Đang tải... (xem toàn văn)
... THƠ VI N NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG TẠI TỈNH... lập vi khuẩn 4.1.1 Kết phân lập dòng vi khuẩn Từ mẫu Diệp Hạ Châu thu tỉnh Vĩnh Long phân lập 21 dòng vi khuẩn nội sinh mơi trường PDA Trong có dòng phân lập từ rễ chiếm 23,81%, dòng phân lập từ... nhuộm Gram dòng vi khuẩn Sau phân lập ròng tiến hành nhuộm Gram dòng vi khuẩn nội sinh phân lập Diệp Hạ Châu Đa số dòng vi khuẩn nội sinh phân lập Gram âm (17/21) chiếm 80,95%, vi khuẩn Gam dương
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG TẠI TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS: NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ THANH THẢO MSSV: 3103987 LỚP : VSVH K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG TẠI TỈNH VĨNH LONG Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. Ts Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Thị Thanh Thảo XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 TRƯỞNG BỘ MÔN Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nổ lực của bản thân tôi, còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và các bạn sinh viên cùng thực hiện đề tài. Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu, nâng cao kiến thức trong những năm qua. Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt những kiến thức bổ ích và những kỹ năng thao tác nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian qua. Đặc biệt là thầy Phó giáo sư –Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp đã hướng dẫn tận tình, cho tôi những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp. Bên cạnh đó tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi tận tình. Tất cả các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 luôn bên cạnh ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian theo học ở trường, nhất là khoảng thời gian thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất tới cha mẹ tôi, người đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong những năm học xa nhà. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị quản lí phòng thí nghiệm và tất cả những người bạn của tôi. Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Thảo Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Hai mươi mốt dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân, lá và trái của cây Diệp Hạ Châu ở ấp Mỹ Yên và ấp Tầm Vu, huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long. Đa số khuẩn lạc có dạng tròn đều, màu trắng đục, một số khuẩn lạc có dạng không đều, màu vàng, hầu hết các dòng vi khuẩn có dạng hình que và có khả năng chuyển động. Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng cố định, sinh tổng hợp IAA, 8 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân. Trong hai mươi mốt dòng vi khuẩn được phân lập, có sáu dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn là R2, R1A1B, L1, L2, L4 và TR9. Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli là L4, R1A1B, R2 và TR9, trong đó dòng R2 có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli mạnh nhất. Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila là L1, L2, L4 và R2, dòng L2, L4 và R2 là ba dòng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila mạnh hơn so với dòng L1. Hai dòng có khả năng kháng tốt Escherichia coli và Aeromonas hydrophila là R2 và L4. Ba dòng vi khuẩn vừa có khả năng kháng khuẩn tốt, vừa có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA và hòa tan lân được chọn để nhận diện bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S – rDNA là TR9, L4, R2. Dựa trên cơ sở dữ liệu gen NCBI, kết quả định danh dòng TR9 có tỉ lệ đồng hình là 99% với dòng Bacillus subtillis, dòng L4 có tỉ lệ đồng hình là 99% với dòng Bacillus amylolifaciens và dòng R2 có tỉ lệ đồng hình là 97% với dòng Bacillus sp.. Từ khóa: Amonium, cây Diệp Hạ Châu, hòa tan lân , IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội sinh.. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC................................................................................................................i MỤC LỤC..................................................................................................................ii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................vii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... ix TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................... x CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU........................................................................................1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................2 2.1 Vị trí địa lý tỉnh Vĩnh Long..……………………………...……………………2 2.2 Giới thiệu cây Diệp Hạ Châu………………………………………………... ..2 2.2.1 Đặc điểm thực vật:.....................................................................................3 2.2.2 Tính vị, tác dụng:.......................................................................................3 2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh..........................................................................3 2.4 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp ........................................................4 2.4.1 Vi khuẩn Azotobacter.................................................................................4 2.4.2 Vi khuẩn Azospirillum................................................................................4 2.4.3 Vi khuẩn Bacillus.......................................................................................5 a. Bacillus amyloliquefaciens.........................................................................6 b. Bacillus cereus...........................................................................................6 c. Bacillus polymyxa ......................................................................................6 d. Bacillus subtillis ........................................................................................7 2.4.4 Vi khuẩn Burkholderia...............................................................................7 2.4.5 Vi khuẩn Klebsiella....................................................................................8 2.4.6 Vi khuẩn Enterobacter ...............................................................................8 2.4.7 Vi khuẩn Pseudomonas..............................................................................9 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.5 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn. .............................................................9 2.6 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)của vi khuẩn......................... 10 2.7 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn. ................................................. 11 2.8 Đối kháng sinh học của vi khuẩn. ................................................................ 11 2.9 Một số dòng vi khuẩn gây bệnh thường gặp:................................................ 12 2.9.1 Vi khuẩn Escherichia coli ........................................................................ 12 2.9.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila .............................................................. 13 2.10 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới............................................... 14 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước: ............................................................ 14 2.10.2 Tình hình nghiên cứu thế giới: ................................................................. 14 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 16 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 16 3.1.1 Địa điểm-thời gian:.................................................................................. 16 3.1.2 Nguyên liệu: ............................................................................................ 16 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm: ................................................................... 16 3.1.4 Hóa chất và môi trường:........................................................................... 17 a. Hóa chất dùng để khử trùng mẫu: ............................................................ 17 b. Hóa chất dùng để phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn: ........... 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 20 3.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu:........................................................ 20 3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn: .............................................................. 21 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn:............................................................................ 22 a. Mục đích: .................................................................................................... 22 b. Các bước tiến hành: ..................................................................................... 22 3.2.4 Quan sát, mô tả hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn .............. 23 a. Mục đích:................................................................................................. 23 b. Nguyên tắc:.............................................................................................. 23 c. Các bước tiến hành: ................................................................................. 23 3.2.5 Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh:................................. 24 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.2.6 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập được .............................................................................................................. 25 a. Nguyên tắc:.............................................................................................. 25 b. Chuẩn bị mẫu........................................................................................... 25 c. Xây dựng đường chuẩn, ........................................................................... 26 d. Xác định nồng độ NH4+có trong mẫu vi khuẩn:........................................ 26 e. Đo lượng NH4+ ........................................................................................ 27 3.2.7 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập............................................................................................................... 27 a. Chuẩn bị. ................................................................................................. 27 b. Xây dựng đường chuẩn ............................................................................ 28 c. Xác định lượng IAA có trong mẫu vi khuẩn:............................................ 29 d. Đo lượng IAA.......................................................................................... 29 3.2.8 Thử nghiệm xác định khả năng hòa tan lân .............................................. 30 3.2.9 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được.31 a. Chuẩn bị vi khuẩn gốc và giấy thấm: ....................................................... 31 b. Tiến hành thí nghiệm: .............................................................................. 31 3.2.10 Thực hiện phản ứng PCR và định danh các dòng vi khuẩn triển vọng:..... 31 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 34 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ........................................................................... 34 4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn......................................................... 34 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn:............................................. 34 4.2 Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động .............................................. 36 4.2.1 Kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn ........................................... 36 4.2.2 Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động của các dòng vi khuẩn....... 38 4.3 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn:......................................... 39 4.3.2 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2: ........................ 40 4.3.3 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3: ........................ 41 4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn. .......................................... 42 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.5 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn:............................................... 44 4.6 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn............................................. 46 4.6.1 Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn E.coli............................. 46 4.6.2 Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila... 48 4.7 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn: ......................................................... 49 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 56 5.1 Kết luận:...................................................................................................... 56 5.2 Đề nghị:....................................................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả 1. Bảng 11: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được 2. Bảng 12: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 2. 3. Bảng 13: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 4. 4. Bảng 14: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 6. 5. Bảng 15: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 8. 6. Bảng 16: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1. 7. Bảng 17: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 2. 8. Bảng 18: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 4. 9. Bảng 19: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 6. 10. Bảng 20: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 8. 11. Bảng 21: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 12. Bảng 22: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 2. 13. Bảng 23: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 4 14. Bảng 24: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 6. 15. Bảng 25: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 8. 16. Bảng 26: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT nhóm 3. 17. Bảng 27: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ ngày 2. 18. Bảng 28: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ ngày 4. 19. Bảng 29: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ ngày 6. 20. Bảng 30: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ 21. Bảng 31:OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái ngày 2. 22. Bảng 32: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái ngày 4. 23. Bảng 33:OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái ngày 6. 24. Bảng 34: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái. 25. Bảng 35: Đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng halo trong thử nghiệm khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn nội sinh: 26. Bảng 36: Mật số, đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn kháng E.coli 27. Bảng 37: So sánh sự khác biệt về khả năng kháng E.coli của các dòng vi khuẩn 28. Bảng 38: Mật số, đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê 1. Kết quả phân tích lượng đạm của các dòng vi khuẩn nhóm 1. 2. Kết quả phân tích lượng đạm của các dòng vi khuẩn nhóm 2. 3. Kết quả phân tích lượng đạm của các dòng vi khuẩn nhóm 3. 4. Kết quả phân tích lượng IAA của các dòng vi khuẩn. 5. Kết quả phân tích khả năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cây Diệp Hạ Châu ..........................................................................................1 Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long ..............................................................1 Hình 3 : Đường chuẩn đo đạm .....................................................................................1 Hình 4: Sơ đồ minh họa pha loãng dung dich chứa IAA ..............................................1 Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước xây dựng đường chuẩn IAA....................................1 Hình 6: Đường chuẩn đo IAA ......................................................................................1 Hình 7: Vi khuẩn phát triển hình thành vòng pellice sau 2-3 ngày chủng .....................1 Hình 8: Một số dạng khuẩn lạc ....................................................................................1 Hình 9: Hình nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn đã phân lập ....................................1 Hình 10: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 theo thời gian trong môi trường NFB lỏng...................................................................................................1 Hình 11: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 theo thời trong môi trường NFB lỏng..........................................................................................................1 Hình 12: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 theo thời gian sau khi chủng trong môi trường NFB lỏng .........................................................................1 Hình 13:Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo thời gian sau khi chủng trong môi trường NFB lỏng .........................................................................................1 Hình 14: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo thời gian sau khi chủng trong môi trường NFB lỏng .........................................................................................1 Hình 15: Vòng Halo của dòng R7 trên môi trường NBRID………………..…………45 Hình 16: Khả năng kháng vi khuẩn E.coli của các dòng vi khuẩn ................................1 Hình 17: Vòng kháng khuẩn của dòng R2 kháng vi khuẩn E.coli.................................1 Hình 18: Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn ......1 Hình 19: Vòng kháng khuẩn của dòng L4 kháng Aeromonas hydrophila .....................1 Hình 20: Phổ diện điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn RNA của các dòng vi khuẩn TR9, L4, R2..........................................................................................1 Hình 21:Mức độ tương đồng của dòng TR9 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT NCBI ...........................................................................................................................1 Hình 22: Mức độ tương đồng của dòng L4 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI ...........................................................................................................................1 Hình 23: Mức độ tương đồng của dòng R2 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI ...........................................................................................................................1 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần hóa chất môi trường PDA.......................................................... 17 Bảng 2: Thành phần hóa chất môi trường NFb lỏng................................................... 19 Bảng 3: Thành phần hóa chất môi trường NBRIP ...................................................... 20 Bảng 4: Thành phần môi trường LB........................................................................... 20 Bảng 5: Đặc điểm của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ........ 35 Bảng 6: Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn ...................................................... 37 Bảng 8 : Độ hữu hiệu hòa tan lân của các dòng vi khuẩn ........................................... 45 Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP đặc....... 46 Bảng 10: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn............................................ 46 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ix Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT BLAST: Basic Local Alignment Seach Tool. DNA: Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxy-nucleotide triphosphates ĐKKL: Đường kính khuẩn lạc ĐKVS:Đường kính vòng sáng E: Độ hữu hiệu hòa tan lân IAA: Indole-3-acetic acid LB Luria - bertani NBRIP: National Botanical Research Institute’s Phosphate OD: Optical Density PDA: Potato Dextro Agar PCR Polymerase Chain Reaction Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học x Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU Y học cổ truyền một số nước đã sử dụng Diệp Hạ Châu làm thuốc lợi tiểu, trị phù thũng. Ở Việt Nam, Diệp Hạ Châu được dùng sớm nhất tại Viện Đông y Hà Nội (1967) trong điều trị xơ gan cổ trướng. Một nghiên cứu của trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil-1984) đã phát hiện một alkaloid của Diệp Hạ Châu có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật của cây thuốc. Theo một báo cáo tổng hợp của Lê Minh Khôi - Bệnh viện Trung Uơng Huế nghiên cứu thực hiện năm 2010, 40% người thường xuyên sử dụng bia rượu (trong nhóm được tổng hợp) mắc chứng gan nhiễm mỡ; 10% số đó tiến triển thành ung thư gan. Việc sử dụng các biện pháp bảo vệ gan từ sớm rất cần thiết. Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu đang được ưa chuộng vì tính an toàn và có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài. Các dược liệu tốt cho gan như actiso, hoàng bá, vọng cách, nhân trần, cà gai leo… trong đó, cây Diệp Hạ Châu đắng được đánh giá cao. Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây dược liệu nhưng phần lớn chỉ tập trung vào việc khảo sát dược tính của cây dược liệu thông qua điều trị lâm sàng, Khi canh tác cây dược liệu phần lớn sử dụng phân bón hoá học hay phân bón hữu cơ mà chưa quan tâm nhiều đến vai trò của các tập đoàn vi sinh vật sống nội sinh trong cây. Chúng có khả năng kích thích cây phát triển tốt thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan lân, sản xuất hoocmon tăng trưởng giúp cây phát triển tốt, giảm chi phí sản xuất. Đặc biệt là khả năng tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh trong cây dược liệu chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu các tập đoàn vi sinh vật sống nội sinh trong cây dược liệu có khả năng tổng hợp các chất có hoạt tính kháng khuẩn đóng vai trò quan trọng giai đoạn hiện nay. Đề tài “Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) mọc hoang tại tỉnh Vĩnh Long” để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học. Mục tiêu của đề tài: Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh sống trong cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Vị trí địa lý tỉnh Vĩnh Long Tỉnh Vĩnh Long có dạng địa hình khá bằng phẳng với độ dốc nhỏ hơn 2 độ, có cao trình khá thấp so với mực nước biển. Với dạng địa hình đồng bằng ngập lụt cửa sông, tiểu địa hình của Tỉnh có dạng lòng chảo ở giữa trung tâm Tỉnh và cao dần về 2 hướng bờ sông Tiền, sông Hậu, sông Mang Thít và ven các sông rạch lớn. Trên từng cánh đồng có những chỗ gò hoặc trũng cục bộ. Vĩnh Long nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, quanh năm nóng ẩm, có chế độ nhiệt tương đối cao và bức xạ dồi dào thuận lợi cho sản xuất nông nghiệp. (http://www.vinhlong.gov.vn/Default.aspx?tabid=58, 24/11/2013). Vĩnh Long tuy có diện tích đất phèn lớn, tầng sinh phèn ở rất sâu, tỉ lệ phèn ít, song đất có chất lượng cao, màu mỡ vào bậc nhất so với các tỉnh trong vùng. Đặc biệt tỉnh có hàng vạn ha đất phù sa ngọt ven sông Tiền và sông Hậu, đất tốt, độ phì nhiêu cao, trồng được hai vụ lúa trở lên, cho năng suất cao, sinh khối lớn lại thuận lợi về giao thông kể cả thuỷ và bộ. Ở Vĩnh Long có 4 loại đất chính: đất phèn có 90.779,06 ha, chiếm 68,94% diện tích đất toàn tỉnh; đất phù sa có 40.577,06 ha, chiếm 30,81%; đất giồng cát có 212,73 ha, chiếm 0,16%; đất xáng thổi có 116,14 ha, chiếm 0,09%. (http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/cactinhvathanhpho/tinhvinhlong/thongtintinhth anh?view=introduction&provinceId=1388, 24/11/2013) 2.2 Giới thiệu cây diệp hạ châu Hình 1: Cây Diệp Hạ Châu (* Nguồn: http://benhvienhanoi.com.vn/News/Tu-van-suc-khoe/734/312/Phong-benh-ganbang-cay-Diep-ha-chau-dang.htm, ngày 5/8/2013. ) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.2.1 Đặc điểm thực vật: Diệp Hạ Châu (chó đẻ thân xanh) có tên khoa học là Phyllanthus amarus L. Thuộc họ Thầu dầu ( Euphorbiaceae). Diệp Hạ Châu là cây cỏ mọc hằng năm cao từ 0,2m -0,3m, toàn thân nhẵn, có màu xanh. Lá thuôn nhỏ hình trứng, mọc so le, trông giống lá kép. Hoa đơn tính cùng gốc, mọc ở kẽ lá. Quả hình cầu nhỏ treo ở mặt dưới cành lá. Diệp Hạ Châu là loài cây của vùng nhiệt đới. Ở nước ta cây mọc khắp nơi. Diệp Hạ Châu sử dụng được toàn cây, dùng tươi hay khô, thu hái vào mùa hè, rửa sạch, phơi khô trong mát. Thành phần hóa học: chất đắng (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin, phyllteralin), alkaloid (nirurine, epibubialin). Ngoài ra còn có flavonoid (4- methyl- nor quercetin), saponin và tanin (Trần Hùng et al., 2009). 2.2.2 Tính vị, tác dụng: Theo tổng kết của Patel et al., (2011), các hợp chất có hoạt tính trong Diệp Hạ Châu đắng là các lignan, Ellagitannins viz. geraniin, amariin, furosin, geraniinic acid, amariinic acid, amarulone, repandusinic acid, corilagin, isocorilagin, elaeocarpusin, phyllanthin D gallic acid, repandusinic acid A etc., triterpenes, alkaloids, sterol….Các lignin liên quan đến hoạt tính kháng viêm như nirtetralin, phyltetralin và niranthin. Phyltetralin, nirtetralin và niranthin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trình viêm và sự lan tràn bạch cầu trung tính. Elllagitanins geraniin, corilagin, niranthin và henokinin có vai trò kháng virus viêm gan. Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của Diệp Hạ Châu có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất là phyllanthin, amariin, repandusinic acid và phyllanthusiin D. Hoạt tính chống ung thư cũng được thử nghiệm trên chuột với hỗn hợp phyllanthin và hypophyllanthin (1:1). Phyllanthin được chứng minh vai trò bảo vệ tế bào gan chuột gây độc với ethanol hoặc CCl4. Diệp Hạ Châu còn được sủ dụng để trị bệnh gan giúp phục hồi tế bào gan và điều trị viêm gan siêu vi B (Trần Hùng et al., 2009). 2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà ngược lại những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi và Palumbo, 2000; Bandara, 2006). Nó có giá trị trong nông nghiệp như một công cụ thực hiện cải tiến mùa màng Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT (Muthukumarasamy et al., 2002). Vi khuẩn nội sinh có thể hình thành các mối quan hệ khác nhau với cây chủ bao gồm cộng sinh, hỗ sinh. Đa số vi khuẩn nội sinh có nguồn gốc từ vùng rễ, tuy nhiên, một số có thể được truyền qua hạt giống, qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983). Hiện nay các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí (Xu et al., 1998), tổng hợp IAA (Barbieri et al., 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Rosenblueth và Martinez, 2006), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng ( Lăng Ngọc Dậu et al., 2007). Một trong những khám phá mới về vi khuẩn nội sinh là chúng khả năng tổng hợp ra những hợp chất chống lại mầm bệnh như vi nấm, nấm, tuyến trùng… gây bệnh cho cây trồng , có thể xem những hợp chất này như là hợp chất kiểm soát sinh học (phytopathogenes) hay đối kháng (biocontrol agents)(Berg et al., 2005). Ngoài ra, chúng còn có khả năng tổng hợp ra những hợp chất tự nhiên phân hủy các hóa chất độc hại như thuốc bảo vệ thực vật, dung môi hữu cơ…….(Siciliano et al.,2001; Germaine et al., 2004, 2006) góp phần trong việc xây dựng nền nông nghiệp bền vững. 2.4 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp 2.4.1 Vi khuẩn Azotobacter Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspanum notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của Azotobacter paspali ở vùng rễ. Bà cho rằng Azotobacter paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspanum notatum chủ yếu bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm. 2.4.2 Vi khuẩn Azospirillum Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al., 1978). Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum). Azospirillum xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan, tổng hợp IAA và các chất dinh dưỡng khác (Bial et al.,1990; Seshadri et al., 2000 Somers et al.,2005; Lăng Ngọc Dậu et al.,2007), sản xuất kích thích tố thực vật (Broek và Vanderleyden, 1995), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003). Vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cỏ, mía đường và ngũ cốc trên khắp thế giới, ở vùng khí hậu nhiệt đới cũng như ôn đới (Enrique và Caceres, 1982; Reinhold-Hurek et al.,1986). 2.4.3 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N. Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al., 1998). Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH =7, một số phù hợp với pH= 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…). Do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT a. Bacillus amyloliquefacien Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn gram dương, hình que, di động, kích thước 0,7-0,9 x1,8-3µm, nội bào tử ( 0,6-0,8 x 1-1,4µm), là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH=7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới hạn 15-50o C, nhiệt độ tối ưu 30-40oC. Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an toàn (GRAS) do đó Bacillus amyloliquefaciens được biết đến với nhiều ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại như sản xuất enzyme công nghiệp. Bacillus amyloliquefaciens có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột. Phytase của các chủng thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens là β propeller phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao với Ca2+. Đây là loại phytase khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng lại biểu hiện rất ít hoặc không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự có mặt của Ca2+ cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này. (Theo dẫn liệu Phan Thị Thu Mai, 2012). b. Bacillus cereus Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983). c. Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa là vi khuẩn gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 –1) x (2 –7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT cây, chúng còn có khả năng cố định đạm và thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược.( Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009). d. Bacillus subtillis: Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 .Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bịu. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 –5) x 0,6 µm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36oC –50oC, tối đa khoảng 60oC. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6–0,9µm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm (Nguyễn Thành Đạt, 1990). Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV). Đặc biệt, B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật –một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007). 2.4.4 Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính khoảng 1 µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT (Caballero- Mellado et al., 2004). Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất. Trong môi trường nuôi cấy, chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4 mm, tròn, phẳng hoặc lài (Caballero – Mellado et al., 2004; 2007). Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu nhiệt đới (Mounlin et al, 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003; Chen et al., 2006). Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia ( Martinez – Aguilar et al., 2008) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye và Vadnamme, 2003; Osulliva và Mahenthiralingam, 2005). Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Van et al., 1994; Gillis et al.,1995) giúp tăng khả năng đâm chồi, tăng số lượng rễ, tăng bề mặt lá và tăng năng suất. 2.4.5 Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn Klebsiella thuộc Gram âm, dạng hình que, ít chuyển động, có khả năng kết nang thành bào xác, kỵ khí không bắt buộc, sống tự do trong đất hoặc có khả năng xâm nhập và nội sinh trong cây trồng. Có hai loài quan trọng là Klebsiella oxytoca và Klebsiella pneumoniae (http://en.wikipedia.org/wiki/ Klebsiella). Ở Ấn Độ, Klebsiella oxytoca được phân lập từ thân và rễ của cây cỏ đuôi mèo (Typha austrlis) có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30µg/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5µg/mg trọng lượng, mức độ biểu hiện hoạt tính của nitrogenase trong phản ứng khử acetylene là khá cao. Ngoài ra, dòng vi khuẩn này còn có khả năng giúp cây lúa tăng toàn bộ chiều dài cây, tăng hàm lượng chlorophyll-a, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây (Jha và Kumar, 2007). 2.4.6 Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ – Proteobacteria , hầu hết là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 đạm, là vi khuẩn Trường ĐHCT kích thích sự sinh trưởng thực vật (http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacter, 2008). Enterobacter intermedium được phân lập từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2 – ketogluconic acid (Hwangbo et al, 2003). 2.4.7 Vi khuẩn Pseudomonas Vi khuẩn Pseudomonas spp. Phân bố rộng rãi và đa dạng nhiều chủng loài (Rangarajan et al.,2001; 2002). Vi khuẩn Pseudomonas spp. thường là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực nên có khả năng lội tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử. Chúng hiện diện khắp nơi như trong đất, trong nước, thực vật, động vật, một số làm hư thực phẩm. Pseudomonas có thể hô hấp trong hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có oxy, nhiệt độ thuận lợi cho chúng phát triển là 30- 37o C, một số chủng có thể sống ở 40oC. Một số chủng Pseudomonas có khả năng thúc đẩy sự phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae ( Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie et al., 1996). Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis có khả năng hòa tan lân (Cattenlla et al., 1999). Pseudomonas có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cho cậy trồng như: Pseudomonas jluorescens HP72, Pseudomonas putida (Suzuki et al.,2003). Theo Sivamani el al., 1987 cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris. Trong số các loài Pseudomonas sp., P.fluorescens được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). 2.5 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn. Đạm là chât dinh dưỡng rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Trong không khí có rất nhiều đạm (78%) nhưng cây trồng không hấp thụ trực tiếp Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT được. Các dòng vi khuẩn cố định đạm có khả năng chuyển hóa đạm từ dạng cây trồng không hấp thụ được (N2) thành dạng đạm cây trồng có thể sử dụng được nhờ sự xúc tác của enzym nitrogenase (Cao Ngọc Điệp, 2011). Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của enzym nitrogenase được viết tóm tắt như sau: N2 + 6e- +12ATP+12H2O à 3NH4+ + 12ADP +12Pi + 4 H+ Quá trình khử này gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau: N2 + 2H+ à [NH=NH] + 2H+ à [NH2-NH2] + 2H+ à 2NH3 Amonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục đồng hóa tạo thành những acid amin cung cấp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007) 2.6 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)của vi khuẩn. Indole-3-acetic acid hay còn gọi là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật. Tác động của IAA phụ thuộc vào dạng tế bào, nồng độ như IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001). Vi khuẩn nội sinh đã được phát hiện là có khả năng tổng hợp indole -3-acetic acid từ tiền chất L- tryptophan (Sergeeva et al., 2002). Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau: o Lộ trình indole- 3-pyruvic acid Tryptophan à indole- 3-pyruvic acidà indole- 3-acetaldehydeàIAA o Lộ trình tryptamine Tryptophanà tryptamine à indole- 3-acetaldehyde à IAA o Lộ trình indole-3-acetamide Tryptophanà indole- 3-acetaldehyde à IAA Nhiều loài vi sinh vật cố định đạm sống tự do, vi sinh vật sống cộng sinh, và những vi sinh khác có cơ chế tổng hợp IAA với tiền chất L-tryptophan (Ten et al., 2000; Sridevi và Mallaiah, 2007). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.7 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn. Nhiều dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như CaHPO4, CaHPO4.2H2O, Ca3PO4 thành dạng lân dễ tan để cây trồng sử dụng. Đặng Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp (2002) đã phân lập được vi khuẩn và nấm có khả năng chuyển hóa lân khó tan trong các loại đất ở Đồng bằng sông Cửu Long. Kucey et al., (1989), Rashid et al., (2004) giải thích sự hòa tan lân trong đất là do sự bài tiết các acid hữu cơ và xác định tác nhân này làm giảm pH đất, điều này rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó tan trong đất. Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase). Có hai loại phosphohydrolase là phosphohydrolase kiềm và phosphohydrolase kiềm. 2.8 Đối kháng sinh học của vi khuẩn. Vi khuẩn nội sinh có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các sinh vật gây hại, điều này có thể dẫn đến hiện tượng gia tăng tính kháng bệnh hay kích kháng. Nhiều giống vi khuẩn nội sinh như Pseudomonas, Burkhoderia và Bacillus được biết là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu (Lodewyckx et al., 2002; Ryan et al., 2008). Chất kháng sinh đã được tìm thấy từ vi khuẩn nội sinh phân lập từ khoai tây chống lại nấm Fusarium sambucinum, F. avenaceum, F. oxysporum, Rhizotonia solani và từ bắp chống lại nấm Fusarium miniliformis (Hinton và Bacon, 1995). Theo nghiên cứu của Đặng Ngọc Phương Uyên năm 2007, Bacillus subtilis chủng L211 có khả năng đối kháng cao với E. coli O157:H7. Những thí nghiệm với dòng B. amyloliquefaciens FZB42 trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng cho thấy có khả năng đối kháng với nhiều nấm bệnh và vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Nấm bệnh được ngăn chặn bởi B. amyloliquefacien FZB42 như Rhizoctonia solani, Fusarium graminearum, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora erythrospetica (Gnanamanickam et al., 2008). Dòng B. amyloliquefaciens FZB24 còn ngăn chặn được vi khuẩn gây héo rủ ở cà chua (Ralstonia solanacearum) và vi khuẩn gây thối các chồi non ở táo (Erwinia amylovora) (Gnanamanickam et al., 2008; Aldwinckle et al., 2008). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.9 Một số dòng vi khuẩn gây bệnh thường gặp: 2.9.1 Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli (E.coli) trước đây gọi là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis, lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt tên theo bác sĩ nhi khoa Đức. Vi khuẩn E.coli thuộc họ Enterobacteriaceas, vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh đường ruột và các cơ quan khác ( Lê Văn Tạo, 1997). Vi khuẩn E.coli có thể sinh trưởng ử nhiệt độ từ 5- 40oC, nhiệt độ thích hợp nhất là 37oC, pH thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 phát triển được pH từ 5,5 – 8. E.coli có thể phát triển trên môi trường thông dễ dàng, một số chủng có thể phát triển trên môi trường tổng hợp nên người ta chọ chúng để nghiên cứu về sinh vật học (Nguyễn Như Thanh, 1997). Trong điều kiện bình thường vi khuẩn E.coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn vi khuẩn bội nhiễm đường tiêu hóa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). Vi khuẩn E.coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin): gồm hai loại độc tố chịu nhiệt (gồm hai loại là STb có vai trò quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy do các chủng E.coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh) (Carter et al., 1995) và độc tố không chịu nhiệt LT ( LT là một trong những yếu tố gây triệu chứng tiêu chảy quan trọng) (Faibrother et al., 1992). Nhóm độc tố tế bào ( Shiga/ Verotoxin): nhóm độc tố này được trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero, được sản sinh bởi vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn con ( Konowalchuck et al., 1997). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn E.coli có khả năng kháng lại một số lạo kháng sinh như: Amoxicillin, Chloramphenicol, Trimethroprim, Tetracyclin, Streptomycin ( Đỗ Ngọc Thúy et al., 2002). Để điều trị bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli sử dụng phương pháp kháng sinh đồ. 2.9.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem la chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên, theo Anhka (1990). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80-90% . Đỗ Thị Hòa et al (2004) bệnh nhiễm trùng do A. hydrophila thường gặp ở nhiều loại thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc,.... Ở Việt Nam, các loại cá nuôi lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, cá chép, cá trê....Tỷ lệ tử vong thủy sản thường từ 30-70%, bệnh xảy ra ở các giai đoạn khác nhau trong quá trinh sinh trưởng. Bệnh do A. hydrophila ở nước ta có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuất hiện nhiều vào đầu màu mưa, mùa có nhiệt độ 25-28OC. Ngoài việc gây bệnh cho thủy sản A. hydrophila còn gây bệnh cho người, Nguyễn Trung Cấp - Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung Ương cho biết từ năm 2009-2013 có hàng chục ca nhiễm A. hydrophila được ghi nhận, trong đó những trường hợp nhiễm bệnh khi làm việc dưới nước bị đứt chân, tay. Cá biệt có người bắt cá bị ngạnh cá đâm vào tay và nhiễm bệnh. Trrước đây có một số bệnh nhân nhiễm A. hydrophila, bị hoại tử da tay, chân nặng nề nhưng sau điều trị và được vá da, hiện bệnh nhân rất khỏe mạnh. Cách phòng bệnh: tốt nhất là nên tránh lội vào vùng nước có bùn, nước nhiễm bẩn khi có vết xước ở tay chân mà không có phương tiện bảo hộ. Người làm nghề đặc thù như làm việc trên bè cá tôm, bè tre nứa, công nhân vệ sinh...nên trang bị đủ phương tiện bảo hộ cá nhân. Không nên chơi đùa ở vũng nước có bùn bẩn. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 13 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.10 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước: Tại Việt Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của Diệp Hạ Châu đã được tiến hành, chẳng hạn: nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y - 1990 - 1996) đã thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus; nhóm nghiên cứu của Trần Danh Việt và Nguyễn Thượng Dong (Viện Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001). Diệp Hạ Châu được dùng sớm nhất tại Viện Đông y Hà Nội (1967) trong điều trị xơ gan cổ trướng. Năm 1977, một nhóm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hoá, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là Diệp Hạ Châu đắng, Xuyên tâm liên, quả Dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HBsAg (+). Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi. Tỷ lệ đạt 26/98 bệnh nhân.. Nghiên cứu của Ngô Bá Duy et al. (2012) cho biết sử dụng cao Diệp Hạ Châu đắn (30ml/con, 3 lần/ngày, trong 20 ngày) cho chó bệnh viêm gan thực nhiễm với CCI4 đã giúp 85% chó có các chỉ tiêu sinh lý (AST, ALT, ALP, TB và DB) và hình ảnh siêu âm về bình thường sau 15 ngày điều trị. 2.10.2 Tình hình nghiên cứu thế giới: Tác dụng giải độc gan và chữa viêm gan siêu vi B chỉ mới được các nhà khoa học lưu ý từ những năm 1980 về sau. Nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và Ấn Độ cho biết họ đã phân lập được những hợp chất trong cây Diệp Hạ Châu có khả năng chữa bệnh viêm gan. Một báo cáo trên tạp chí Lancet vào năm 1988 cũng xác định tác dụng này. Theo đó, 2 nhà khoa học Blumberg và Thiogarajan đã điều trị 37 trường hợp viêm gan siêu vi B với kết quả 22 người âm tính sau 30 ngày dùng Diệp Hạ Châu. Đối với viêm gan siêu vi, 50% yếu tố lây truyền của virus viêm gan B trong máu đã mất sau 30 ngày sử dụng loại cây này (với liều 900 mg/ngày). Một nghiên cứu của trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil-1984) đã phát hiện một alkaloid của Diệp Hạ Châu (phyllan thoside) có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật của cây thuốc. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 14 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Năm 1995, các nhà khoa học Brazil cũng phát hiện tác dụng giảm đau mạnh và bền vững của loài cây này. Tác dụng này được cho là do acid gallic, có ý nghĩa trong tình trạng viêm gan, tổn thương gan do bia rượu. Theo dẫn liệu của Patela (2011), chất chiết cồn của P.amarus được chứng minh là có hoạt tính cao nhất chống lại Salmonella typhi.. Dịch chiết trong nước và trong methanol của lá cây P. amarus ở nồng độ 100mg/ml được kiểm tra với E.coli, Streptococcus spp, Klebsiella spp, Pseudomonas spp và Staphylococcus. Kết quả cho thấy dịch chiết thô ức chế E. coli, Streptococcus và S.aureus. Trong một nghiên cứu khác, dịch chiết thân lá của Diệp Hạ Châu đắng có đặc tính kháng khuẩn đối với Bacillus cereus ATCC 11778, B. subtilis ATCCC 6633, Bacteroides fragilis ATTC 25285, E. faecalis ATCCC 29212, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC27853, S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 và Streptococcus pyogenes ATCC 19615 với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 0,25 đến 16mg/ml. Hoạt tính kháng khuẩn này là do phyllanthin. Nhiều kết quả nghiên cứu chứng minh quan trọng cả về cơ bản và ứng dụng của chất Diệp Hạ Châu hoặc các hoạt chất với nhiều tác dụng như chống chứng lãng quên, chống ung thư, chống sốt rét, lợi tiểu, tránh thai hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hòa miễn dịch và bảo vệ thận ( Patel et al.,2011). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 15 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm-thời gian: Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật và phòng thí nghiệm Thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2013 -11/2013 3.1.2 Vật liệu: Mẫu cây Diệp Hạ Châu ấp Tầm Vu và ấp Mỹ Yên, xã Trà Côn, huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long. Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long, ngày 5/12/2013 Vi khuẩn E. coli được cung cấp từ phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Vi khuẩn A. hydrophila được cung cấp từ khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm: Sử dụng máy móc và các thiết bị hiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Những thiết bị, dụng cụ để phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn: − Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong. − Tủ cấy vi sinh vật Biosafe II – ESCO (Singapore) − Tủ ủ vi sinh vật Binder (Đức). − Kính hiển vi olympus CHT (Nhật) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 16 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức). − Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức). − Tủ sấy EHRET (Đức). − pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ). − Cân điện tử Satorius (Đức). − Đĩa petri, ống nghiệm. − Máy ly tâm - Eppendorf. − Bộ micropipette. − Những thiết bị, dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm: tủ lạnh, máy chụp ảnh kỹ thuật số Canon Digital Ixus 75 (Nhật), máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. 3.1.4 Hóa chất và môi trường: a. Hóa chất dùng để khử trùng mẫu: − Nước cất khử trùng. − Ethanol (Cồn 70o). − H2O2 (3%). b. Hóa chất dùng để phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn: • Môi trường nuôi cấy PDA: Bảng 1: Thành phần hóa chất môi trường PDA Tên hóa chất Liều lượng (g/l) Dịch trích khoai tây 1 lít Destro 20 Agar 20 pH 5,6 + 0,2 Môi trường PDA bán rắn chỉ sử dụng 2% agar môi trường đặc. * Cách nấu dịch trích khoai tây: − Tỉ lệ 200 gam khoai tây và 1 lít nước cất. − Khoai tây: bỏ vỏ rửa sạch, cắt thành từng mảnh nhỏ. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 17 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Nấu khoai tây và nước cất theo tỉ lệ trên khoảng 15 phút, bỏ xác và để nguội, lọc qua giấy lọc để loại bỏ xác khoai tây còn lại trong dịch trích. Môi trường sau khi được khử trùng nhiệt ướt rót vào đĩa petri giữ trong tủ ủ. Tất cả các thao tác đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Chú ý: môi trường dùng để cấy trải vi khuẩn được bổ sung kháng sinh với liều lượng 1ml/l môi trường. Môi trường cấy chuyển thì không cần bổ sung thêm kháng sinh. • Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn: − Nước cất khử trùng. − Iod. − Fushin. − Crystal violet. − Ethanol (Cồn 70 o). • Hóa chất dùng để đo lượng NH4+ tổng hợp bằng phương pháp Indolphenol blue (Page et al., 1982) − Chuẩn bị dung dịch KCl 2 M: Hòa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất. − Stock (NH4 +): Hòa tan 0,4717 g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. − Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5 g phenol và 0,025 g nitroprusside trong 0,5 lít nước cất. − Hypochloride buffer: hòa tan 15 ml NaOCl + 5 g NaOH vào 0,5 lít nước cất. − Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và nuôi tăng sinh môi trường NFb lỏng. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 18 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 2: Thành phần hóa chất môi trường NFb lỏng Hóa chất Liều lượng (g/l) Malic aciad 5 MgSO4,7H2O 0,2 CaCl2 0,02 NaCl 0,02 KOH 4,5 FeEDTA (1,64%) 4 ml/l Vi lượng (0,2g Na2MoO4,2H2O, 0,235g MnSO4,H2O, 0,28 g H3BO3, 0,008g 2 ml/l CuSO4,5H2O, 0,24g ZnSO4,7H2O) Vitamin (0,001g biotin, 0,002 pyridoxine) 1 ml/l Bromothymol blue 0,5% trong 0,2N 2 ml/l pH 6,8 Nguồn: Kirchhof et al., (1997). • Hóa chất dùng để đo lượng IAA tổng hợp bằng phương pháp Salkowski: − Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1l H2SO4 10,8M − Chuẩn bị phosphat buffer 200 ml: + A: KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất. + B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất. + Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml ta được dung dịch C, chỉnh pH = 7. • Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng phát triển của vi khuẩn nội sinh trên môi trường chứa lân khó tan NBRIP: Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 19 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 3: Thành phần hóa chất môi trường NBRIP Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 MgSO4,7H2O 0,25 Ca3PO4 5 MgCl2,6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1 Bromothymol blye 0,5% trong KOH 0,2N 6 ml/l Agar Môi trường đặc: 20 Môi trường bán đặc: 2 pH 7,0 * Nguồn: Nautiyal,(1999) • Hóa chất dùng để khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh bằng phương pháp giấy thấm (d=0,6cm). Sử dụng môi trường LB để khảo sát khả năng khả năng khángr vi khuẩn E.coli và Aeromonas hydrophila. Bảng 4: Thành phần môi trường LB Tên hóa chất Liều lượng (g/l) Tryptone 10 NaCl 10 Yeast extract 5 Agar 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu: Thu mẫu Diệp Hạ Châu ở nhiều điểm khác nhau và ít sử dụng phân bón hoặc không có bón phân ở tỉnh Vĩnh Long, mỗi điểm lấy 4-5 cây, chọn cây đang ở giai đoạn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT tăng trưởng mạnh. Thời gian thu mẫu là buổi sáng và chiều, lấy toàn bộ cây rửa dưới vòi nước cho sạch đất, tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng. Sau đó, cắt rời rễ, thân, lá và trái thành từng đoạn nhỏ khoảng 2cm, cho mẫu vào cốc nhỏ lần lượt khử trùng theo quy trình sau: − Rửa mẫu cồn 70o trong 30 giây. − Rửa mẫu H2O2 trong 3-5 phút. − Rửa lại với nước cất 4 lần. − Chuyển mẫu vào tủ cấy. Khi thu mẫu chúng ta lấy phần đất xung quanh gốc cây khoảng 4-5cm để hạn chế rễ cây bị đứt và xác định pH của đất. 3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn: Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt rễ, thân, lá và trái sau khi khử trùng chuyển nước rửa lần thứ 4 chủng lên môi trường PDA để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có vi khuẩn xuất hiện, mẫu cần được khử trùng triệt để hơn để loại bỏ các vi khuẩn có trong đất. Sau khi xử lý mẫu ta thực hiện phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diệp Hạ Châu theo quy trình sau: − Mẫu được giã nhuyễn trong cối đã được khử trùng trước đó, bổ sung thêm 1ml nước cất đã khử trùng. Hút phần dịch trích mẫu cho vào tube 1,5ml. Trộn đều dịch trích mẫu bằng máy khuấy, hút 500µl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường NFb bán đặc đã khử trùng nhiệt ướt 121 o C. Ủ mẫu ở 30oC trong 2 đến 4 ngày. − Sau 2 đến 4 ngày, quan sát các ống nghiệm xuất hiện một lớp màng mỏng (vòng pellice), cách mặt môi trường khoảng 0,5 cm, đó là dấu hiệu chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh. − Dùng micropipet hút cẩn thận 5µl từ vòng pellice nhỏ lên môi trường PDA đặc đã được khử trùng trước đó, dùng que cấy trải mẫu đều trên bề mặt môi trường, hơ dưới ngọn đền cồn cho đến khi khô bề mặt môi trường, ủ 30oC. − Khi khuẩn lạc vi khuẩn phát triển xuất hiện trên bề mặt môi trường, tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường khác đến khi xuất hiện những khuẩn lạc rời rạc và Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 21 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT giống nhau. Kiểm tra độ ròng của vi khuẩn bằng cách quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép ở vật kính X40 (độ phóng đại 400 lần) thực hiện như sau: + Nhỏ 1 giọt nước cất (khoảng 20 µl) đã được khử trùng lên kính mang vật (lame). + Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và để nguội. + Dùng đầu kim cấy lấy một ít mẫu đã được cấy trữ trong ống nghiệm chấm vào giọt nước cất trên kính mang vật và tán đều (trong điều kiện vô trùng). + Dùng kính đậy vật (lammelella) đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o hạ kính đậy vật xuống từ từ sao cho không có bọt khí trong mẫu vật. Nếu quan sát thấy mẫu vi khuẩn đã ròng (giống nhau về hình dạng) thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để trữ ở 4oC và được xem như là một dòng. 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn: a. Mục đích: Nhuộm Gram dùng để nhận diện các tế bào vi sinh vật sơ hạch trước khi sử dụng chúng vào công tác nghiên cứu. Mục đích của việc nhuộm Gram giúp ta xác định mẫu vật là Gram âm hay Gram dương. Để công tác nhuộm Gram được chính xác phải có mẫu vật ở giai đoạn mẫu vật đang ở giai đoạn phát triển mạnh nhất (giai đoạn log) vì nếu sử dụng mẫu vật già thì kết quả nhuộm nhiều khi bị sai lạc do có một số tế bào vi sinh vật lúc già sẽ chuyển đổi từ Gram dương sang Gram âm do Iod không gắn được vào phẩm nhuộm Crystal vào vách tế bào vi khuẩn Gram dương (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). b. Các bước tiến hành: Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Trình tự nhuộm Gram được thự hiện như sau: − Nhỏ 10μL nước cất vô trùng lên giữa kính mang vật. − Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật. − Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút. − Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước. − Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút. − Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. − Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa. − Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. − Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút. − Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin. − Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước. − Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm. 3.2.4 Quan sát, mô tả hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn a. Mục đích: Đánh giá sơ bộ về những đặc điểm hình thái của chúng, từ đó có thể phân nhóm ra để tiến hành nghiên cứu cho thuận tiện. b. Nguyên tắc: Dựa trên sự khác biệt về hình dạng, kích thước của vi khuẩn. c. Các bước tiến hành: Sau khi phân lập vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn: − Nhỏ 5 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật. − Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. − Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). 3.2.5 Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh: Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng, tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau: − Nhỏ 10μL nước cất vô trùng lên kính mang vật. − Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. − Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. − Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính. (Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính. Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2 mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10µm). Phương pháp đo kích thước vi khuẩn được thực hiện như sau: − Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước. − Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính. − Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35 − Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. − Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo − Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này. − Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). 3.2.6 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập được. a. Nguyên tắc: Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng NH3 tác dụng với hypoclorite( pH 8-11,5) hình thành hợp chất trung gian monocloramine. Chất này sẽ kết hợp với phenol và hypoclorite dư với sự xúc tác của nitroprusside tạo thành hợp chất Indophenol có màu xanh ở điều kiện pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982). Với phương pháp này ta có thể đo được nồng độ NH4+ từ 0,2 đến 12,5 ppm. b. Chuẩn bị mẫu − Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn đã tách ròng trong môi trường PDA lỏng. Ủ lắc trong 2 ngày. − Chủng 500µl các dòng vi khuẩn đã nuôi vào ống nghiệm chứa 8 ml môi trường NFb lỏng không đạm, mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần. − Các ống nghiệm vừa được chủng vi khuẩn được ủ lắc ( tốc độ 200 vòng/phút) ở Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT nhiệt độ phòng. − Định lượng đạm do các dòng vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4 ,6, 8 (sau khi chủng). c. Xây dựng đường chuẩn, − Pha dung dịch NH4+ chuẩn: Pha loãng 1ml stock NH4+ bằng 49 ml dung dịch KCl để được 50 ml sau cùng có nồng độ 2 µg NH4+/ml. Lưu ý, chỉ pha loãng khi sử dụng. − Chuẩn bị 6 ống nghiệm, đánh số từ 0 đến 5, lần lượt thêm vòa mỗi ống các hóa chất theo thứ tự sau: + Ống 0 gồm có: 2,5ml H2O; 0 ml NH4+ chuẩn; 2,5ml buffer, 2,5 ml thuốc thử. + Ống 1 gồm có: 2ml H2O: 0,5 ml NH4+ chuẩn; 2,5ml buffer, 2,5ml thuốc thử. + Ống 2 gồm có: 1,5ml H2O:1 ml NH4+ chuẩn; 2,5ml buffer, 2,5ml thuốc thử. + Ống 3 gồm có: 1ml H2O: 1,5 ml NH4+ chuẩn; 2,5ml buffer, 2,5ml thuốc thử. + Ống 4 gồm có: 0,5ml H2O: 2ml NH4+ chuẩn; 2,5ml buffer, 2,5ml thuốc thử. + Ống 5 gồm có: 0ml H2O: 2,5ml NH4 chuẩn; 2,5ml buffer, 2,5ml thuốc thử. Vortex các ống nghiệm, để ở nhiệt độ phòng khoảng 10-20 phút. Phản ứng tạo màu sẽ xảy ra tỉ lệ với lượng NH4+. 0 1 2 3 4 5 Hình 3 : Đường chuẩn đo đạm 0 d. Xác định nồng độ NH4+ có trong mẫu vi khuẩn: − Chuẩn bị 3 eppendorf (3 lần lặp lại) cho mỗi dòng. Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã nuôi trong môi trường NFb lỏng trước đó cho vào eppendorf ( trước khi hút dịch vi khuẩn vortex thật đều ống nghiệm chứa dịch vi khuẩn). − Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút để loại bỏ tế bào chết. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Hút cẩn thận 0,5 ml dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml nước khử khoáng và 2,5 ml dung dịch buffer. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử vào ống nghiệm, trộn đều bằng máy Vortex. − Để ổn định ở nhiệt độ phòng 10-20 phút, sau đó đo OD ở bước sóng 636nm (OD636nm). e. Đo lượng NH4+ − Bật máy đo quang phổ 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 636 nm (OD636 nm). − Đo OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn trước, sau đó tiến hành đo OD các mẫu. − Đưa giá trị của ống 0 ( không có đạm, không có màu xanh) về giá trị 0, làm mẫu đối chứng âm. Sau đó tiếp tục đo giá trị OD của năm ống đường chuẩn theo thứ tự từ 1 đến 5. Sáu ống nghiệm đường có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với giá trị OD tăng dần. Tiếp tục đo giá trị OD của các dòng vi khuẩn đã chuẩn bị. − Từ kết quả đo OD của sáu ống nghệm đường chuẩn dùng chương trình vẽ đồ thị trong phần mềm Microsoft Exel để xác định phương trình đường chuẩn của NH4+ có dạng: y = ax+b Trong đó: y: là giá trị đo OD. x : là lượng đạm cần tìm. − Kết quả giá trị đo OD của các dòng vi khuẩn được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính đưuọc lượng NH4+ cần tìm. Sau đó, các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Statgraphics. 3.2.7 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập. a. Chuẩn bị. − Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn đã tách ròng trong môi trường PDA lỏng, Ủ lắc trong 2 ngày. − Chủng 500µl các dòng vi khuẩn đã nuôi vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường NFb lỏng không đạm, mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần. − Các ống nghiệm vừa được chủng vi khuẩn được ủ lắc ( tốc độ 200 vòng/phút) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT ở nhiệt độ phòng. Chú ý: các ống nghiệm chứa vi khuẩn phải được trùm kín tránh tiếp xúc với ánh sáng. b. Xây dựng đường chuẩn − Cân 0,0016 g IAA thương mại hòa tan với 10 ml phosphat buffer ( dung dịch C) được nồng độ là 160 µg/l. Đun trên ngọn đèn cồn cho đến khi IAA hòa tan hết. Sau đó, chuẩn bị 7 ống nghiệm có chứa sẵn 3 ml dung dịch C rồi tiến hành pha loãng pha loãng ra các nồng độ 2,5 µg/ml; 5 µg/ml; 10 µg/ml; 20 µg/ml; 40 µg/ml; 80 µg/ml; 160 µg/ml như hình dưới đây: 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Dung dich C+IAA 3ml dung dịch C 2.5 5 10 20 40 80 160 Hình 4: Sơ đồ minh họa pha loãng dung dich chứa IAA − Chuẩn bị tám ống nghiệm có chứa 2 ml thuốc thử đánh số theo thứ tự sau: 0, 2,5, 5, 10, 20, 30, 40, 80. − Thành phần hóa chất mỗi ống nghiệm đường chuẩn như sau: 2.5 5 10 20 40 1ml dung dịch C 80 0.5ml 160 0.5ml 1ml 2ml thuốc thử 0 2.5 5 10 20 30 40 80 Hình 5:Sơ đồ minh họa các bước xây dựng đường chuẩn IAA + Ống 0 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch C. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT + Ống 2,5 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch IAA ở nồng độ 2,5 µg/ml. + Ống 5 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch IAA ở nồng độ 5 µg/ml. + Ống 10 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch IAA ở nồng độ 10 µg/ml. + Ống 20 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch IAA ở nồng độ 20 µg/ml. + Ống 30 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 0,5 ml dung dịch IAA ở nồng độ 20 µg/ml + 0,5 ml dung dịch Iaa ở nồng độ 40 µg/ml. + Ống 40 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch IAA ở nồng độ 40 µg/ml. + Ống 80 bao gồm: 2 ml thuốc thử và 1 ml dung dịch IAA ở nồng độ 80µg/ml. − Vortex các ống nghiệm , để ở nhiệt độ phòng khoảng 10-20 phút. Các ống nghiệm được trùm kín hạn chế tiếp xúc với ánh sáng. Hình 6: Đường chuẩn đo IAA c. Xác định lượng IAA có trong mẫu vi khuẩn: − Chuẩn bị ba eppendorf ( 3 lần lặp lại) cho mỗi dòng. Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn đã nuôi trong môi trường NFb lỏng trước đó cho vào eppendorf (trước khi hút dịch vi khuẩn vortex thật đều ống nghiệm chứa dịch vi khuẩn). − Ly tâm 5500 vòng trong 10 phút để loại bỏ tế bào chết. − Hút cẩn thận 1 ml dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml thuốc thử (các ống nghiệm được trùm kín tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng) trộn đều bằng máy Vortex. − Để ổn định ở nhiệt độ phòng 10-20 phút, sau đó đo OD ở bước sóng 530nm (OD530nm). d. Đo lượng IAA − Bật máy đo quang phổ 30 phút trước khi đo, hàm lượng IAA được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 530 nm (OD530nm). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT − Đo OD của 8 ống nghiệm đường chuẩn trước, sau đó tiến hành đo OD các mẫu. − Đưa giá trị của ống 0 ( không có IAA) về giá trị 0, làm mẫu đối chứng âm, Sau đó tiếp tục đo giá trị OD của 7 ống đường chuẩn theo thứ tự từ 2,5 đến 80, 7 ống nghiệm đường có màu đậm dần sẽ tương ứng với giá trị OD tăng dần. Tiếp tục đo giá trị OD cua các dòng vi khuẩn đã chuẩn bị. − Từ kết quả đo OD của 8 ống nghệm đường chuẩn dùng chương trình vẽ đồ thị trong phần mềm Microsoft Exel để xác định phương trình đường chuẩn của IAA có dạng: y = ax+b Trong đó: y: là giá trị đo OD. x : là lượng IAA cần tìm, − Kết quả giá trị đo OD của các dòng vi khuẩn được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính đưuọc lượng IAA cần tìm. Sau đó, các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Statgraphics. 3.2.8 Thử nghiệm xác định khả năng hòa tan lân − Chuẩn bị vi khuẩn gốc: Vi khuẩn gốc được nuôi tăng sinh trong môi trường PDA lỏng đã khử trùng nhiệt ướt 121oC. Dùng Micropipet hút 1 ml môi trường PDA lỏng cho vào ống có chứa vi khuẩn đã tách ròng, sụt nhẹ để vi khuẩn hòa vào dung dịch, sau đó rút dịch vi khuẩn chủng vào ống nghiệm chứa môi trường PDA lỏng , ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ. − Pha loãng vi khuẩn bằng cách hút 100 µl dịch vi khuẩn gốc cho vào eppendorf có chứa 900 µl nước cất tiệt trùng. − Sử dụng phương pháp nhỏ giọt để kiểm tra khả năng hòa tan lân trên môi trường NBRIP đặc. Hút 5 µl dich vi khuẩn pha loãng nhỏ lên môi trường, để những giọt vi khuẩn khô dưới ngọn đèn cồn, sau đó đem ủ ở 30oC từ 2-6 ngày. − Những dòng vi khuẩn hào tan lân sẽ được nhận diện bằng vòng sáng đồng tâm trong suốt quanh khuẩn lạc ( vòng Halo). − Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc vi khuẩn và đường kính vòng sáng do vi khuẩn tạo thành ở các ngày 2, 4, 6. − Hiệu suất hòa tan lân E được tính theo công thức: Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 E= 3.2.9 Trường ĐHCT Ñöôøng kính halo × 100 Ñöôøng kính khuaån laïc Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được. a. Chuẩn bị vi khuẩn gốc và giấy thấm: − Vi khuẩn gốc được nuôi tăng sinh trong môi trường PDA lỏng đã khử trùng nhiệt ướt 1210C. Dùng Micropipet hút 1 ml môi trường PDA lỏng cho vào ống có chứa vi khuẩn đã tách ròng, sụt nhẹ để vi khuẩn hòa vào dung dịch, sau đó rút dịch vi khuẩn chủng vào ống nghiệm chứa môi trường PDA lỏng, ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ. − Giấy thấm: chuẩn bị những mảnh giấy thấm có đường kính 6 mm. b. Tiến hành thí nghiệm: − Chuẩn bị môi trường LB. − Trải vi khuẩn E. coli, A. hydrophila lên bề mặt môi trường LB. − Rút 1 ml dịch vi khuẩn gốc cho vào eppendofd. Phần còn lại do OD để xác định mật số vi khuẩn. − Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào eppendof chứa vi khuẩn nuôi đạt mật số khoảng 108 tế bào/ml trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn E.coli. − Ủ 35oC trong 12h – 24h. − Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. − Đường kính vòng kháng khuẩn được tính bằng công thức: d = đường kính vòng sáng- đường kính khuẩn lạc (Ngô Thị Phương Dung et al., 2012) 3.2.10 Thực hiện phản ứng PCR và định danh các dòng vi khuẩn triển vọng: Sau khi tổng hợp kết quả các thí nghiệm trước, xét các tiêu chí về khả năng cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn. Ba dòng vi khuẩn triển vọng Tr9, L4, R2 được lựa chọn để định danh nhận diện bằng kỹ thuật PCR sử dụng các mồi 16S rDNA (Lane,1991) có trình tự sau: Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Mồi xuôi 27F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3’ Mồi ngược 1492R: 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3’ Quy trình trích DNA : Nuôi vi khuẩn trong 6ml môi trường LB khoảng 14-16h. Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml. Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn). Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa. Hòa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định trong môi trường, không bị biến tính). Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hoàn toàn màng tế bào, loại bỏ polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein giúp mẫu sạch hơn). Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một lần để trộn đều dung dịch. Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phóng ADN). Ủ ở 65oC trong 20 phút. Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần không phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa có tạo màng protein ngăn cách). Trộn đều và ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN không biến tính và bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vòng/phút. Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hoá chất đã dùng trước đó hay tạp chất còn lẫn), ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần). Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng trong 1-2h hoặc sấy khô bằng máy ly tâm chân không. Trữ ở 20oC. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR Điện di sản phẩm trên agarose gel Các sản phẩm sau khi được khuyết đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel bằng bộ điện di. Sau khi điện di, tiến hành quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel để nhận diện các dòng vi khuẩn. Các band xuất hiện trên gel được quan sát và so sánh độ dài band DNA vi khuẩn phân lập với độ dài thang chuẩn. Sau đó chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn đã phân lập dựa vào kết quả PCR xuất hiện band rỏ nét chọn ra các dòng vi khuẩn giải trình tự. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn Từ mẫu cây Diệp Hạ Châu thu được ở tỉnh Vĩnh Long đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường PDA. Trong đó có 5 dòng được phân lập từ rễ chiếm 23,81%, 3 dòng phân lập từ thân chiếm 14,29%, 5 dòng phân lập từ lá chiếm 23,81% và 8 dòng phân lập từ trái chiếm 38,09%. Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có chung đặc tính sinh trưởng và phát triển ở điều kiện vi hiếu khí trong môi trường NFb bán đặc, vi khuẩn phát triển hình thành vòng trắng đục (vòng pellice) cách bề mặt môi trường 2-5mm sau 2-3 ngày nuôi ( Hình 7). Khi vi khuẩn phát triển đồng thời làm đổi màu môi trường NFb từ màu xanh lá cây (pH=6,8) sang màu xanh dương do trong môi trường có chất chị thị màu Bromothymol blue. Sự làm đổi màu môi trường nuôi cấy chứng minh có sự phát triển của vi khuẩn đã làm tăng pH của môi trường ban đầu sang môi trường kiềm (pH>7). Kết quả này rất phù hợp với nghiên cứu được mô tả trước đây của Cao Ngọc Điệp et al., (2007), Nguyễn Thành Dũng (2009), Ngô Minh Toàn (2010) và Lê Thị Thanh Ren (2010). Vòng Pellicle Hình 7: Vi khuẩn phát triển hình thành vòng pellicle 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn: Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh có đặc điểm được được trình bày trong Bảng 5: Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 5: Đặc điểm của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được Đường Số Dòng Màu Hình Dạng Độ Đặc điểm TT vi khuẩn sắc dạng bìa nổi bề mặt 1 R1 vàng nhạt tròn nguyên mô trơn 3 2 R1A1B trắng đục tròn nguyên mô trơn 2 3 R2 trắng trong tròn nguyên mô màng 2 4 R7 trắng đục tròn nguyên mô nhăn 3,5 5 R1A2 trắng đục tròn nguyên mô trơn 3 6 T3 trắng đục không đều răng cưa mô trơn, ướt 5 7 T7 trắng đục tròn nguyên mô trơn 3,5 8 T6C trắng đục tròn nguyên mô trơn 2,5 9 L1 trắng đục tròn nguyên mô nhăn, ướt 3 10 L2 vàng nhạt tròn nguyên lài trơn 5 11 L3 trắng đục tròn nguyên mô,lõm trơn 2 12 L4 trắng trong tròn nguyên lài màng 2 13 L6 trắng trong tròn nguyên lài màng 2 14 TR1m trắng trong tròn nguyên mô trơn 3,5 15 TR1c trắng đục tròn nguyên mô nhăn 2 16 TR2 trắng đục tròn nguyên mô trơn 3 17 TR2 * trắng đục tròn nguyên mô trơn,ướt 4 18 TR6 vàng nhạt tròn nguyên mô trơn 0,5 19 TR7 trắng trong tròn nguyên lài màng 2 20 TR8 vàng nhạt tròn nguyên mô trơn 0,5 21 TR9 nâu tròn răng cưa lài sần sùi 2 kính (mm) Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc là khá nhanh (khoảng 24 giờ) ở 30oC. Đặc điểm khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc: có 11/21 dòng vi khuẩn màu trắng đục chiếm 52,38%, màu trắng trong có 5/21 dòng chiếm 23,81%, màu vàng nhạt có 4/21 dòng chiếm 19,05%, màu nâu có 1/21 dòng chiếm 4,76%. Hình dạng khuẩn lạc: Hầu hết (20/21) các dòng vi khuẩn đều có dạng hình tròn chiếm tỉ lệ 95,24%. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Dạng bìa khuẩn lạc: hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng bìa nguyên 19/21 chiếm 90,48%, bìa răng cưa có 2/21 dòng chiếm 9,52%. Độ nổi khuẩn lạc: 16/21 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng mô, chiếm 76,2% và 5/21 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc dạng lài, chiếm 23,8%. Đặc điểm bề mặt khuẩn lạc các dòng vi khuẩn đa dạng: khuẩn lạc có bề mặt trơn 14/21 chiếm 66,67%, 4/21 dòng vi khuẩn có bề mặt khuẩn lạc tạo màng chiếm 19,05%, 1/21 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc sần sùi chiếm 4,76%, khuẩn lạc có bề mặt nhăn có 2/21 chiếm 9,52%. Kích thước khuẩn lạc thay đổi từ 0,05cm đến 0,5cm. A D B C Hình 8: Một số dạng khuẩn lạc A: Khuẩn lạc có màu trắng đục, hình tròn, bìa nguyên và độ nổi mô. B: Khuẩn lạc có màu trắng đục, hình tròn, bìa nguyên và độ nổi mô bề mặt lõm. C: Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, hình tròn, bìa nguyên và độ nổi lài. D: Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng không đều, bìa răng cưa và độ nổi mô, bề mặt nhăn 4.2 Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động 4.2.1 Kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn Sau khi phân lập ròng tiến hành nhuộm Gram các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diệp Hạ Châu. Đa số các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được là Gram âm (17/21) chiếm 80,95%, vi khuẩn Gam dương 4/21 chiếm 19,05%. Kết quả được trình bày ở bảng 6: Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 6: Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn * Số TT Dòng vi khuẩn Gram 1 R1 - 2 R1A1B + 3 R2 + 4 R7 - 5 R1A2 - 6 T3 - 7 T7 - 8 T6C - 9 L1 - 10 L2 - 11 L3 - 12 L4 + 13 L6 - 14 TR1m - 15 TR1c - 16 TR2 - 17 TR2 * - 18 TR6 - 19 TR7 - 20 TR8 - 21 TR9 + Chú thích: (+): Gram dương A (-) : Gram âm B Hình 9: Hình nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn đã phân lập A: Hình nhuộm Gram của dòng vi khuẩn R1A1B. B: Hình nhuộm Gram của dòng vi khuẩn TR2. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.2.2 Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động của các dòng vi khuẩn. Đa số các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng hình que. Vi khuẩn hình que dài 5/21 chiếm 23,81%, vi khuẩn hình que ngắn 13/21 chiếm 61,9%, vi khuẩn hình cầu 1/21 chiếm 4,78% và vi khuẩn dạng chuỗi 2/21 9,51%. Đa số các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển động 20/21 chiếm 95,24%. Bảng 7: Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động của vi khuẩn * Số Dòng Chiều dài Chiều rộng Hình dạng Khả năng TT vi khuẩn (µm) (µm) vi khuẩn chuyển động 1 R1 5,13 1,71 Que dài + 2 R1A1B 6,84 1,71 Que dài + 3 R2 3,42 0,86 Que ngắn + 4 R7 5,13 1,71 Que dài + 5 R1A2 5,13 1,71 Chuỗi + 6 T3 3,42 1,71 Que ngắn + 7 T7 3,42 1,71 Que ngắn - 8 T6C 4,28 1,71 Que ngắn + 9 L1 5,13 1,71 Que dài + 10 L2 2,57 0,86 Que ngắn + 11 L3 3,42 1,71 Que ngắn + 12 L4 1,71 1,71 Que ngắn + 13 L6 3,42 1,71 Que ngắn + 14 TR1m 3,42 1,71 Que ngắn + 15 TR1c 6,84 1,71 Chuỗi ++ 16 TR2 5,13 1,71 Que dài + 17 TR2 * 1,71 0,86 Que ngắn + 18 TR6 2,57 0,86 Que ngắn + 19 TR7 3,42 1,71 Que ngắn + 20 TR8 0,86 0,86 Cầu + 21 TR9 5,13 1,71 Que dài + Chú thích: (+) : có khả năng chuyển động,; (++): chuyển động rất nhanh; (-): không chuyển động, Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.3 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn: Sau khi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của 21 dòng vi khuẩn, nhìn chung các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ nhưng lượng đạm tạo ra không cao lắm ( trong khoảng từ 0 – dưới 0,7µg/ml). Sau 2 ngày chủng tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp ra lượng NH4+ nhất định. Các ngày tiếp theo, trong 21 dòng vi khuẩn có 8 dòng vi khuẩn (nhóm 1, chiếm 38,1%) tạo ra hàm lượng đạm tăng và đạt nồng độ cao nhất vào ngày 6. Năm dòng vi khuẩn ( nhóm 2, chiếm 23,8%) tạo ra hàm lượng đạm cao nhất vào ngày 2 và giảm dần ở các ngày sau. Tám dòng vi khuẩn (nhóm 3, chiếm 38,1%) tạo ra hàm lượng đạm cao nhất vào ngày 2, giảm mạnh vào 4, đến ngày 6 tăng nhẹ và đến ngày 8 giảm. 4.3.1 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1: Các dòng vi khuẩn thuộc nhóm 1 có khả năng tổng hợp NH4+ tăng dần từ ngày 2 đến ngày 6 và ngày 8 giảm. Ngày 2, hàm lượng NH4+ do dòng TR2 (0,192 µg/ml) tổng hợp được cao nhất và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với dòng T6C (0,167 µg/ml) và dòng R1A2 (0,172 µg/ml). Dòng L1 tổng hợp lượng đạm thấp nhất với lượng NH4+ trung bình là 0,105 µg/ml. Ngày 4, hàm lượng đạm trung bình của do các vi khuẩn thuộc nhóm 1 tổng hợp được tăng nhưng không đáng kể và khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê, ngoại trừ dòng TR2 (0,207 µg/ml) tổng hợp được lượng NH4+ cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Ngày 6, hàm lượng NH4+ trung bình được các dòng vi khuẩn tổng hợp tăng cao. Dòng R1A2 tuy tổng hợp lượng đạm chỉ ở mức trung bình vào ngày 4 (0,207µg/ml ) nhưng đến ngày 6 lại tổng hợp được lượng đạm cao nhất (0,263 µg/ml), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Ngược lại, dòng TR2 tuy tổng hợp lượng NH4+ cao nhất vào ngày 4 (0,207 µg/ml), nhưng chỉ tổng hợp được lượng đạm ở mức trung bình (0,238 µg/ml) vào ngày 6 và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các L1 (0,238 µg/ml), T6C (0,223 µg/ml) và TR1m (0,218 µg/ml). Ngày 8, lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn tổng hợp giảm mạnh ( hàm lượng đạm dao động trong khoảng 0,034 µg/ml – 0,098 µg/ml). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Lượng NH4+ (ug/ml) 0.3 c b 0.25 0.2 d cd 0.15 a abab cd bc bc b aa a a a b b a aa L1 b T6C a T7 a TR1m TR2 cc 0.1 cc bbb a 0.05 TR7 R1A2 R2 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Hình 10: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 theo thời gian trong môi trường NFB lỏng a: là giá trị thấp nhất Lượng NH4+ tăng dần từ ngày 2 đến ngày 6 vì những dòng vi khuẩn thuộc nhóm 1 phát triển chậm nên lượng NH4+ tăng đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn. Đến ngày 6, lượng NH4+ được tổng hợp quá nhiều sẽ ức chế sự tổng hợp NH4+ của vi khuẩn, vi khuẩn sử dụng lượng NH4+ có sẵn trong môi trường dẫn đến lượng NH4+ sẽ giảm rõ rệt vào ngày 8. 4.3.2 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2: Ngày 2, hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn tổng hợp đạt cực đại. Trong đó, dòng R1 tổng hợp được lượng đạm cao nhất (0,902 µg/ml) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Ngược lại, dòng TR8 tổng hợp lượng đạm thấp nhất (0,329 µg/ml). Ngày 4, lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn tổng hợp đều giảm. Dòng L4, R1, R1A1B có lượng đạm trung bình giảm đáng kể và khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa 3 dòng. Trong đó, dòng R1 giảm nhiều nhất (0,902 µg/ml ở ngày 2 giảm xuống còn 0,22 µg/ml ở ngày 4). Dòng TR6 (0,33 µg/ml ở ngày 4 so với 0,445 µg/ml ở ngày 2) và TR8 (0,29 µg/ml ở ngày 4 so với 0,32 µg/ml) giảm chậm nhất và khác biệt không có ý nghĩa thống giữa 2 dòng. Ngày 6, hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn tổng hợp giảm nhẹ. Đến ngày 8, hàm lượng đạm do các dòng vi khuẩn tổng hợp tiếp tục giảm, hàm lượng đạm dao động trong khoảng từ 0,034 µg/ml -0,086 µg/ml, chỉ có dòng L4 với lượng đạm tổng hợp là 0,11 µg/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Lượng NH4+ (ug/ml) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Trường ĐHCT d c L4 c R1 b R1A1B b a a a a b TR6 b a a a ab TR8 c b Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 a b c Ngày 8 Hình 11: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 theo thời trong môi trường NFB lỏng a: là giá trị thấp nhất Các dòng vi khuẩn có khả năng thích nghi nhanh với môi trường, lượng NH4+ được tổng hợp ở ngày 2 cao nhất. Khi lượng NH4+ trong môi trường quá cao sẽ ức chế quá trình tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nên vi khuẩn sử dụng chính lượng NH4+ được tạo ra ở ngày 2 làm cho hàm lượng NH4+ giảm dần theo thời gian. 4.3.3 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3: Ngày 2, lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn tổng hợp được khá cao, cao nhất là dòng TR9 (0,669 µg/ml), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại và thấp nhất là dòng TR2* với lượng NH4+ tổng hợp được là 0,163 µg/ml. Ngày 4, lượng đạm do các dòng tổng hợp đều giảm. Lượng NH4+ được tổng hợp giảm mạnh nhất là dòng TR9 (0,18 µg/ml ở ngày 4 so với 0,669 µg/ml ở ngày 2) và dòng L3 (0,132 µg/ml ở ngày 4 so với 0,504 µg/ml ở ngày 2), khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai dòng. Dòng TR2* có lượng đạm tổng hợp giảm ít nhất (0,161 µg/ml ở ngày 4 so với 0,163 µg/ml ở ngày 2). Ngày 6, lượng đạm do các dòng vi khuẩn tăng nhẹ, nhưng hàm lượng đạm được tổng hợp này thấp hơn lượng đạm được tổng hợp ở ngày 2, chỉ có TR2* (0,241 µg/ml ở ngày 6 so với 0,163 µg/ml ở ngày 2) và R7 (0,246 µg/ml ở ngày 6 so với 0,221 µg/ml ở ngày 2) tổng hợp được lượng đạm cao hơn ngày hai, khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai dòng. Dòng Tr9 vẫn tiếp tục là dòng tổng hợp được lượng đạm cao nhất (0,263 µg/ml) ở ngày 6 so với các dòng còn lại. Ngày 8, hàm lượng được tổng hợp giảm mạnh, hầu hết lượng đạm do các dòng vi Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 41 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT khuẩn tổng hợp dao động trong khoảng 0,068 µg/ml -0,095 µg/ml, chỉ có dòng L6 với lượng NH4+ tổng hợp được là 0,116 µg/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Lượng NH4+ (ug/ml) 0.8 f 0.7 L2 L3 0.6 e 0.5 L6 d d R7 0.4 c 0.3 ab b a 0.2 a a a b c c b bc T3 cd d bc cdbcd bcd a ab TR1c b c b b bb b a 0.1 TR2* TR9 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Hình 12: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 theo thời gian sau khi chủng trong môi trường NFB lỏng a: là giá trị thấp nhất Các dòng vi khuẩn có khả năng thích nghi với môi trường nhanh nên lượng NH4+ được tổng hợp ở ngày 2 cao. Khi lượng NH4+ quá cao sẽ ức chế khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nên chúng sử dụng lượng NH4+ có sẵn trong môi trường làm cho lượng NH4+ giảm vào ngày 4. Ngày 6, lượng NH4+ trong môi trường không đủ để đáp ứng nhu cầu cho các dòng vi khuẩn nên chúng tiếp tục quá trình tổng hợp NH4+. Nhưng lượng chất dinh dưỡng trong môi trường không còn dồi dào, mật số vi khuẩn giảm nên lượng NH4+ được tổng hợp thấp hơn ngày 2. Lượng NH4+ ngày 6 tạo ra cao tiếp tục ức chế quá trình tổng hợp đạm của các dòng vi khuẩn, chúng tiếp tục sử dụng nguồn đạm có trong môi trường nên lượng NH4+ giảm vào ngày 8. 4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn. Tiến hành khảo sát khả năng tổng IAA của 21 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp Hạ Châu trên môi trường NFb, bằng phương pháp Salkowski ( Glickman và Dessaux, 1995). 4.4.1 Nhóm vi khuẩn được phân lập từ lá và rễ. Ngày 2, các dòng vi khuẩn tổng hợp được lượng IAA khá cao. Dòng L3, L6 và R2 là những dòng có khả năng tổng hợp tốt với lượng IAA lần lượng là 11,496 µg/ml, 11,135 µg/ml và 10,955 µg/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại, khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các dòng. Ngược lại, dòng R1A2 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 42 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT (3,838 µg/ml) tổng hợp được lượng IAA thấp nhất. Lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp tăng cao vào ngày 4. Dòng L3 và L6 tuy tổng hợp được lượng IAA cao vào ngày 2, nhưng đến ngày 4 lượng IAA tổng hợp được chỉ đạt mức trung bình với lượng IAA lần lượt là 15,795 µg/ml và 14,461 µg/ml. Dòng R2 tổng hợp được 16,906 µg/ml IAA khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với hai dòng vi khuẩn L4 (17,683 µg/ml) và R1A1B (17,683 µg/ml) là những dòng tổng hợp được lượng IAA cao nhất. Ngày 6, lượng IAA do các dòng vi khuẩn đều giảm. Dòng L2 giảm mạnh nhất (0,205 µg/mlở ngày 8 so với 13,628 µg/ml ở ngày 6), khác biệt có ý nghĩa thống kê so Lượng IAA (ug/ml) với các dòng còn lại. 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 e c c c a e e L1 e de c b L2 bc L3 L4 de d c bc d d L6 bc b d a c c c c b a e R1 c R1A1B R1A2 R2 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 R7 Hình 13: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo thời gian sau khi chủng trong môi trường NFB lỏng a: là giá trị thấp nhất Ngày 2, vi khuẩn chưa thích nghi với môi trường nên khả năng tổng hợp IAA kém. Ngày 4, các dòng vi khuẩn đã thích nghi với môi trường mới nên khả năng tổng hợp IAA tăng nhanh. Đến ngày 6, môi trường không còn nhiều chất dinh dưỡng, không đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng, mật số vi khuẩn giảm nên lượng IAA tổng hợp được ở ngày 6 của các dòng vi khuẩn cũng giảm. 4.4.2 Nhóm vi khuẩn được phân lập từ trái và thân. Lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp được ở ngày 2 khá cao. Dòng T3 và dòng TR8 có khả năng tổng hợp cao nhất với lượng IAA lần lượt là 13,207 µg/ml và 12,667 µg/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Dòng TR6 (1,225 µg/ml ) tổng hợp được lượng IAA thấp nhất. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 43 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ngày 4, lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp tăng cao. Dòng T3 vẫn là một trong những dòng có khả năng tổng. Dòng TR1C (16,35 µg/ml), T7 (16,239 µg/ml) và T3 (16,128 µg/ml) là những dòng tổng hợp IAA cao nhất, khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các dòng. TR2* vẫn là dòng có lượng lượng IAA tổng hợp được thấp nhất (12,295 µg/ml). Ngày 6, lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp giảm dao động trong khoảng 2,598 µg/ml -9,949 µg/ml. Tuy nhiên, dòng TR6 và TR7 có hàm lượng IAA giảm [...]... nay Đề tài Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) mọc hoang tại tỉnh Vĩnh Long để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học Mục tiêu của đề tài: Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh sống trong cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp... Phòng thí nghiệm Vi sinh vật và phòng thí nghiệm Thực phẩm thuộc Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2013 -11/2013 3.1.2 Vật liệu: Mẫu cây Diệp Hạ Châu ấp Tầm Vu và ấp Mỹ Yên, xã Trà Côn, huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long, ngày 5/12/2013 Vi khuẩn E coli được cung cấp từ phòng Sinh học phân tử, Vi n Nghiên Cứu và... khoa học là Phyllanthus amarus L Thuộc họ Thầu dầu ( Euphorbiaceae) Diệp Hạ Châu là cây cỏ mọc hằng năm cao từ 0,2m -0,3m, toàn thân nhẵn, có màu xanh Lá thuôn nhỏ hình trứng, mọc so le, trông giống lá kép Hoa đơn tính cùng gốc, mọc ở kẽ lá Quả hình cầu nhỏ treo ở mặt dưới cành lá Diệp Hạ Châu là loài cây của vùng nhiệt đới Ở nước ta cây mọc khắp nơi Diệp Hạ Châu sử dụng được toàn cây, dùng tươi hay khô,... 5: Đặc điểm của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được 35 Bảng 6: Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn 37 Bảng 8 : Độ hữu hiệu hòa tan lân của các dòng vi khuẩn 45 Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP đặc 46 Bảng 10: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn 46 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ix Vi n NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn... độc với ethanol hoặc CCl4 Diệp Hạ Châu còn được sủ dụng để trị bệnh gan giúp phục hồi tế bào gan và điều trị vi m gan siêu vi B (Trần Hùng et al., 2009) 2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà ngược lại những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi và Palumbo,... (http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/cactinhvathanhpho/tinhvinhlong/thongtintinhth anh?view=introduction&provinceId=1388, 24/11/2013) 2.2 Giới thiệu cây diệp hạ châu Hình 1: Cây Diệp Hạ Châu (* Nguồn: http://benhvienhanoi.com.vn/News/Tu-van-suc-khoe/734/312/Phong-benh-ganbang-cay-Diep-ha-chau-dang.htm, ngày 5/8/2013 ) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.2.1 Đặc điểm thực vật: Diệp Hạ Châu (chó... đường và ngũ cốc trên khắp thế giới, ở vùng khí hậu nhiệt đới cũng như ôn đới (Enrique và Caceres, 1982; Reinhold-Hurek et al.,1986) 2.4.3 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ... 3-acetaldehyde à IAA Nhiều loài vi sinh vật cố định đạm sống tự do, vi sinh vật sống cộng sinh, và những vi sinh khác có cơ chế tổng hợp IAA với tiền chất L-tryptophan (Ten et al., 2000; Sridevi và Mallaiah, 2007) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 10 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.7 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn Nhiều dòng vi khuẩn có khả năng chuyển... nước: Tại Vi t Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị vi m gan của Diệp Hạ Châu đã được tiến hành, chẳng hạn: nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường (Học Vi n Quân Y - 1990 - 1996) đã thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus; nhóm nghiên cứu của Trần Danh Vi t và Nguyễn Thượng Dong (Vi n Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001) Diệp Hạ Châu được dùng sớm nhất tại Vi n Đông... Độ cho biết họ đã phân lập được những hợp chất trong cây Diệp Hạ Châu có khả năng chữa bệnh vi m gan Một báo cáo trên tạp chí Lancet vào năm 1988 cũng xác định tác dụng này Theo đó, 2 nhà khoa học Blumberg và Thiogarajan đã điều trị 37 trường hợp vi m gan siêu vi B với kết quả 22 người âm tính sau 30 ngày dùng Diệp Hạ Châu Đối với vi m gan siêu vi, 50% yếu tố lây truyền của virus vi m gan B trong máu