TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH-KTNN ===£0lGũlGa=== KHƯƠNG THỊ BÍCH ■ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA ƯU TÚ (NSC46 - NSC68) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR KHÓA LUÂN TỐT NGHIÊP ĐAI HOC •••• Chuyên ngành: Dỉ truyền phân tử Ngưòi hướng dẫn khoa học TS. KHUẤT HỮU TRUNG HÀ NỘI – 2015 ■ Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu thực hướng dẫn TS. Khuất Hữu Trung, viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. Nội dung nghiên cứu, trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, không chép từ tài liệu nào, toàn công trình nghiên cứu cá nhân qua trình tìm tòi, học tập nghiên cứu khoa học. Tôi xin chịu trách nhiệm đề tài nghiên cứu mình. LỜI CAM ĐOAN Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Khương Thị Bích Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn, cảm kích sâu sắc đến TS. Khuất Hữu Trung dành nhiều thòi gian, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thả nh tới đội ngũ cán Bộ môn Kỹ thuật di truyền viện Di truyền Nông nghiệp nhiệt tình bảo, hướng dẫn kỹ thuật, cung cấp cho thông tin tài liệu bổ ích giúp hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tói quý thầy giáo, cô giáo khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình giảng dạy, tâm huyết, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho suốt năm học qua. Lời cuối, xin bày tỏ lòng biết ơn tói người thân gia đình bên cạnh tôi, giúp đỡ, động viên tôi; cảm ơn người bạn giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn! LỜI CẢM ƠN Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Khương Thị Bích DANH MUC CÂC CHCTVIÉT TÂT AFLP: Amplified fragment length polymorphism CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat FAO: The World FoodOrganization IRRI: International Research Ricelnstitute PCR: Polymerase chain reaction PIC: Polymorphic Information Content QTL: Quantitative trait loci RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid SSR: Simple sequence repeats TAE: Tris-acetat-acid EDTA TE: Tris EDTA DANH MỤC BẢNG BIẺU& HÌNH ẢNH Danh mục bảng Bảng 1.1: Sản lượng gạo xuất dự trữ gạo số nước giới. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài Lúa gạo lương thực lâu đời có tầm quan trọng đặc biệt đối vói nửa dân số giói. Lúa gạo trồng nhiều nơi ừên giới, có diện tích gieo trồng đứng thứ hai sau lúa mì. Tổng sản lượng lúa đứng thứ ba sau lúa mì ngô. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm 1/10 diện tích đất trồng thế giới phân bố chủ yếu khu vực Châu Á (chiếm 13 nước tổng số 15 nước trồng lúa với diện tích triệu ha). Ở Việt Nam, vói vị trí địa lí điều kiện khí hậu thuận lọi nước ta nước có truyền thống lúa nước cổ xưa giới. Dân số nước ta có 80 triệu người 100% người Việt sử dụng lúa gạo làm lương thực chính. Nông nghiệp trồng lúa nước vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa sở kinh tế sống đất nước. Vì vậy, lúa có vai trò vô quan trọng kinh tế quốc dân. Với lịch sử lâu đời trồng lúa, nước ta có nguồn gen lúa tự nhiên YÔ phong phú đa dạng từ loài lúa trồng lúa hoang dại (Trần Thị Hòa, Triest, 1999)[3]. Để khai thác sử dụng cách có hiệu nguồn gen này, chọn giống càn phải có hiểu biết thiết yếu mức độ đa dạng di truyền giống. Sự phát triển thành tựu đạt sinh học phân tử cung cấp công cụ thích họp cho nghiên cứu đa dạng di truyền, cho phép ta xác định khoảng cách di truyền cách nhanh chóng xác. Trong số thị thị SSR đánh giá có nhiều ưu điểm so với thị khác, đơn giản ữong phân tích di truyền, có khả cho đa hình cao, có chất đồng trội, có độ xác cao, di truyền theo quy luật Menden. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa có ý nghĩa to lớn việc đánh giá, phân loại sử dụng nguồn gen chọn tạo giống lúa. Do vậy, xuất phát từ hiểu biết đa dạng di truyền, để khai thác nguồn gen quý phục vụ cho chọn giống tiến hành thực nghiệm đề tài nghiên cứu: “Đánh giá đa dạng dì truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC46 - NSC68) thị phân tửSSR”. 2. Mục đích nghiền cứu Nghiên cứu đa dạng di truyền giống lúa nghiên cứu,xác định alen đặc trưng, alen để nhận dạng xác nguồn gen ưu tú phục vụ cho nghiên cứu chọn lai tạo giống định hướng phát triển giống lúa suất cao, chất lượng tốt. Đánh giá đa dạng di truyền kết họp với phân tích di truyền giống lúa chức gen, đặc tính sinh lý, sinh hóa, trao đổi chất .nhằm mục đích bảo tồn, trì nguồn gen quý, phục vụ cho chọn tạo giống ưu tú có suất cao, chất lượng tốt, có khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường, sẵn sàng đối phó với biến đổi điều kiện khí hậu. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú NSC46 NSC68 thị phân tử SSR. - Thu mẫu lúa NSC - Xử lí mẫu, tách chiết DNA - Phản ứng PCR - Điện di sản phẩm PCR 4. Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ỷ nghĩa khoa học Cung cấp thêm nhiều liệu, thông tin khoa học hữu ích cho công tác nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền giống lúa ưu tú. Hiểu biết đa dạng di truyền nguồn gen lúa tạo sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm di truyền giống lúa việc chọn tạo giống mới. Phân tích đa dạng di truyền có ý nghĩa quan trọng việc xác định alen hiếm, alen đặc trưng để nhận dạng xác nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa mức phân tử. 4.2. Ỷ nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua thị phân tử góp phần nâng cao hiệu công tác bảo tồn chọn tạo giống lúa có phẩm chất tốt, suất cao, phù hợp với điều kiện khí hậu, môi trường sống cấu sản xuất lúa vùng Việt Nam. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại lúa Nguồn gốc lúa Cây lúa trồng có lịch sử lâu đời giói, năm loại lương thực giói, với ngô (Zea maysL.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz) khoai tây ị Solanum tuberosum L.). Người ta cho lúa trồng cổ, có vai trò quan trọng đòi sống lịch sử phát triển hàng ngàn triệu người giới. Căn vào tài liệu khảo cổ Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam . lúa có mặt từ 3.000-2.000 năm TCN. Ở Trung Quốc, vùng Triết Giang xuất lúa 5.000 năm, hạ lưu sông Dương Tử 4.000 năm. Tuy nhiên thực tế nhiều ý kiến cụ thể khác nguồn gốc xuất xứ lúa, xét phương diện sinh thái, sinh học lúa nghề trồng lúa có từ lâu đòi gắn liền với lịch sử phát triển loài người, Châu Á. nguồn gốc thực vật, giới có hai loài lúa trồng xác định tò thời cổ đại ngày nay. Thứ lúa trồng Châu Á (Oryza sativa), nguồn gốc xuất phát nơi đề tài tranh luận nhà khoa học giới ngày sáng tỏ với khai quật khảo cổ học có tính đột phá phương pháp phân tích đại dựa sở phân tích phóng xạ. Thứ hai loài lúa trồng Châu Phi(Oryza glaberrỉma), xác định có nguồn gốc thung lũng thượng nguồn sông Niger (nay thuộc Mali). Trước có giả thuyết xuất xứ đàu tiên giống trồng Châu Á, là: nguồn gốc Trung Quốc, nguồn gốc Ấn Độ, nguồn gốc Đông Nam Á giả thuyết đa trung tâm phát sinh. Tuy nhiên, giả thuyết phần lớn bị bác bỏ. Chang (1985)[11], chuyên gia di truyền lúa IRRI, xem xét lại tất tài liệu kiện từ khoa học, khảo cổ, sinh học tiến hóa, hệ thống sinh học lịch sử nông nghiệp để đưa kết luậnrằng lúa ữồng Châu Á bắt nguồn từ nhiều địa điểm cách độc lập đồng bộ, nơi có nhiều loài lúa dại lúa ữồng sống môi trường. Mặc dù có nhiều tranh luận nguồn gốc ban đàu loài lúa trồng Châu Á, bước dựa vào tư liệu truyền thuyết hay tư liệu khảo cổ niên đại xuất lúa hay hạt lúa nước nôi xuất phát nghề trồng lúa. Những nguồn gốc truyền thuyết dần bị loại bỏ khám phá khoa học giới khẳng định lại nguồn gốc xuất phát lúa dựa vào công nghệ phân tích phóng xạ sinh học phân tử xác định DNA. Nếu cho lúa ữồng Châu Á xuất phát từ nguồn gốc Trung Quốc nơi xuất phát lúa trồng Châu Á. Trong năm 2011, nỗ lực kết hợp Đại học Stanford (Mỹ), Đại học New York (Mỹ), Đại học Washington (Mỹ) Đại học Purdue (Mỹ) cung cấp chứng để kết luận lúa Châu Á có nguồn gốc thung lũng sông Dương Tử Trung Quốc. Nhưng tùy thuộc vào đồng hồ phân tử sử dụng nhà khoa học, thời gian xuất lúa trồng Châu Á cách từ 8.200 năm đến 13.500 năm. Điều phù hợp với liệu khảo cổ học tiếng đề tài này. Nguồn gốc lúa trồng 'Việt Nam. Ở Việt Nam, lúa phong phú diện rải rác khắp vùng miền nước. Lúa dại đa niên o. rufipogon lúa dại hàng niên o. Nivara loài nguyên thủy, tổ tiên giống lúa trồng ngày Indica Japonica, diện lâu đòi nước ta. Đó yếu tố quan ữọng xác định lúa có nguồn gốc Việt Nam. Giáo sư Phạm Hoàng Hộ tin tưởng miền Bắc Việt Nam trung tâm nguồn gốc lúa trồng giới (2000) (theo Trần Văn Đạt 2005)[1]. 1.1.2. Phân loại lúa Lúa Châu Phi (oryza glaberima) phân loại thực vật, Lúa nhiệt đới: oryza sativa var ỉndỉca Giới (kìngdom/regnum): Lúa ôn đới: oryza sativa var japonica Ngành (phyla): Lúa rẫy : oryza sativa var javanica Lớp (class): Bộ ịordo): Đối với lúa trồng có nhiều cách phân loại khác Họ (familia): : Chi (genus): - Theo điều kiện sinh thái, Kato (1930) chia lúa Loài (species): trồng thành nhóm lớn Japonica (lúa cánh) Indỉca (lúa tiên). Đinh Dĩnh (1958) cho Phân loài/thứ (subspecies): lúa cánh bắt nguồn từ Trung Quốc nên lúa thuộc: gọi Suno-Japonica. Gout lại chia lúa làm Thực vật (Plantae) loài phụ : Indica,Japonica Brevis. - Theo thời gian sinh trưởng, Roxburg chia Thực vật có giống lúa ữồng Ấn Độ thành nhóm hoa chín sớm chín muộn mà không quan tâm (Angiosperm hình thái. Watt, vào vụ trồng Ấn ae) Thực vật Độ chia thành lúa thu lúa đông. mầm - Theo mùa vụ gieo cấy năm thời gian ịMonocots) sinh trưởng, người Trung Quốc chia lúa ưồng Hòa thành lúa sớm lúa muộn lúa xuân thảo (Poales) Hòa lúa mùa. thảo - Theo điều kiện tưới gieo cấy, chia lúa trồng (Poaceae) thành nhóm lúa nước lúa cạn. Lúa (Oryza) Lúa Châu (oryza sativa) - Dựa vào cấu tạo hạt, Komik Atefeld chia Á lúa Indonesia thành lúa tẻ lúa nếp. trồng Việt Nam hạn OPB12, OPB13, OPC4, OPC6, OPC19, 0PC20) chế. Tuy nhiên, chạy PCR với DNA genome 15 dòng lúa thu năm gần nhà khoa 341 băng đa hình. Trong dòng Japonica học tập trung nghiên cứu thể khác rõ dòng quan tâm nhiều đến vấn Indicacòn lại. Do hệ số tương đồng thấp đề đánh giá đa dạng tài mức độ 0,03. Các dòng Indỉca có hệ số có hệ số nguyên lúa để phục vụ cho tương đồng di truyền 0,35. Dựa vào kết việc chọn lai tạo thí nghiệm ừên thiết lập giống có suất chất cặp lai cho ưu lai cao phục vụ cho công tác lượng cao khả chọn tạo giống[6]. chống chịu tốt. Theo tác giả Lưu Ngọc Trình (2007), Kết nghiên cứu đa dạng tổng số 6.083 giống lúa bảo quản Ngân di truyền 101 giống lúa hàng gen trồng Quốc gia, Trung tâm Tài địa phương locus nguyên thực vật tiến hành đánh giá đầy đủ 60 thuộc enzim. Kết cho tính trạng hình thái nông học 1.819 giống, thấy, số giống thu đánh giá 40 - 50 tính ừạng 1.385 giống từ từ huyện Nho Quan - Ninh 20 - 30 tính trạng 2.066 giống[8]. Bình huyện Đà Bắc - Năm 2010, tác giả Khuất Hữu Trung Hòa Bình có 44 giống Nguyễn Thị Phương Đoài sử dụng thị (chiếm 43,6%) thuộc lúa SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn Indỉca 57 giống (56,4%) nguồn gen lúa Tám đặc sản địa Việt thuộc lúa Japonica (Trần Nam. Kết nghiên cứu cho thấy tập đoàn Danh Sửu cộng sự, lúa Tám nghiên cứu đa dạng: phân tích 36 2004) [5]. cặp mồi SSR 26 giống lúa Tám thu Năm 2004, Nguyễn tổng số 938 băng ADN thuộc 88 loại alen khác Đức Thành cộng (trung bình 2,44 alen/cặp mồi). Hệ số PIC sử dụng mồi RAPD dao động từ đến 0,65 (trung bình 0,27). Các (OPB8, OPB9, OPB11, giống lúa Tám nghiên cứu có độ di truyền cao, tỉ lệ dị hợp tử trung 1, 808. Trong số 96 alen thu được, xuất bình tập đoàn 0,86. alen (trung bình 0,27 alen Hệ số tương đồng di truyền locut) cặp mồi khác nhau: cặp mồi RM241 giống tập xác định alen nhân dạng đoàn nghiên cứu dao động giống Ka tiêu, Plẩu tâu đằng dạng Nếp cẩm khoảng 0,14-1,00. Ở đen; cặp mồi RM229 xác định alen mức tương đồng di truyền nhận dạng giống Nếp lùn Kháu căm pị; 40%, tập đoàn 26 giống lúa cặp mồi RM13, RM172 RM318, xác định Tám thơm chia thành alen locut nhận dạng nhóm lớn. Trong đó, hai giống Lia tón, Tan lanh Nếp cẩm tương giống Tám Nghĩa Hồng ứng. Các kết thu hữu ích ữong việc Tám có kiểu gen giống xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo 36 locus nghiên tồn, khai thác sử dụng có hiệu nguồn cứu. Kết nghiên cứu gen lúa nếp, lúa nương Việt Nam (Khuất có ý nghĩa phục vụ công tác Hữu Trung cộng sự., 2010)[9]. nghiên cứu lai, chọn tạo Năm 2011, Trần Danh Sửu cộng giống lúa chất lượng (Khuất sử dụng 50 thị SSR sử dụng nghiên cứu Hữu Trung Nguyễn Thị đa dạng di truyền 45 giống lúa nếp tỉnh Phương Đoài, 2010). đồng miền Bắc Việt Nam. Kết phân Tiếp đó, Khuất Hữu tích cho thấy 45 thị cho băng DNA đa Trung cộng hình 46 locut. Trong đó, 18 locut SSR cho sử dụng 29 cặp mồi SSR để nhận dạng đặc trưng với 28 alen 16 nghiên cứu đa dạng di giống số 45 giống lúa nếp nghiên cứu. Hệ truyền tập đoàn 27 nguồn số tương đồng di truyền giống lúa nếp gen lúa nếp, lúa nương dao động từ 0,10 đến 0,98. Thấp (0,10) địa Việt Nam. Kết thu giống Nếp bà lão (6195) giống Nếp hạt 96 loại alen, hệ số PIC chanh (7055) cao (0,98) giống dao động từ đến Nếp sấp (6236) vàNếp quắn (7060). Trong số 45 giống lúa nếp nghiên thành nhóm chính, số lượng lớn cứu, 43 giống thuộc loài dòng/giống thuộc hai nhóm có hai giống đối phụ Japonỉca giống chứng chịu hạn CH5 LC93-l.Kết (Nếp nõn tre Nếp hạt bước đàu cho thấy dòng/giống có khả chanh) thuộc loài phụ chịu hạn tương tự hai giống đối chứng thông Indica dựa DNA lục qua biểu cấp độ phân tử DNA. Thông tin lạp[6]. thị SSR đa hình dòng/giống Năm 2012, Vũ Thị có giá trị chọn giống lúa chịu hạn nhờ Thu Hiền Phạm Văn thị phân tử[2]. Cường phân tích đa dạng Tràn Thị Lương cộng (2013). di truyền 64 dòng/giống Nghiên cứu quan hệ di truyền giống lúa đặc lúa canh tác điều sản, chất lượng Việt Nam vấn đề kiện nhờ nước trời thông quantrọng ưong việc quản lý, bảo tồn nguồn gen, qua có mặt mức độ đa xác định giống trồng mới. Trong nghiên cứu hình thị phân tử này, 60 giống lúa chọn lựa để nghiên SSR. Bằng việc sử dụng 34 cứu với 40 thị SSR. thị phân tử SSR, có Tổng cộng có 180 alen phát thị không cho xuất bỏi33 thị cho đa hình với trung bình 5,45 vạch tất alen/locut. Trong số 33 locus đa hình, tìm thấy dòng/giống; thị xuất 61 alen hiếmvà 14 alen đặc trưng 11 locus. Kết yạch đơn hình; 24 cho thấy, alen đặc trưng nhận thị lại xuất đa hình dạng đặc điểm phân tử, DNA 12 giống lúa với tổng số 90 alen chiếm tỷ nghiên cứu. Hệ số đa hình di truyền (PIC) dao lệ trung bình 3,75 alen động từ 0,06 đến 0,83 vói giá ưị trang bình locus. Kết phân 0,6. Hệ số tương đồng di truyền 60 giống lúa tích đa dạng di truyền với nghiên cứu dao động từ 0,056 đến 0,77; hai hệ số tương đồng 0,65 giống có hệ số tương đồng di truyền thấp phân chia nguồn vật liệu Jamin 85 (DS28) LC93-1; hai giống có hệ số tương đồng di truyền cao Vật liệu nghiên cứu 23 dòng/giống lúa ưu Q5ĐB (DS42) tú chọn tạo nhập nội Công ty Giống KDĐB (DS43). Các số liệu trồng Trung Ương cung cấp (Bảng 2.1). thu nghiên cứu Bảng 2.1. Danh sách 23 mẫu giống lúa ưu tú nàycung cấp thông TT Tên mồi nghiên cứu Trình tự mồi NST Kích thước RM592 F:AATTACTGTAGGTCCATCCA R:AGATAGTATAGCGTAGCAGC 11 (bp) 100-180 R:AGGTGAAGGTGCATTGTGT F: G GGCGGCGTCATATCCAACA RM6506 R:CATCTATCCTCCTCGGGCAA F: GTCCTTC AGGTGATTCGCC RM13 F: R: TCC A AC ATGGC A RM1942 AGAGAGAG R: GTCGCTCGAAGCCAATTAAG F: RM21 F:ACAGTATTCCGTAGGCACGG TATGTGGTTGGCTTGCCTAGT RM2856 R: F: CTTC A AGACTGGCCC AAT RM190 F: CTTTGTCTATCTCAAGCAC ATTACTG R: RM463 R: CTGACTGAAGCCTTCTTCACT F: rrCCCCTCCTTTTATGGTGC RM208 Tên F: R:TGTTCTCCTCAGTCACTGCG Kí hiệu RM515 TCTGCAAGCCTTGTCTGATG mẫu F: TAGGACGACC RM212 F: ccmẫu ACTTTC AGCTACTACC AAAGGGTGAG NSC58 S58 RM527 AG R: CACCC F: GGCTCGATCTAGA RM224 NSC59 F:ATCGATCGATCTTCACGAGG S59 ATTTGTCTCTCATTATG AAATCCG RM1233 NSC60 R:TGCTATAAAAGGCATTCGGG S60 R:TTGCACAGGTTGCGATAGA F: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG RM585 NSC61 F: S61 R:ATTGGCTCCTGAAGAAGG RM7102 F:TTGAGAGCGTTTTTAGGATG CAGTCTTGCTCCGTTTGTTG NSC62 S62 RM372 R:TCGGTTTACTTGGTTACTCG R: F: CAC AC AC ATCGCTCGGTC NSC63 S63 RM261 R: GATGTGGAGGTCGATGGC F: RM630 NSC64 F: S64 CTACTTCTCCCCTTGTGTCG PTA248 F:AGACGCGGAAGGGTGGTTC NSC65 TCGACCTGGCTCTCCTCTAG S65 RM699 CCGGA CA S66ACGCGGCAGTA NSC66 F: R:AGACGCGGTAATCGAAAGA RM6320 AATTTGC R: NSC67 F: GAGCTGGACCTCCTCGAC S67 RM821 F:AGCCCAGTGATACAAAGATG AC R: NSC68 S68 MP1F:ATCGATCGATCTTCACGAGG R: RM313 F: GC AGGC AC AA A AGC A A MP2 R:TCGTATAAAAGGCATTCGGG AGAG 173 219 141 11 180-220 132-157 15 16 17 STT Tên mẫu Kí hiệu NSC46 mẫu S46 NSC47 S47 NSC48 S48 NSC49 S49 NSC50 S50 NSC51 S51 NSC52 S52 NSC53 S53 NSC54 S54 10 NSC55 S55 11 NSC56 S56 12 NSC57 S57 18 STT 19 13 20 148 1521 16 22 1710 18 23 1911 2024 12 21 25 2213 23 26 14 AROl 12 259 124 12 192 166-173 205-231 244 11 215-221 120-152 11 175 171-233 12 12 168 193 10 125 104 11 500-1000 154 164 177 150 178 Mẩu 5. Tiếp tục chiết lần hỗn hợp CHCI 3- dòng thu riêng rẽ IS0A (24:1). Thu dịch chiết chứa DNA. tách chiết DNA tổng số theo 6. Tủa DNA isopropanol làm lạnh. Để phương pháp CTAB -20°c giờ. Obara Kako (1998) có 7. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút 15 phút cải tiến. Chuẩn bị sẵn dung 4°c. dịch đệm chiết CTAB 8. Rửa tủa etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô hoà tan đệm TE. 60°c. 1. Nghiền 0,3 gam mẫu 9. Độ tính nồng độ DNA tổng số chày cối sứ vô kiểm tra cách điện di gel agarose trùng nitơ lỏng 1%. đến thành dạng bột 2.2.2. Phản ứng PCR đánh giá đa dạng dì mịn. truyền thị SSR 2. Hoà tan mẫu nghiền Tổng thể tích phản ứng PCR 15|xl bao nhỏ 800|il CTAB gồm: 1,5)0.1 đệm PCR10X; buffer 60|J,1 SDS l,2fxl MgCl2 25mM; 0,3ỊXỈ dNTPs lOmM; 0,2| 10%. il Taq DNA polymerase 5U/|il; 3. ủ mẫu 65°c bể ổn lịil mồi xuôi 10|iM; lịil mồi ngược 10|iM; lp.1 nhiệt, thòi gian 60 phút. DNA (30ngẠil); 3,8|il nước cất 4. Bổ sung hỗn hợp CHCl3- lần khử ion. IsoA (24:1) vói tỷ lệ 1:1 thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tói thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút ữong 10 phút nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía chuyển sang ống mới. 2.2.3. Chu ừình PCR Trộn hỗn hợp dung dịch Bảng 2.3: Chu kỳ nhiệt dùng xilanh bơm vào hai kính. cho phản ứng PCR sử dụng mồi SSR + Sau 30 phút gel polyme hoá hoàn toàn. Các bước Nhiệt độ(°C) Thời gian Số chu kỳ I 94 phút II 94 phút 35 Tm 45 giây 72 phút 72 phút III Giữ mẫu 4°c 2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR điện di polyacrulamide gel 6,0% phát tia cực tím phương pháp nhuộm ethidium bromide. + Gel bao gồm thành phần sau: 55,5ml TBE10X 3,5ml Dung dịch acrylamide 40% 10,5ml Dung dịch APS 10% 700|il Dung dịch TEMED 58,4|il Tông thê tích gel 70ml PCR với thang marker 20bp điều kiện 150V. Thời gian điện di khoảng 3-4 giờ. Lấy gel khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% 15 phút, rửa lại nước sạch. Soi chụp ảnh gel máy chụp ảnh gel DigiDoc-It. 2.2.5. polyacrylamide Nước cât khử ion Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm Phân tích kết xử lí số liệu Kết thống kê dựa vào xuất hay không xuất băng DNA (các alen). số liệu xử lý, phân tích chương trình Exel version 5.0 3.1. phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf FJ, 2000). Hệ (Polymorphic số Kết tách chiết DNA Tách chiết DNA công việc đóng vai trò quan ừọng công nghệ DNA. PIC Hiện có nhiều phương pháp tách chiết Information DNA tổng số mẫu thực vật. Mỗi đối tượng Content) tính theo DNA tách chiết có phương pháp khác công thức phù hợp với chúng. sau: Trong nghiên cứu này, lựa PIC =1 - ZPj2 (trong Pi tần số xuất alen chọn phương pháp CTAB Obara Kako thứ i). (1998) có bổ sung Natribisuníit PVP để tiến Tỷ lệ dị hợp (H) hành tách chiết DNA tổng số 23 mẫu lúa mẫu tính theo công nghiên cứu. Kết tách chiết DNA tổng số thức: H % = ——— 23 mẫu lúa kiểm ứa phương pháp Trong đó: X: điện di gel agarose 1%. Trong đó: z tổng 3.2. số mồi không xuất CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Kết sử dụng thị SSR phân tích đa dạng di truyền Để nghiên cứu đa dạng di truyền dòng/giống lúa ưu tú tiến hành sử dụng sản phẩm DNA tách locus SSR. Weir (1996) cho rằng, giá trị chiết làm khuôn cho PIC hiểu đa dạng di truyền phản ứng PCR với locus gen nghiên cứu. Kết phân tích tập 26 mồi nghiên cứu. Sản đoàn dòng/giống lúa ưu tú Công ty giống phẩm PCR mồi trồng Trung ương kí hiệu NSC46 đến điện di gel NSC68 bảng 3.1 cho thấy: Giá tri acrylamide (điện di đứng). 3.2.1. PIC 26 locus nghiên cứu thay đổi từ 0,08 (ở Hệ sổ PIC, số aỉen cặp mồi xuất alen RM190 tổng số băng DNA thể RM6308) đến 0,76 (ở cặp mồi xuất alen cặp mồi RM224). Hệ số PIC tiling bình 26 cặp mồi Theo Smith (1997), hệ số nghiên cứu 0,45. Kết tương tự số PIC (Polymorphic công trình nghiên cứu công bố Information Content) giới Việt Nam (Malik et al., 2010; Rajei al., coi thước đo tính đa dạng 2006; Khuất Hữu Trung cs., 2010)[9]. di truyền alen Qua kết thu Số mồi thể alen: mồi (RM585, RM3726, (bảng 3.1) thấy RM6997, PTA248, RM6320, MP1-MP2) với 26 cặp mồi SSR, tổng Số mồi thể alen: 13 mồi (AROl, RM13, số alen thống kê RM190, RM208, RM212, RM6308, RM3134, 26 cặp mồi SSR 74 loại RM6506, RM28561, RM463, RM527, RM7102, alen, trung bình 2,85 RM261. alen/cặp mồi. Các mồi 3.2.2. cho alen đa hình: Tỉ lệ khuyấ sổ liệu (M) tỉ lệ di họp tử (H) - Số mồi thể alen: giống lúa ưu tú Theo hướng dẫn AMBIONET- CIMMYT giá tị M% phải nhỏ mồi (RM224, RM8213) - Số mồi thể alen: 15% đảm bảo độ tin cậy cho mồi (AP5926, RM21, phép tiến hành bước xử lý số liệu tiếp theo. RM463, Trước đánh giá mức độ đa dạng di truyền 23 dòng lúa nghiên cứu, tiến RM19429, RM1223) hành tính tỷ lệ khuyết số liệu thí nghiệm dựa vào số mẫu giống không khuếch đại Bảng 3.1: Sổ alen thể hệ sổ PIC 26 cặp mồi STT Tên cặp Sô mồi RM5926 AROl alen ứiể PIC STT Tên cặp Sô alen ứiể PIC 0,72 16 mồi RM6506 0,45 16 RM19429 0,52 RM13 0,29 17 RM28561 0,49 RM21 0,71 18 RM463 0,29 RM190 0,08 19 RM515 0,58 RM208 0,39 20 RM527 0,29 RM212 0,48 21 RM1223 0,59 RM224 0,76 22 RM7102 0,34 RM585 0,42 23 RM261 0,38 10 RM3726 0,47 24 PTA248 0,47 11 RM6308 0,08 25 RM6320 0,58 12 RM6997 0,48 26 MP1-2 0,66 13 RM8213 0,67 Tổng số 74 11,8 14 RM3134 0,23 Trung bình 2,85 0,45 0,49 STT ГЛ А Tên dòng mồi. Kết Tỷ lệ dị hợp tử (H) tỷ lệ số liệu trình bày bảng 3.2: Bảng 3.2: Tỉ lệ khuyết sổ liệu (M%) tỉ lệ dị họp tử (H%) 23 giống lúa nghiên cứu khuyết (M) giống lúa ưu tú nghiên Sô môi khuyêt Tỉ lệ khuyêt Sô môi xuât Tỉ lệ di họp số liệu số liệu (M%) dị họp tử tử(H%) cứu dựa kết phân tích với 26 cặp mồi SSR trình bày (bảng 3.2) cho thấy: Có NSC46 NSC47 3,85 NSC48 NSC49 3,85 NSC50 NSC51 3,85 NSC52 NSC53 NSC54 11,5 10 NSC55 11 NSC56 12 NSC57 13 NSC58 14 NSC59 15 NSC60 7,69 16 NSC61 17 NSC62 18 NSC63 15,4 19 NSC64 3,85 20 NSC65 21 NSC66 22 NSC67 3,85 23 NSC68 7,69 hai giống (NSC49, NSC64 NSC67 có tỷ lệ dị hợp tử 3,85%. NSC51) khuyết Các giống lại có tỷ lệ dị hợp 0% tổng số 26 cặp mồi (đồng họp 26 locus nghiên cứu). Từ kết nghiên cứu với tỷ lệ nghiên cứu cho thấy: cần làm 3,85%. Các giống dòng/giống có tỉ lệ di hợp tử cao (NSC63, lại không bị khuyết số NSC60, NSC68, NSC49, NSC51, NSC54 liệu. Tỷ lệ khuyết số liệu NSC47, NSC64 NSC67) trước khai trung bình 23 giống thác, sử dụng lúa thấp 0,33; 3.2.3. giống có Kầ phân tích đa dạng dì truyền mối quan hệ di truyền 23 giống lúa ưu tú tỷ lệ khuyết số liệu lớn • Kết phân tích với mồi RM21 15%. Như vậy, Kết điện di sản phẩm PCR với 23 giống lúa ưu tú RM21 thu loại băng. Trên tổng số 23 có ý nghĩa phân tích mẫu nghiên cứu cho thấy xuất băng thống kê để đánh giá đa DNA từ khoảng 130bp đến 180bp, có mẫu dạng di truyền. giống nghiên cứu xuất alen có tổng Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao mẫu giống lúa NSC63 15,4%; tiếp đến mẫu giống lúa NSC54 có tỉ lệ dị hợp tử 11,5%; hai giống lúa NSC60 NSC68 có tỷ lệ dị hợp tử 7,69%; hai mẫu giống NSC49, NSC51 có tỷ lệ dị họp tử 4%; ba giống lúa NSC47, số 24 băng DNA. Mồi RM21 có mẫu giống dị hợp NSC54. 46 47 48 49 50 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 6Ộ 67 uu«^kể 200 -180 RM21 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM21 (M: marker 20bp) Kết phân tích với mồi RM224 Kết điện di sản phẩm PCR với RM224 thu loại băng. Trên tổng số 23 mẫu nghiên cứu cho thấy xuất băng DNA từ khoảng 125bp đến 165bp, có mẫu nghiên cứu xuất alen có tổng số 25 băng DNA. Mồi RM224 có mẫu giống có băng dị hợp NSC60 NSC63. 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 M «. i1 tui uw u Kết phân tích với mồi RM1233 Kết điện di sản phẩm PCR với RM1233 thu loại băng. Trên tổng số 23 mẫu giống lúa nghiên cứu cho thấy xuất băng DNA từ khoảng 160bp đến 200bp, mẫu giống nghiên cứu xuất alen thu tổng 23 băng DNA, xuất dị hợp tử khuyết số liệu. 46 47 48 49 50 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 6Ộ 67 RM 224 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu vói đoạn mồi RM224 (M: marker 20bp) • Kết phân tích với mồi RM515 Kết điện di sản phẩm PCR 23 mẫu giống nghiên cứu với cặp mồi RM515 thu tổng số 24 băng DNA thuộc loại băng có kích thước khác nhau. Các băng DNA dao động từ khoảng 200bp đến 250bp. Với locus RM515 mẫu giống NSC54 xuất alen (mẫu giống NSC54 có kiểu gen dị hợp locus này). 46 47 48 49* 50 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 M Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM515 (M: marker 20bp) 46 47 48 49 50 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 M 200 180 160 140 RM1233 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu vói đoạn mồi RM1233 (M: marker 20bp) • Kết phân tích mồi RM7102 Kết điện di sản phẩm PCR 23 mẫu giống nghiên cứu vói cặp mồi RM7102 thu tổng số 25 băng DNA thuộc loại băng có kích thước khác nhau. Các băng DNA dao động từ khoảng 180bp đến 200bp. Với locus RM7102 mẫu giống NSC51 NSC54 xuất alen (mẫu giống NSC51 NSC54 có kiểu gen dị hợp locus này). м ta* —* 'км#► < 200 IM# ^ * » *w-.^ ^ *• * •* * ,. __ I JJQ 160 w RM7102 w 100 Hình 3.6: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu vói đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp) Số liệu thu từ tiêu điện di sản phẩm PCR 26 cặp mồi SSR với 23 mẫu giống lúa nghiên cứu thống kê phân tích phàn mềm NTSYpc 2.1, từ thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền sơ đồ hình (hình 3.7) mối quan hệ di truyền giống lúa nghiên cứu. 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 46 1. 00. 20. 30. 60. 50. 50. 30. 50. 40. 40. 30. 20. 50. 30. 30. 30. 30. 40. 30. 50. 30. 10. 49 15 47 1. 00. 30 20. 30. 40. 20. 30. 30 20. 30 20. 20. 40. 20. 20. 40. 30. 30. 20. 30 20. 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 1. 00. 40. 50. 30. 30. 40. 30. 30. 40. 20. 30. 30. 30. 20. 20. 20. 30. 30. 20. 10. 1. 00. 30. 40. 50. 30. 30. 30. 40. 30. 30. 40. 30. 30. 30. 30 20 20. 1. 00. 50. 20. 50. 20. 20. 40. 20. 30. 30. 20. 30. 30. 20. 20. 20. 1. 00. 20. 60. 30. 20. 40. 20. 30. 20. 30. 30. 30. 30. 20. 10. 1. 00. 30. 20. 50. 30. 30. 40. 30. 30. 40. 30. 10 1. 00. 40. 20. 40. 30. 30. 30. 40. 40. 40. 20. 1. 00. 40. 40. 30. 30. 40. 40. 50. 30. 20. 1. 00. 40. 30. 50. 50 20. 1. 00. 50. 60. 50. 20. 1. 00. 10 1. 00. 1. 1. 00 0. 61 0. 56 0. 43 0. 56 0. 39 0. 51 0. 38 0. 39 0. 77 0. 43 0. 34 0. 39 0. 39 0. 39 0. 38 0. 47 0. 29 0. 23 0. 31 1. 00. 40. 40. 60. 30. 50. 40. 30. 40. 40. 40. 30. 40. 50. 40. 50. 30. 20. 1. 00 0. 26 0. 34 0. 26 0. 32 0. 35 0. 30 0. 38 0. 35 0. 35 0. 34 0. 35 0. 23 0. 31 0. 40 1. 00. 40 20. 30. 30. 30. 30. 30. 30. 30. 30 20. 10. 1. 00. 30. 30. 60. 40. 40. 50. 40. 10. 1. 00. 60. 40. 40. 40. 40. 40. 10. 1. 00. 40. 30. 30. 40. 30. 10. 1. 00. 50. 40. 20. 1. 00. 50. 10. [...]... truyền thống giống với 28 mồi và hệ số PIC có giá trị dao động từ 0,139-0,99 với Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân trung bình 0,589 cho mỗi tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa mồi[19] (được thu thập từ phòng di truyền học, Viện Theo Shahid Masood nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị Shah (2013), Sử dụng RAPD và chỉ thị SSR Sử dụng 20 mồi RAPD marker phân tử đánh giá đa thu được... các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả việc phát triển công tác người nông dân và người tiêu dùng Theo chọn giống[ 13] SinghBalwant (2011), nghiên cứu đa dạng di Tác giả Malik Ashiq truyền của 50 giống lúa thơm bằng chỉ thị SSR, (2010), đã tiến hành đánh hình thái, đánh dấu hóa lý Kết quả SSR marker giá đa dạng di truyền giữa phân tích cho thấy đa hình khác biệt giữa các các giống lúa truyền. .. chọn lọc giống, đa di truyền lúa trên thế giới và ở Việt dạng hóa về các vật liệu di Nam truyền và dùng ữong thiết 1.5.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lập bản đồ di truyền lúa trên thế giới Hạn chế của chỉ thị Tác giả Olufowote et «/.,(1997),đã nghiên này là cần nhiều bước tiến cứu biến động di truyền trong giống của 71 hành, cần thiết kế các cặp giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP... hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các alen dụng phân tích trên một hệ cao hơn chỉ thị AFLP Các tác giả cũng chỉ ra thống lớn bao gồm nhiều rằng chỉ cần chọn chính xác 4 chỉ thị SSR là có loài có quan hệ di truyền xa thể nghiên cứu các alen dị hợp tử ở lúa[ 15] nhau Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của Trong nghiên cứu 38 giống lúa thơm bản địa Basmati bằng chỉ thị này chúng tôi chọn chỉ thị. .. dòng /giống có khả năng chanh) thuộc loài phụ chịu hạn tương tự như hai giống đối chứng thông Indica dựa trên DNA lục qua biểu hiện ở cấp độ phân tử DNA Thông tin lạp[6] các chỉ thị SSR đa hình giữa các dòng /giống rất Năm 2012, Vũ Thị có giá trị trong chọn giống lúa chịu hạn nhờ chỉ Thu Hiền và Phạm Văn thị phân tử[ 2] Cường đã phân tích đa dạng Tràn Thị Lương và cộng sự (2013) di truyền của 64 dòng /giống. .. cứu quan hệ di truyền các giống lúa đặc lúa đang canh tác trong điều sản, chất lượng ở Việt Nam là vấn đề rất kiện nhờ nước trời thông quantrọng ưong việc quản lý, bảo tồn nguồn gen, qua sự có mặt và mức độ đa xác định giống cây trồng mới Trong nghiên cứu hình của các chỉ thị phân tử này, 60 giống lúa đã được chọn lựa để nghiên SSR Bằng việc sử dụng 34 cứu với 40 chỉ thị SSR chỉ thị phân tử SSR, có 8... phân Tiếp đó, Khuất Hữu tích cho thấy 45 chỉ thị cho các băng DNA đa Trung và cộng sự cũng đã hình tại 46 locut Trong đó, 18 locut SSR cho sử dụng 29 cặp mồi SSR để nhận dạng đặc trưng với 28 alen duy nhất của 16 nghiên cứu đa dạng di giống trong số 45 giống lúa nếp nghiên cứu Hệ truyền tập đoàn 27 nguồn số tương đồng di truyền giữa các giống lúa nếp gen lúa nếp, lúa nương bản dao động từ 0,10 đến 0,98... để đánh giá đa DNA từ khoảng 130bp đến 180bp, có mẫu dạng di truyền giống nghiên cứu xuất hiện 2 alen và có tổng Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở mẫu giống lúa NSC63 là 15,4%; tiếp đến là mẫu giống lúa NSC54 có tỉ lệ dị hợp tử là 11,5%; hai giống lúa NSC60 và NSC68 có tỷ lệ dị hợp tử là 7,69%; hai mẫu giống NSC49, NSC51 có tỷ lệ dị họp tử là 4%; ba giống lúa NSC47, số 24 băng DNA Mồi RM21 có 1 mẫu giống. .. của 23 mẫu lá lúa mẫu được tính theo công nghiên cứu Kết quả tách chiết DNA tổng số của thức: H % = ——— 23 mẫu lúa được kiểm ứa bằng phương pháp Trong đó: X: là điện di trên gel agarose 1% Trong đó: z là tổng 3.2 số mồi không xuất hiện CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Kết quả sử dụng chỉ thị SSR trong phân tích đa dạng di truyền Để nghiên cứu đa dạng di truyền của các dòng /giống lúa ưu tú chúng tôi tiến... trước khi khai trung bình của 23 giống thác, sử dụng lúa khá thấp là 0,33; 3.2.3 không có giống nào có Kầ quả phân tích đa dạng dì truyền và mối quan hệ di truyền của 23 giống lúa ưu tú tỷ lệ khuyết số liệu lớn • Kết quả phân tích với mồi RM21 hơn 15% Như vậy, cả Kết quả điện di sản phẩm PCR với 23 giống lúa ưu tú đều RM21 thu được 4 loại băng Trên tổng số 23 có ý nghĩa phân tích mẫu nghiên cứu cho thấy . SINH-KTNN ===£0lGũlGa=== KHƯƠNG THỊ BÍCH ■ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA ƯU TÚ (NSC46 - NSC68) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR KHÓA LUÂN TỐT NGHIÊP ĐAI HOC • • • • Chuyên ngành: Dỉ truyền phân tử Ngưòi hướng. cứu Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú NSC46 - NSC68 bằng chỉ thị phân tử SSR. - Thu mẫu lúa NSC - Xử lí mẫu, tách chiết DNA - Phản ứng PCR - Điện di sản phẩm PCR 4 giống lúa[ 18]. Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa (được thu thập từ phòng di truyền học, Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị