TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN NGỌC DIỆP PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÕNG NGÔ CÓ HÀM LƢỢNG PROTEIN CAO (QPM) BẰNG CHỈ THỊ SSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học ThS. NGUYỄN VĂN TRƢỜNG HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, nỗ lực phấn đấu thân, nhận đƣợc nhiều đƣợc quan tâm, giúp đỡ dìu dắt tận tình Thầy Cô giáo, cán phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Ngô. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Văn Trƣờng dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, giúp có thêm niềm đam mê với nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cản ơn thầy giáo, cô giáo, cán Bộ môn Sinh học, Khoa Sinh - KTNN - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập tốt nghiệp vừa qua. Tôi xin cảm ơn cán phòng Công nghệ sinh học thuộc Viện nghiên cứu Ngô tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện cho hoàn thành khoá luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ suốt trình học tập thực khóa luận này. Mặc dù có nhiều cố gắng để thực khóa luận cách hoàn chỉnh nhất. Song buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học nên không tránh khỏi thiếu sót mà thân chƣa thấy đƣợc. Tôi mong đƣợc góp ý quý Thầy, Cô giáo bạn để khóa luận đƣợc hoàn chỉnh hơn. Tôi xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Ngọc Diệp ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận hoàn toàn đƣợc thực nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn Ths. Nguyễn Văn Trƣờng, cán phòng Công nghệ sinh học Viện nghiên cứu Ngô Trung ƣơng. Các hình ảnh, số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, thu đƣợc trình nghiên cứu chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Ngọc Diệp iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU . CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC . 1.1. Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam . 1.1.1. Tình hình sản xuất ngô giới . 1.1.2. Tình hình sản xuất ngô Việt Nam 1.2. Tổng quan ngô chất lƣợng protein cao – QPM . 1.2.1. Khái niệm hiệu sử dụng ngô QPM 1.2.2. Tình hình nghiên cứu giống ngô QPM . 1.3. Chỉ thị phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền chọn tạo giống ngô 1.3.1. Các loại thị phân tử . 1.3.2. Ứng dụng thị phân tử phân tích di truyền chọn tạo giống ngô . 13 1.3.3. Ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống ngô QPM . 16 Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 2.1. Vật liệu . 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Tách DNA tổng số 20 2.3.2. Chạy phản ứng PCR 21 2.3.3. Điện di sản phẩm PCR 22 2.3.4. Đọc phân tích số liệu 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. Kết tách chiết DNA tổng số 25 3.2. Kết khảo sát thị SSR 30 dòng ngô QPM . 26 3.3. Kết đánh giá độ di truyền dòng ngô nghiên cứu 32 3.4. Kết phân tích đa dạng di truyền dòng ngô 34 3.5. Lựa chọn sơ đồ lai tạo dòng cho ƣu lai cao phục vụ công tác chọn tạo giống đồng ruộng 38 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 40 4.1. Kết luận 40 4.2. Đề nghị . 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 41 PHỤ LỤC 45 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Diện tích, suất, sản lƣợng ngô Việt Nam giai đoạn 2007 2013 . Bảng 2.1: Dang sách 30 dòng ngô QPM sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2: Danh sách 29 thị SSR sử dụng nghiên cứu . 18 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR . 21 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR . 22 Bảng 3.1. Kết tách chiết DNA 30 dòng ngô nghiên cứu . 25 Bảng 3.2: Hệ số PIC, số băng DNA, số allen xuất 29 mồi . 27 Bảng 3.3. Tỉ lệ khuyết số liệu (M%) 29 mồi SSR nghiên cứu . 31 Bảng 3.4. Tỉ lệ dị hợp tử (H%) tỉ lệ khuyết số liệu (M%) dòng ngô đánh giá dựa 29 thị SSR . 33 Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng (Jacard) 30 dòng ngô nghiên cứu dựa 29 thị SSR . 36 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1. Ảnh điện di kiểm DNA tổng số 30 dòng ngô gel agarose 0,8% . 26 Hình 3.2. Kết di sản phẩm PCR mồi umc1304 30 dòng ngô gel polyacrylamide 4,5% . 29 Hình 3.3. Kết điện di sản phẩm PCR mồi phi101049 30 dòng ngô gel polyacrylamide 4,5% . 29 Hình 3.4. Kết điện di sản phẩm PCR mồi phi029 30 dòng ngô gel polyacrylamide 4,5% . 30 Hình 3.5. Kết điện di sản phẩm PCR mồi phi109188 30 dòng ngô gel polyacrylamide 4,5% . 30 Hình 3.6. Sơ đồ phả hệ 30 dòng ngô nghiên cứu dựa 29 thị SSR phân tích phần mềm NTSYSpc 2.1 theo phƣơng pháp UPGMA 37 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp Baso pair cs cộng CTAB Cetyltrimethyl amoniumbromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleosid triphosphat PCR Polymerase chain reaction PIC Polymorphism Imformation Content QPM High Quality Protein Maize RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat UPGMA ƢTL Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages Ƣu lai vii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ở Việt Nam, ngô đƣợc coi trồng quan trọng thứ hai sau lúa màu quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác. Trong khoảng hai thập niên gần đây, áp dụng giống ngô lai vào canh tác nên sản xuất ngô nƣớc ta phát triển mạnh diện tích, suất sản lƣợng. Theo số liệu thống kê năm 2013 Tổng cục Thống kê [35] diện tích ngô nƣớc 1172,5 nghìn 101,37% so với năm 2012 (1156,6 nghìn ha), suất bình quân đạt 44,3 tạ/ha sản lƣợng ngô 5193,5 nghìn tấn, tăng 3,02% suất 4,42% sản lƣợng so với năm 2012. Công tác chọn tạo giống ngô lai nhà chọn tạo giống đóng góp phần lớn cho phát triển sản xuất ngô việc tạo giống ngô lai có khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất thuận sâu bệnh đặc biệt có suất cao, chất lƣợng tốt. Ngô chất lƣợng protein cao (QPM - High Quality Protein Maize) nhờ có ƣu điểm hàm lƣợng chất lƣợng protein cao nên chọn tạo giống ngô lai QPM đƣợc xác định xu hƣớng công tác chọn tạo giống ngô giới Việt Nam. Ngô QPM đƣợc sử dụng trực tiếp làm lƣơng thực cho ngƣời vùng có truyền thống ăn ngô, tăng giá trị dinh dƣỡng thức ăn gia súc. Trong chọn tạo giống ngô lai nói chung ngô QPM nói riêng việc phân tích đa dạng di truyền tập đoàn dòng thị sinh học phân tử (molecular markers) đƣợc coi phƣơng tiện quan trọng khắc phục vấn đề khó khăn công đoạn đánh giá dòng phƣơng pháp hình thái phƣơng pháp phả hệ truyền thống. Các nhà chọn tạo giống dựa thông tin đa dạng di truyền nhanh chóng xác định đƣợc mối quan hệ di truyền tập đoàn nguyên liệu, hỗ trợ đắc lực cho việc lai tạo giống đồng ruộng. Ứng dụng thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống ngô Viện Nghiên cứu Ngô năm gần không ngừng đƣợc khai thác phát triển giúp nhà tạo giống định hƣớng cho việc khai thác, sử dụng nguồn vật liệu. Trong số thị sinh học phân tử nhƣ RFLP, AFLP, RAPD, SSR… thị SSR (Simple Sequence Repeat) đƣợc coi thị có độ tin cậy cao, đánh giá xác đầy đủ thông tin phả hệ tập đoàn nghiên cứu. Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền số dòng ngô có hàm lƣợng protein cao (QPM) thị SSR”. 2. Mục tiêu đề tài Áp dụng thị SSR đánh giá mối quan hệ di truyền dòng ngô QPM, xác định xác dòng ngô QPM làm sở cho việc thiết kế sơ đồ lai tạo, giảm thiểu công việc công tác chọn tạo giống nhanh chóng chọn đƣợc giống ngô lai QPM có suất cao, chất lƣợng tốt phục vụ sản xuất. 3. Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Đánh giá đa dạng di truyền nguồn vật liệu ngô QPM, giúp cung cấp số liệu, thông tin khoa học tạo sở lý luận cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống ngô QPM. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết phân tích đề tài rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lƣợng công việc lai tạo đồng ruộng. Dựa sở đa dạng di truyền dòng ngô, nhà chọn tạo giống chọn dòng ƣu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống ngô có chất lƣợng protein cao. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 1.1. Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất ngô giới Trong ba loại ngũ cốc phổ biến ngô, lúa mì lúa nƣớc ngô (Zea mays L.) đứng đầu suất sản lƣợng, đứng thứ hai diện tích. Nhờ vai trò quan trọng kinh tế nên sản xuất ngô giới đƣợc quan tâm ngày phát triển. Ngô đƣợc trồng toàn giới vào khoảng 155,57 triệu hecta hàng năm với sản lƣợng 803,69 triệu tấn. Ngô chiếm vị trí quan trọng kinh tế giới thƣơng mại thực phẩm, thức ăn chăn nuôi công nghiệp. Hàng triệu ngƣời giới sử dụng ngô nhƣ thực phẩm chủ yếu quan trọng ngô có hàm lƣợng protein calo cao (Vasal, 1999) [30]. Mặc dù năm gần diện tích trồng ngô toàn cầu không tăng mạnh nhƣ cuối kỷ XX diện tích canh tác có giới hạn nhƣng sản lƣợng ngô giới liên tục tăng trƣởng. Nguyên nhân suất ngô ngày đƣợc cải thiện nhờ áp dụng giống ngô lai biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến vào sản xuất (Vũ Ngọc Quý, 2004) [11]. Năm 2001, diện tích trồng ngô toàn giới 140,2 triệu hecta với suất bình quân 4,3 tấn/ha đạt tổng sản lƣợng 600 triệu tấn, tỷ lệ diện tích trồng ngô chiếm 20% tổng diện tích trồng ngũ cốc (Ngô Hữu Tình, 2002) [13]. Mức tăng trƣởng bình quân hàng năm sản xuất ngô toàn giới giai đoạn 2000 - 2010 diện tích 1,8%, suất 2,1% sản lƣợng 4,3%. Đến năm 2012, diện tích gieo trồng ngô toàn giới 176,9 triệu hecta với suất trung bình 4,94 tấn/ha (giảm so với năm 2011 0,4 tấn/ha) sản lƣợng đạt 875 triệu (Vũ Ngọc Quý, 2014) [11]. 1.1.2. Tình hình sản xuất ngô Việt Nam Cùng với phát triển giới, việc phát triển sản xuất ngô Việt Bảng 3.3. Tỉ lệ khuyết số liệu (M%) 29 mồi SSR nghiên cứu STT Tên mồi Số dòng khuyết dòng (%) Tỷ lệ khuyết mồi (%) phi057 umc1066 phi299852 umc1399 phi062 phi083 phi093 phi96342 umc1136 10 phi084 11 umc1196 12 phi029 13 phi102228 14 phi053 15 phi227562 16 phi101049 10 17 phi213984 18 phi374118 10 19 phi423796 20 umc1279 21 umc1153 22 umc1109 23 phi308707 24 phi448880 25 phi087 31 26 phi109188 27 umc1304 28 phi233376 29 phi065 0,41 1,31 Trung bình 3.3. Kết đánh giá độ di truyền dòng ngô nghiên cứu Dòng nguyên liệu quan trọng để tạo tổ hợp lai có ƢTL cao nhƣ có tính trạng mong muốn khác. Nhƣng ngô giao phấn điển hình nên việc tạo dòng 100% khó. Theo hƣớng dẫn CIMMYT dòng phải có tỉ lệ đồng hợp tử 85% locus khảo sát nên đƣa vào thiết kế sơ đồ lai tạo, điều có nghĩa tỉ lệ dị hợp tử dòng không vƣợt qua 15%, dòng không đáp ứng tỉ lệ dị hợp tử vƣợt 15% đƣợc loại bƣớc phân tích phả hệ. Từ yêu cầu mà đánh giá độ mặt di truyền thông qua xuất băng DNA gel điện di theo locus. Tỉ lệ dị hợp tử đƣợc tính với dòng đƣợc trình bày bảng 3.3. Kết bảng 3.3 cho thấy dòng có tỷ lệ dị hợp tử thay đổi từ đến 13,3%. Giá trị trung bình tỉ lệ dị hợp tử 2,6% thể dòng ngô có độ cao locus khảo sát. Toàn 30 dòng ngô nghiên thỏa mãn yêu cầu độ di truyền cho việc phân tích đa dạng di truyền phục vụ công tác thiết kế sơ đồ lai tạo giống. Bên cạnh việc đánh giá độ di truyền, tiến hành đánh giá tỷ lệ khuyết số liệu (M%) dòng nghiên cứu. Theo hƣớng dẫn AMBIONET giá trị M% < 15% đảm bảo độ tin cậy cho phép tiến hành bƣớc xử lý số liệu tiếp theo. Từ kết bảng 3.3 cho thấy tỉ lệ mồi đƣợc khuếch đại dòng ngô cao. Có 10 dòng có mồi không đƣợc khuếch đại L1, L3, L10, L15, 32 L16, L20, L25, L26, L28, L30 tƣơng ứng với tỉ lệ khuyết số liệu 3,3% dòng L9 có có mồi không đƣợc khuếch đại cao với tỉ lệ khuyết số liệu dòng 10%. Tỷ lệ khuyết số liệu trung bình dòng 1,4%. Vậy thí nghiệm này, 30 dòng ngô đạt tỉ lệ khuyết số liệu nhỏ 15% , số liệu đảm bảo độ tin cậy. Bảng 3.4. Tỉ lệ dị hợp tử (H%) tỉ lệ khuyết số liệu (M%) dòng ngô đánh giá dựa 29 thị SSR STT Tên dòng Số mồi khuyết Tỷ lệ khuyết Số mồi xuất Tỷ lệ dị hợp (M%) dị hợp tử tử (H%) L1 3,3 0,0 L2 0,0 3,3 L3 3,3 3,4 L4 0,0 0,0 L5 0,0 3,3 L6 0,0 0,0 L7 0,0 0,0 L8 0,0 0,0 L9 10,0 3,7 10 L10 3,3 0,0 11 L11 0,0 3,3 12 L12 0,0 13,3 13 L13 0,0 0,0 14 L14 0,0 0,0 15 L15 3,3 0,0 16 L16 3,3 10,3 17 L17 0,0 0,0 18 L18 0,0 0,0 33 19 L19 0,0 0,0 20 L20 3,3 0,0 21 L21 0,0 0,0 22 L22 0,0 0,0 23 L23 0,0 6,7 24 L24 0,0 0,0 25 L25 3,3 0,0 26 L26 3,3 3,4 27 L27 0,0 0,0 28 L28 3,3 10,3 29 L29 0,0 6,7 30 L30 3,3 10,3 Tổng 13 Trung bình 0,43 23 1,43 0,77 2,60 3.4. Kết phân tích đa dạng di truyền dòng ngô Để phân tích mối quan hệ di truyền dòng với nhau, sử dụng phần mềm NTSYS để xử lý số liệu qua phân tích mối quan hệ di truyền dòng. Kết đƣợc trình bày bảng 3.5. Bảng hệ số tƣơng đồng di truyền (GS) dòng cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền lớn dòng L895 L891 (0,9). Hệ số tƣơng đồng di truyền nhỏ dòng L886 L821, dòng L878 L885 với hệ số 0,11. Hệ số tƣơng đồng di truyền cặp dòng khác dao động từ 0.12 đến 0.71. Nhìn chung hệ số tƣơng đồng di truyền (GS) dòng tƣơng đối nhỏ cho thấy dòng tƣơng đối khác biệt vật chất di truyền. Đây thuân lợi lớn chọn tạo giống ngô lai từ dòng ngô tự phối này, sở để có đƣợc những tổ hợp lai có khả nằng kết hợp cao hay nói cách khác có biểu ƣu lai cao. 34 Để nhận thấy rõ mối quan hệ di truyền dòng, từ kết độ tƣơng đồng di truyền dựa sở phân tích 29 mồi, sử dụng chƣơng trình NTSYS để phân nhóm theo UPGMA thu đƣợc sơ đồ phả hệ 30 dòng ngô nhƣ hình 3.6. 35 Bảng 3.5. Hệ số tương đồng (Jacard) 30 dòng ngô nghiên cứu dựa 29 thị SSR L769 L787 L791 L797 L804 L817 L821 L837 L839 L843 L845 L851 L855 L861 L863 L867 L872 L875 L878 L880 L882 L884 L885 L1521 L889 L891 L895 L918 L952 L769 1.00 L787 0.39 1.00 L791 0.22 0.38 1.00 L797 0.51 0.55 0.27 1.00 L804 0.43 0.43 0.35 0.44 1.00 L817 0.37 0.34 0.33 0.41 0.37 1.00 L821 0.19 0.28 0.24 0.32 0.26 0.35 1.00 L837 0.51 0.44 0.21 0.49 0.31 0.32 0.21 1.00 L839 0.42 0.42 0.24 0.33 0.32 0.26 0.20 0.36 1.00 L843 0.32 0.39 0.28 0.40 0.36 0.30 0.19 0.33 0.35 1.00 L845 0.46 0.54 0.35 0.59 0.67 0.40 0.34 0.40 0.38 0.43 1.00 L851 0.25 0.21 0.22 0.27 0.26 0.22 0.19 0.24 0.24 0.30 0.31 1.00 L855 0.33 0.31 0.36 0.41 0.34 0.35 0.26 0.32 0.36 0.40 0.40 0.27 1.00 L861 0.40 0.31 0.27 0.45 0.34 0.35 0.21 0.32 0.29 0.37 0.37 0.27 0.53 1.00 L863 0.29 0.24 0.31 0.30 0.27 0.27 0.19 0.27 0.21 0.32 0.36 0.30 0.30 0.37 1.00 L867 0.33 0.19 0.24 0.29 0.21 0.17 0.22 0.27 0.27 0.28 0.29 0.27 0.32 0.32 0.51 1.00 L872 0.17 0.26 0.27 0.23 0.26 0.21 0.16 0.21 0.33 0.22 0.26 0.35 0.38 0.29 0.24 0.32 1.00 L875 0.24 0.28 0.27 0.35 0.26 0.21 0.29 0.32 0.36 0.40 0.34 0.29 0.35 0.32 0.24 0.35 0.29 1.00 L878 0.27 0.18 0.21 0.16 0.18 0.14 0.21 0.21 0.26 0.19 0.23 0.19 0.32 0.23 0.24 0.32 0.09 0.26 1.00 L880 0.29 0.27 0.20 0.30 0.30 0.24 0.12 0.27 0.26 0.26 0.36 0.30 0.30 0.27 0.23 0.40 0.47 0.27 0.12 1.00 L882 0.33 0.28 0.24 0.32 0.34 0.29 0.09 0.23 0.33 0.27 0.34 0.29 0.35 0.35 0.22 0.38 0.57 0.26 0.09 0.60 1.00 L884 0.33 0.23 0.19 0.32 0.26 0.16 0.12 0.29 0.20 0.30 0.34 0.35 0.26 0.32 0.33 0.41 0.38 0.41 0.16 0.47 0.41 1.00 L885 0.29 0.20 0.26 0.30 0.33 0.28 0.11 0.20 0.20 0.21 0.30 0.31 0.33 0.40 0.35 0.42 0.54 0.25 0.11 0.49 0.71 0.50 1.00 L1521 0.40 0.26 0.33 0.29 0.18 0.21 0.16 0.29 0.33 0.37 0.26 0.22 0.32 0.29 0.37 0.38 0.21 0.26 0.23 0.19 0.21 0.29 0.20 1.00 L889 0.32 0.24 0.38 0.30 0.33 0.27 0.27 0.30 0.24 0.32 0.36 0.28 0.60 0.40 0.35 0.40 0.33 0.30 0.33 0.26 0.30 0.27 0.32 0.33 1.00 L891 0.41 0.26 0.30 0.39 0.35 0.24 0.19 0.30 0.24 0.45 0.35 0.27 0.36 0.39 0.58 0.58 0.19 0.36 0.27 0.25 0.33 0.36 0.34 0.43 0.49 1.00 L895 0.40 0.23 0.30 0.38 0.31 0.21 0.18 0.29 0.23 0.37 0.31 0.24 0.41 0.41 0.60 0.63 0.18 0.35 0.26 0.24 0.32 0.35 0.33 0.38 0.51 0.90 1.00 L918 0.33 0.28 0.46 0.37 0.40 0.28 0.16 0.26 0.23 0.36 0.43 0.31 0.34 0.34 0.24 0.27 0.28 0.26 0.20 0.21 0.28 0.26 0.30 0.31 0.40 0.39 0.34 1.00 L952 0.33 0.31 0.24 0.37 0.23 0.24 0.19 0.31 0.35 0.39 0.31 0.31 0.24 0.31 0.25 0.32 0.26 0.40 0.19 0.27 0.31 0.31 0.27 0.37 0.25 0.36 0.31 0.39 1.00 L2045 0.43 0.39 0.29 0.62 0.33 0.31 0.26 0.47 0.30 0.39 0.42 0.29 0.47 0.40 0.50 0.50 0.29 0.34 0.24 0.31 0.31 0.34 0.33 0.43 0.53 0.65 0.62 0.36 0.39 36 L2045 1.00 L1 L8 L2 L4 L5 L11 L9 L6 L10 L18 L29 L13 L25 L14 L15 L16 L26 L27 L30 L24 L3 L28 L12 L17 L21 L23 L20 L22 L7 L19 L10 0.21 0.38 0.56 0.73 I II III IV 0.90 Coefficient Hình 3.6. Sơ đồ phả hệ 30 dòng ngô nghiên cứu dựa 29 thị SSR phân tích phần mềm NTSYSpc 2.1 theo phương pháp UPGMA 37 Kết phân nhóm đa dạng di truyền theo phƣơng pháp UPGMA cho thấy, hệ số tƣơng đồng 0,28 tƣơng ứng với khoảng cách di truyền 0,72, dòng ngô QPM nghiên cứu đƣợc chia thành nhóm lớn nhƣ sau: Nhóm lớn I: Gồm 22 dòng L1, L8, L2, L4, L5, L11, L9, L6, L10, L18, L29, L13, L25, L14, L15, L16, L26, L27, L30, L24, L3, L28 Nhóm lớn II: Gồm dòng L12, L17, L21, L23, L20, L22 Nhóm lớn III: Chỉ gồm dòng L7 Nhóm lớn IV: Chỉ gồm dòng L19 Trong nhóm lớn I, hệ số tƣơng đồng 0,35 tƣơng ứng với khoảng cách di truyền 0,65, 22 dòng ngô QPM nghiên cứu đƣợc chia thành nhóm phụ là: +Nhóm phụ I.1: Gồm dòng L1, L8, L2, L4, L5, L11, L9, L6 +Nhóm phụ I.2: Gồm dòng L10, L18, L29 +Nhóm phụ I.3: Gồm dòng L13, L25, L14, L15, L16, L26, L27, L30, L24 +Nhóm phụ I.4: Gồm dòng L3, L28 Tƣơng tự, nhóm lớn II chia thành nhóm phụ nhƣ sau: Nhóm phụ II.1: Chỉ gồm dòng L12 Nhóm phụ II.2: Bao gồm dòng L17, L21, L23, L20, L22 Nhìn vào sơ đồ phả hệ kết phân nhóm ta thấy có hai dòng L26 L27 gần mặt di truyền với khoảng cách di truyền 0,1. Các dòng L7 L19 không nằm chung nhóm so với 28 dòng lại, chúng nằm riêng rẽ thành nhóm riêng. Nhƣ nói chúng có khác biệt mặt di truyền lớn so với 28 dòng kia. Vì vậy, ta lấy dòng dùng làm thử để lai với dòng lại. 3.5. Lựa chọn sơ đồ lai tạo dòng cho ƣu lai cao phục vụ công tác chọn tạo giống đồng ruộng Nhiều kết luận khoa học ƣu lai khẳng định ƣu lai chịu 38 chi phối mạnh mẽ khác biệt di truyền dạng bố mẹ. Vì thế, việc phân nhóm dòng dựa khoảng cách di truyền đƣợc xác định thị phân tử sở quan trọng vấn đề sử dụng, khai thác dòng nguyên liệu nhƣ định hƣớng công tác lai tạo. Xác suất thành công với tổ hợp có ƣu lai cao từ việc lai dòng khác nhóm cao so với việc lai dòng nhóm. Căn vào kết phân nhóm, kết phân tích đa hình di truyền nhƣ ta thiết kế sơ đồ lai có khả cho ƣu lai cao nhƣ sau: Các dòng thuộc nhóm I với dòng thuộc nhóm II. Dòng thuộc nhóm III với dòng thuộc nhóm I, II. Dòng thuộc nhóm IV với dòng thuộc nhóm I, II. Trong dòng thuộc nhóm lớn I nhóm lớn II, lai tạo dòng nhóm phụ với nhau. Không tiến hành lai tạo cặp dòng có hệ số khoảng cách di truyền thấp, tức gẫn gũi mặt di truyền, ví dụ nhƣ dòng L26 L27. 39 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ kết nghiên cứu, phân tích 30 dòng với 29 mồi SSR, có kết luận sau: - Đã tách chiết đƣợc DNA 30 dòng ngô QPM, sản phẩm DNA tách chiết đƣợc có nồng độ độ tinh đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành thí nghiệm. - Các dòng ngô QPM nghiên cứu đa dạng thành phần allen. Kết phân tích với 29 cặp mồi SSR thu đƣợc tổng số 110 loại allen, trung bình 3,79 allen/cặp mồi. Hệ số PIC trung bình 29 cặp mồi nghiên cứu 0,49, hệ số PIC đạt giá trị cao (0,76) cặp mồi phi101049 với allen thể hiện. Các dòng ngô nghiên cứu có độ di truyền khác cao, tỉ lệ dị hợp tử trung bình tập đoàn 2,6%. - Tập đoàn dòng ngô nghiên cứu đa dạng mặt di truyền. Hệ số tƣơng đồng di truyền dòng tập đoàn dao động từ 0,11 – 0,90. Ở khoảng cách di truyền 0,72, 30 dòng ngô QPM nghiên cứu đƣợc chia thành thành nhóm cách biệt di truyền khác nhau. 4.2. Đề nghị - Trên sở kết nghiên cứu thu đƣợc, tiến hành thiết kế sơ đồ lai dòng có khả cho ƣu lai cao. - Tiếp tục nghiên cứu, đánh giá thêm thị phân tử SSR khác nguồn vật liệu QPM để xây dựng sở liệu đầy đủ phục vụ công tác tạo dòng tạo giống ngô lai. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Văn Ba, (2013). Bƣớc đầu nghiêm cứu ảnh hƣởng mức độ phân bón đến sinh trƣởng suất số giống ngô nếp lai. Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 2. Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, (2014). Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 12 năm 2014 ngành nông nghiệp phát triển nông thôn. 3. Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, (1999). Những nguyên tắc chọn giống trồng (Giáo trình). Quyển 1: Phân tích GENOME. NXB Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. 4. Bùi Mạnh Cƣờng, (2007). Công nghệ sinh học chọn tạo giống ngô, Nhà xuất Nông nghiệp,138tr. 5. Nguyễn Thị Phƣơng Đoài, (2003). Sử dụng thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền dự đoán ƣu lai số dòng ngô. Luận văn Thạc sỹ khoa học, Trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội. 6. Phan Xuân Hào, Bùi Mạnh Cƣờng, Nguyễn Văn Trƣờng, Đoàn Thị Bích Thảo, (2004). Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn dòng ngô thị SSR. Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn. Số 1: 32-35. 7. Trần Trung Kiên, (2009). Nghiên cứu ảnh hƣởng liều lƣợng đạm, lân, kali đến sinh trƣởng, phát triển, suất chất lƣợng giống ngô chất lƣợng protein cao có triển vọng Thái Nguyên. Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 8. Châu Ngọc Lý, (2012). Nghiên cứu chọn tạo giống ngô có hàm lƣợng protein cao (QPM) hệ Việt Nam. Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 9. Châu Ngọc Lý cộng sự, (2008). Khảo sát tập đoàn dòng ngô có chất lƣợng proten cao (QPM) chọn tạo phái Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học Phát triển. Tập IV, Số 2: 110-115. 10. Đỗ Thị Lan Phƣơng, (2003). Nghiên cứu sử dụng ngô giàu đạm 41 HQ2000 chăn nuôi lƣợn thịt cao sản giai đoạn 2-5 tháng tuổi. Luận văn Thạc sĩ, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 11.Vũ Ngọc Quý, (2014). Nghiên cứu chọn tạo giống ngô lai trung ngày suất cao cho vùng Đông Nam Tây Nguyên. Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 12. Phạm Công Thiếu, Lê Quý Kha, Trần Hồng Uy cộng sự, (2003). Sử dụng ngô HQ2000 chăn nuôi lợn gia cầm. Tạp chí Nông nghiệp PTNT. 13. Ngô Hữu Tình, (2002), "2001-năm với chuyển biến chất nghiên cứu khoa học chuyển giao tiến kỹ thuật Viện Nghiên cứu Ngô. Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn. Số 4: 281-283. TIẾNG ANH 14. AMBIONET – Asian Maize Biotechnology Network, (2004). Laboratory handbook: Protocol for maize genotyping using SSR markers and data analysis. AMBIONET Service Laboratory, CIMMYT. 15. Babu R. and B.M. Prasanna, (2014). Molecular breeding for Quality Protein Maize. Springer Science + Business Media Dordrecht 2014: 489-505. 16. Bantte K., B.M.Prasanna, (2003). Simple sequence repeat polymorphism in Quality Protein Maize (QPM) lines. Euphytica, 129: 337–344. 17.Bucker E,S,, et at, (2001). Molercular diversity structure DNA dometication of grasses. Genet, Res., Camb.77: 213-218. 18. Clark, H.E., Glover D.V., Betz J.L., & Bailey L.B., (1977). Nitrogen retention of young men who consumed isonitrogenous diets containing normal, opaque-2, or sugary-2 opaque-2 corn. Journal of Nutrition. 107: 404. 19. Gill G., (2008). Quality protein maize and special purpose maize improvement. In: Recent advances in crop improvement. CAS training 42 at PAU from 05-25 Feb, 2008:377-385. 20.Graham GG, Lembcke J, Lancho E, Morales E., (1989). Quality protein maize: Digestibility and utilization by recovering malnourished infants. Pediatrics 1989 Mar; 83(3):416-21. 21.Krishna M.S.R., S. Sokka Reddy and V. Chinna Babu Naik, (2012). Assessment of genetic diversity in quality protein maize (QPM) lines using simple sequence repeat (SSR) markers. African Journal of Biotechnology, Vol. 11(98): 16427-16433. 22. Li M.S., X.H. Li, S. Salvi, R. Tuberosa, L.X. Yuan, F. Rotondo, L. Bai, S.H. Zhang, (2006). Genetic relationships among CIMMYTsubtropical QPM and Chinese maize inbred lines based on SSRs.Maydica, 51: 543-549. 23. Lin K.R., A.J. Bockoit, J.D. Smith, (1997). Utilization of molecular probes to facilitate development of Quality Protein Maize. Maize Gen.et Coop News, 71: 22–23. 24. Mertz E.T., (1992). Discovery of high lysine, high Tryptophan cereals. In: Mertz ET (ed) Quality protein maize. American Society of Cereal Chemistry, St Paul, MN. 1–8. 25. Mertz E.T., L.S. Bates, O.E. Nelson, (1964). Mutant that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm. Science, 145: 279–280. 26. Michelmore R.W. and B.C. Meyers, (1998). Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process. Genome Res., 8(11):1113-30. 27.Pandey N., F. Hossain, (2015). Microsatellite marker-based genetic diversity among quality protein maize (QPM) inbreds differing for kernel iron and zinc.Molecular Plant Breeding, Vol.6, No.3: 1-10. 28. Prasad R. et al (1998), Combining ability analysis in maize diallel. Indian J. Genet Plant Breed, 48: 19-23. 29.Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W., 43 (1984). Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics. Proc Natl Acad Sci USA, 81: 8014-8018. 30. Vasal S.K., (1999). Quality Protein Maize story. In workshop on improving Human nutrition through Agriculture - The role of international agricultural research, October 5-7, IRRI, Philippines 31. Vasal S.K., G. Srinivasan, S. Pandy, C.F. Gonzalez, J. Crossa, D.L. Beck, (1993). Heterosis and combining ability of CIMMYT's quality protein maize germplasm: I. Lowland tropical. Crop Science, 33(1): 4651. 32. Vasal S.K., (2002). Quality Protein Maize: Overcoming the hurdles. In: P.K. Katiki and S.C. Babu (Eds). Food Systemsfor Improved Human Nutrition: Linking Agriculture, Nutrition and Productivity. Food products Press, an imprint of the Haworth Press, In: 193-227. 33. Vivek B.S., A.F. Krivanek, N. Palacios-Rojas, S. Twumasi-Afriyie, A.O. Diallo, (2008). Breeding Quality Protein Maize: Protocol for developing QPM cultivars. Mexico. D.F: CIMMYT. WEBSITE 34. FAO: http//faostat.fao.org/site/567DesktopDefault.aspx?PageD=567#ancor 35. Tổng cục thống kê: https://gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=14188. 36. Tổng cục thống kê: http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=717. 44 PHỤ LỤC MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA Kết điện di sản phẩm PCR với mồi phi227562 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi phi093 45 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi phi102228 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi phi213984 46 [...]... của CIMMYT (0,310) Dòng ngô thƣờng Trung Quốc và dòng QPM đƣợc coi là có một sự đa dạng di truyền hẹp hơn so với dòng QPM từ CIMMYT Năm 2012, Krishna và cộng sự [21] đã dùng 48 chỉ thị phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền của 63 dòng QPM phổ biến Trong số 48 dòng thì có 37 dòng cho thấy sự đa hình Tổng cộng có 151 allen đã đƣợc xác định từ 37 chỉ thị SSR trong 63 dòng ngô QPM Số lƣợng trung bình... Các chỉ thị SSR là chỉ thị tƣơng đối đơn giản, dễ thực hiện và cho kết quả chính xác Tuy nhiên thì chỉ thị SSR có một số nhƣợc điểm nhƣ cần nhiều thao tác khi tiến hành, thiết kế mồi cho phản ứng nhân các đoạn SSR phức tạp và thực hiện chỉ thị SSR cũng tƣơng đối tốn kém 1.3.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền và chọn tạo giống ngô Cây ngô là cây giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng. .. methionine trong protein đạt 3% cao hơn so với Q2 và tƣơng đƣơng HQ2000 (1,92 và 3,01%) (Trần Trung Kiên, 2009) [7] 1.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống ngô 1.3.1 Các loại chỉ thị phân tử Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần kiểu gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, sự đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc... nghiên cứu tính đa hình di truyền ở ngô, một trong những chỉ thị di truyền đƣợc sử dụng rộng rãi là chỉ thị SSR Chỉ thị SSR có khả năng cung cấp đầy đủ thông tin về phả hệ, mức đa hình di truyền, phân nhóm ƣu thế lai, khả năng áp dụng tiện lợi và hữu ích (Bùi Mạnh Cƣờng, 2007) [4] Năm 2003, Bantte và Prasanna [16] sử dụng 43 chỉ thị SSR nằm trên toàn bộ 10 nhiễm sắc thể, với ít nhất ba chỉ thị trên mỗi... hình thái, chỉ thị phân tử hay chỉ thị DNA Các chỉ thị phân tử DNA có thể chia làm hai nhóm: + Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP 9 + Các chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR nhƣ RAPD, AFLP, SSR, STS… 1.3.1.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Kỹ thuật sử dụng chỉ thị RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA... Nghiên cứu đa dạng di truyền cho biết mức độ đa dạng của các tập đoàn cây trồng Đặc biệt nghiên cứu đa dạng di truyền có thể dự đoán khả năng cho ƣu thế lai giữa các cặp bố mẹ bằng cách cho lai các cặp bố mẹ có khoảng cách di truyền xa nhau Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể đƣợc đánh giá thông qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thị hình... SSR để đánh giá đa dạng 46 dòng ngô Giá trị trung bình (0,66) của chỉ số đa hình của mồi (PIC) đối với các locus SSR cung cấp đủ khả năng đánh giá tính đa dạng di truyền giữa các dòng thuần Hệ số tƣơng đồng di truyền trung bình (GS) của 18 dòng ngô thƣờng của Trung Quốc (0,344) và trong số 6 dòng QPM Trung Quốc (0,486) cao hơn đáng kể (P < 0,01) so với giá trị trung bình GS trong số 22 dòng QPM của CIMMYT... giữa các cá thể trong cùng loài SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao SSR đƣợc sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen Chỉ thị SSR là chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong xác định quan hệ di truyền, phân loại thực vật, xây dựng bản... dụng 41 mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của 88 dòng ngô (51 dòng có nguồn gốc Việt Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT) Trong đó có 16 dòng QPM, 6 dòng 15 tham khảo từ AMBIONET Kết quả xác định đƣợc sơ đồ phả hệ giữa các dòng ngô nghiên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng... mồi SSR (bảng 2.2) do AMBIONET cung cấp các loại hoá chất thiết bị cần thiết khác trong sinh học phân tử 2.2 Nội dung nghiên cứu - Tách chiết ADN tổng số của các dòng ngô - Khảo sát 29 chỉ thị SSR trên 30 dòng ngô QPM, đánh giá hệ số PIC của các mồi - Đánh giá độ thuần của các dòng ngô - Phân tích đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu - Lựa chọn sơ đồ lai tạo giữa các dòng có thể cho ƣu thế lai cao . tài: Phân tích đa dạng di truyền một số dòng ngô có hàm lƣợng protein cao (QPM) bằng chỉ thị SSR . 2. Mục tiêu đề tài Áp dng ch th i quan h di truyn gia các dòng ngô . NGUYỄN NGỌC DI P PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÕNG NGÔ CÓ HÀM LƢỢNG PROTEIN CAO (QPM) BẰNG CHỈ THỊ SSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời. phn ng nhân SSR phc tp và thc hin ch th SSR  i tn kém. 1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền và chọn tạo giống ngô Cây ngô là cây giao phn