Đang tải... (xem toàn văn)
... hóa học để nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng xạ khuẩn 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn MT lên men chìm tốt - Thực lên men từ dạng chủng biến... lần tác nhân hoá học hoạt tính kháng sinh Streptomyces 173. 113 tăng lên đáng kể Kháng sinh Streptomyces 173. 113 sinh tổng hợp có số đặc điểm sau: Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, vi khuẩn... bình lên men + Lên men liên tục: Thiết bị cấu tạo đặc biệt cho VSV phát triển đến giai đoạn thích hợp lấy thể tích dịch lên men bổ sung thêm MT vào bình + Lên men bán liên tục: trình lên men,
BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SI HÀ NỘI - 2012 MỤC LỤC MỤC LỤC........................................................................................................................2 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................................1 Chương 1 : TỔNG QUAN.................................................................................................2 1.1 Đại cương về kháng sinh..................................................................................................2 1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh.........................................................................................................2 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh........................................................................................................................2 1.1.3 Phân loại kháng sinh..........................................................................................................................3 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh........................................................................................................3 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh............................................................................................................4 1.2 Đại cương về xạ khuẩn....................................................................................................4 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.......................................................................................................4 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces.........................................................................................5 1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6)...................................................................7 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn...............................................................8 1.4.1 Mục đích............................................................................................................................................8 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên................................................................8 1.4.3Đột biến cải tạo giống.........................................................................................................................8 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn...................................................................................................................9 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh...................................................................................9 1.5.1 Khái niệm lên men.............................................................................................................................9 1.5.2 Các phương pháp lên men...............................................................................................................10 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men...........................................................................11 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men..........................................................11 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh..................................................................................11 1.6.2 Các phương pháp chiết tách............................................................................................................12 1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng.............................................................................12 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến....................................................................................................................12 1.7.2 Phổ hồng ngoại................................................................................................................................13 1.7.3. Khối phổ (MS).................................................................................................................................13 1.8 Một số nghiên cứu liên quan.........................................................................................13 1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus [18]....................................................................................................................................13 1.8.2 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces sp.[19]..............14 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................15 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị.............................................................................................15 2.1.1 Nguyên vật liệu................................................................................................................................15 2.1.2 Máy móc thiết bị..............................................................................................................................16 2.2 Nội dung nghiên cứu.....................................................................................................17 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống.....................................................................................................................17 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.......................................................................................................17 2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được.............................................................18 2.3 Phương pháp thực nghiệm............................................................................................18 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn........................................................................................................18 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán......................................................18 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên.........................................................................................................................19 2.3.4 Phương pháp đột biến.....................................................................................................................19 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh.................................................................................................21 2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc...............................................................................22 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ...............................................................22 2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng........................................................22 2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không...............................................................................23 2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột.......................................................................................23 2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được.............................................................................24 Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT........................................................24 3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên...........................................................................................24 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1................................................................................25 3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2................................................................................26 3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3................................................................................27 3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh.....................................................................28 3.6 Kết quả chọn chủng lên men..........................................................................................29 3.7 Kết quả thử độ bền pH..................................................................................................30 3.8 Kết quả chọn dung môi và pH chiết................................................................................30 3.9 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi....................................................................31 3.10 Kết quả sắc ký cột........................................................................................................31 3.11 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết..................................35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................................36 1. Kết luận.......................................................................................................................... 36 2. Kiến nghị......................................................................................................................... 37 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÊT TẮT S. aureus Staphylococcus aureus P. mirabilis Proteus mirabilis ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic DMHC Dung môi hữu cơ ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại - Infrared KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào TĐC Trao đổi chất UV Tử ngoại – Ultraviolet VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn............................................................15 Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.................................................16 Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng..........................................................................16 Bảng 4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên....................................................25 Bảng 5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1..............................................................26 Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2..............................................................27 Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3..............................................................28 Bảng 8: Kết quả chọn môi trường lên men.............................................................29 Bảng 9: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt.................30 Bảng 10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày.........31 Bảng 11: Kết quả chiết kháng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khác nhau..................31 Bảng 12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký...................................................32 Bảng 13: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1......................33 Bảng 14: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........34 Bảng 15: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2......................34 Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........35 Bảng 17: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3............36 Bảng 18: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........36 Bảng 19: Biện giải các nhóm chức của phổ IR.......................................................37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn. Hình 2: Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi khuẩn. Hình 3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn. Hình 4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn. Hình 5: Sự phát triển của khuẩn ti ở xạ khuẩn. Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh. Hình 7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn. Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Hình P3: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV. Hình P4: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn 3 lần 1. Hình P5: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được. Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được. Hình P7: Phổ MS của kháng sinh tinh khiết thu được. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh ngay từ khi ra đời đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y - dược. Hiện nay, kháng sinh đã trở thành một nhóm thuốc thiết yếu trong nền y học hiện đại. Nhờ nhóm thuốc này mà nhân loại đã chống lại được các dịch bệnh nguy hiểm đã từng cướp đi sinh mạng của hàng trăm ngàn người trên thế giới như : dịch hạch, tả, viêm phổi… Đặc biệt, nhóm thuốc này giữ 1 vị trí hết sức quan trọng ở những nước đang phát triển khi mức sống thấp, điều kiện vệ sinh yếu kém… nên thường xuất hiện và có nguy cơ bùng phát các dịch bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn tiêu hóa. Không dừng lại ở điều trị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm, ngày nay phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS và cũng cho nhiều kết quả khả quan. Bên cạnh đó, tình hình sử dụng kháng sinh chưa hợp lý dẫn tới tình trạng VSV kháng thuốc diện rộng, kháng cả với những kháng sinh thế hệ mới. Đặc biệt, hiện nay xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng chéo với nhiều loại kháng sinh có cấu trúc tương tự nhau.Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp thiết trong công cuộc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Do đó, bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh bằng phương pháp tổng hợp, bán tổng hợp thì việc tìm kiếm những kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên cần được chú trọng hơn nữa. Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất. - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được. 2 Chương 1 : TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander Fleming tình cờ phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum. Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey đã đề nghị được hợp tác với Fleming để tiếp tục nghiên cứu về penicilin. Năm 1941, nhóm đã chọn được chủng Penicilliumchrysogenium ưu việt nhất để chiết penicillin. Từ 1943, Anh và Mỹ đã sản xuất penicilin với quy mô công nghiệp. Đến năm 1945, giáo sư Fleming được tặng giải thưởng Nobel về y học, cùng với Chain và Florey [21]. Penicillin xuất hiện đã mở đầu một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y – dược: kỷ nguyên kháng sinh. Trong vòng 20 năm tiếp theo đó (1940 – 1960) là thời kỳ “hoàng kim” trong lịch sử nghiên cứu kháng sinh với sự ra đời của hàng loạt các kháng sinh liên tiếp: streptomycin (1944), cloramphenicol – neomycin (1949)…Tuy nhiên, ngay sau khi kháng sinh được đưa vào ứng dụng điều trị trong thực tế không lâu thì bắt đầu phát hiện các chủng VSV kháng thuốc. Năm 1953, trong một trận dịch bệnh tả ở Nhật, lần đầu tiên xuất hiện hiện tượng vi khuẩn đề kháng với cloramphenicol, tetracycline. Đến năm 1955, các nhà khoa học phát hiện vi khuẩn lao kháng streptomycin… (Tham khảo phụ lục - Hình 1) Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và cephalosporin… 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.[10] 3 1.1.3 Phân loại kháng sinh Danh sách các chất KS được phát minh đang ngày càng dài thêm (Tham khảo Phụ lục 1) và việc phân loại chúng trở nên thật sự cần thiết. Có nhiều cách phân loại KS: theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên cứu có thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó [10]. Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm sau đây [8]: - Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin…). - Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol…). - Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin…). - Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin…). - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…). - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…). - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…). - Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin…). - Các kháng sinh nhóm actinomycin (actinomycin D…). 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào vi sinh vật, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. [4] Có 6 kiểu chủ yếu: (Tham khảo phụ lục - Hình 2) [17] - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất - Tác dụng lên sự tổng hợp ADN - Tác dụng lên sự tổng hợp protein (Tham khảo phụ lục - Hình P3) - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian 4 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau [10]: - Trong chăn nuôi: kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt. - Trong trồng trọt: Hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh đã được sử dụng để đấu tranh với các bệnh của cây trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ: Herbicidin A và B là kháng sinh do S.saganonensis tạo ra kìm hãm sự phát triển của Xanthomonas oryzae gây bệnh cho lúa. - Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis). 1.2 Đại cương về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%.[4] Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym....nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều.[4] Xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất kháng sinh và nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[4] 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn - Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[6] 5 - Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng, …[7] Actinomycetes Actinomycetales Actinoplanaceae Streptoverticulum Streptomycetaceae Streptomyces VSV giống xạ khuẩn Actinomycetaceae … Themostreptomyces … Hình 4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những đặc điểm riêng: - Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc: + Tạo thành cụm, bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn hoặc bởi những sợi nhỏ bông như lông tơ. + Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách rời khỏi môi trường nuôi cấy. + Hệ sợi của khuẩn lạc: Khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. • Khuẩn ty cơ chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi. 6 • Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. (Hình 5) [7] Chuỗi bào tử: Có thể mọc đơn hoặc mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như thẳng, cong, móc câu, xoắn đơn hoặc kép, xoắn lò xo.Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp).[4] `Hình 5: Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn - Đặc điểm sinh lý:Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5.[11] - Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.[11] 7 1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6) Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm Nhân giống quy mô thí nghiệm Nhân giống trong thiết bị nhân giống Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm được đóng gói Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 8 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 Mục đích Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[14] 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20 - 30 % so với những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[10] 1.4.3 Đột biến cải tạo giống Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp cân hữu tính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần. Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:[12] - Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitroro (HNO 2), hydroxylamin, dimethylsulphat… - Tác nhân vật lý: + Ánh sáng UV, tia X, tia hay electron. + Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thước nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. 9 + Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ. + Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục hoạt (photoreactivation) : Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được phục hồi. - Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu. 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.[15] Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).[13] Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[13] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong các điều kiện tối thích để sản xuất ra các sản phẩm TĐC nhờ chính các VSV hoặc các thành phần tế bào của chúng. [10] Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết 10 thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng.[16] Hình 7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn 1.5.2 Các phương pháp lên men - Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[5] - Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.[5] Có 4 kiểu lên men chìm như sau: + Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm. Trong lên men sinh tổng hợp kháng sinh hay sử dụng phương pháp này.[10] 11 + Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men. + Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và bổ sung thêm MT mới vào bình. + Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định. 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men - pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp.[13] - Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt.[13] Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn. 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men đôi khi thấp. Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế 12 sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn dược điển. Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết định tới giá thành của sản phẩm.[10] 1.6.2 Các phương pháp chiết tách - Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc (hoặc bông), bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suất trên và dưới lớp lọc.[15] - Ly tâm: là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau, thường là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.[15] - Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan trong dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ không đồng tan.[15] - Các phương pháp sắc ký: + Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số R f.[1] + Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.[1] 1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ [9] (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS. [1] 13 1.7.2 Phổ hồng ngoại Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[2] 1.7.3. Khối phổ (MS) Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. [1] Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất. 1.8 Một số nghiên cứu liên quan 1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus [18] Gendanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư… với nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCI. Đặc tính kháng ung thư của gendanamycin do ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung thư. Các nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng gendanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phương pháp điều trị đồng thời như xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong giai đoạn 2 giám sát lâm sàng. Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-epoxy-8-demethyl 14 gendanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Gendanamycin và 4,5-epoxy-8-demethylgendanamycin là những kháng sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh tổng hợp từ Streptomyces sp. 1.8.2 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces sp.[19] Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase gồm tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ Streptomyces sp. USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp tetrapetalone A. HLO (Human lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là những enzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh ra một loạt các chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin. Nghiên cứu được tiến hành trên lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean Lipoxygenase) Streptomyces sp. USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải bằng MeOH và aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan: ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4). Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giải là MeOH, tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2 lit môi trường. Tetrapetalone A có IC50 là 190 (µM) 15 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH Dược Hà Nội cung cấp: Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633 Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định + Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (Bảng 1) Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn MT MT1 Thành phần Tinh bột 2 Glucose Bột đậu tương Cao thịt Pepton KNO3 0,1 CaCO3 (NH4)2SO4 K2HPO4 0,05 MgSO4.7H2O 0,05 NaCl 0,05 Cao nấm men Thạch 1,8 Nước máy (ml) 100 pH Chú thích: - Đơn vị tính theo gram. MT5 MT6 2,4 1 2 1,5 0,3 0,3 0,4 0,2 2 100 6,8-7,2 0,1 0,5 2 100 - Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút. - Các môi trường lên men dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch. 16 + Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (Bảng 2): Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần (%) NaCl Cao thịt Pepton Thạch pH 0,5 0,5 0,3 0,3 0,5 0,5 0 1,8 7,0-7,4 Môi trường MT canh thang MT thạch thường Dung môi Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng Dung môi Aceton Acetonitril n-Butanol Butylacetat Cloroform Diclorometan Ethanol Ethylacetat NH4OH 25% Methanol Triethylamin Khối lượng riêng (g/ml) 0,79 0,782-0,783 0,81 0,880-0,885 1,470-1,480 1,32 0,789-0,791 0,889-0,901 0,880 0,791-0,793 0,726-0,728 Nhiệt độ sôi (°C) 56 80-82 116-118 117-118 60-62 40 78,3 70,4 64,5 90 Vật liệu chạy sắc ký - Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck. - Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 4 ở trên. - Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm. 2.1.2 Máy móc thiết bị - Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V. - Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf - Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc 17 - Tủ lạnh Samsung - Tủ cấy vô trùng Aura VF 48 - Tủ sấy SL shellab - Lò vi sóng Whirlpool - Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030 - Cân kỹ thuật Sartorius TE 210 - Cân phân tích Sartorius BP 121 S - Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt - Máy cất quay Buchi Waterbath B480 - Kính hiển vi điện tử - Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm - Hộp Petri đường kính 9cm - Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác… 2.2 Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất. - Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn. 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh. - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất. - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất. - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất 18 - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ 2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được - Xác định nhiệt độ nóng chảy - Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS. 2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn - Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C. - Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền. 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán - Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. - Tiến hành: + Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml. + Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa. + Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau: • Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50 oC, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định. (Xem hình P5 ở phụ lục) • Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định. (Xem hình P3) 19 • Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng. (Xem hình P4) + Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định. + Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức: n D= ∑D i =1 i n n s= ∑ ( D − D) i =1 2 i n −1 Trong đó: D (mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3) 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên - Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10 -1 (định ước). Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6 bằng nước cất vô trùng. - Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. - Phép chọn lọc tự nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. 2.3.4 Phương pháp đột biến Bằng ánh sáng UV 20 Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10 -1(định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10 -6 bằng nước cất vô trùng. Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10 -6, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng. Đột biến bằng ánh sáng UV: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10 -1 đổ ra đĩa Petri vô trùng. Chiếu ánh sáng UV (λ=254 nm) vào đĩa Petri có hỗn dịch bào tử nồng độ 10-1 đặt cách nguồn sáng 60 cm, trong thời gian 5 phút. Lấy ra để vào chỗ tối 2 giờ, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5. Phân tán bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử sau đột biến ở các nồng độ 10 -4, 10-5, nhỏ vào hộp Petri có MTth, dàn đều bằng que chang vô trùng rồi cho vào tủ ấm. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức: % độ sống sót = Nm x 10-6+k x 100% N0 Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến. N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng. 10-k : Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng. Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến, cấy ra hộp Petri. Làm song song cả mẫu chứng. Sau 6 ngày để trong tủ ấm, thử hoạt tính kháng sinh. Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức: % biến đổi hoạt tính = Di x 100% D0 Di : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB. D0 : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng. Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Bằng tác nhân hoá học acid nitrơ (HNO2) Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2 Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào 21 tử có độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10 -6 bằng nước cất vô trùng. Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10 -6, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng. Đột biến bằng acid nitroro: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10 -1 cho thêm 0,07g NaNO2. Điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong 2-3 phút. Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N , rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5. Phân tán bào tử sau đột biến, chọn lọc ngẫu nhiên, tính toán kết quả các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV. 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh - Nguyên tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng. - Tiến hành + Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 173.113 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h. + Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên nhiều MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. + Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dd được lên men trên môi trường tối ưu cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất. 22 2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc - Mục đích: Xác định mức độ ảnh hưởng của các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh. Từ đó có những chú ý trong quá trình làm thực nghiệm, bảo quản, xử lý và tinh chế kháng sinh. - Tiến hành: + Thử độ bền pH: Dịch lọc được cho vào 5 ống nghiệm (làm 3 dãy song song), mỗi ống khoảng 7ml. Điều chỉnh pH trong các ống lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản trong tủ lạnh. Sau 1 ngày và 5 ngày, chỉnh pH mỗi ống về pH trung tính, thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Theo dõi sự thay đổi HTKS. 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ - Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho dịch lọc. - Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần. + Dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch HCl 1M và NaOH 1M. + Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi khác nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ V dung môi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ trong 1 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc. + Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy lọc. 2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng - Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định kháng sinh đã tinh khiết hay chưa. - Tiến hành: + Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút. + Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi. + Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C. 23 + Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy. + Xác định vết theo các phương pháp sau: • Soi đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng sắc ký vào đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ hiện màu. • Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh. (Xem hình P2 ở phụ lục). • Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết. Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin. + Tính hệ số Rf (Retardation factor) Rf = Trong đó: a b a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết họat chất b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi. 2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không. Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không. Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ vào bình sạch, cô đến khô. Cạo, thu lấy bột kháng sinh thô. 2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột - Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ, để 30 phút cho bão hòa. - Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột. 24 - Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột, ổn định cột trong 30 phút. - Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml. - Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn chính là các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi không còn vết có R f tương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh. - Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào đĩa Petri sạch, cô chân không ở 50°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết. 2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, khối phổ để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được. Chương 3: KÊT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể Kết quả: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên được giới thiệu ở bảng 4: Bảng 4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Dạng chủng 01 02 03 04 05 Hoạt tính kháng sinh B. subtilis P. mirabilis s s D (mm) D (mm) 23,86 0,25 23,87 0,30 24,79 0,49 23,21 0,21 25,13 0,26 25,52 0,05 23,94 0,78 22,93 0,70 23,63 0,92 23,64 0,54 Dạng chủng 18 19 20 21 22 Hoạt tính kháng sinh B. subtilis P. mirabilis s s D (mm) D (mm) 22,43 0,79 21,23 0,39 22,68 1,54 22,97 0,53 22,92 1,13 21,43 0,51 23,73 0,32 22,73 0,67 22,57 0,25 21,37 0,54 25 06 23,43 0,83 23,14 0,76 23 23,37 0,66 23,26 0,29 07 23,37 0,70 23,98 0,33 24 22,37 1,37 21,23 0,93 08 23,40 0,39 24,38 1,02 25 23,80 1,72 21,55 0,21 09 24,68 0,16 24,71 0,19 26 22,93 1,23 23,40 0,18 10 24,51 0,52 24,25 0,55 27 21,00 1,26 22,20 0,72 11 24,31 1,12 23,79 0,53 28 22,13 0,97 21,97 0,58 12 22,07 1,26 22,14 0,76 29 22,67 1,18 21,30 0,38 13 21,12 0,63 21,45 0,29 30 23,07 0,33 22,98 0,48 14 22,98 0,41 23,09 0,23 31 22,31 0,61 21,17 0,16 15 23,40 1,27 24,11 0,57 32 21,92 0,69 22,17 0,22 16 22,92 0,51 23,63 0,47 33 21,77 0,97 22,30 0,69 17 22,13 0,82 23,65 1,74 34 21,88 0,28 22,73 1,01 Nhận xét: Chọn 3 dạng chủng số 03, 09, 10 (SLNN.3, SLNN.9, SLNN.10) cho hoạt tính KS cao nhất đem nhân giống, bảo quản và sử dụng cho các nghiên cứu về sau.Dạng chủng số 3 có HTKS cao nhất đem đột biến lần 1 bằng ánh sáng UV. 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 Đem đột biến chủng SLNN.3 bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian 5 phút. Đánh giá HTKS 32 biến chủng sau đột biến bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 5. Bảng 5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 Ký hiệu dạng biến chủng ĐB1.01 ĐB1.02 ĐB1.03 ĐB1.04 ĐB1.05 ĐB1.07 ĐB1.09 ĐB1.12 ĐB1.15 ĐB1.16 ĐB1.18 Hoạt tính kháng sinh B. subtilis D (mm) 27,50 24,38 26,99 25,89 26,86 25,15 26,01 25,29 26,23 25,82 26,09 s 0,47 0,47 0,53 0,19 0,20 0,84 0,25 0,77 1,02 0,39 0,27 % hoạt tính so với MC 109,50 97,92 107,61 103,53 107,12 100,78 103,97 105,01 104,79 103,27 104,27 D (mm) 26,73 25,88 27,00 24,57 27,00 24,95 23,83 25,79 24,19 25,67 24,98 P. mirabilis % hoạt tính s so với MC 0,12 105,94 0,39 102,80 0,24 106,96 0,28 97,97 0,58 106,96 0,91 99,37 0,27 95,24 0,60 102,47 0,98 96,57 0,22 102,03 0,40 99,48 26 ĐB1.21 ĐB1.23 ĐB1.24 ĐB1.25 ĐB1.28 ĐB1.29 ĐB1.31 ĐB1.32 MC 26,09 25,18 26,83 25,18 26,91 25,59 26,87 26,56 24,94 0,09 1,25 0,91 1,29 0,52 0,70 0,13 0,54 0,04 104,27 100,89 107,02 100,89 103,60 102,41 107,16 106,01 100,00 25,37 24,69 24,87 25,99 24,89 24,74 24,22 25,49 25,12 0,13 0,60 0,48 0,54 0,34 0,70 0,11 0,98 0,20 100,92 98,41 99,08 103,21 99,15 102,29 96,68 101,36 100,00 Nhận xét: Sau đột biến lần 1 tỷ lệ sống sót là: 0,79%. Chọn 3 biến chủng có HTKS mạnh số 01, 03, 05 (ĐB1.1, ĐB1.3, ĐB1.5) để nhân giống, lưu giữ và sử dụng cho các nghiên cứu về sau. 3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 Đem chủng ĐB1.1 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút. Thử HTKS của 32 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được thể hiện trong bảng 6. Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 Ký hiệu dạng biến chủng Hoạt tính kháng sinh B. subtilis ĐB2.01 (mm) 27,10 0,91 % hoạt tính so với MC 107,58 ĐB2.03 ĐB2.04 ĐB2.05 ĐB2.07 ĐB2.08 ĐB2.09 ĐB2.11 ĐB2.14 ĐB2.15 ĐB2.17 27,15 27,63 27,14 27,85 28,69 24,62 27,52 26,71 27,97 28,19 0,58 1,24 0,66 0,36 0,86 0,88 1,11 1,15 1,35 0,33 107,78 109,69 107,74 110,56 118,89 97,74 109,25 106,03 111,04 117,91 D s D (mm) 24,11 24,45 24,83 24,58 24,13 26,07 23,51 24,01 24,03 24,85 26,55 P. mirabilis % hoạt tính s so với MC 0,77 104,29 1,11 0,48 0,42 0,82 0,85 0,15 0,43 0,56 1,44 0,41 104,13 104,95 103,75 106,39 110,91 94,61 103,82 103,91 105,05 113,22 27 ĐB2.20 ĐB2.23 ĐB2.25 ĐB2.26 ĐB2.27 ĐB2.30 ĐB2.31 ĐB2.32 MC 27,78 25,52 25,79 25,47 24,88 25,05 24,78 24,27 25,19 0,49 0,92 0,27 0,51 0,52 1,05 0,39 1,99 1,33 108,28 101,31 102,38 101,11 98,77 94,44 98,37 96,35 100 26,06 25,80 25,64 25,07 24,82 24,87 24,74 23,88 23,80 0,39 0,32 1,29 0,53 0,69 0,53 1,32 0,57 0,39 110,36 109,62 108,85 106,11 104,90 104,95 104,52 100,38 100 Nhận xét: Tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là 0,89%. Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 08, 17, 20 (ĐB2.8, ĐB2.17, ĐB2.20) để nhân giống, lưu giữ cho các nghiên cứu về sau. 3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 Đem chủng ĐB2.17 đột biến bằng tác nhân hóa học HNO 2. Thử HTKS của 32 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được thể hiện trong bảng 7. Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 Ký hiệu dạng biến chủng ĐB3.01 ĐB3.03 ĐB3.04 ĐB3.05 ĐB3.07 ĐB3.08 ĐB3.09 ĐB3.11 ĐB3.14 ĐB3.17 ĐB3.20 Hoạt tính kháng sinh B. subtilis D (mm) 28,11 28,04 27,36 27,75 29,29 26,56 24,79 27,47 30,61 26,37 25,88 s 0,31 1,41 0,80 0,64 0,49 0,21 0,33 0,58 0,34 0,45 0,18 P. mirabilis % hoạt tính so với MC 104,10 103,83 101,31 102,76 108,47 98,35 91,80 101,70 113,35 97,63 95,83 D (mm) 26,03 26,15 26,44 26,63 25,91 24,49 22,52 26,48 28,10 24,77 23,95 s 0,41 0,77 0,90 0,90 0,68 0,31 0,62 0,33 0,19 0,55 0,67 % hoạt tính so với MC 102,38 102,87 104,04 104,80 101,89 96,08 88,01 104,20 110,83 97,20 93,84 28 ĐB3.23 ĐB3.25 ĐB3.26 ĐB3.27 ĐB3.30 ĐB3.31 ĐB3.32 MC 28,72 30,31 28,49 26,27 28,78 29,63 28,09 27,01 0,59 0,75 0,60 0,49 0,88 0,56 0,49 0,53 106,34 112,24 105,50 97,28 106,57 109,70 104,00 100,00 26,45 27,05 25,97 24,58 26,96 27,63 25,25 25,45 0,89 0,12 0,18 0,26 0,21 0,31 0,38 0,35 104,09 106,52 102,13 96,43 106,17 108,92 99,16 100,00 Nhận xét: Tỷ lệ sống sót là 0,08%. Tỷ lệ sống sót khi đột biến bằng tác nhân hoá học nhỏ hơn rất nhiều so với đột biến bằng ánh sáng UV (0,08% so với 0,89%). Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 14, 25, 31 (ĐB3.14, ĐB3.25, ĐB3.31) để nhân giống, lưu giữ cho các nghiên cứu về sau. 3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh Từ kết quả chọn MT nuôi cấy bề mặt, đã chọn được 3 MT tốt nhất là MT1, MT5 và MT6. Thực hiện lên men chìm Streptomyces 173.113 trên 3 MTdt tương ứng là MT1dt, MT5dt và MT6dt. Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối. Thử HTKS theo phương pháp giếng thạch. Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 8. Bảng 8: Kết quả chọn môi trường lên men P. mirabilis Môi trường (mm) S. aureus s (mm) s MT1 dt 23,64 0,88 21,35 0,41 MT5 dt 21,35 0,11 18,60 0,77 MT6 dt 22,55 1,00 19,59 0,57 Nhận xét: Kết quả lên men Streptomyces 173.113 trên MT1dt có HTKS mạnh nhất nên lựa chọn MT1 làm môi trường lên men cho những thí nghiệm tiếp theo. 29 3.6 Kết quả chọn chủng lên men Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, lần 3 đã chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 173.113. Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT1dt. Dịch lên men được lọc qua giấy lọc để loại sinh khối rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 9. Bảng 9: Kết quả chọn chủng lên men Hoạt tính kháng sinh Dạng chủng, biến chủng P. mirabilis S. aureus D (mm) s D (mm) s SLNN.03 21,92 0,30 23,10 0,11 SLNN.10 21,30 0,28 23,74 0,47 ĐB1.01 23,40 0,31 24,74 0,47 ĐB1.03 23,01 0,84 24,39 0,44 ĐB2.08 26,43 0,40 27,39 0,48 ĐB2.17 26,71 0,48 27,56 0,45 ĐB3.14 28,29 0,27 29,77 0,41 ĐB3.25 27,27 0,80 29,07 0,92 ĐB3.31 27,08 0,38 27,67 0,69 Nhận xét: Biến chủng ĐB3.14 khả năng sinh tổng hợp KS tốt nhất, chọn làm chủng lên men chìm lấy dịch cho những nghiên cứu sau. 30 3.7 Kết quả thử độ bền pH Dịch lọc được thử độ bền pH (ở các pH 3, 5, 7, 9, 11). Kết quả được thể hiện ở bảng 10. Bảng10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày P. mirabilis HTKS sau 1 ngày HTKS sau 5 ngày s s D (mm) D (mm) 20,35 0,51 20,26 0,42 20,07 0,81 20,31 0,32 20,65 0,22 20,62 0,22 20,15 0,62 19,97 0,43 19,29 0,65 16,72 0,60 Mẫu thử pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11 Nhận xét: Chủng Streptomyces 173.113 khá bền với pH từ acid đến trung tính, không bền với pH base. Do đó bảo quản dịch lọc ở pH acid hoặc trung tính. 3.8 Kết quả chọn dung môi và pH chiết Thực hiện chiết dịch lọc với 4 dung môi: ethylacetat, n-butanol, butylacetat, dichloromethan ở 5 pH 3, 5, 7, 9. Thử HTKS của pha nước và pha dung môi bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 11. Bảng 11: Kết quả chiết kháng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khác nhau Ethylacetat pH 3 5 Pha D Dung môi Nước Dung môi (mm) 20,80 0,00 21,23 s 0,47 0,00 0,55 n-Butanol D (mm) 18,00 0,00 18,47 s 0,35 0,00 0,02 Butylacetat D (mm) 14,78 10,29 16,28 s 0,58 0,83 0,10 Dichloromethan D (mm) 7,79 9,00 17,48 s 0,32 1,50 1,03 31 Nước Dung môi Nước Dung môi Nước 7 9 0,00 20,83 0,00 17,25 0,00 0,00 0,55 0,00 0,67 0,00 0,00 18,78 0,00 17,23 0,00 0,00 0,49 0,00 0,22 0,00 000 15,35 8,35 14,85 8,70 0,00 0,88 0,30 0,80 1,53 9,62 17,89 9,81 18,53 10,10 0,68 0,68 0,99 0,44 0,68 Nhận xét: Dung môi ethylacetal và n-butanol đều chiết kiệt kháng sinh trong dịch lọc ở các pH khác nhau, nhưng lựa chọn ethylacetat bởi vì khi chiết bằng nbutanol tạo rất nhiều nhũ tương. Hơn nữa, ethylacetat là dung môi không độc, dễ kiếm. HTKS khi chiết ở pH 5 có giá trị cao nhất.Vậy chọn dung môi ethylacetat để chiết và chiết ở pH 5 (có khác so với nghiên cứu trước là Ethylacetat ở pH 7). 3.9 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử dụng là P. mirabilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng 12. Bảng 12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký Dung môi Thành phần Tỷ lệ 1 2 3 4 Chloroform: methanol: amoniac 25% Butanol: ethanol: dimethylformamid Butylacetat: aceton: triethylamin Ethylacetat: propanol: aceton nitril 2: 2: 1 3: 1: 1 1: 2: 1 2: 3: 1 Rf Vết 1 0,34 0,40 Vết 2 0,43 0,53 Nhận xét: Kết quả chỉ có hệ 3, 4 cho tách thành vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt hơn vì vết hiện hình VSV có dạng hình tròn, không có đuôi kéo dài trong khi với hệ 4 gần như giọt nước ngược, có đuôi kéo dài. 3.10 Kết quả sắc ký cột Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 6 lít, đem chiết bằng ethylacetat ở pH 5 thu được 750 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang 32 cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, thu được 0,6141g bột kháng sinh thô mang chạy sắc ký cột. Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết. Chạy sắc ký lần 1: Cân 0,1094 g bột KS thô để chạy cột với hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P. mirabilis). Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 13. Bảng 13: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) s 1 10,53 0,27 12 10,92 0,76 2 16,13 0,18 13 9,09 0,45 3 23,35 0,48 14 7,06 0,39 4 23,89 0,45 15 7,11 0,17 5 23,53 0,64 16 6 16,81 0,66 17 0,00 0,00 0,00 0,00 7 15,93 0,22 18 0,00 0,00 8 15,64 0,33 19 0,00 0,00 9 13,04 0,18 20 0,00 0,00 10 12,31 0,19 21 0,00 0,00 11 10,35 0,20 22 đến 30 0,00 0,00 Nhận xét: Có ít nhất 4 chất có HTKS trong bột kháng sinh thô thu được: một chất màu nâu bị giữ lại trên cột, một chất màu vàng chảy rất chậm và có thể thấy phân đoạn kháng sinh chính là các phân đoạn từ 3 đến 5. Tiến hành SKLM với các phân đoạn đó, hệ dung môi chạy là Ethylacetat : Dichloromethan (6 : 1). Kết quả được thể hiện ở bảng 14. 33 Bảng 14: Kết quả SKLM các phân đoạn 1 - 4 (hiện hình bằng P. mirabilis) Các phân đoạn Rf quan sát bằng mắt thường Vết 1 Vết 2 3 0,30 0,23 4 5 0,30 0,30 0,21 0,21 Nhận xét: Phân đoạn chính là phân đoạn từ 3 đến 5, song vẫn còn 2 chất chưa tách được trong 3 phân đoạn này. Đem cô, thu được 0,0720 g bột KS màu vàng cam. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 1 là H1 = 65,82% Chạy sắc ký lần 2 Cân 0,0720g kháng sinh sau tinh chế lần 1, chạy cột với hệ dung môi Buthylacetat : Aceton : Triethylamin (2:2:0,5). - Bước 1: Đưa silicagel lên cột bằng hệ dung môi đã chuẩn bị. Bước 2: Rửa cột bằng 15 – 20 ml n-hexan. Bước 3: Chạy cột như bình thường. Kết quả: Thu được 10 phân đoạn trong đó có 6 phân đoạn có hoạt tính kháng sinh. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày trong bảng 15: Bảng 15:Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Các phân đoạn P. mirabilis D (mm) s 3 20,36 0,74 4 21,50 0,30 5 22,16 0,49 6 22,00 0,25 7 21,34 0,69 8 21,00 0,73 34 Nhận xét: Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, hệ dung môi chạy là hệ dung môi Ethylacetat : Dicloromethan (6 : 1).Kết quả được thể hiện ở bảng 16. Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn 1 - 4 (hiện hình bằng P. mirabilis) Các phân đoạn Rf quan sát bằng mắt thường Vết 1 Vết 2 3 4 5 6 0,32 0,31 0,32 0,31 0,21 0,22 0,21 0,20 7 8 0,30 0,31 0,22 0,21 Nhận xét: Phân đoạn chính là phân đoạn từ 3 đến 8, song vẫn còn 2 chất chưa tách được trong 6 phân đoạn này. Đem cô, thu được 0,0601 g bột KS màu vàng cam. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 2 là H2 = 83,49% Chạy sắc ký lần 3 Cân 0,0601g kháng sinh sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol (6 : 1) thu được 14 phân đoạn. Thử hoạt tính KS các phân đoạn, kết quả được trình bày trong bảng 17: Bảng 17:Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 35 Các phân đoạn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Kết quả: P. mirabilis D (mm) s 19,35 0,86 21,39 0,43 21,65 0,79 20,16 0,64 18,48 0,39 17,30 0,16 15,79 0,49 15,48 0,58 13,50 0,16 12,49 0,37 13,20 0,25 12,38 0,46 12,59 0,17 12,04 0,56 Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1 - 4 bằng hệ dung môi Ethylacetat : Dichloromethan (6 : 1). Hiện hình VSV bằng P. mirabilis kết quả như sau (bảng 18): Bảng 18:Kết quả SKLM các phân đoạn 1 - 4 (hiện hình bằng P. mirabilis) Các phân đoạn 1 2 3 4 Rf Vết 1 0,31 0,30 0,31 0,32 Vết 2 0,21 Nhận xét: Từ kết quả bảng 18, 19 nhận thấy phân đoạn 1 - 3 là phân đoạn chính. Đem cô, kết tinh lại thu được 0,0259 g bột tinh thể KS màu vàng cam. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 3 là H 3 = 43,16% và của tổng quá trình tinh chế là H = 23,67%. Kháng sinh tinh khiết này dùng để đo phổ IR, UV, nhiệt độ nóng chảy và khối phổ. 3.11 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh: 219,7ºC. 36 Phổ tử ngoại: cho các đỉnh hấp thụ ở: 206 nm, 272 nm và 443 nm. Từ đó, dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc điểm trên. Phổ hồng ngoại: cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 19. Bảng 19: Biện giải các nhóm chức của phổ IR [20] λ (nm) 2924 2860 1730 1676 Nhóm chức đặc trưng -OH carboxyl =CH aldehyd -C=O este >C=N- imin λ (nm) 1580 1271 448 729; 584 Nhóm chức đặc trưng >NH vòng >C=N amin C-Br C-Cl Phổ khối lượng phân tử : dự đoán phân tử lượng là 1326,51 dvC KÊT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 1. Kết luận Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau: Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi ethylacetat ở pH 5 cho hiệu quả tốt nhất. Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần bằng tác nhân hoá học thì hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 173.113 tăng lên đáng kể. Kháng sinh do Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau: Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn Gram(-) Bền với pH acid và trung tính, không bền với pH base Có ít nhất 4 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được 37 Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 23,67% Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 219,7ºC, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố; các nhóm chức có trong kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid. 2. Kiến nghị Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau: Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces 173.113. Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 173.113 (bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang…) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh. Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu. Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn. Tiến hành cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa, … để xác định chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2. 2. Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến và ứng dụng trong định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật. 3. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr. PL129-PL131. 4. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr. 22-87 5. Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ 6. 7. 8. 9. thuật. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr. 25-57. Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 39-67. Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập 2. Võ Thị Bạch Huệ (2008) , Hóa phân tích, NXB y học, tập 2, tr. 58-122, tr. 205-225. 10. Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 2. 11. Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 7-37. 12. Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp. 13. Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 35-57. 14. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr. 40-52. 15. Trịnh Thị Thịnh (2009), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 80.259, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2004-2009, Trường đại học Dược Hà Nội. 16. Cao Văn Thu (1998), Bài giảng về kháng sinh và vitamin. 17. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập 2. Tiếng Anh: 18. Greg O.Buchanan, Rika Regentin, Misty Piagentini, Andreas Rascher, Robert McDaniel, Jorge L.Galazzo, and Peter J.Licori (2005), “ Production of 8-Demethylgeldanamycin and 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin from a Recombinat Strain of Streptomyces hygroscopicus”,J. Nat. Prod, No. 68, P. 607-610. 19. Toshikazu Komoda, Madoka Kishi, Naoki Abe, Yasumase Sugiyama, and Akira Hirota (2004), “Novel Lipoxygenase Inhibitors, Tetrapetalone B, C, and D from Streptomyces sp.”, Biosi. Biotechnol. Biochem, No. 68 20. Donald L. Pavia, Gary M. Lampman, George S. Kriz (1996), Introduction to Spectroscopy, Thomson Learning, Washington, USA 21. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1945/flemingbio.html PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra Kháng sinh Nguồn gốc Phổ tác dụng Actinomycin S. antibioticus Ung thư Acid clavulanic S. clavuligerus Vi khuẩn G(+) Adriamycin S. peuceticus Ung thư Amphotericin S. nodosus Nấm Bleomycin S. verticillus Ung thư Candicidin S. griseus Nấm Cloramphenicol S. venezuelae Vi khuẩn G(+) Daunomycin S. peuceticus Ung thư Erythromycin S. erythreus Vi khuẩn G(+) Kanamycin S. kanamyceticus Vi khuẩn G(-) Kasugamycin s. kasugaenis Vi khuẩn G(+) và G(-) và nấm Lincomycin S. lincolnensis Vi khuẩn G(+) Nystatin S. noursei Nấm Oxytetracyclin S. rimosus Vi khuẩn G(+) và G(-) Pymaricin s. natalnensis Nấm Spiramycin S. ambofaciens Vi khuẩn G(+) Streptomycin S. griseus Vi khuẩn Mycobacterium Tetracyclin S. aureofaciens Vi khuẩn G(+) và G(-) Vancomycin S. orientalis Vi khuẩn G(+) G(+) và Hình 1 : Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Hình 2: Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi khuẩn Hình 3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn Hình Thử bằng P1: HTKS phương pháp khối thạch Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hình P3: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV Hình P4: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn 3 lần 1 Hình P5: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được Hình P7: Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được [...]... Kết quả lên men Streptomyces 173. 113 trên MT1dt có HTKS mạnh nhất nên lựa chọn MT1 làm môi trường lên men cho những thí nghiệm tiếp theo 29 3.6 Kết quả chọn chủng lên men Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, lần 3 đã chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 173. 113 Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT1dt Dịch lên men được... các nghiên cứu về sau 3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh Từ kết quả chọn MT nuôi cấy bề mặt, đã chọn được 3 MT tốt nhất là MT1, MT5 và MT6 Thực hiện lên men chìm Streptomyces 173. 113 trên 3 MTdt tương ứng là MT1dt, MT5dt và MT6dt Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối Thử HTKS theo phương pháp giếng thạch Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 8 Bảng 8: Kết quả chọn môi trường lên men. .. môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[13] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong các điều kiện tối thích để sản xuất ra các sản phẩm TĐC nhờ chính các VSV hoặc các thành phần tế bào của chúng [10] Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn Cụ... nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[5] - Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.[5] Có 4 kiểu lên men chìm như sau: + Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định... Trong lên men sinh tổng hợp kháng sinh hay sử dụng phương pháp này.[10] 11 + Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men + Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và... Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h + Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dd được lên men trên môi trường tối ưu cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất 22 2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc - Mục đích: Xác... tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men đôi khi thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế 12 sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn dược điển Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết... nghiệm Nhân giống quy mô thí nghiệm Nhân giống trong thiết bị nhân giống Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm được đóng gói Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 8 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 Mục... lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất 18 - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu... môi trường Tetrapetalone A có IC50 là 190 (µM) 15 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173. 113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH Dược Hà Nội cung cấp: Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633 Vi