tỉ lệ giống khác nhau Các chất hòa tan và đƣờng trong dịch lên men sẽ tạo nên áp suất thẩm thấu giữa môi trƣờng và tế bào nấm men. Sự chênh lệch này làm cho nấm men dễ dàng hấp thụ các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng và thải ra các chất khác. Sự chênh lệch áp suất thẩm thấu này phải nằm trong trạng thái cân bằng thì mới duy trì quá trình lên men một cách thuận lợi. Nếu nồng độ đƣờng cao tức áp suất thẩm thấu lớn sẽ gây ức chế quá trình lên men và nhƣ vậy sẽ làm chậm quá trình lên men. Nếu nồng độ đƣờng thấp thì sẽ thiếu chất dinh dƣỡng cho nấm men sinh trƣởng và lên men vì thế quá trình lên men sẽ yếu và sẽ không tốt cho sản phẩm này. Qua kết quả bảng 3.7 và hình 3.14 ta thấy ở t lệ vi khuẩn: nấm men là 1:1 cho hàm lƣợng đƣờng sót là thấp nhất. 42 Tổng điểm T lệ vi khuẩn : nấm men Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các tỉ lệ giống khác nhau Từ kết quả dẫn ra ở bảng 3.7, và hình 3.15 nhận thấy: Tỷ lệ vi khuẩn: nấm men là 1:1 quá trình lên men diễn ra nhanh, sản phẩm tạo ra có vị thơm ngon đặc trƣng hơn so với các t lệ khác. Điều này đƣợc giải thích do sự cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm men trong kombucha nên nếu lƣợng nấm men ít sẽ làm giảm hàm lƣợng etanol sinh ra, vì thế vi khuẩn thiếu nguyên liệu để chuyển hóa thành acid. Mặt khác nếu lƣợng nấm men tăng lên nhiều hơn so với vi khuẩn thì etanol sẽ dƣ thừa, ảnh hƣởng tới chất lƣợng trà kombucha. 3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng quyết định đến quá trình lên men kombucha. Nhiệt độ thấp quá hay cao quá đều không có lợi cho quá trình lên men cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm. Nhiệt độ thấp làm cho vi khuẩn sinh trƣởng chậm, thời gian lên men kéo dài. Nhiệt độ cao làm tăng quá trình hô hấp trong tế bào vi khuẩn ảnh hƣởng tới quá trình lên men. Để xác định đƣợc nhiệt độ thích hợp nhất cho lên men, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi 43 khuẩn K1 và chủng nấm men N2 trong dịch lên men kombucha ở các ngƣỡng nhiệt độ khác nhau sau 7 ngày lên men, xác định hàm lƣợng acid tạo thành. Kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra ở bảng sau. Bảng 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha STT Nhiệt độ Hàm lƣợng acid tổng số Hàm lƣợng Cảm đƣờng sót quan (Brix) (điểm) M±m δ( ) CV (%) 1 5 0,8±0,2 0,0035 0,43 17,3±1,2 15,3 2 25 4,8±1,04 0,018 0,375 7,17±0,6 18 3 30 7,8±1,25 0,022 0,28 5,3±0,17 19,6 4 35 2,4±0,35 0,006 0,25 8±0,5 17,2 Hàm lƣợng acid tổng số (g/l) (oC) Nhiệt độ (0C) Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số ở các nhiệt độ khác nhau Lên men kombucha ở điều kiện 50C trong ngăn mát tủ lạnh thấy sau 7 ngày dịch lên men vẫn chƣa xuất hiện lớp màng nổi lên mặt, tiến hành chuẩn độ thì thấy hàm lƣợng acid tổng số rất thấp. Nhiệt độ thấp, tốc độ lên men 44 diễn ra chậm, thời gian lên men kéo dài. Qúa trình chuyển hóa đƣờng glucose thành etanol và CO2 diễn ra chậm, hoạt lực lên men yếu, vì thế hàm lƣợng CO2 thoát ra ít. Do lƣợng etanol sinh ra ít nên vi khuẩn có ít nguyên liệu để chuyển hóa thành acid acetic. Lên men kombucha ở các điều kiện nhiệt độ 250C, 300C, 350C, ở ngày thứ 3 đã xuất hiện lớp màng mỏng nổi lên trên. Ở cả 3 nhiệt độ hoạt lực lên men khá cao, dịch trà đều sinh ra acid, trong đó hàm lƣợng acid ở bình lên men trong điều kiện nhiệt độ 300C là phù hợp nhất, cho vị chua vừa phải, Hàm lƣợng đƣờng sót (Brix) không ngắt. Nhiệt độ Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ở các nhiệt độ khác nhau Ở bình lên men trong điều kiện nhiệt độ 50C có hàm lƣợng đƣờng sót quá cao là 17,3±1,2 do đƣờng trong dịch trà chuyển hóa đƣợc ít. Hàm lƣợng đƣờng sót ở bình lên men trong điều kiện 350C là 8±0,5. Bình lên men trong điều kiện 300C cho hàm lƣợng đƣờng sót thấp nhất là 5,3±0,17 45 Điểm cảm quan Nhiệt độ Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau Qua kết quả khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha thu đƣợc ở bảmg 3.8, hình 3.16, 3.17, 3.18 ta thấy, 300C là nhiệt độ phù hợp nhất để tiến hành lên men kombucha. 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của độ pH ban đầu Độ pH ban đầu của môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng trƣc tiếp hoặc gián tiếp đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật nên ảnh hƣởng đến khả năng lên men kombucha. Tiến hành lên men kombucha ở các độ pH là: 2, 3, 4, 5. Sau 7 ngày ở 30oC khảo sát ảnh hƣởng của độ pH tới quá trình lên men kombucha tới trà Phú Thọ. Kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng 3.9, hình 3.19, 3.20, 3.21. 46 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới quá trình lên men kombucha Hàm lƣợng acid tổng số STT pH M±m δ( ) CV (%) Hàm lƣợng Cảm đƣờng sót quan (Brix) (điểm) 2 3,8±0,4 0,0069 0,18 8,7±0,3 14 2 3 4±0,4 0,0069 0,17 6,7±0,3 17,6 3 4 7±0,72 0,0125 0,18 6,3±0,33 18,7 4 5 3,4±0,72 0,0125 0,38 7±0,58 17 Hàm lƣợng acid tổng số (g/l) 1 pH Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số ở các pH khác nhau Qua kết quả bảng 3.9 ta thấy, khi lên men kombucha ở điều kiện pH là 4 thì dịch lên men có hàm lƣợng acid tổng số cao nhất, hàm lƣợng đƣờng sót cao nhất và cho kết quả đánh giá cảm quan lớn nhất. Với pH: 5, lƣợng acid sinh ra ít hơn, cùng với đó là nguy cơ bị nhiễm nấm mốc và các vi sinh vật khác làm sản phẩm dễ bị hỏng. Còn mức pH từ 2-3 lƣợng acid sinh ra thấp 47 hơn vì trong thời gian đầu vi khuẩn Acetobacter khó chịu đựng đƣợc mà phải Hàm lƣợng đƣờng sót (Brix) làm quen dần với môi trƣờng. pH Hình 3.20. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ở các pH khác nhau Qua bảng 3.9 và hình 3.20 cho thấy, ở điều kiện pH bằng 4 cho hàm Tổng điểm lƣợng đƣờng sót thấp nhất là 6,3±0,33 . pH Hình 3.21. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các pH khác nhau 48 Ở pH bằng 4 cho sản phẩm trà có chất lƣợng cảm quan tốt nhất với tổng điểm là 18.7. Từ kết quả trên cho thấy pH bằng 4 là phù hợp nhất cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ. Như vậy, điều kiện môi trường thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ được xác định: tỉ lệ vi khuẩn/nấm men là 1/1, nhiệt độ 300C, pH là 4. 3.5. Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm * Giai đoạn 1: Chế biến dịch trà đường Bước 1. Chế biến dịch trà Tuyển chọn trà: có nhiều loại trà có thể sử dụng để lên men kombucha nhƣ: trà xanh, trà lipton… Vì vậy cần phải chọn loại trà phù hợp với khẩu vị và điều kiện. Hơn nữa cần phải chọn trà ngon, không nhiễm nấm mốc…Sau khi tuyển chọn trà, tiến hành gia nhiệt nƣớc, trích ly các chất hòa tan trong trà khô để thu đƣợc dịch trà và tiêu diệt vi sinh vật. T lệ nƣớc : đƣờng = 1000ml : 20g, nhiệt độ 1000C trong 5 phút. Bước 2. Lọc Bước 3. Làm nguội Bước 4. Nấu siro, lọc, để nguội Nấu: đƣờng trƣớc khi đƣa vào phối trộn với dịch trà phải nấu thành dạng syrup có nồng độ 60 – 70%. Sirô nhất thiết phải đƣợc đun sôi, lọc và làm nguội. Mục đích của quá trình đun sôi sirô là khi đun sôi sẽ tiêu diệt đƣợc các vi sinh vật có trong đƣờng và trong nƣớc, mặt khác tạo điều kiện tốt để biến saccharose thành glucose và fructose và làm giảm độ nhớt của dung dịch đƣờng giúp cho việc lọc dễ dàng. Yêu cầu sirô: màu sắc trong suốt, không màu hoặc có màu vàng nhạt. Có mùi đặc trƣng của sirô, không có mùi vị lạ. 49 Lọc – làm nguội sirô: Lọc sirô trƣớc hết phải lọc ở trạng thái nóng để giảm độ nhớt. Lọc nhằm mục đích tách hết các hợp chất cơ học nhƣ rác, đất cát lẫn vào đƣờng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Sau khi lọc, cần làm lạnh nguội để sirô không bị sẫm màu. Bước 5. Phối trộn Dịch sirô sau khi làm nguội đƣợc phối trộn cùng với dịch trà để tạo thành một dung dịch đồng nhất có nồng độ theo yêu cầu. Sau khi phối trộn, dịch trà cần đƣợc thanh trùng và để nguội về nhiệt độ phòng (28 – 320C) để chuẩn bị cho quá trình lên men. * Giai đoạn 2: Lên men Bổ sung nấm men (10%V), vi khuẩn (10%V) vào dịch lên men. Đây là quá trình lên men hiếu khí nên rất dễ nhiễm vi sinh vật lạ và đặc biệt là nấm mốc. Do đó cần điều ch nh pH của dịch trà ≤ 4,2. Khoảng pH này tạo điều kiện bất lợi cho sự xâm nhiễm của đa số các loài vi sinh vật và nấm mốc. Thời gian lên men khoảng 7 ngày. Lên men đến khi đạt pH cuối = 2,5. * Giai đoạn 3: Hoàn thiện và thu sản phẩm Bước 1. Thu dịch đã lên men. Sau khi quá trình lên men kết thúc, vớt nấm kombucha, để thu lấy dịch lên men đem lọc. Thao tác vớt nấm kombucha phải đảm bảo điều kiện vệ sinh nghiêm ngặt, hạn chế nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài môi trƣờng vào. Bước 2. Lọc dịch lên men để loại bỏ cặn, xác vi sinh vật sau quá trình lên men, làm trong dịch lên men, tăng chất lƣợng cảm quan của sản phẩm, sau khi lọc, dịch lên men phải trong, không vẩn đục, vẫn giữ đƣợc mùi vị, màu sắc đặc trƣng của sản phẩm. Bước 3. Thanh trùng nhằm mục đích: tiêu diệt nấm men, vi khuẩn, đình ch hoàn toàn quá trình lên men, tiêu diệt các vi sinh gây hại, tăng thời gian bảo quản sản phẩm. 50 Bước 4. Thu sản phẩm. Sau khi đƣợc thanh trùng, kombucha sẽ đƣợc đóng chai. Trong khâu đóng chai rất có thể bị nhiễm. Nƣớc Gia nhiệt Trích ly Trà Đƣờng, nƣớc Lọc Nấu Siro Lọc, làm nguội Phối trộn Dịch trà đƣờng Thanh trùng Nấm men Vi khuẩn Dịch lên men Thời gian: 7 ngày Nhiệt độ: 300C pH : 4 Dịch đã lên men Đóng chai Sản phẩm kombucha, bảo quản, sử dụng Hình 3.22. Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Đã phân lập đƣợc 5 chủng vi khuẩn trong đó có 4 chủng vi khuẩn Acetobacter :K1, K2, K3, K5 và 4 chủng nấm men N1, N2, N3, N4 có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter và 4 chủng nấm men đã tuyển chọn đƣợc 1 chủng vi khuẩn Acetobacter là K1 và 1 chủng nấm men là N2 có khả năng lên men kombucha tốt nhất; Nghiên cứu động thái sinh trƣởng, phát triển của chủng vi khuẩn K1 và chủng nấm men N2 có khả năng lên men kombucha tốt. 1.2. Đã khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ. T lệ vi khuẩn/nấm men là 1/1, nhiệt độ 300C, pH ban đầu là 4; Xây dựng đƣợc quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm. 2. Kiến nghị 2.1. Với kết quả thu đƣợc chúng tôi rất mong muốn chủng vi khuẩn K1 và chủng nấm men N2 đƣợc nhanh chóng áp dụng vào sản xuất kombucha làm phong phú nguồn nƣớc giải khát trên thị trƣờng. 2.2. Nghiên cứu tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy, nâng cao các ch tiêu cảm quan cũng nhƣ hàm lƣợng dinh dƣỡng, tạo cơ sở cho sản xuất kombucha ở quy mô công nghiệp. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê và ứng dụng, Nxb Giáo dục, tr. 214- 267. [2]. Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội. [3]. Lâm Thị Hồng Liên (2013), Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. [4]. Lê Thị Huệ (2013), Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. [5]. Lƣơng Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, Nxb Khoa học và Kĩ thuật. [6]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sƣ Phạm Hà Nội. [7]. Nguyễn Lân Dũng ( 1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1-2-3, Nxb Khoa học &kĩ thuật, Hà Nội. [8]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học (sách dịch), Nxb “Mir” Moskwa. [9]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Đình Quyết, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb khoa học kĩ thuật. [10]. Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục. 53 [11]. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1986), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục. [12]. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo Dục [13]. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật, Nxb ĐHQG Hà Nội, tr. 1 –50. [14]. Balentine DA (1997), Special issue: Tea and Health, Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 8:691-692. [15]. Bergey. H, John. G. Holt.( 1992) Bergey’s manual of dererminativa bacteriology. Wolters kluwer health, p.71- 84. [16]. Cavusoglu K., Gluer P. (2010), Protective effect of kombucha mushroom tea on chromosomal aberrations induced by gamma radiation in human peripheral lymphocytes in vitro, J. Environ. Biol. 31, N5.P. 851856. [17]. Dutta D., Gachhui R. (2006), Novel nitrogen-fixing Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov., isolated from Kombucha tea, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56. pt8. p.1899-1903. [18]. Greenwalt CJ, Steinkraus KH, Ledford RA (2000), Kombucha, the fermented tea: microbiology, composition, and claimed health effects, J.Food. Prot. 63:976-981. [19]. J Reiss, (1994), Influence of different sugars on the metabolism of the tea fungus., Zeitschrift fuer Lebensmittel-Untersuchung und Forschung. [20]. Jean F. MacFaddin, (2000), Biochemical tests for identification of medical bacteria, Third edition. [21]. Kappel T, Anken RH (1993), The tea-mushroom, Mycol. 7:12-13. [22]. Kurtzman CP, Robnett CJ, Basehoar-Powers E (2001). Zigosaccharomyces kombuchaensis , a new ascosporogeneous yeast from , Kombucha tea, FEMS Yeast Res. 2:133-138. 54 [23]. Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996), The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage, Haipao, and their interactions during Haipao fermentation, Food Microbiol. 6:407415. [24]. Steinkraus KH (1996), Handbook of indigenous fermented foods, 2nd edn, Marcel Dekker, New York. [25]. http://en.wikipedia.org/wiki/Kombucha [26]. http://muare.vn/threads/18/nam-thuy-sam-kombucha-than-duoc-cuathien-nhien-gia-tu-140-000-den-160-000-con-nam-truongthanh.391105/ [27]. http://muare.vn/threads/18/nam-thuy-sam-kombucha-than-duoc-cuathien-nhien-gia-tu-140-000-den-160-000-con-nam-truong-thanh.391105 [28]. http://tuoitre.vn/chinh-tri-xa-hoi/song-khoe/416138/tra-kombucha-vasuc-khoe.html [29]. http://www.vitas.org.vn/vi/blog/29-nganh-che-phu-tho-giai-bai-toanthieu-nguon-nguyen-lieu-.html 55 [...]... các công trình nghiên cứu về kombucha ở nƣớc ta vẫn chƣa 1 đầy đủ, hoàn ch nh Đặc biệt là những nghiên cứu về ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đối với quá trình lên men kombucha Vì vậy, tôi quyết định lựa chọn đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ 2 Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng lên men kombucha. .. tốt từ trà Phú Thọ Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng thích hợp để lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kom bucha 3.2 Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha 3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn, nấm men đã tuyển chọn 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha. .. lên men kombucha 3.5 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng giống tới quá trình lên men kombucha 3.7 Xây dựng quy trình lên men kombucha trong phòng thí nghiệm 4 Đ i tƣ ng và ph m vi nghiên cứu Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 5 Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp vi sinh: Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn, nấm men và quan sát hình... 1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau: * Lên men ethanol Hình 1.2 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men Lên men rƣợu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đƣờng lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men rƣợu chia làm hai... số chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha, nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng và phát triển nấm men trong môi trƣờng lên men, nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đối với quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình sản xuất kombucha Đề tài ch đƣợc thực hiện trên đối tƣợng trà Shan tuyết... năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Đã xác định đƣợc nhiệt độ: 300C, pH: 4, t lệ vi khuẩn/nấm men bổ sung ban đầu 1/1 là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về kombucha 1.1.1 Sơ lược về kombucha Kombucha, còn đƣợc gọi là trà kombucha, trà nấm, trà Kvas, trà. .. khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha cũng nhƣ những ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha Theo Nguyễn Lân Dũng: hiện nay, lĩnh vực nghiên cứu về kombucha ở nƣớc ta còn khá mới mẻ, chƣa có một công trình nghiên cứu nào về kombucha cũng nhƣ hiệu quả chữa bệnh của loại trà này đƣợc công bố Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải đƣợc nghiên cứu, kiểm... hƣớng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha đƣợc chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lƣợng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha đƣợc chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm... ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình lên men kombucha Tuy nhiên, đề tài ch thực hiện trên đối tƣợng trà Thái Nguyên và ch tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên [4] Lâm Thị Hồng Liên, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 thực hiện đề tài Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” Đề tài đã thực hiện:... Trà Kombucha còn chứa một lƣợng nhỏ cafein vì nó đƣợc lên men từ các loại trà nhƣ trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha [27] Nồng độ acid và rƣợu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn Kết quả là kombucha có thể tƣơng đối dễ dàng lên men trong điều kiện thƣờng Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [20] Trong quá trình