Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu cải tiến quy trình xử lí và đóng gói màng bacterial cellulose

39 534 2
Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu cải tiến quy trình xử lí và đóng gói màng bacterial cellulose

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

... trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học Các nghiên cứu màng Bc trến giới tập trung vào vấn đề đề sản xuất ứng dụng sản phẩm từ màng BC vào lĩnh vực khác Nghiên cứu màng BC từ vi... cellulose; nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown M R., 2005); nghiên cứu. .. công trình bước đầu nghiên cứu trình sinh axit acetic, khả tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [4]; gần nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Năm 2000, nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN -----goCQos------ BÙI THỊ HUẾ ẢNH HƯỞNG CỦA (NH4)2S04, KNO3 TỚI KHẢ NẢNG TẠO MÀNG BC CHO VI KHUẨN GLUCONACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC • •• • Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngưòì hướng dẫn khoa học: TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI, 2015 Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà Nội 2, và thầy TS. Phương Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề LỜI CAM ĐOAN này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tố bộ môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em, hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đõ' em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Em xin trân thành cảm ơn ỉ Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Huế Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biếu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phương Phú Công Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Huế DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Bảng Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT BC: Bacterial cellulose cs: Cộng sự MT: Môi trường STT: Số thứ tự MỤC LỤC MỞ ĐÀU 1 . Lý do chọn đề tài Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liến kết P-1,4 glucorit). Cellulose vi khuân khác với cellulose thực vật ở chô không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, peptin, hemicellulose, và sáp nến... Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi. Với những đặc tính hóa, lí ưu việt trên nên màng BC được xem như là một nguồn polymer sinh học mới, nó thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp sản xuất giấy, màng BC được dùng đế sản xuất giấy điện tử chất lượng cao; Trong công nghệ môi trường, màng BC làm màng phân tách để xử lý nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998). Trong y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người; Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm... Nhận thấy rằng nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triến của vi sinh vật. Đe tìm hiếu rõ hơn ảnh hưởng của nitơ tới quá trình tạo màng BC mỏng, dai, có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đi đến quyết định chọn đề tài: "Anh hưởng của (NH^ĩSOặ, KNOĩtởi khả năng tạo màng BCcho vi khuấnGluconacetobacter". 2 . Mục đích nghiên cứu Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 3 . Nội dung nghiên cứu 4 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter. 3.2. Ánh hưởng của KN0 3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuầnGluconacetobacter. 3.3. Ánh hưởng của (NH^SCUtới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter. 3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo. 4 . Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ỷ nghĩa khoa học Tìm được nguồn nitơ thích hợp nhất đối với khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter. 4.2. Ỷ nghĩa thực tiễn Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực y học. 5 . Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp vi sinh vật 5.2. Phương pháp hóa sinh 5.3. Phương pháp toán học 6 . Điểm mới của đề tài Đã lựa chọn được hàm lượng (NH4) 2S04 là 3g/l thích hợp cho lên men tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter. Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới 1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới Theo hệ thống Gluconacetobacterthuộc phân loại của chi Acetobacter, nhà khoa học Bergey thì họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes.Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn 5 acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tửglucose thành cellulose trong 1 giờ. Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điếm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi cần nhiều nghiến cứu hơn nữa về loại vi khuấn này. 1.1.2. Đặc điếm phân loại của Gluconacetobacter 1.1.2.1. Đặc điếm hình thái, tế bào học Gluconacetobacter là trực khuấn hình thước khoảng 2ụm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc que, xếp thắng hay hơi cong, kích thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản chất là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H 2SO4, bắt màu hồng khi nhuộm fucshin.Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5% acid acetic trong môi trường, khi nồng độ acid trong môi trường khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [4]. Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuấn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Hình 1.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter ỉ.1.2.2. Đặc điếm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, vi khuấn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phang hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Ở điều kiên nuôi tĩnh, trong môi trường dịch thế chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường môt lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đối oxy và các chất dinh dưỡng. 6 Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trương dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hắn cellulose trong điều kiện nuôi tĩnh [ 6]. 1.1.2.3. Đặc điếm sinh lí, sinh hóa + Đặc điểm sinh lí: Vi khuấn Gluconacetobacter phát triến ở nhiệt độ 25 - 35°c, pH: 4 - 6 . Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống.Ở 37°c, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và tạo màng. Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ. + Đặc điếm sinh hóa: Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuấn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CƠ 2và H2O; hoạt tính catalase; khả năng tăng trưởng trên môi trường Hoyer... Theo quan điếm này Gluconacetobacterìầ. chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schiiommycetes. Đặc điếm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây: Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuấn Gluconacetobacter theo Frateur (1950) STT Đặc điểm 1 2 Hiện tượng -Oxy hóa ethanol thành -Chuyến hóa môi trường chứa acid acetic Bromphenol Blue 0,04% từ màu -Hoạt tính catalase xanh sang màu vàng -Hiện tượng sủi bọt khí 7 Kết quả + + 3 -Sinh trưởng trên môi -Sinh khối không phát triển - trường Hoyer 4 -Chuyển hóa glycerol -Tạo kết tử đỏ gạch trong dịch sau thành dihydroxyaceton 5 lên men -Chuyển hóa glucose thành -Vòng sáng xuất hiện xung quanh acid 6 + + khuấn lạc trên môi trường chứa -Kiếm tra khả năng sinh CaCƠ3 -Không hình thành săc tô nâu - sắc tố nâu 7 -Kiểm tra khả năng tổng -Váng vi khuẩn xuất hiện màu hợp cellulose xanh lam 1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuấn Gluconacetobacter 1.2.1. Ảnh hường của nguồn cacbon + Đe vi khuẩn sinh trưởng và phát triến tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hóa học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điếm sinh lí của từng loại vi sinh vật. Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thế chuyến hóa thành loại hợp chất cố màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyến hóa làm biến đổi pH môi trường. Đế tránh hiện tường này khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở 110°c trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Đe nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường. Gluconacetobacter sinh trưng chính trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol.Có thế sinh trưởng trong môi trường chỉ có D - mantolse.Hầu hết các chủng không sử dụng sucrose [7]. 8 Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước chết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật [7]. 1.2.2. Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật Môi trường cơ bản cho nghiên cứu về cellulose vi khuấn là môi trường do Hestrin và Schramm thiết lập [7], có chứa cao nấm men và peptone là nguồn hữu cơ, (NH 4) 2S04 là nguồn nitơ vô cơ. Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH 4 + . Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH 4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO 42 ', cr...) làm hạ thấp rất nhiều trị so pH của môi trường. Muối anion của các acid hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc dù dù đắt hơn). Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO 3’ các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [7]. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chưa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [7]. 1.2.3. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men Ethanol được sử dụng như một cơ chất.Hàm lượng ethanol có thế thay đối từ 2 - 10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong - J00 Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - ỉ % tốt nhất là ở 0,6% [4]. Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10% V. Đe tránh hiện tượng oxy hóa hoàn toàn acid acetic cần có mooti lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate [7]. Ngoài việc oxy hóa 9 ethanol, vi khuấn acetic còn có khả năng oxy hóa các rượu khác thành acid tương ứng. 1.3. Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial celluỉocse BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC- Plant Cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme ß-l,4glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [16]. Chuỗi polyme (3-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril ) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn-sợi vĩ mô (microfibril ) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbol có chiều dài trong khoảng từ 1-9 nm. Những dải ribbol được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màn mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.3. Sợi cellulose của thực vật 1.3.2. Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse Brown A. J (1886), đã nghiên cứu các lớp màng đặc đo vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra trên môi nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nước nhưng tan trong dng dịch kiềm tính. Một số tính chất của màng BC: độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn 1 0 rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn; Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng lớn, on định về kích thước; Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao. 1.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulocse Quá trình tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [13]. Theo tác giả Alina Krystynowics và cs có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuấn Gỉuconacetobacter. Glucokinase, Phosphoglucomutase, Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (ƯDPG pyrophosphorylase hay UPG), Cellulose synthase (CS). Trong đó UPG là enzyme có vai trò quan trọng nhất. glucose cellulose Hình 1.4.Con đường sinh tống hợp cenlulose ở Gluconacetobacter Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Giai 1 1 đoạn polymer hóa Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate.Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isome hóa.Glucose-1 -phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-glucose.Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được chuyển hóa thành cellulosevà cellulose được tiết ra mội trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase.Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP. Một số chủng vi khuấn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn. Hệthống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phosphate.Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyến hóa thành fructose-biphosphate nhờ enzym fructose-1- phosphatekinase.Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa thành fructose-6-phosphate.Glucose-1 -phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose. Giai đoạn kết tinh Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó các chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals.Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi [12]. Ý nghĩa của quá trình sinh tống hợp cellulose của vi khuấn Gluconacetobacter Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter khôngdi động do chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá 1 2 trình chuyến hóa, vận chuyến chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào. Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng cellulose có khả năng giữ nước nên nên giúp cho vi khuấn phân hủy các chất dinh dưỡng đế sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia ƯV (tia tử ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như: giảm độ ấm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại. Các vi khuẩn Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Thực nghiệm chỉ ra rang cellulose bao quanh tế bào vi khuấn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng 3% [6]. Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Chính mạng lưới này làm cho các tế bào có thế bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose [10]. Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điến hình. Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose được tổng hợp bởi Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thế sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo gluconase hay endo glucanase. Các enzyme exo gluconase hay endo glucanase phân hủy cellulose được phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một và chủng Gluconacetobacter sản xuất cellulose [10]. 1 3 1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Trên thế giới Vi khuấn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghệ môi trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học... Các nghiên cứu hiện nay về màng Bc trến thế giới đã tập trung vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau. Nghiên cứu về màng BC từ vi khuấn Gluconacetobacter và những ứng dụng của nó đã được hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng như một chất đế biến đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Jay shah, Brown. M. R. (2005) đã dùng BC làm vải đặc biệt, Barbara Surma và cộng sự (2008), Jonas và Farad (1998) dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất đế cố định pritein thay co sắc kí. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm sạch máu điều trị các bệnh tim mạch. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữa, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phấm phụ gia,... Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn cacbon dến khả năng hình thành màng cellulose; nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện 1 4 tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R., 2005); nghiên cứu của Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đường hình thành cellulose ở vi khuấn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả năng hình thành cellulose và khả năng sinh axit acetic [15]; trong khi đó Alina Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điếm sinh học phân tử của chủng Gluconacetobacter dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không có khả năng tống hợp cellulose) [16]; năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc của màng BC sử dụng làm monocomposit; Czafa, w. Young; Elvie Escoro Brown đã nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tương đồng vầ cấu trúc giữa màng BC với colagen. Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành màng trong điều kiện cụ thế là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi trong bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng, cấu trúc sợi cellulose của màng trong điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong sản xuất giấy; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc màng cellulose ứng dụng làm da nhân tạo. Năm 2008, Barbara Surma-S'lusarska và cộng sự [17] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điếm màng, ảnh hưởng của nguồn cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nước ngoài nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC trong y học, công nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm. Tuy nhiên những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là trong ngành dược phấm và mỹ phấm. Czajt và cs (2006), sử dụng màng Bc đắp lên vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ. 1.4.2. Tại Việt Nam ơ Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter và màng BC còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chi' quan tâm tới quá trình tạo 1 5 màng, đặc tính và cấu trúc của màng, về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [3], [5], [6], [9], [10]. Hiện nay việc nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter chưa được thực hiện. Hầu như có rất ít các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Năm 1997, có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Gỉuconacetobacter. Năm 1995 - 2000, các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Gluconacetobacter và khả năng lên men sinh axit acetic của nhóm tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [4]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn. Năm 2000, nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuấn Gluconacetobacter ứng dụng vào làm thạch dừa. Năm 2003, có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thúy Hường, Phạm Thành Hố về chọn lọc dòng Gluconacetobacterũìích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn [11]. Năm 2006, nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Gluconacetobacter tẩm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng [6]. Năm 2008, có nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã chọn được một chủng Gluconacetobacter NH], khảo sát khả năng tạo màng của chủng này. Ngoài nguồn nguyên liệu nước hoa quả dùng cho lên men giấm, còn có thế sử dụng nhiều nguồn nguyên lệu khác như các loại bia, rượu nhạt, các nguyên liệu có chứa đường, tinh bột, axit hữu cơ, giàu vitamin... từ các vùng miền khác nhau ở Việt Nam. Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày càng 1 6 được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng Gluconacetobacter sự hình thành màng BC và các hướng ứng dụng màng BC. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh, Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thế thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy dùng màng sinh học đế ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiếu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng BC từ vi khuấn Gluconacetobacter , ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1. Đối tượng ngiên cứu và hóa chất 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là chủng Gluconacetobacter từ phòng thí nghiệm Vi Sinh - Khoa sinh - KTNN, Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp. 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ và thiết bị sau: Tủ ấm, tủ say Binder (Đức). Box cấy vô trùng (Haraeus). Nồi hap Tommy (Nhật). Máy lac Orbital Shakergallenkump (Anh). Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 0.5 \x\ - 10ml. 1 7 Kính hiến vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40. Cân (Preccisa XT 320M- Thụy Sỹ). Khay nhựa có kích thước 15 X 1 0 x 4 cm. Tủ lạnh, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn... 2.1.3. Hóa chất Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Acid acetic, Agar. Nguồn Nitơ: (NH 4) 2S0 4 , KNO3. Các muối khoáng: KH2PO4, CaCC>3, MgSƠ4.7H20. Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol. Ngoài ra còn sử dụng: nước dừa. 1 8 2. /.¥. Môi trường 2.1.4. ỉ. Môi trường giữ Glucose: 20g KH 2PƠ 4 : 2g Pepton : 5g Nước giong (MT1) (NH 4) 2S0 4 : 3g MgS0 4.7H 20: 2g máy: lOOOml. 2.1.4.2. Môi trường Agar: 20g nhân giống (MT2) Glucose: 20g KH 2P0 4 : 2g pH: 5,0 - 6,0 Nước MgS0 4.7H 20: 2g dừa: lOOOml 2.1.4.3. Môi trường lên Glucose: 20g KH2PO4: 2g pH: 5,0 - 6,0 Nước 2.2.1. Các men (MT3) (NH 4) 2S0 4 : 3g Axit acetic: 2% Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.1. Axit acetic: 2% MgS0 4.7H 20: 2g dừa: lOOOml 2.2. (NH 4) 2S0 4 : 3g Phương pháp vỉ sinh vật Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng chủng sau khi phân lập được xác định là vi khuấn Gluconacetobacterđuợc cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm 30°c. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4°c dùng cho các bước nghiên cứu tiếp theo 2.2.1.2. Phương pháp hoạt hỏa giong 1 9 Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêuchuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121° c trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn cực tím trong 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào nuôi lắc 130 vòng/phút trong 24h [8], [14]. 2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điếm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram: Tím gentian: 2 phút Rửa nước Dung dịch lugol: 2 phút Rửa nước Cồn 95°: 20 giây Rửa nước Dung dịch íucshin: 2 phút Rửa nước Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó soi trên tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiến vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Neu tế bào vi khuấn nhuộm màu hồng, đó là vi khuẩn Gluconacetobacter. 2.2.1.4. Phương pháp lên men tạo màng Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110°c trong 20 phút đế tránh caramen đường.Sau đó khử khuấn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hóa. Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi sự hình thành màng BC. Khoảng sau 5 ngày thì có thể thu được màng. 2 0 2.2.2. Phương pháp xác định trọng lượng tươỉ của màng BC Sau khi nuôi cấy, màng được lấy ra, để ráo nước khoảng 4 -5 giờ, trên khay nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm. Tiến hành cân màng trên cân điện tử. Trọng lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và chưa có màng. 2.2.3. 2.2.3.1. Phương pháp hóa sinh Phương pháp kiêm tra hoạt tính catalase Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -). 2.2.3.2. Xác định khả năng oxy hóa acỉd acetỉc Sử dụng môi trường sau để khử khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn. Thành phần: Cao nấm men : lOg Calcium acetate : lOg Thạch : 20g Nước máy : lOOOml pH : 7,0-7,2 Phân phối môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121°c trong 20 phút, để nguội khoảng 40-45°C đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (1824h) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng: nếu xung quanh khuấn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat bị oxy hóa, calcium giải phóng ra tạo màu trang sữa), nêu không là âm tính. 2.2.4. Phương pháp toán học Chúng tôi xử lí các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn "ứng dụng tin học trong sinh học" [1], và "Thống kê và ứng dụng" [ 2] như: 2 1 số trung bình công: dùng đế tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: n 1=1 Trung bình bình phương các sai lệch: Hệ số biến thiên: cv= I 100 % A Trong đó: n: số lần nhắc lại. Xji Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuân m: Sai số trung bình học 2.2.5. Quá trình xử lí màng BC từ chủngGluconacetobacter Do màng BC khi được tạo thành còn khá nhiều thành phần dư của môi trường bám vào nên mục đích của quá trình xử lí màng là loại bớt các sản phẩm dư thừa (thành phần chính là đường dư), giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màu trắng trong, dai và bền hơn... Song màng BC chúng tôi nghên cứu chủ yếu được ứng dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp, vì vậy các bước xử lí màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém. Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy được qua các bước xử lí sau: Bảng 2.1. Các bước xử lí màng BC STT Kết quả Các bước xử lí 2 2 1 -Rửa sạch màng bằng nước máy nhiều -Loại bỏ bớt acid acetic và các lần thành phần dư thừa từ môi trường, màng có màu vàng, mùi hơi chua. 2 -Ngâm màng BC trong dung dịch muối -Làm chết và làm sạch vi khuẩn NaCl 0,7M, ở 25 - 40°c trong 12 giờ 3 -Rửa nước và đun sôi 3 lần. -Loại bớt muối và chất dư thừa -Cho màng BC vào dung dịch NaOH - Loại bỏ chất dư thừa, làm 0,5M (400g màng BC/1 lít), ở 30 - 40°c trắng màng, kiềm hóa bề mặt sợi cho đến khi màng chuyển sang màu trắng cellulose. Màng có màu trắng trong (20 phút) trong, mùi khét, giảm độ cứng -Rửa sạch bằng nước máy nhiều lần và dai -Giảm bớt nồng độ kiềm (pH: 8,3) 4 -Trung hòa bằng acid citric loãng và -Màng có màu trắng đục, có mùi kiểm tra bằng máy đo pH. Rửa sạch để kiềm muối Natri acetat -Ngâm cồn 70°, kiếm tra nếu còn kiềm -Kiềm còn dư và chất dư thừa sẽ tiếp tục trung hòa bằng acid acetic -Rửa tan trong cồn, sau khi trung hòa nước và đun sôi màng 3 lần, mỗi lần pH: 7 đun sôi từ 2 - 3 phút -Loại bỏ muối Natri acetat, các chất dư thừa. Màng trắng hơi đục, không mùi Sau khi xử lí màng BC, chúng tôi tạo màng có kích thước 10x10 cm, sau đó sấy màng ở nhiệt độ 45°c trong khoảng 6 giờ đế làm thoát bớt hơi nước có trên màng. 2 3 Nhìn chung, thời gian đế sấy màng phụ thuộc nhiều vào độ dày của màng, nếu sấy màng ở nhiệt độ quá cao màng sẽ bị giòn, giảm tính dẻo dai. Quy trình bảo quản như sau: + Sấy màng ở độ ẩm khoảng 30%. + Đóng gói chế phẩm màng trong các túi nilon nhờ máy hút chân không. + Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°c, trong 15 phút. Chương 3 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 3.1.1. Quan sát hình hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Chủng Gluconacetobacter nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiến vi quang học Labomed (Mỹ) với độ phóng đại 1000 lần, nhận thấy vi khuầnGỉucơnacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong,kích thước khoảng 2|Lim, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản chất là hemicellulose,bắt màu hồng khi nhuộm íucshin. 2 4 Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter 3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gỉuconacetohacter hình thành khuẩn lạc như hình 3.2 2 5 Hình 3.2.Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa Khi quan sát trên hình 3.2 thấy khuấn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. 3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường dịch lỏng Vi khuẩn Gluconacetobacter nuôi cấy trong môi trường lỏng hình thành một lớp màng trên môi trường nuôi cấy (hình 3.3) Hình 3.3.Gluconacetobacter trong môi trường dịch lỏng 3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter 3.1.4.1. Hoạt tính catalase Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.4). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay dưới tác dụng của enzzym catalase phân giải ỈỈ202theo phương trình: 26 Hình 3.2.Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng vi khuấn Gluconacetobacter 3.1.4.2. Khả năng chuyến hỏa glucose thành acid gluconic Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuấn lạc trên môi trường có chứa CaCƠ 3 điều đó cho thấy acid gluconic đã được tạo thành (Hình 3.5). Chúng tham gia phản ứng với CaCC>3 đế chuyến môi trường từ màu trắng sang không màu. H + + CaC0 3 -> Ca 2+ + H 2 0 + CƠ 2 Hình 3.5. Vòng phân giải CaCƠ 3 3.1.5. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC tù’ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, TS. Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter được tiến hành theo 4 bước cơ bản sau: 27 Bước 1: Nhân giống ị Bước 2: Hoạt hóa giống ị Bước 3: Lên màng I Bước 4: Thu màng Cụ thể như sau: Bước 7: Nhân giống Quá trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng Gỉuconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng. Hình ảnh vi khuẩn Gluconacetobacter được cấy truyền trên thạch nghiêng được thế hiện trong hình 3.6 Hình 3.6.VÌ khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng Chủng Gluconacetobacter khi nuôi cấy trên thạch nghiêng có màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bóng, có tính dai và nhớt. Bước 2: Hoạt hóa Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuấn từ các ống giống Gluconacetobacter nuôi trong các bình chứa nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch. Sau đó tiến hành lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1-1,5 ngày để thu sinh khối Gỉuconacetobacter. Các bình chứa nhân giống cấp 1 được thể hiện trong hình 3.7 28 Hình 3.7.VÌ khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường nhân giống cấp 1 Sau 1-1,5 ngày nuôi lắc, các bình giống Gluconacetobacter có màu trắng đục, có hệ sợi lơ lửng trong dung dịch, đó là các sợi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng. Bước 3: Tạo màng Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên men theo tỉ lệ lOml/lOOml môi trường. Tiến hành lên men tĩnh 4 ngày Các hộp lên men sau 4 ngày xuất hiện 1 lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men. Lớp màng này có thể dày hay mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau. Bước 4: Thu màng Thu màng ở ngày thứ 4 Sau 4 ngày tiến hành thu màng BC. Chuẩn bị hộp cồn 90° để ngâm bảo quản màng. Dùng găng tay cao su vớt màng trong các hộp lên men. Tiến hành cân và kiểm tra đặc tính của từng màng như cân nặng, độ dày, độ dai. 29 Hình 3.8. Màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đã lên men tạo màng BC thành cống từ chủng Gluconacetobacter 3.2. Ảnh hưởng của KNO3 tói khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Trong quá trình phát triến tiến hóa, các vi sinh vật có quan hệ mật thiết với các yếu tố của điều kiện sống. Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều phụ thuộc vào sự tác động chi phối của môi trường. Các vi sinh vật cần ở môi trường tự nhiên hay môi trường nhân tạo (nuôi cấy) những chất dinh dưỡng đế xây dựng lên các hợp chất của tế bào và các hợp chất dùng cho trao đối chất và năng lượng. Đối với sự phát triển của vi sinh vật nói chung và các vi khuấn Gluconacetobacter nói riêng, các điều kiện môi trường cần cung cấp tương đối đơn giản. Tuy nhiên cũng phải đảm bảo đầy đủ các nguồn dinh dưỡng như nước, nguồn năng lượng như cacbon, nitơ, gluxit, vitamin, các hợp chất khoáng và các nhân tố sinh trưởng. Các yếu tố này không chi' cung cấp năng lượng cho vi sinh vật mà còn là nguồn nguyên liệu cấu trúc nên các thành phần tế bào khi vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Do đó các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triến của vi khuấn. Đối với vi khuẩnGluconacetobacter, tế bào nhỏ nên sự ảnh hưởng của các yếu tố trên biếu hiện rõ rệt. Sự ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng không chỉ xảy ra khi nó bị thiếu hụt mà còn diễn ra khi ta cung cấp các yếu tố đó ở các nồng độ khác nhau. Không phải ở bất kì nồng độ nào vi sinh vật cũng có thể sử dụng các chất dinh dưỡng ta cung cấp và phát triển bình thường mà mỗi loài vi khuấn có một ngưỡng 30 nhất định với từng yếu tố dinh dưỡng và từng điều kiện môi trường sống. Các điều kiện này không đạt đến ngưỡng hoặc vượt quá ngưỡng thì sự sinh trưởng và phát triến của vi khuấn diễn ra không bình thường thậm chí ngừng sinh trưởng. Mặt khác lại có những nồng độ mà tại đó vi sinh vật sinh trưởng và phát triến rất nhanh và mạnh. Với phương pháp nghiên cứu chủ yếu là: giữ nguyên nồng độ các thành phần khác của môi trường, chỉ thay đối nồng độ KNO3, tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường dịch thế MT3 (thay (NH 4) 2S04 bằng KNO3) ở 30°c. Hình 3.9. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đỗi hàm lượng KNO 3 Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả đạt được biểu hiện ở bảng 3.1 và hình 3.10. 31 Hình 3.10. Sau 4 ngày lên men tạo màng BC trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng KNO 3 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter ST T 1 Hàm lượng Đặc điểm của màng BC KNO3 (g/1) Khối lượng màng (g) 1 Không có sự hình thành màng 0 2 2 Không có sự hình thành màng 0 3 3 Không có sự hình thành màng 0 4 4 Không có sự hình thành màng 0 5 5 Không có sự hình thành màng 0 6 6 Không có sự hình thành màng 0 Nguồn nitơ ảnh hưởng gián tiếp tới khả năng tạo màng thông qua ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn. Nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một so coenzyme quan trọng như ATP, NADP, FDA và một so enzyme tham gia vào quá trình tạo thành Hemicellulose. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH4+ . Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Do đó 32 khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH^SCU, NH4NO3, nguồn nitơhữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men. Từ kết quả kiếm tra cho thấy nguồnnitơ vô cơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triến phù hợp với nghiên cứu của tác giả Neelobon, Jiraporn và Suwanncee (2007). Nguồn nitơ vô cơ KNO 3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triền. 3.3. Ảnh hưởng của (NH 4 ) 2 S0 4 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủngvi khuẩn Gluconacetobacter Yeu tố (NH 4) 2S 04 của Gluconacetobacter, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triến.Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC. Ngược lại, nếu hàm lượng nitơ quá nhiều, vi khuấn không sử dụng hết, nó sẽ bị thối rữa gây ô nhiễm môi trường [3]. Mặt khác, nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một số coenzyme quan trọng như ATP, NADP, FDA và một so enzyme tham gia vào quá trình hình thành màng BC. Đe tìm ra nồng độ (N]-Lị)2S04tốt nhất cho sự hình thành màng BC, tôi quyết định nuôi cấy chủng Gỉuconacetobacter trên môi trường dịch thế(MT3) ở 30°c với sự thay đối hàm lượng của (NH4) 2S04 từ Og/1 đến 6g/l. Hình 3.11. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đối hàm lượng (NH4)2so4 33 Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả dẫn ra ở bảng 3.2 và biếu đồ 3.1. Bảng 3.2. Ảnh hường của nồng độ (NIỈ 4 ) 2 S 04 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter ST T Hàm lượng Đặc điếm của màng BC (NH 4) 2so 4 (g/1) Khối lượng màng (g) 1 0 Màng mỏng, dễ rách 1.99 2 1 Màng mỏng, dễ rách 3.15 3 2 Màng mỏng, dai, mềm 5,92 4 3 Màng dày, dai, trong 7.64 5 4 Màng mỏng, dai, 5.68 6 5 Màng mỏng, dai, mềm 4.47 7 6 Màng mỏng, dễ rách 2.30 9.000 7.64 0 8.0 7 5.92 0 . 0 >5 0 3.000 0 52.0 6.0001 u> 1 5.000 .0 ÙỌ c §• 4.000 0 0 3.150 1.990 E .00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Hàm lưựng (g/l) Biểu đồ 3.1..000 Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 S 04 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter 34 Hình 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SƠ 4 đến khối lượng tươi của màng Từ bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.12 ta thấy rằng (NH 4)2SƠ4 ở hàm lượng 3/1 vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất. Có thể giải thích kết quả thu được như sau: Ket quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lượng 3g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất. Hàm lượng (NH4)2SƠ4 trên 3g/l có thể là quá cao đối với nhu cầu của tế bào vi khuấn Gluconacetobacter, do đó không thế hấp thụ hết lượng sulphate amone làm tăng pH dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và tổng hợp màng BC của vi khuấn. Vì vậy, lượng BC tạo ra thấp hơn so với môi trường có hàm lượng (NH4)2SƠ4 3g/l. Còn hàm lượng (NtLị^SCU dưới 3g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu phát triển của vi khuẩn, nên lượng BC tạo ra thấp hơn. Ket quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Schramm và Hestrin (1954) và tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013), tôi quyết định sử dụng nguồn (NtLị^SCU với hàm lượng 3g/l để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Nguồn nỉtơ vô cơ (NH ậ) 2SO 4 phù hợp cho quá trình lên men tạo màng BC của chủng Gỉuconacetobacterlà 3 (g/ỉ). 3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo Nước gạo có lượng dinh dưỡng rất cao với lượng chất béo chưa bão hoà, vitamin nhóm E, nhóm B, kẽm, canxi, kali đều rất cao, ngoài ra trong cám gạo còn có chứa chất béo omega 3 khá cao. Khoảng 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở cám, thành thần của cám có nhiều lọai vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho vi khuẩn phát triển. Thành phần - Calori - Lipit - Chât béo bão hòa Khối lượng/100g 316 KJ 21 g 4.2 g - Chất xơ tiêu hóa được 21 g - Carbohydrat 28 g - Đường 0,9 g - Protein 13,3 g - Vitamin E 4,9 mg - Vitamin B6 4,1 mg - Canxi 57 mg Theo: www.Nutritiondata.com Tôi tiến hành lên men tạo màng từ chủng Gluconacetobacterưèn môi trường dịch thể (MT3) ở 30°c với môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa. Ket quả thí nghiệm được dẫn ra trên hình 3.13 và bảng 3.3 Bảng 3.3. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo Đặc điếm màng BC Môi trường nước dừa Môi trường nước gạo Màu sắc, cảm quan Khối lượng màng Màng mỏng, nhẵn, màu Màng mỏng, nhẵn, màu trong đục 7.64g 5.91g tươi thu được Hình 3.13. Khối lượng màng BC thu được trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo Nhận xét :môi trường nước gạocó khả năng tạo màng tốt,tương đương với môi trường nước dừa. Thu màng ở ngày thứ 4,không có sự chênh lệch lớn về khối lượng, màng mỏng, dai, nhẵn.Ket quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013). Như vậy môi trường nước gạo có thế thay thế môi trường nước dừa khi lên men tạo màng BC từ chủngGluconacetobacter. KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Kiểm tra một một số đặc tính sinh học và lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacterthu màngốn định ở ngày thứ 4. 1.2. Nguồn nitơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển. 1.3. Xác định được nguồn nitơ vô cơ (NH^SCU phù hợp cho quá trình lến men tạo màng BC của chủng Gỉuconacetobacterìầ 3 (g/1). 1.4. Đã xác định được khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước gạo. 2. Đề nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng hình thành màng của chủng Gluconacetobacter .Đe sản phẩm hoàn thiện hơn và ứng dụng vào thực tiễn cần phải tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng khác tới khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIÉNG VIỆT [1] Chu Văn Man (2003), ứng dụng tin học trong sinh học , Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [2] Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê và ứng dụng, Nxb Giáo dục, tr. 214267. [3] Đặng Thị Hồng (2007), Phân lập, tuyến chọn và nghiên cứu một sổ đặc tính sinh học của vi khuân Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ sinh học trường ĐHSP Hà Nội. [4] Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một sẻ đặc điểm của vi khuấn Acetobacter và ứng dụng lên men acetỉc theo phương pháp chìm,Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội [5] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011), "Nghiên cứu vi khuấn Acetobacter xylinum sinh tống hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng", Tạp chí Y học thảm họa và bỏng, ISSN 1859-3461 số 2, tr. 122-127. [6] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuân từ Acetobacter xỵlỉnum sử dụng làm màng trị bỏng. Số 361, Tạp chí dược học. [7] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr. 149-150 [8] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr. 17-34, 63-74, 89-92. [9] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterỉal cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn thạc sĩ sinh họctrường ĐHSP Hà Nội. [10] khả Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học và [...]... nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện 1 4 tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown M R., 2005); nghiên cứu của Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đường hình thành cellulose ở vi khuấn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả năng hình thành cellulose và khả năng sinh... Barbara Surma-S'lusarska và cộng sự [17] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điếm màng, ảnh hưởng của nguồn cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy Hầu hết các tác giả nước ngoài nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC trong y học, công nghiệp giấy, trong chế... các bước xử lí sau: Bảng 2.1 Các bước xử lí màng BC STT Kết quả Các bước xử lí 2 2 1 -Rửa sạch màng bằng nước máy nhiều -Loại bỏ bớt acid acetic và các lần thành phần dư thừa từ môi trường, màng có màu vàng, mùi hơi chua 2 -Ngâm màng BC trong dung dịch muối -Làm chết và làm sạch vi khuẩn NaCl 0,7M, ở 25 - 40°c trong 12 giờ 3 -Rửa nước và đun sôi 3 lần -Loại bớt muối và chất dư thừa -Cho màng BC vào dung... giới của màng BC là trong ngành dược phấm và mỹ phấm Czajt và cs (2006), sử dụng màng Bc đắp lên vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ 1.4.2 Tại Việt Nam ơ Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter và màng BC còn khá mới mẻ Các công trình nghiên cứu mới chi'... Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành màng trong điều kiện cụ thế là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi trong bioreactor; Sirlene M Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng, cấu trúc sợi cellulose của màng trong điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong sản xuất giấy; Wojciech K và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc màng cellulose ứng dụng... 3 Nhìn chung, thời gian đế sấy màng phụ thuộc nhiều vào độ dày của màng, nếu sấy màng ở nhiệt độ quá cao màng sẽ bị giòn, giảm tính dẻo dai Quy trình bảo quản như sau: + Sấy màng ở độ ẩm khoảng 30% + Đóng gói chế phẩm màng trong các túi nilon nhờ máy hút chân không + Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°c, trong 15 phút Chương 3 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter... trường bám vào nên mục đích của quá trình xử lí màng là loại bớt các sản phẩm dư thừa (thành phần chính là đường dư), giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màu trắng trong, dai và bền hơn Song màng BC chúng tôi nghên cứu chủ yếu được ứng dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp, vì vậy các bước xử lí màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém Màng BC thu... giới và ở Việt Nam 1.4.1 Trên thế giới Vi khuấn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghệ môi trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học Các nghiên cứu hiện nay về màng Bc trến thế giới đã tập trung vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau Nghiên cứu. .. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [4]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Năm 2000, nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuấn... màng BC trong điều trị bỏng Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Đối tượng ngiên cứu và hóa chất 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là chủng Gluconacetobacter từ phòng thí nghiệm Vi Sinh - Khoa sinh - KTNN, Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ và thiết bị sau: Tủ ấm, tủ say Binder (Đức)

Ngày đăng: 30/09/2015, 08:23

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN

  • MỤC LỤC

  • MỞ ĐÀU

    • Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU

  • glucose

  • cellulose

    • Chương 3 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN

    • KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ

    • TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan