Đang tải... (xem toàn văn)
... tới sinh tố CoQlO, định thực đề tài: "Tuyển chọn chủng nấm men sinh tổng hợp Coenzyme Q10" với mục tiêu sau: • Tuyển chọn chủng nấm men sinh CoQlO dựa nguồn thông tin thu thập Bộ môn Vi Sinh. .. sau : Tuyển chọn chủng số 12 chủng nghiên cứu có khả sinh tổng hợp CoQlO: chủng JCM8274, TH3.2.59, Litch08, Litchl2, Litchl7 sinh CoQlO Xác định lại loại CoQ chủng nấm men nghiên cứu: chủng JCM2320... : Các chủng nấm men sử dụng phân tích a.TH3.2.59 (CoQ) c Litchl7 (CoQ) b TVN309 (CoQ) d CNTP-7028 (CoQ) Thanh chèn tương ứng với |im -26- 3.2 Lên men thu sinh khối Các chủng nấm men sau lên men
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI VÕ THỊ BÍCH THỦY TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN SINH T ổN G HỢP COENZYME Q10 ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược sĩ KHOÁ 1999-2004) Giáo viên hướng dẫn: - TS. Vũ Nguyên Thành - GVC. Nguyễn Lệ Phi Nơi thực hiện : - Viện Công Nghiệp Thực Phẩm - Bộ môn Vi Sinh trường ĐH Dược Hà Nội. Thòi gian thực hiện: - -Tháng 2/04-5/04. Hà Nội tháng 6/2004 u Sbcị' / LỜI CẢM ƠN Sau khi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Vũ Nguyên Thành, cô giáo Nguyễn Lệ Phi. Những người thầy đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo tôi để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn các anh, chị cán bộ Bộ môn Vi Sinh - Viện Công Nghiệp Thực Phẩm cùng các thầy cô giáo bộ môn Vi Sinh - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè, người thân đã luôn động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt khoá luận này. Sinh viên V ố Thị Bích Thuỷ MỤC LỤC Trang 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Phần 1- TỔNG QUAN 1.1 Khái quát CoQ 10 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Cấu trúc hoá học 1.1.3 Nguồn gốc cơ chế hoạt động, vai trò tác dụng 1.1.4 CoQlO, Lịch sử phát triển, thực trạng và tương lai 1.2 Nấm men 1.2.1 ứng dụng chung 1.2.2 ứng dụng trong lĩnh vực Y - Dược 1.2.3 Nấm men và CoenzymeQ 10 2 2 2 3 4 10 13 13 13 14 Phần 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 2.1.2 Nguyên liệu 2.1.2 Hoá chất và môi trường 2.1.3 Máy móc thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Lên men thu sinh khối 2.2.2 Tách chiết CoQ . 2.2.3 Tinh sạch CoQ 2.2.4 Xác định chủng loại CoQ 2.2.5 Đánh giá hàm lượng CoQlO 2.2.6 Thăm dò nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp CoQlO 16 16 16 16 17 17 17 18 19 20 21 22 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm các chủng nấm men nghiên cứu 3.2 Lên men thu sinh khối 3.3 Tách chiết CoQ 3.4 Tinh sạch CoQ 3.5 Kết quả xác định chủng loại CoQ 3.6 Sơ bộ đánh giá hàm lượng CoQlO củacác mẫu tách chiết 3.7 Kết quả thăm dò nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp CoQlO 23 23 27 29 29 30 32 35 Phần 4: KÊT LUẬN VÀ ĐỀ Xư ẤT 4.1 Kết luận 4.2 Đề xuất 37 37 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . 38 CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT CoQ CoQlO CoQ9 C0 Q 8 CoQ7 C0 Q 6 TQ Coenzym Q Coenzym Q10 Coenzym Q9 Coenzym Q 8 Coenzym Q7 Coenzym Q 6 Trung Quốc ĐẶT VÂN ĐỂ Được biết đến từ thập niên 60- 70 của thế kỷ XX, CoenzymQ10 (CoQlO) là một hợp chất nội sinh, có chức năng sinh học hết sức quan trọng, là thành phần của chuỗi hô hấp tế bào ở màng ty thể, nơi được xem là nhà máy sản xuất năng lượng sống (ATP) trong cơ thể. Ngày nay, Y - Dược học hiện đại còn quan tâm đến CoQlO với vai trò là một chất chống oxy hoá, một nguyên tố vi lượng cần thiết, có tác dụng tốt cho sức khoẻ con người, có tác dụng phòng và điều trị nhiều căn bệnh như: bệnh tim mạch, bệnh đái đường, bệnh ung thư, lão hoá . CoQlO đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu khá nhiều ở các nước phát triển như Nhật Bản, Mỹ, Canada... Và cũng tại các nước đó, CoQlO được sản xuất và bào chế thành các dạng dược phẩm và mỹ phẩm để sử dụng rộng rãi trong phòng và điều trị bệnh tật, cũng như chăm sóc sức khoẻ, sắc đẹp, kéo dài tuổi xuân. Mặc dù có nhiều lợi ích to lớn nhưng ở nhiều nước trong đó có nước ta, CoQlO vẫn còn ít được biết đến. Vấn đề nghiên cứu vai trò tác dụng của CoQlO và nghiên cứu sản xuất, bào chế, sử dụng nó hầu như chưa được quan tâm. Để góp phần và thu hút sự quan tâm của các chuyên gia trong lĩnh vực Y Dược nước nhà tới sinh tố mới CoQlO, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: "Tuyển chọn các chủng nấm men sinh tổng hợp Coenzyme Q10" với các mục tiêu sau: • Tuyển chọn các chủng nấm men sinh CoQlO dựa trên nguồn thông tin đã thu thập được của Bộ môn Vi Sinh - Viện Công nghiệp Thực Phẩm. • Thiết lập quy trình tách chiết và tinh sạch CoQ 10 từ tế bào nấm men. • Sơ bộ xác định hàm lượng CoQlO trong các mẫu tách chiết. • Bước đầu nghiên cứu tìm cách nâng cao hoạt tính sinh CoQlO của nấm men. PHẦN 1 - TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về CoenzymQ10. 1.1.1. Giới thiệu chung. CoenzymQ10(CoQ10) hay còn gọi là Ubidecarenone, là một coenzym nội sinh, thuộc nhóm benzoquinone, tan trong dầu, có đuôi hydratcacbon gồm 10 nhóm isopren. CoQlO là thành phần của chuỗi hô hấp tế bào trong màng ty thể. Nó là cầu nối vận chuyển electron (e ) và proton (H+) từ chất cho là NADH(FMNH2) đến chất nhận là chuỗi cytocrom, giúp ty thể thực hiện chức năng tổng hợp năng lượng sinh học (ATP). Năng lượng dưới dạng ATP được sử dụng để duy trì mọi hoạt động sống của tế bào cũng như cơ thể. [2 , 8 , 15, 20] CoQlO có trong mọi tế bào của cơ thể các loài động vật có vú. Ngoài ra còn có ở các loài vi sinh vật hiếu khí (nấm men, vi khuẩn) và ở thực vật bậc cao [16, 30, 33]. Trong tế bào, ty thể là nơi chứa nhiều CoQlO nhất[33]. Ở đây, CoQlO kết hợp với các phức hợp enzym khác trong chuỗi hô hấp tế bào để thực hiện chức năng tổng hợp ATP. Ngoài chức năng tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể, CoQlO còn có tác dụng loại bỏ gốc tự do, là chất “Antioxydant” đầu tiên được sử dụng để bảo vệ màng ty thể tránh khỏi sự peroxy hoá màng (quá trình POL), bảo vệ tế bào (bao gồm màng tế bào, ADN và ARN...) khỏi tác hại của gốc tự đo. [6] Ở người, CoQlO là chất chống oxy hoá tan trong dầu duy nhất mà cơ thể tự tổng hợp được. Xét về đặc điểm chống oxy hoá, CoQlO được xếp vào hệ thống các chất chống oxy hoá có không có bản chất là enzym, thuộc nhóm polyphenol (nhóm này gồm có VitaminA, VitaminE, VitaminC, CoQlO và riboflavin).[7] Vì bất kỳ cơ quan nào trong cơ thể cũng cần đến nên CoQlO được gọi là “ubiquitous quinone” tức là Coenzym quinone có mặt và cần thiết ở khắp nơi. Tổ chức giàu CoQlO nhất là tim, gan, thận, tụy; phổi là cơ quan có ít CoQlO nhất. Nồng độ CoQlO trong các tổ chức cơ thể giảm dần theo tuổi già. [5, 16, 30] 1.1.2 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá. 1 .1 .2.1 . Cấu trúc hoá học. Coemym Q10 (n = 10) Cấu trúc cơ bản của CoQlO gồm hai phần: Nhân benzoquinone và đuôi hydratcacbon.[14, 23, 34] Sự có mặt của nhân benzoquinone làm cho cấu trúc phân tử CoQlO giống với cấu trúc của Vitamin K2, Vitamin E và Vitamin C[7, 22]. Vì nhân benzoquinone có khả năng biến đổi thuận nghịch giữa dạng quinone và dạng quinol nên CoQlO có thể tồn tại ở 3 dạng cấu trúc: dạng oxy hoá, dạng khử và dạng lưỡng gốc[8]. Các dạng cấu trúc này tham gia vào quá trình oxy hoá khử giữa những hydrogenase và cytocrom trong chuỗi hô hấp tế bào và quá trình trung hoà gốc tự do. “Chìa khoá” để CoQlO hoàn thành được chức năng sinh học và có những tác dụng có lợi nổi bật chính là ở cấu trúc benzoquinone. o* 0 OH H 3C O ^ J l / C H 3 H sC O ^^ịị^^R H 0 Dạng oxy hoá Dạng lưỡng gốc Dạng khử Đuôi hydratcacbon của CoQlO gồm 10 nhóm isopren(n = 10), cùng với nhân benzoquinone làm tăng tính thân dầu của toàn phân tử, giúp phân tử dễ dàng di - 3- chuyển trong lớp lipid kép của màng ty thể, làm con thoi vận chuyển e‘ giữa các phức hợp enzym vận chuyển electron cồng kềnh khác nhau trong màng ty thể.[7, 8] Đuôi hydratcacbon của CoenzymQ nói chung còn được sử dụng làm dấu hiệu phân loại[13]. Ở người chỉ có CoQlO có nghĩa là đuôi hydratcacbon gồm 10 nhóm isopren. Ở các loài khác CoenzymQ tồn tại dưới dạng từ CoQ6 đến CoQlO, nghĩa là số lượng gốc isopren (n) khác nhau: [2 , 12] n = 10 -» n=9 — > Coenzym Q9 n=8 —> Coenzym Q8 n=7 -» Coenzym Q7 n=6 Coenzym Q10 Coenzym Q6 Tất cả các chất này đều là những coenzym oxy hoá khử và có chức năng, vai trò sinh học giống nhau [2 ]. 1.1.2.2. Tính chất lý hoá. CoenzymQ10 tinh khiết tồn tại ở dạng tinh thể màu vàng hoặc vàng cam, nóng chảy ở nhiệt độ T° = 48°c, tan trong dầu và các dung môi hĩru cơ, đặc biệt dễ tan trong Aceton, Ethanol, n-Hexan... không tan trong nước. Bị phân huỷ và biến màu từ từ khi tiếp xúc với ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm. [14, 34 ] Cấu trúc benzoquinone trong phân tử làm cho CoQlO dễ bị khử. Đuôi hydratcacbon cùng với nhân benzoquinone kết hợp với nhau tạo nên hệ thống dây nối đôi liên hợp dài và do đó CoQlO hấp thụ ánh sáng tử ngoại từ bước sóng 270 —> 290 nm, có A,max = 275 nm[18, 30]. Đây là tính chất quan trọng được ứng dụng để định tính và định lượng CoQlO bằng phép đo phổ hấp thụ tử ngoại. 1.1.3. Nguồn gốc, cơ chế hoạt động, vai trò tác dụng. 1.1.3.1 Nguồn gốc. CoenzymQ10 là hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, được tổng hợp trong cơ thể. ở người, CoQlO được tổng hợp ở gan qua 17 phản ứng với sự tham gia của nhiều enzym cùng với khoảng 8 loại Vitamin (gồm VitaminBị, VitaminB2, Vitamin B3, VitaminB5 ,VitaminB6, VitaminB12, acid folic, VitaminC) và một số nguyên tố vi lượng(selen, kẽm, đồng.. .)• Quá trình sinh tổng hợp CoQlO trong cơ thể gồm 3 giai đoạn cơ bản: 1. Tổng hợp decaprenyldiphotphate từ Acetyl CoA dùng cho phần đuôi hydratcacbon. 2. Tổng hợp Acid Parahydroxylbenzoic từ các acid amin: tyrosine, phenylamin, dùng để tổng hợp nhân benzoquinone. 3. Gắn phần nhân benzoquinone và đuôi hydratcacbon sau khi đã được tổng hợp nhờ enzym decaprenyl diphotphat synthethase. Trong quá trình trên, phản ứng gắn đuôi hydratcacbon vào nhân benzoquinone do enzym decaprenyl diphotphat synthethase xúc tác là phản ứng quan trọng nhất. Phản ứng này được ví là “chìa khoá” của cả quá trình sinh tổng hợp CoQlO trong cơ thể.[18, 29, 12] Ngoài lượng CoQlO nội sinh, cơ thể còn được cung cấp CoQlO từ thức ăn, lượng này nhiều hay ít tuỳ thuộc vào khẩu phần dinh dưỡng và thói quen ăn uống của các vùng dân cư khác nhau[31]. Các loại thực phẩm giàu CoQlO gồm: các loại thịt, các tổ chức động vật như tim, gan, lòng đỏ trứng, sữa động vật, một số loài cá như cá mòi, cá thu, ca hổi, cá sacdin và cả trong một số loại rau đặc biệt là loại rau bina và súp lơ. Ngoài ra, các CoQ khác (CoQ6 -» CoQ9) khi theo thức ăn vào cơ thể cũng được biến đổi thành CoQ10.[12, 20, 21] Nồng độ CoQlO thay đổi tuỳ theo từng loại mô, cao nhất là ở cơ tim. Vì vậy rất dễ hiểu là khi thiếu CoQlO thì tim bị ảnh hưởng trước tiên. Khi mức GoQlO trong cơ thể giảm 25% sẽ dẫn đến tình trạng thiếu hụt năng lượng trong cơ thể. Lượng CoQlO nội sinh đạt tối đa quanh tuổi 20 sau đó giảm dần. Ở tuổi 30, CoQlO giảm đi 25%, đến lứa tuổi 39 —» 43 thì chỉ còn 50,% lượng ban đầu. [5] Như vậy có thể thấy rằng, để duy trì được nồng độ CoQlO trong cờ thể ở mức cần thiết một cách tự nhiên là rất khó bởi để tổng hợp được CoQlO phụ thuộc rất nhiều yếu tố trong khi khả năng tổng hợp của cơ thể giảm theo độ tuổi, còn lượng CoQlO cung cấp từ thức ăn lại không đáng kể vì các thực phẩm có CoQlO không thật sự phong phú và lượng này còn bị mất đi đáng kể trong quá trình chế biến thức ăn. Do vậy việc cung cấp CoQlO cho cơ thể dưới dạng thuốc hay dạng chất dinh dưỡng là thực sự cần thiết và quan trọng, đặc biệt là đối với người cao tuổi và các bệnh nhân tim mạch, đái đường, ung thư, ... những đối tượng có nhu cầu cao về CoQlO và nồng độ CoQlO trong cơ thể giảm sút. 1.1.3.2. Cơ chế hoạt động. Trong chuỗi hô hấp tế bào, H+ và e' được vận chuyển từ NADH (FMNH2) tới CoenzymQ (oxyhoá). Sau đó, CoenzymQ (khử) vận chuyển e - đến phức hợp enzym vận chuyển điện tử (hệ thống cytocrom) còn H+ được chuyển trực tiếp tới o để tạo H20.[2, 7, 8] Hình 1.1 : Sơ đồ chuỗi hô hấp tế bào Với vai trò của một "Coenzyme"- CoQlO là yếu tố không thể thiếu được của mọi tế bào sống, không có CoQ quá trình vận chuyển e\ H+ từ cơ chất đến oxy không thực hiện đựơc, ty thể không tổng hợp đựoc năng lượng ATP và do đó tế bào không hoàn thành các chức năng sinh học, thậm chí không duy trì sự sống.[19, 27] Bên ngoài ty thể, CoQlO (và các dạng coenzymQ khác) là chất chống oxy hóa mạnh, được đánh giá cao như các chất chống oxy hoá khác đã được chứng minh: VitaminE, VitaminA, (5- caroten, lycopen, VitaminC,...[6 , 17, 24, 30] khả năng trung hoà gốc tự do của CoQlO còn có những ưu điểm nổi bật bởi cả 3 dạng tồn tại của CoQlO đều có khả năng loại bỏ gốc tự do: [7] Dạng khử của CoQlO thuộc nhóm các chất chống oxy hoá polyphenol, có khả năng trung hoà hai gốc tự do (R*): o OH + 2R* + 2RH o Dạng khử Dạng oxy hoá (R* : gốc tự do) Dạng oxy hoá có khả năng trung hoà tiếp hai gốc tự do nữa nhờ khả năng chuyển dạng lưỡng gốc: 0 o* OR + o 2R* OR o* Dạng lưỡng gốc Đặc biệt dạng oxy hoá và dạng khử có thể phản ứng với nhau một cách thuận nghịch tạo gốc Semiquinone và trung hoà tiếp hai gốc tự do . ỌH + 2R* + OH OH Gốc semiquinon Nói chung gốc Semiquinone rất bền, có thể tổn tại lâu dài, một số có độc tính do nó gắn đổng hoá với các cao phân tử sinh học, nhưng riêng với VitaminA, VitaminE, VitaminC và CoQlO thì gốc Semiquinone của chúng lại không độc nên cũng là những chất trung hoà gốc tự do và dập tắt chuỗi phản ứng oxy hoá rất tốt. CoQlO có mặt ngay ở màng ty thể, là chất chống oxy hoá đựoc sử dụng đầu tiên để loại bỏ gốc tự do thoát ra từ chuỗi hô hấp tế bào, một trong những trung tâm làm xuất hiện gốc tự do “nội sinh” mà chủ yếu là những gốc tự do có đặc tính cao: *OH, O21. H20 2. .. Bảo vệ màng ty thể tránh khỏi quá trình POL, bảo vệ ADN, ARN của tế bào tránh khỏi tác hại của gốc tự do nội môi và ngoại môi. Trong máu, CoQlO bảo vệ các LDL tránh khỏi sự tấn công của gốc tự do, ngăn cản quá trình oxy hoá các LDL. Các LDL sau khi bị oxyhoá trở thành chất lạ đối với cơ thể, bị thực bào rồi lắng đọng trong thành mạch. Đây là nguyên nhân gây xơ vữa, tắc ngẽn mạch máu dẫn đến các căn bệnh về tim mạch và tai biến mạch máu đặc biệt là tai biến mạch máu não. Liên quan đến tác dụng chống gốc tự do của CoQlO còn có lợi trong phòng và điều trì nhiều bệnh khác mà cơ chế bệnh sinh có liên quan đến gốc tự do[7]. Vấn đề này sẽ được đề cập sâu hơn ở phần sau. 1.1.3.3. Vai trò tác dụng, ứng dụng trong lĩnh vực Y - Dược. Năng lượng sinh học có vai trò hết sức quan trọng. Nó duy trì sự sống của chúng ta. Năng lượng này được tổng hợp từ các chất được đưa vào cơ thể qua quá trình oxy hoá sinh học. Năng lượng được giải phóng ra dưới dạng nhiệt và một phần được tích luỹ dưới dạng ATP - được dùng cho các phản ứng tổng hợp, thoái hoá, co cơ, hấp thu, bài tiết, xung động thần kinh,... Quá tình oxy hoá sinh học rất phức tạp, được tiến hành ở từng mô, từng tế bào, qua nhiều giai đoạn, được xúc tác bởi hệ thống enzym trong tế bào[2]. Giữ ổn định quá trình tổng hợp ATP là rất cần thiết bởi vì cơ thể chỉ dự trữ một khoảng 84 gam ATP, lượng này được sử dụng để đáp ứng nhu câu của các hoạt động sô'ng[21]. Tất cả các kết quả nghiên cứu từ trước đến nay đều cho thấy rằng CoQlO là "mấu chốt" của quá trình sinh tổng hợp ATP, nếu cơ thể thiếu CoQlO ATP sẽ không được tổng hợp, tế bào không có đủ năng lượng để thực hiện các chức năng sinh học cũng như duy trì sự sống. Theo nhận định ở tạp chí - 8- tim mạch của Mỹ năm 1990 “CoenzymQ10 là yếu tố cần thiết để ty thể tổng hợp ATP mà nhờ đó mà tế bào hoàn thành các chức năng sinh học cần thiết cho sự sống của chúng ta”[21]. Ty thể là nơi tập trung chủ yếu của CoQlO và với chức năng trên, thật dễ hiểu khi mọi tế bào đều cần đến CoQlO. Ở các tổ chức hoạt động nhiều, nhu cầu năng lượng cao như tim, gan, thận, tuỵ, não, ruột,... là những tổ chức mà tế bào có nhiều ty thể và do đó nồng độ CoQlO ở các cơ quan này thường rất cao.[12] Bảng L I : Nồng độ CoQỈO trong các cơ quan Cơ quan Nồng độ CoQlO (mcg/g) Tim 144.0 Thận 66.5 Gan 54.9 Tuỵ 32.7 Não 13.4 Ruột 16.7 Tim phải hoạt động hoạt nhiều, liên tục cho đến khi ta chết nên lượng oxy tiêu thụ cũng rất lớn, một gam cơ tim “xài” oxy gấp 25 lần so với bất kỳ một gam của mô nào trong cơ thể. Cho nên không lạ gì mà quả tim chứa một lượng CoQlO nhiều hơn hẳn các mô khác để cung cấp năng lượng. [5] Tác dụng chống oxy hoá của CoQlO đã đựoc đề cập ở mục 1.2.3 đây cũng là một tác dụng có vai trò quan trọng góp phần làm cho CoQlO có những ưu điểm nổi bật. Lợi ích của CoQlO đối với sức khoẻ và trong phòng điều trị bệnh tật đều được lý giải dựa trên cơ sở hai tác dụng này. Người ta đã chứng minh được rằng CoQlO có tác dụng tốt trong phòng và điều trị các bệnh sau: - Các bệnh tim mạch: Suy tim xung huyết, đau thắt ngực, cơ tim thiếu máu cục bộ, bệnh cơ tim, bệnh van tim, bệnh mạch vành, loạn nhịp tim và cả cho người bệnh sau mổ tim [24, 27, 29, 31, 32] - Bệnh cao huyết áp.[23, 24] - Bệnh liên quan đến gốc tự do: dị ứng, đục thuỷ tinh thể,ung thư, tiểu đường, béo phì, bệnh gan thận, parkinson, Alzheimer, ....[12, 16, 24, 27, 31] Đối với bệnh Parkinson, Alzheimer, Huntingtion,... kết quả các thử nghiệm cho thấy rằng, CoQlO phát huy tác dụng ở liều cao 600-800mg/ngày, đây đựợc xem là hướng đi có triển vọng trong công tác điều trị các bệnh này. Theo ý kiến của các chuyên gia, sử dụng CoQlO bắt đầu từ tuổi trung niên để phòng các bệnh này sẽ là giải pháp tốt nhất. [25] Cơ chế tác dụng chung nhất của CoQlO trong việc phòng và điều trị các bệnh trên là: + CoQlO tăng tổng hợp ATP. + CoQlO có khả năng trung hoà gốc tự do cao . Ngoài ra đối với mỗi bệnh, CoQlO còn có vai trò tác dụng riêng CoQlO còn được chứng minh có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch do đó có tác dụng tốt khi sử dụng phối hợp điều trị các bệnh nhiểm khuẩn(nhiễm khuẩn răng lợi, nhiễm trùng và cả đối với bệnh AIDS). [20, 25, 28] Một đặc tính nổi bật của CoQlO nữa là rất an toàn, trong quá trình nghiên cứu và sử dụng người ta nhận thấy rằng hầu như CoQlO không có tácdụng phụ, nếu có thì chỉ xuất hiện khi dùng liều rất cao và cũng không nguy hiểm.[19] 1.1.4 . CoQlO, lịch sử phát triển, thực trạng và tương lai. Được phát hiện từ năm 1957 qua nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng, đến nay CoQlO đã đạt được một bước tiến dài trên con đường chăm sóc sức khoẻ con người. Có thể điểm qua vài nét về lịch sử phát triển của CoQ10.[ 12, 16, 24]. - Năm 1957, TS. Frederick Carne ở trường đại học Wiscosin đã phân lập đựoc một chất vàng cam tử ty thể 1 thể tim bò. Cùng năm đó ở Anh TS. Morton giới thiệu một chất tương tự tên là Ubiquinone có nghĩạ “Ubiquitous quinone”. - Năm 1958, TS Karl Folkersvaf cộng sự ở Merk đã xác định được cấu trúc hoá học của CoQlO và tổng hợp được CoQlO trong phòng thí nghiệm. Lần đầu họ đã sản xuất CoQlO bằng phương pháp lên men, tách chiết từ nấm men. Họ phát - 10- hiện ra rằng các ubiquinou khác nhau số nhóm isoprene, CoQlO có ở động vật có vú trong khi C0Q6 có ở vi khuẩn . - Năm 1960, nhà nghiên cứu Nhật Tora Yamamura đã thành công trong việc sử dụng CoQ7 để điều trị bệnh thiếu máu cơ tim. - Năm 1961, lần đầu tiên CoQlO được sử dụng thử nghiệm trong điều trị ung thư, người ta đã phát hiện thấy sự thiếu hụt CoQlO ở những bệnh nhân ung thư (ung thư máu, ung thư bạch cầu, ung thư phổi, tuỷ, thận, não ...)• - Từ năm 1964, CoQlO được nghiên cứu sử dụng trong điều trị suy tim ở Nhật Bản cho nhiều kết quả khả quan . - Năm 1970, các nhà nghiên cứu phát hiện ra khả năng chống oxy hoá của CoQlO, từ đây CoQlO bắt đầu trở thành một thuốc, một chất dinh dưỡng mới có nhiều ích lợi trong phòng và điều trị bệnh với ưu thế về hiệu quả điều trị và độ an toàn. - Năm 1978, nhà nghiên cứu Anh Peter Michell nhận giải Nobel về các công trình chuyển tải năng lượng của CoQlO. -Từ năm 1980 đến nay, rất nhiều các nghiên cứu thử nghiệm CoQlO trên lâm sàng sử dụng CoQlO dưới dạng thuốc của các hãng dược phẩm trên thế giới, đặc biệt là Nhật Bản. Các kết quả nghiên cứu đều chứng minh vai trò và tác dụng có lợi của CoQlO cũng như khẳng định việc phải bổ sung CoQlO là cần thiết, kể cả với người khoẻ mạnh. Đến nay, đã có được những kếtiuận rõ ràng về CoQ: tác dụng, cơ chế tác dụng, chỉ định điều trị, liều dùng, tác dụng phụ, thận trọng, tương tác thuốc... [19, 15]. Ở các nước phát triển (NhậtBản, Mỹ, Đan mạch, Canada...), CoQlO được sử dụng rộng rãi, thậm chí không cần kê đơn. Dùng cho cả mục đích phòngvà điều trị bệnh, chăm sóc sắc đẹp, kéo dài tuổi xuân, CoQlO còn được xem như là một thực phẩm thuốc với nhiều tác dụng có lợi [26] Trong tương lai, CoQlO hứa hẹn là một thuốc có nhiều triển vọng, người ta đang tiến tới sử dụng CoQlO trong điều trị bệnh tim mạch, ung thư, parkinson, Alzheimer, đái đường, cao huyết áp, béo phì, và cả bệnh AIDS ...[25] đều là những căn bệnh thời đại đang đặt ra nhiều thách thức đối với Y-Dựơc trên toàn thế giới. CoQlO thực sự có ý nghĩa cho sức khoẻ con người trong cuộc sống hiện tại và tương lai, một cuộc sống hiện đại với nhiều áp lực, bên cạnh sự tăng lên về chất lượng cuộc sống thì các "nguy cơ" cũng luôn tăng theo. Từ khi người ta tổng hợp được CoQlO lần đầu tiên, cho tới nay vấn đề sản xuất CoQlO đã được đặt ra và có nhiều bước tiến đáng kể. Lần đầu tiên CoQlO được sản xuất bằng phương pháp lên men, tách chiết từ tế bào nấm men, và đến nay vẫn là một phương pháp chính để sản xuất CoQlO, tất nhiên đã có rất nhiều cải tiến, tác động để cho hiệu suất cao nhất: đột biến, kỹ thuật chuyển gen..[18, 20]. CoQlO còn được chiết từ một số vi khuẩn, từ các tố chức của thực vật bậc cao, động vật, tuy nhiên nguồn này ít được khai thác vì giá thành cao [18]. Phương pháp tổng hợp hoá học cũng là một phương pháp được sử dụng nhiều để tổng hợp CoQlO ở quy mô công nghiệp, trong lĩnh vực này người ta đã tìm ra nhiều nguyên liệu ban đầu để tổng hợp CoQlO, sản phẩm thu được thường không phải là CoQlO dạng tự nhiên, mà thường là dạng đồng phân cis, trans, isome... [18]. Tách chiết từ vi sinh vật và tổng hợp hoá học là hai phương pháp chính đang được sử dụng hiện nay trên thế giới để sản xuất CoQlO. Hiện nay, thế giới đã đạt đến trình độ kỹ thuật cao trong sản xuất CoQlO. Năm 1970, Nhật Bản là nước đầu tiên sản xuất được CoQlO ở quy mô công nghiệp. Vậy mà đến nay sản phẩm CoQlO đẵ rất phổ biến trên thị trường thế giới, của nhiều hãng dược phẩm, của nhiều quốc gia trong đó chủ yếu là: Nhật Bản , Mỹ, ý, Đan Mạch, Canada... Các sản phẩm có chất lượng tốt, phong phú về chủng loại và mẫu mã như: viên nén, viên nang dầu, viên nang mềm... Hàm lượng phong phú:30mg, 60mg, lOOmg, 120mg, 200mg, 400mg, sử dụng rất thuận tiện. Hiện nay còn có cả những chế phẩm mới, được bào chế dưới dạng phối hợp trong đó chứa đầy đủ các thành phần nguyên tố cần thiết (các vitamin nhóm B, Vitamin tan trong dầu và các nguyên tố vi lượng) với tỷ lệ chuẩn về hàm lượng, hoặc sản phẩm phối hợp giữa VitaminE+CoQlO, Selen+CoQlO, Mg+CoQ10.... ở các nước phát triển, người dân tiếp nhận sản phẩm này rất tích cực bởi CoQlO có hiệu quả và độ an toàn cao. Trong khi đó, ở nước ta CoQlO con rất mới lạ đối với cả thầy thuốc và người dân. -12- 1.2. Nấm men 1.2.1. Những ứng dụng chung [3, 9,10] Đã từ lâu con người đã biết sử dụng nấm men và các sản phẩm của nó trong công nghiệp thực phẩm. Điển hình là Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong sản xuất bánh mì, bia , rượu, chất glycerol hoặc men invertaza .s. íragilis có khả năng lên men lactose nên đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa . Sử dụng nấm men sản xuất các acid amin (đặc biệt là các acid amin không thể thay thế), protein, các vitamin ngày càng có ý nghĩa. Hiện nay đã có “ Nấm men thực phẩm " được sử dụng làm chất dinh dưỡng cho con người (đã được dùng nhiều trong các chiến dịch chống đói ở Ân Độ , Angieri). Ngoài ra, nấm men còn được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, sử dụng các sản phẩm phụ của ngành công nghiệp khác (rỉ đường, dịch thuỷ phân gỗ, parapin...) để làm chất dinh dưỡng cho vật nuôi và nâng cao chất lượng th ịt. Sử dụng nấm men để xử lí các nguồn phế thải như: dầu mỏ và các sản phẩm của dầu mỏ sử dụng trong các ngành công nghiệp, giao thông, đời sống... tránh gây ô nhiễm môi trường. Ngày nay, công nghệ sinh hoc phát triển mạnh, nấm men còn là đối tượng và phương tiện nghiên cứu hữu hiệu, đặc biệt trong lĩnh vực sinh học phân tử. 1.2.2. Những ứng dụng trong lĩnh vực Y- Dược [3, 9,10] Nhiều loại nấm men có khả năng tổng hợp một lượng enzim ngoại bào rất lớn so với nhu cầu sử dụng trong trao đổi chất của chúng nên được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzim như: amylase, lipase... dùng làm thuốc hỗ trợ tiêu hoá . Nhiều loài thuộc chi saccharomyces hiện đang được sử dụng như một công cụ đắc lực để mang các ADN tái tổ hợp cho việc sản xuất các sản phẩm thuốc thế hệ mới của kĩ thuật di truyền . Nhiều nước trên thế giới đã và đang sử dụng các chế phẩm đông khô của nấm men s. boulardi như BioAor, Ultra-Levue để điều trị một số bệnh: ỉa chảy nhiễm trùng cấp tính do vi khuẩn, virus điều trị hội chứng kích thích ruột.... 1.2.3. Nấm men và CoQlO Bất kỳ một cơ thể sống nào cũng cần phải có năng lượng. Vì vậy, không có gì ngạc nhiên khi có sự có mặt của CoQlO trong tế bào nấm men. Hệ thống Ubiquinone đẵ được coi như một chỉ tiêu phân loại nấm ở mức độ chi. CoQ nói chung và CoQlO nói riêng được tế bào nấm tự tổng hợp để phục vụ nhu cầu của chúng. Vì vậy lượng không nhiều, cơ chế sinh tổng hợp CoQ và CoQlO trong tế bào nấm thế nào ở đề tài này chúng tôi chưa tìm hiểu được. Cho đến nay hệ thống Ubiquinone đẩ được ghi nhận với con số khá lớn trong bảng phân loại của vi nấm. Theo tài liệu "Yeast characteristics and identification" sự phân bố của các loại CoQ ở các chi nấm men như sau: Bảng 1.2: Sự phân bô của các loại CoQ ở các chi nấm men Tên chi Loại CoQ Arxiozyma, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Nematospora Saccharomyces,Torulaspora,Zygosaccharomyces,Nadsoni C0Q6 Ambrosiozyma , Williopsis, Candida). CoQ7 Hormoascus, Pichia, Isatchenikia. Arthroascus, Botryoascus, Citeromyces, Clavỉspora Cystoỷilobasidium, Endomyces, Pachisolen, Zỵgozyma Guilliermondella, Hyphpichia, Mrakia, Myxoiyma, C0Q8 Canđida Aciculoconidium, Benỉngtonia, Canđia, Debarynomyces, Dekkera, Filobasidium, Hasegauvaea, Lipomyces, Lodderomyces, Holleya, Leucosporidium Lipomyces ,Lodderomyces ,Metschinikowia, Octosporomyces, Rhodosporidium Rhodotorula, Schwaonnỉomyces,Sporoboỉomyces Trichosporon,Waltomyces, Wickerhamia,Wingea,YaiTowia Còn những chi sau có khả năng sinh tổng hợp CoQlO: CoQ9 1. Bullera 8. Saitoella 2. Cryptococcus 9. Schizosaccharomyces 3. Fiỉobasidiella 10. Sporodioboliis 4. Filobasỉdium 11. Sporobolomyces 5. Leucosporidiưm 12. Tremella 6. Rhodoỷorula 13. Trichospoon 7. Rhodosporidium Nuôi nấm men, thu sinh khối và tách chiết CoQlO từ tế bào nấm men là phương pháp đầu tiên được sử dụng để sản xuất CoQlO, phục vụ nhu cầu điều trị. Cho tới nay đây vẫn là một trong những phương pháp tốt nhất được sử dụng. Có lẽ bởi các lý do sau: - Nấm men đa số là lành tính - Nuôi cấy dễ, thời gian phát triển ngắn, sớm thu được sinh khối - EnzymQ10 (và các CoQ khác) là hợp chất nội sinh, có nguồn gốc sinh học.Vì vậy, sản xuất bằng phương pháp sinh tổng hợp là hướng đi hợp lý. Tuy nhiên, có một số trở ngại như: để chiết được CoQlO phải phá vỡ được màng tế bào và cả màng ty thể, màng tế bào nấm men tương đối dày. Hơn nữa thường nấm men chỉ sản xuất ra lượng CoQlO vừa đủ nhu cấu sử dụng của nó, có một phần dự trữ(lượng này gấp lượng sử dụng khoảng 13-14 lần)[2]. Nếu chỉ nuôi cấy thông thường thì lượng CoQlO tách chiết được không đáng kể, không đáp ứng đựoc nhu cầu sử dụng và giá thành sẽ rất cao. Để có được các sản phẩm của CoQ phong phú trên thị trường hiện nay với giá tương đối phù hợp chắc chắn hiệu suất tổng hợp CoQlO phải cao. Các biện pháp kỹ thuật hiện đại đã được ứng dụng để nâng cao hệ số tổng hợp CoQlO : tuyển chọn giống(chọn lọc, đột biến...) và ngày nay áp dụng cả kỹ thuật sinh hoá phân tử, kĩ thuật chuyển gen... [18] điều chỉnh nấm men tổng hợp CoQlO theo ý muốn của nhà sản xuất. Tuy nhiên đây là vấn đề của thế giới, còn chúng ta chỉ mới đặt những bước chân đầu tiên trên con đường nghiên cứu sinh tố mới này, nghiên cứu, học hỏi, thu thập kinh nghiệm, là tất cả những gì chúng ta phải làm để có được những thành công trong tương lai. PH Ầ N 2: THỰC N G H IÊ M VÀ K ẾT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 2.1.2. Nguyên liệu Trong các chủng nấm men lưu giữ ở bộ sưu tâp giống vi sinh vật công nghiệp của Viện công nghiệp thực phẩm, chúng tôi lựa chọn 12 chủng nấm men có ký hiệu sau để nghiên cứu: 1.JCM1545(CoQ 10H2) 7.Litch08(CoQ) 2.JCM8274(CoQ10) 8.Litchl2(CoQ) 3.JCM2320(CoQ9) 9.Litchl3(CoQ) 4.G376(CoQ8) 10.Litchl7(CoQ) 5.HB.1.3.13(CoQ7) 11.TH3.2.59(CoQ) 6.CNTP-7028(CoQ6) 12.TVN309(CoQ) 2.1.2. Hoá chất và môi trường, a. Hoá chất n-Hexan (TQ) Parafin (TQ) Methanol (TQ) Glucose (TQ) Ethanol (TQ) Kali nitrat (TQ) Aceton (TQ) Dimetyl sulfoxid (TQ) Dietyl Acetat (TQ) Kalihydrocid (TQ) Isopopanol (TQ) Silicagel GF254 for TLC Merk Benzen (TQ) SilicagelóO for collum Merrk Acid pyrogalic (TQ) Keli permanganat (TQ) b. Môi trường sử dụng * Mối trường Malt-Gluco 4°BX Nước malt 2°BX Glucose 20g Nước cất vừa đủ lOOOml * Mỏi trường Malt-Glucose 2°BX+2%agar Nước malt 1BX Glucose lOg Aga 20g Nước cất vừa đủ lOOOml Các môi trường đựơc hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121°c/20phút 2.1.3. Máy móc thiết bị - Bốc cấy Bioblockcientiíic (Pháp) - Nồi hấp áp lực Sanyo (Nhật Bản) - Máy li tâm to Rotanda460 (Đức) - Máy li tâm vừa Universal (Đức) - Máy li tâm siêu tốc Heracusperatech (Đức) - Máy cô quay Kika Werke (Đức) - Bơm hút chân không V acuubrandGMBH (Đức) - Kính hiển vi Nikon clipse E600 (Nhật Bản) - Máy đo quang UV1650cp (Nhật Bản) - Máy lắc IKA KS260 Basic (Nhật Bản) - Máy ổn nhiệt Eppendorí (Đức) - Thiết bị lên men New Brunswich (Mỹ) - Đen soi tử ngoại McroVue UV.-20 (Mỹ) - Lò vi sóng LG (Hàn Quốc) Bình tam giác, pipét các loại, ống Eppendorí, ống Fancon, đầu col các loại, bình Soxlet, sinh hàn thẳng, bình chạy sắc ký, bản mỏng thuỷ tinh... 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.1.Lên men thu sinh khôi a. Hoai hoa chủng nấm men Cấy 12 chủng nấm men lên môi trường thạch nghiêng Malt-Glucose b. Nhân giống cấp / Cấy truyền 12 chủng nấm men từ môi trường thạch nghiêng sang bình tam giác chứa 30ml môi trường Malt-Glucose 4°Bx. Nuôi lắc 150 vòng/phút, ở 25 ° c trong 24 giờ. c. Nhân giốn g CỐỊ2 // Chuyển giống cấp I vào bình tam giác chứa 270ml môi trường MaltGlucose 4 °Bx. Nuôi lắc ở điều kiện 150 rpm, nhiệt độ 25 ° c trong 48 giờ. d. Lỵ tâm thu sinh khối Các chủng nấm men sau khi nhân giống cấp II được ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu sinh khối mẫu. Rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý. Ly tâm thu sinh khối 4500 vòng/phút trong 10 phút. Sinh khối sau khi thu được đem cân khổi lượng và bảo quản trong tủ đá để tách chiết. 2.2.2. Tách chiết CoQ Tiến hành tách chiết theo hai phương pháp * Phương nháp l : - 4g sinh khối nấm men của mỗi chủng được cho vào ống Falcon chứa : 7ml H20 : 2,5g KOH : 0,6g Acid Pyrogalic : 19ml Methanol. Lắc đều. Cho hỗn hợp vào bình Soxlet rồi thuỷ phân trong điều kiện : 90 °c, 45 phút. Sau đó làm lạnh nhanh trong 10 phút. Chuyển hỗn hợp thu được vào ống Falcon. Cho vào mỗi ống Falcon 13 ml n-Hexan. Lắc mạnh trong 30 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lớp dịch n-Hexan phía trên. - Bổ xung 13ml n-Hexan. Lắc mạnh trong 5 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lớp dịch n-Hexan phía trên. Gộp dịch n-Hexan của 2 lần chiết vào một ống Falcon. Rửa dịch c h iế t: bổ xung lOml HaO vào mỗi ống Falcon chứa dịch chiết n-Hexan, lắc đều, để phân lớp. Thu dịch n-Hexan phía trên. Lặp lại 2-3 lần đến khi nước cất phía dưới trong. Lọc dịch chiết n-Hexan qua giấy lọc vào bình solet 200ml khô sạch. Dịch thu được đem cô ở 32 ° c trong chân không cho đến khi n-Hexan bốc hơi hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 0,5 ml Aceton. Bảo quản mẫu thu được trong tủ lạnh 4 °c để tinh sạch. * Phương DÌỉáv 2: Cho 4g sinh khối mỗi chủng nấm men vào ổng Falcon chứa 20 ml Dimetyl sulíoxid. Lắc mạnh trong 2 phút. Cho vào mỗi ống lm l đệm photphat pH 7 ; 20 ml hỗn hợp dung môi chiết ( hỗn hợp Etylacetat và n-Hexan tỷ lệ 1:1). Lắc mạnh trong 5 phút. - Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút. Hút lấy phần dịch phía trên. Lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình soxlet 200ml khô sạch. - Dịch thu được đem cô ở 32 °c trong chân không cho đến khi dung môi bốc hơi hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 0,5 ml Aceton. Bảo quản mẫu thu được trong tủ lạnh 4 °c để tinh sạch. 2.2.3. Tinh sạch CoQ Các mẫu dịch chiết được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký bản mỏng. a. Chuẩn bi bản mỏng - Hoà tan 5 g bột silicagen GF254 vào 20 ml nước cất. Dùng bơm chân không hút sạch khí hoà tan trong hỗn dịch. - Đổ hỗn dịch ra bản thuỷ tinh mỏng. Sấy bản mỏng ở 160 ° c trong 2 giờ. Để nguội rồi sử dụng. b. Chaỵ sắc ký Mẫu tách chiết được cô đặc từ 0,5 ml đến 0,1 ml ở 40 °c. Chấm 0,1 ml dịch chiết cô đặc lên bản mỏng. Chạy sắc ký trong dung môi là benzen đến khi vệt dung môi cách mép trên của bản mỏng lcm. Bản mỏng sau khi sắc ký được lấy ra để khô tự nhiên. Soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại để xác định vị trí mẫu. c. Thu hồi mẫu Cạo phần bột silicagen chứa mẫu. Hoà tan bột thu được trong lm l Aceton. Ly tâm 8 000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trong. Dịch thu được đem cô đặc ở 40 ° c đến thể tích 0,1 ml. Bảo quản mẫu ở 4 ° c để định tính. 2.2.4. Xác định chủng loại CoQ Xác định chủng loại CoQ theo phương pháp sắc ký bản mỏng. CL Chuẩn bj bản mỏng Bản mỏng silicagen HTLC được sấy 110 ° c trong 1 giờ để hoạt hoá. Tẩm bản mỏng bằng dung dịch parafin5% trong n-Hexan. Để khô tự nhiên. b. Chuẩn bi dung môi Cho vào bình Solet 50ml isopropanol, 50 ml methanol, 2 ml paraíin. Lắc mạnh để đảm bảo dung dịch là bão hoà paraíin. Dung dịch thu được cho vào bình sắc ký,đậy nắp cho bão hoà dung môi. c. Chuẩn bi mẫu chuẩn Trộn các mẫu chứa CoQ 6 , CoQ7, CoQ 8 , CoQ9, CoQlO với nhau, mỗi mẫu 10 ịil, ta thu được hỗn hợp mẫu chuẩn. d. Chaỵ sắc ký Chấm 12 mẫu tách chiết và mẫu chuẩn, mỗi mẫu 10 |ul lên bản mỏng. Để khô tự nhiên. Chạy sắc ký bằng dung môi đã chuẩn bị sẵn đến khi vệt dung môi cách mép trên của bản mỏng lcm. Lấy bản mỏng ra, để khô tự nhiên. e. Xác định mẫu Nhuộm bản mỏng bằng K M nơ 4 0,2% trong 1-2 phút. Rửa sạch bản mỏng bằng nước cất. Đối chiếu vị trí mẫu phân tích với mẫu chuẩn trên sắc ký đồ để định loại CoQ. 2.2.5. Đánh giá hàm lượng CoQlO Định lượng CoQlO bằng phương pháp đo quang phổ hấp phụ tử ngoại. * Chuẩn bị mẫu chuẩn : Lấy viên thuốc Coenzyme Q10 hàm lượng 30mg của hãng ECKHART Corp (Mỹ). Hoà vào 1-2 ml Etylacetat. Thu được dịch thuốc. Trộn dịch thuốc vào 2g silicagen 60. Để khô tự nhiên cho thuốc hấp phụ vào bột silicagel. Nhồi bột silicagen 60 sạch vào cột thuỷ tinh, bão hoà cột bằng dung môi là benzen. Cho bột silicagen đã hấp phụ thuốc lên trên. - Bổ xung từ từ dung môi vào cột đến khi CoQlO bị đẩy hoàn toànxuống lớp silicagen sạch. Bổ xung dung môi liên tục đến khi CoQlO bị đẩy ra ngoài dưới dạng dịch chiết màu vàng. Hứng lấy lớp dịch này. - Dịch thu được đem cô chân không ở 30 °c đến khi dung môibốc hơi hoàn toàn. - Hoà tan cặn bằng 5 ml n-Hexan ta thu được dung dịch gốc. -21 - Hoà 40 |il dung dịch gốc vào ethanol đến thể tích 5ml ta thu được mẫu chuẩn. * Chuẩn bị mẫu thử Các mẫu sau khi tinh sạch được hoà tan trong 40 |J,1 n-Hexan. Bổ xung ethanol đến thể tích 5 ml ta thu được dung dịch mẫu thử. * Quét phổ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử ở bước sóng x = 190 1100 nm, so sánh để xác định độ tinh sạch của mẫu thử. * Đo độ hấp thụ tử ngoại của mẫu thử và mẫu chuẩn ở bước sóng X = 275 nm, so sánh để đánh giá hàm lượng. 2.2.6. Thăm dồ nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp CoQlO Chủng JCM8274 được lên men trong các điều kiện khác nhau ở 25 °c, 48 g iờ : - Nuôi cấy trong môi trường Malt-Glucose 4°Bx có bổ xung 5% KN03. Nuôi cấy trong môi trường Malt-Glucose 4°Bx có sục khí với tốc độ 0,3 và 0 ,6 (đơn vị tương đối của thiết bị). Sinh khối thu được dùng để tách chiết CoQlO theo phương pháp 1. Dịch chiết được tinh sạch và đo quang phổ hấp thụ để sơ bộ đánh giá hàm lượng theo phương pháp đã nêu ở trên. PH Ẩ N 3: K ẾT Q U Ả VÀ BÀN LU Ậ N 3.1. Đặc điểm các chủng nấm men nghiên cứu Mười hai chủng nấm men được lựa chọn để nghiên cún đã biết một số thông tin về danh pháp, khả năng sinh CoQ (chính xác và dự đoán): Các chủng: JCM1545, JCM8274, JCM2320, G376, HB1.3.13 đã được xác định là có các CoQ như bảng dưới. Các chủng này được bố trí vào thí nghiệm nhằm mục đích tạo chất chuẩn, .các chủng còn lai dự đoán có khả năng sinh CoQlO dựa trên phân loại sơ bộ. Các chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng và sau một tuần được soi, chụp ảnh tế bào. Bảng3.1 : Đặc điểm các chủng nấm men nghiên cứu s tt Ký hiệu Tên loài Loài CoQ 1 JCM1545 Erythrobasidium Hasegawianum CoQ10H2 2 JCM8274 Schizoshaccharomyces pombe CoQlO 3 JCM2320 Yarrowa lipolytica CoQ9 4 G376 Citeromyces matritensỉs CoQ 8 5 HB1.3.13 Issachenkia hanoiensỉs CoQ7 6 CNTP-7028 Shacccharomyces cereviseae CoQ 6 7 Lith08 Bullera sp. CoQ 8 Litchl2 Bullera sp. CoQ 9 Litchl3 Bullera sp. CoQ 10 Litchl7 Bullera sp. CoQ 11 TH3.2.59 Bullera sp. CoQ 12 TVN309 Rhodotorulla cycloclastica CoQ Hình 3 .1 : Các chủng CoQ được dùng trong phân tích: a. G376 (CoQ-8) b. HB1.3.13 (CoQ-7), c. JMC1545 (CoQ-10H2) d. JCM2320 (CoQ-9). Thanh chèn tương ứng vói 4 |im. - 24- t> '< £ * § ) é < 7© ẵ Q , 0 - < £> Õ (• r y ầ — _ * ù , H V — 0 • ' ■ M C Ù í v LỈ ** te ~ 0 o o ^ c. ® , , * '" 'í ■ © 1 Hình 3.2: Các chủng nấm men sử dụng trong phân tích. a. JCM8274 (CoQ-10) b. Litch08 (CoQ), c. Litchl2 (CoQ) d. Litchl 3 (CoQ). Thanh chèn tương ứng với 4 |j.m. - 25- = 4 ' ị) (9Fế sẼ mề 0 đ?) co\jy [...]... Ậ N 3.1 Đặc điểm các chủng nấm men nghiên cứu Mười hai chủng nấm men được lựa chọn để nghiên cún đã biết một số thông tin về danh pháp, khả năng sinh CoQ (chính xác và dự đoán): Các chủng: JCM1545, JCM8274, JCM2320, G376, HB1.3.13 đã được xác định là có các CoQ như bảng dưới Các chủng này được bố trí vào thí nghiệm nhằm mục đích tạo chất chuẩn, các chủng còn lai dự đoán có khả năng sinh CoQlO dựa trên... sử dụng Có lẽ bởi các lý do sau: - Nấm men đa số là lành tính - Nuôi cấy dễ, thời gian phát triển ngắn, sớm thu được sinh khối - EnzymQ10 (và các CoQ khác) là hợp chất nội sinh, có nguồn gốc sinh học.Vì vậy, sản xuất bằng phương pháp sinh tổng hợp là hướng đi hợp lý Tuy nhiên, có một số trở ngại như: để chiết được CoQlO phải phá vỡ được màng tế bào và cả màng ty thể, màng tế bào nấm men tương đối dày... Hình 3.3 : Các chủng nấm men sử dụng trong phân tích a.TH3.2.59 (CoQ) c Litchl7 (CoQ) b TVN309 (CoQ) d CNTP-7028 (CoQ) Thanh chèn tương ứng với 4 |im -26- 3.2 Lên men thu sinh khối Các chủng nấm men sau khi lên men trong 300ml môi trường Malt-Glucose 4°BX ở điều kiện T=25°c, lắc 150 vòng /phút trong 72 giờ Ly tâm ,rửa tế bào, thu sinh khối Lượng tế bào của các chủng đạt trung bình 4gam (sinh khối ướt)... nhiều thời gian Các chủng nấm men sau tách chiết, dịch chiết thu được ở giai đoạn dịch Aceton 0.5ml của các mẫu có màu vàng, hơi mờ đục, với độ đậm khác nhau: Các mẫu dịch chiết của các chủng Litchl2, Litchl?, JCM8274, TH3.2.59, JCM2320, HB1.3.13, CNTP-7028 có màu vàng đậm Các mẫu tách chiết các chủng G376, LitchQ8 có màu vàng nhạt Dịch chiết mẫu JCM1545 có màu vàng đỏ Mẫu dịch chiết các chủngTVN309,... cả các kết quả nghiên cứu từ trước đến nay đều cho thấy rằng CoQlO là "mấu chốt" của quá trình sinh tổng hợp ATP, nếu cơ thể thiếu CoQlO ATP sẽ không được tổng hợp, tế bào không có đủ năng lượng để thực hiện các chức năng sinh học cũng như duy trì sự sống Theo nhận định ở tạp chí - 8- tim mạch của Mỹ năm 1990 “CoenzymQ10 là yếu tố cần thiết để ty thể tổng hợp ATP mà nhờ đó mà tế bào hoàn thành các. .. CoQlO phải cao Các biện pháp kỹ thuật hiện đại đã được ứng dụng để nâng cao hệ số tổng hợp CoQlO : tuyển chọn giống (chọn lọc, đột biến ) và ngày nay áp dụng cả kỹ thuật sinh hoá phân tử, kĩ thuật chuyển gen [18] điều chỉnh nấm men tổng hợp CoQlO theo ý muốn của nhà sản xuất Tuy nhiên đây là vấn đề của thế giới, còn chúng ta chỉ mới đặt những bước chân đầu tiên trên con đường nghiên cứu sinh tố mới này,... nhiệt Eppendorí (Đức) - Thiết bị lên men New Brunswich (Mỹ) - Đen soi tử ngoại McroVue UV.-20 (Mỹ) - Lò vi sóng LG (Hàn Quốc) Bình tam giác, pipét các loại, ống Eppendorí, ống Fancon, đầu col các loại, bình Soxlet, sinh hàn thẳng, bình chạy sắc ký, bản mỏng thuỷ tinh 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Lên men thu sinh khôi a Hoai hoa chủng nấm men Cấy 12 chủng nấm men lên môi trường thạch nghiêng Malt-Glucose... glycerol hoặc men invertaza s íragilis có khả năng lên men lactose nên đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa Sử dụng nấm men sản xuất các acid amin (đặc biệt là các acid amin không thể thay thế), protein, các vitamin ngày càng có ý nghĩa Hiện nay đã có “ Nấm men thực phẩm " được sử dụng làm chất dinh dưỡng cho con người (đã được dùng nhiều trong các chiến dịch... bào nấm men Hệ thống Ubiquinone đẵ được coi như một chỉ tiêu phân loại nấm ở mức độ chi CoQ nói chung và CoQlO nói riêng được tế bào nấm tự tổng hợp để phục vụ nhu cầu của chúng Vì vậy lượng không nhiều, cơ chế sinh tổng hợp CoQ và CoQlO trong tế bào nấm thế nào ở đề tài này chúng tôi chưa tìm hiểu được Cho đến nay hệ thống Ubiquinone đẩ được ghi nhận với con số khá lớn trong bảng phân loại của vi nấm. .. lai PH Ầ N 2: THỰC N G H IÊ M VÀ K ẾT QUẢ 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 2.1.2 Nguyên liệu Trong các chủng nấm men lưu giữ ở bộ sưu tâp giống vi sinh vật công nghiệp của Viện công nghiệp thực phẩm, chúng tôi lựa chọn 12 chủng nấm men có ký hiệu sau để nghiên cứu: 1.JCM1545(CoQ 10H2) 7.Litch08(CoQ) 2.JCM8274(CoQ10) 8.Litchl2(CoQ) 3.JCM2320(CoQ9) 9.Litchl3(CoQ) 4.G376(CoQ8) 10.Litchl7(CoQ) 5.HB.1.3.13(CoQ7)