BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHÙNG KẾTOẠI NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM CÁC LOÀI ASPERGILLUSFLAVUSLINK, A.PARASITICUS SPEARE VÀ AFLATOXIN B1TRÊN HẠT SEN CỦA MỘT SÔ HIỆU THUỐC HÀ NỘI, THÁI BÌNH, THANH HÓA VẢ NGHỆ AN. ■ ■ ( KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Người hướng dẫn - Nơi thực ■ Dược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA 1999-2004 ) : ThS. TRẦN TRỊNH CÔNG : Bộ môn Vi Sinh - Sinh học, Đại học Dược Hà Nội • Thời gian thực : 24/2 - 24/5/2004 HÀ NỘI-6/ 2004 ỊÌIẾÌ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Trần Trịnh Công, người trực tiếp hướng dẫn hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Cao Văn Thu, thầy cô giáo cán kỹ thuật viên Bộ môn Vi Sinh - Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài. Hà nội, tháng năm 2004 Sinh viên PHÙNG KẾ TOẠI MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ . PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Hệ vi nấm chất có nguồn gốc thực v ật 1.1.1. Hệ nấm đồng . 1.1.2. Hệ nấm bảo quản .3 1.2. Độc tố nấm mốc (mycotoxin) 1.2.1. Vài nét lịch sử mycotoxin 1.2.2. Độc tố aflatoxin .6 1.3. Những bước việc khảo sát mycotoxin . 10 1.3.1. Phương pháp lấy m ẫu 10 1.3.2. Các phương pháp phân tích mycotoxin 10 1.4. Tinh hình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc mycotoxin dược liệu Việt N am . 13 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 14 2.1. Vật liệu phương pháp thực nghiệm .14 2.1.1. Vật liệ u .14 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu .15 2.2. Kết thực nghiệm nhận xét 19 2.2.1. Mức độ nhiễm loài A./lavus, A.parasiticus, chi loài nấm khác hạt sen Hà N ội . 19 2.2.2. Mức độ nhiễm loài A.ỷlavus, A.parasiticus, chi loài nấm khác hạt sen Thái Bình 22 2.2.3. Mức độ nhiễm loài A.flavus, A.parasiticus, chi loài nấm khác hạt sen Thanh Hóa Nghệ A n . 23 2.2.4. Đặc điểm phân loại chủng thuộc loài A.ỷlavus phân lập từ mẫu hạt sen nghiên u . 26 2.2.5. Kết khảo sát aílatoxin hạt sen 31 PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ Xư ẤT 36 3.1. Kết luận 36 3.2. Một số đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 ĐẶT VẤN ĐỂ Ớ nước ta thuốc y học cổ truyền chế phẩm đông dược, nguyên liệu dùng làm thuốc đa sô có nguồn gốc thực vật [3]. Hiện phương pháp, phương tiện chế biến, bảo quản dược liệu nghèo nàn lạc hậu, chủ yếu dùng phương pháp truyền thống phơi sấy theo kinh nghiệm. Điều làm cho loại dược liệu, vị thuốc đông dược dễ bị nấm mốc xâm nhiễm phát triển, điều kiện khí hậu nóng ẩm nước ta. Ngoài việc làm giảm chất lượng sản phẩm làm giảm hàm lượng vitamin, lipid, protid, tinh bột hoạt chất khác, nấm mốc sinh độc tố (mycotoxin) gây nguy hại cho sức khoẻ người tiêu dùng. Trong loại độc tố nấm mốc mà người biết đáng ý aAatoxin, độc tố có khả gây ung thư gan loài nấm chủ yếu A.ỷlavus A.parasiticus sinh ra. Mức độ nhiễm loài A.flavus độc tố aAatoxin nhà khoa học phát mức độ cao loại lương thực, thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật lạc, gạo, ngô, đậu, vv . [1]. Riêng dược liệu chưa có nhiều nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc mycotoxin nguồn chất này. Hạt sen vừa dược thảo dùng phổ biến làm thuốc từ lâu đời, loại thực phẩm dùng rộng rãi dân gian để chế biến nhiều ăn. Qua tìm hiều thành phần hoá học thấy hạt sen có nhiều tinh bột, đường, protid (chiếm 16,6%) chất béo (2%) [3] tương đối giống với thành phần hoá học lạc (một nông sản phát thấy tỷ lệ nhiễm A. flavus aAatoxin cao). Ngoài tâm sen có asparagin axit amin nhà nghiên cứu độc tố nấm mốc dùng để làm tăng sản lượng aílatoxin loài A. ỷlavus A.parasiticus điều kiện phòng thí nghiệm. Với thành phần hoá học vậy, điều kiện khí hậu nóng ẩm, điều kiện thu hoạch bảo quản chế biến thủ công theo kinh nghiệm nước ta, hạt sen tiềm ẩn nguy cao khả nhiễm loài nấm A.ỷlavus, A.parasiticus độc tố aAatoxin. Đê tìm hiểu vấn đề tiến hành nghiên cứu khảo sát mức độ nhiễm loài A.ýlavus, A.parasiticus aflatoxin hạt sen số địa điểm Hà Nội, Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An với mục tiêu sau: 1. Phân lập loài Aspergillus flavus A.parasiticus từ mẫu hạt sen thu thập từ tỉnh nói trên. 2. Khảo sát định tính định lượng aAatoxin B| mẫu hạt sen bị nhiễm hai loài nấm A.ịìavus A.parasiticus. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. HỆ VI NẤM TRÊN c CHẤT CÓ NGUỔN G ố c THựC VẬT Vi nấm chiếm số lượng loài vô phong phú số sinh vật tự nhiên, chúng so sánh với thực vật có hoa côn trùng [15]. Trong từ điển nấm Hawksworth cộng xuất năm 1983, liệt kê 6.000 chi nấm khác với số lượng 65.000 loài. Dựa vào đặc điểm sinh thái nấm đặc biệt hàm lượng ẩm mà chúng yêu cầu, Christensen Kawfmann [10] chia loài nấm nhiễm chất thực vật trồng sống đồng, phận cây, loại hạch, củ rễ thu hoạch thành loại: nấm đồng (field fungi) nấm bảo quản (Storage fungi). 1.1.1. Hệ nấm đồng Là loài nấm nhiễm hạt, quả, củ, lá, thân, cành trước thu hoạch vào giai đoạn thu hoạch. Chúng yêu cầu hàm ẩm cân với độ ẩm tương đối (RH) từ 90-100% đại đa số chúng không sinh độc tố, trừ trường hợp ngoại lệ loài thuộc chi Fusarium, Aỉternaria loài A.flavus. Các chi nấm đồng thường gặp Alternaria, Cladosporium, Helminthosporium chi Fusarium. + Chi Alternaria thường nhiễm hạt loại lương thực hạt giống bảo quản điều kiện ẩm thấp. Khi hạt thu hoạch, phơi sấy khô để bảo quản, loài chi Alternaria chết dần nấm mốc bảo quản tăng lên. + Chi Cìadosporium thường nhiễm hạt lương thực, lưu giữ thời tiết ẩm trình thu hoạch, đặc biệt loại hạt có vỏ thóc, v ỏ hạt thường bị sẫm màu bị nhiễm loài chi nấm này. + Chi Helminthosporium thường có mặt hạt ngũ cốc giống, thời tiết trước thu hoạch bị ẩm ướt. Khi nhiễm chi nấm làm màu hạt, làm chết hạt nảy mầm, gây thối rễ hạt nảy mầm không gây tổn thất trình bảo quản. + Chi Fusarium thường gặp hạt ngũ cốc trước vào giai đoạn thu hoạch. Một số chủng hay loài thường tạo " vẩy" đại mạch, lúa mỳ ngô. Các h t" vẩy" gây độc cho người động vật. Tóm lại loài nấm đồng ảnh hưởng tới bề chất lượng cuả hạt. Thông thường tổn thất gây nên nấm mốc đồng xảy vào giai đoạn trước thu hoạch không tiếp tục xảy trình bảo quản. Đồng thời tổn thất hệ nấm đồng gây phát phương pháp giám định thông thường. 1.1.2. Hệ nấm bảo quản Nấm bảo quản bao gồm loài nấm nhiễm hạt, quả, củ, lá, thân . thời gian bảo quản chúng yêu cầu hàm ẩm cân với độ ẩm tương đối từ 70-90%. Hầu hết chúng phát triển nước tự môi trường có áp suất thẩm thấu cao. Chúng đóng vai trò chủ đạo việc gây hư hại sản phẩm gạo, ngô, lạc, dược liệu . sinh độc tố sản phẩm này. Các chi nấm bảo quản quan trọng Aspergillus Peniciỉlium. Theo Christensen [10] có khoảng 12 loài thuộc chi Aspergillus số loài thuộc chi Penicillium nấm men. Chúng có mặt tất nơi giới, nhiễm phát triển tất loại hạt lương thực, hạt giống có hàm ẩm lớn 18% nhiệt độ 30- 32°c. Đó điều kiện thuận lợi cho phát triển loài nấm bảo quản. Tuy nhiên tiêu chí để phân biệt nấm đồng nấm bảo quản mang tính chất tương đối số loài nấm bảo quản bao gồm A.flavus loài thân thuộc phát nhiều lạc ngô trước thu hoạch [14]. 1.2. ĐỘC TỐ NẤM MỐC (MYCOTOXIN) 1.2.1. Vài nét lịch sử mycotoxin Mycotoxin sản phẩm chuyển hoá thứ cấp quan trọng nấm mốc. Chúng mối đe doạ tiềm tàng sức khoẻ người động vật vòng thập niên trở lại đây. Bên cạnh gây thiệt hại kinh tế phạm vi khác tuỳ độc tố cụ thể. Các mycotoxin tạo thách thức nhiều nhà khoa học nhiều lĩnh vực khác vi sinh, hoá sinh, hoá học cấu trúc, độc tố học, dược lý học di truyền học [8]. Rất nhiều loài nấm gây bệnh cho người, động vật thực vật gây tổn thất vụ thu hoạch, gây hư hại lương thực, thực phẩm, dược thảo . trình bảo quản [15]. Tuy nhiên người quan tâm tới mycotoxin bệnh mycotoxin gây năm đầu thập kỷ 60 kỷ 20 mà nhà khoa học phát aílatoxin bệnh độc tố nấm gây thừa nhận gây ý nhiều người mà cụ thể nhà khoa học quản lý . Các loài sinh độc tố gặp tất taxon chủ yếu nấm. Tuy nhiên hầu hết mycotoxin biết sản phẩm chuyển hoá thứ cấp chi Aspergillus, Peniciỉlium Fusarium. Ngoài số chi khác chi Claviceps chi Alternaria. Các độc tố trình bày độc tố quan trọng thường gặp số hàng trăm mycotoxin phát hiện. Mycotoxin nhóm chất có cấu trúc đa dạng, hầu hết hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ, tạo trao đổi chất thứ cấp nấm mốc gây độc động vật có vú, cá gia cầm [7]. Bệnh độc tố nấm mốc (mycotoxicose) đựơc bắt đầu nghiên cứu sâu từ năm 1960, mà giới bắt đầu nhận biết tầm quan trọng mycotoxin việc phát bệnh T-X (Turkey X) nước Anh năm 1960. Bệnh T-X làm chết hàng vạn gà tây ăn phải lạc bị nhiễm loài nấm A.flavus aílatoxin, nhóm chất có liên quan tới ung thư gan [8]. Những số liệu có giá trị mycotoxin bệnh mycotoxin có đựơc từ lĩnh vực thú y. Các nghiên cứu động vật thực nghiệm cho thấy độc tính mycotoxin lớn [8]. Hầu tất sản phẩm thực vật chất cho phát triển nấm mốc. Sự hình thành mycotoxin nguồn chất dẫn đến nguy gây nhiễm trực tiếp thực phẩm người. Khi ăn loại thức ăn nhiễm mycotoxin, vật nuôi không chịu tác dụng độc trực tiếp mà nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt tạo nhiễm mycotoxin cho người [17]. Vấn đề mycotoxin ngày thu hút quan tâm đông đảo nhà khoa học nhiều lĩnh vực khác nhau. Điều chứng tỏ qua nhiều hội nghị, hội thảo, chuyên khảo, tạp chí nghiên cứu giành cho vấn đề có tính hấp dẫn [19]. Trong điều kiện phòng thí nghiệm có 300 loại mycotoxin sản sinh từ chủng nấm khiết đặc trưng hoá mặt hoá học. Nhưng khoảng 20 loại mycotoxin có thực phẩm mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm tạo năm chi nấm Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria Claviceps là: Các độc tố chi Aspergillus: aiìatoxin (Bị, B2, Gj, G2, Mị, M2), sterimatocystin, axit cyclopianzoic. Các độc tố chi Fusarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin. Các độc tố chi Penicillium: Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, axit cyclopiazonic, diacetocyscirpenol, íumonisin moniliíormin. Các độc tố chi Alternaria: axit tenuazonic, alternariol, methyl ether alternariol Các độc tố chi Claviceps: Các alkaloit Ergot [9] 1.2.2. Độc tô aĩlatoxin Trong mycotoxin aflatoxin độc tố phát sớm nghiên cứu đầy đủ phương diện [19]. 1.2.2.1. Tính chất hóa học Bốn aílatoxin quan trọng có khung di-furanocumarin, sản phẩm trao đổi chất tạo loài nấm A.ỷìavus A.parasiticus, đựơc đặt tên Bj, B2, G|, G2. Bốn chất phân biệt sở mầu phát huỳnh quang chúng: B chữ viết tắt Blue (màu xanh da trời) G chữ viết tắt Green (màu xanh cây). Các động vật có vú ăn phải aAatoxin B| B2 aflatoxin chuyển hóa thành aílatoxin Mị aílatoxin M2 có sữa (M chữ viết tắt Milk). Trong bốn loại aílatoxin aílatoxin B| thường tìm thấy nồng độ cao nhất, G|. Trong aAatoxin B2 G2 tồn nồng độ thấp [9]. Aflatoxin B2 G2 dẫn xuất dihydro hợp chất mẹ Bị Gị. Các aílatoxin M| M2 dạng hydroxyl hóa Bị B2. chúng có công thức cấu tạo sau: o o o o o o aílatoxin aflatoxin Mị o o aAatoxin Gi aAatoxin Gj Các aílatoxin phát quang mạnh ánh sáng tia tử ngoại. Điều cho phép phát hợp chất nồng độ thấp ( 0,5 ng hay thấp vết sắc ký mỏng). Đây sở cho tất phương pháp hóa lý việc phát định lượng hợp chất này. Nồng độ atlatoxin M| 0,02 mg/lít phát sữa lỏng [11]. Các aílatoxin hòa tan dung môi phân cực nhẹ clorofoc, methanol đặc biệt dimethylsulíoxit (dung môi thường sử dụng để hòa tan aílatoxin để tiêm vào động vật thực nghiệm). Độ tan aữatoxin nước dao động từ 10-20 mg/lít. Ở dạng tinh khiết aílatoxin bền nhiệt độ cao, làm nóng không khí. Tuy nhiên bị phá hủy để không khí ánh sáng tia cực tím đặc biệt hòa tan dung môi có độ phân cực cao. Các aĩlatoxin dung môi cloroíoc benzen bền vững nhiều năm bảo quản chỗ tối lạnh. Các Bảng 4: Mức độ nhiễm nấm mốc hạt sen số hiệu thuốc tỉnh Thanh Hóa Nghệ An. Tỷ lệ % STT Địa điểm lấy hạt bị mẫu nhiễm nấm mốc Vĩnh lộc, Thanh Hóa Vĩnh lộc, Thanh Hóa Vĩnh lộc, Thanh Hóa Hậu Lộc, Thanh Hóa Hoàng Hóa, Thanh Hóa Hậu Lộc, Thanh Hóa Tỷ lệ chi loài nấm thường gặp (%) Aspergillus Penicillium Fusarium A.ỷlavus A.niger 67 35 17 14 40 14 11 54 27 11 70 47 17 13 80 62 10 Thanh Chương , Nghệ An 56 24 14 Thanh Chương , Nghệ An 90 71 12 TP Vinh, Nghệ An 53 25 10 70 34 16 59,3 34,2 10,3 8,7 6,9 Nam Đàn, 10 Nghệ An Trung bình 24 Qua kết bảng thấy tất 10 mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm nấm mốc với tỷ lệ dao động từ 13-90% mẫu có hàm ẩm đạt yêu cầu DĐVN III. Tỷ lệ nhiễm nấm mốc trung bình mẫu 59%. Nhu' vậy, mẫu hạt sen giống Thái Bình Hà Nội bị nhiễm nấm mốc với tỷ lệ cao. Ngoài nguy gây giảm chất lượng hạt tiềm ẩn nguy xuất độc tố sản phẩm này. Cũng giống hai bảng 3, loài A.parasiticus không phát thấy mẫu hạt sen nghiên cứu. Tỷ lệ nhiễm loài A.flavus cao, mẫu bị nhiễm dao động từ 8-71% trung bình 34% (ảnh 3) thấp 6% so với mẫu Hà Nội. Bên cạnh tỷ lệ 10% hạt bị nhiễm loài A.niger đối tượng có liên quan đến khả sinh độc tố aílatoxin, có nguy cao loài Aflavus, A.parasiticus. Sự xuất chi Penicillium Fusarium tiềm ẩn thêm nguy xuất độc tố loài thuộc chi nấm này, chi phần tổng quan trình bày có khả sinh nhiều độc tố. Ảnh 3: Nấm mốc nhiễm hạt sen hiệu thuốc đông dược Thanh Chương, Nghệ An (môi trường PDA, 35°c, ngày tuổi) 25 2.2.4. Đặc điểm phân loại chủng thuộc loài A.flavus phân lập từ mẫu hạt sen nghiên cứu . Qua trình phân loại chủng A.ỷlavus phân lập từ mẫu hạt sen nghiên cứu, thấy đặc điểm khuẩn lạc vi học chủng loài thay đổi giới hạn rộng. Dựa vào kết khảo sát đặc điểm khuẩn lạc vi học phân chia chủng thành nhóm liệt kê bảng ảnh minh họa 4a, 4b, 4c, 4d chủng N°18 phân lập hạt sen Thái Bình: 26 Bảng 5:Đặc điểm khuẩn lạc vỉ học chủng đại diện thuộc nhóm chủng loài A.ýĩavus Link (Môi trường Czapek - Dox, ngày tuổi, nhiệt độ nuôi cấy 25°C). Các nhóm chủng loài A.ílavusUnV, TT 11 Đặc điểm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Dạng len, phẳng xốp Dạng len Dạng len không phẳng, xốp Dạng len phẳng Xanh lục Lục vàng Lục vàng sang vàng Lục vàng sang nâu Màu kem trắng đục Trắng đục tím Hơi vàng Trắng vàng 1. Dạng mặt khuẩn lạc (KL). 2. Màu sắc KL 3. Màu mặt sau KL 4. Giọt tiết Không Không Không 5. Sắc tố hoà tan Không Không Không Không 6. Hạch nấm Không Không Nhiều 7. Đường kính KL (cm) ,0 -4 ,5 ,5 -5 ,5 ,5 -5 ,0 ,6 -6 ,0 8. Kích thước giá conidi 500-625 475-825 675-825 600-975 -1 8-10 -1 -2 - Chiều dài (fam) - Đường kính (|im ) 27 9. Khối conidi Cầu.tia toả tròn cột cầ u tia toả tròn cột Cầu xẻ thành nhiều cột Cầu, tia toả tròn - Kích thước (|im ) 280-350 300-450 550-650 550-700 Bọng đỉnh giá (*) loại loại loại loại Cầu gần cầu Cầu gần cầu Cầu chuỳ Cầu, gần cầu 40-65 10-25 35-60 10-20 45-65 12-25 47-70 10-20 6,0-9,0 X 3,5-5,5 8,5-11,0x4,5-5,5 6,0-9,0 X 4,0-5,5 8,0-11,0x5,0-6,5 - Hình dạng 10. - Hình dạng - Kích thước 11. (ịim) Cuống thể bình - Kích thước (um ) 12. 13. Thể bình Hình chai Hình chai - Hỉnh dạng Hình chai 7-9 X 3,5-5,5 Hỉnh chai - Kích thước 6-8 X 3-4,5 (12-15x3,0-5,0) -1 x -5 Cầu, gần cầu Cầu, gần cầu Cẩu, gần cầu Cầu, gần cầu - Kích thước ( |im ) 3, 5- 5, 4,5-6,0 4-6,0 3-6 - Dạng mặt Nhẵn - Gai Nhẵn - Gai Ráp Gai 8,5-10,5x4-5 Conidi - Hình dạng (*) loại: Bọng có cuống thể bình sinh thể bình bọng bình sinh trực tiếp từ bọng. 28 Anh 4a: Khuẩn lạc sau tuần môi trường Czapek 25°c chủng A.ỷlavus N°18 phân lập Thái Bình. Anh 4b: Hình ảnh conidi chủng A.ỷlavus N°18 phân lập Thái Bình Ảnh 4c: Cấu trúc bọng có cuống thể bình thể bình chủng A./lavus N°18 phân lập Thái Bình Anh 4d. Cấu trúc bọng bình chủng A./lavus N°18 phân lập Thái Bình. 30 2.2.5. Kết khảo sát aAatoxin hạt sen Từ kết trình bày mục 3.1., 3.2. 3.3., thấy khả nhiễm aílatoxin hạt sen lưu hành hiệu thuốc chợ thực phẩm cao nguyên nhân gồm: + Hạt sen bị nhiễm loài A.ỷlavus với tỷ lệ cao (34-40%). + Điều kiện bảo quản nghèo nàn lạc hậu, điều kiện thời tiết (nhiệt độ độ ẩm) nước ta lại thuận lợi cho phát triển nấm mốc trình bày phần đặt vấn đề. Với lý tiến hành khảo sát nhiễm độc tố aflatoxin Bị mẫu hạt sen Hà Nội số mẫu Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An. 2.2.5.1. Độc tô aỷlatoxin Bj mẫu hạt sen ỏ'Hà Nội Kết khảo sát aílatoxin B, 20 mẫu hạt sen Hà Nội trình bày bảng 6. 31 Bảng 6: Mức độ nhiễm aílatoxin Bị hạt sen số hiệu thuốc chợ Hà Nội Địa điểm lấy mẫu (Từ mẫu 10 lấy hiệu thuốc; từ 10-20 lấy chợ) Tình trạng hạt (quan sát mắt thường) 21- Dốc Tam Đa - Q. Tây Hồ Sao khô, không mốc 10,5 60 386 - Bạch Mai Sao khô, không mốc 9,5 84 434 26 Đội Cấn Phơi khô, không mốc 8,2 26 17,5 162A Đội Cấn Sao khô, không mốc 9,2 34 35 522 Bạch Mai Phơi khô, không mốc 8,9 93 - 12 Lãn Ông Phơi khô, không mốc 11,5 92 - 24 Lãn Ông Phơi khô, không mốc 11 100 - 32A Lãn ông Phơi khô, không mốc 8,01 - 44A Lãn ông Sao khô, không mốc 11,5 83 - 10 53 Lãn Ông Phơi khô, không mốc 8,01 16 - 11 Chợ Nguyễn Cao - Lò Đúc Phơi khô, không mốc 10,02 40 173,6 12 Chợ Nguyễn Cao - Lò Đúc Phơi khô, không mốc 9,70 16,6 - 13 Chợ Nguyễn Cao - Lò Đúc Phơi khô, không mốc 9,80 20 - 14 Chợ Nguyễn Cao - Lò Đúc Phơi khô, không mốc 10,30 26,6 - 15 Chợ Nguyễn Cao - Lò Đúc Phơi khô, không mốc 9,60 13,3 - 16 Chợ 8/3 Phơi khô, không mốc 10,20 18,4 - 17 Chợ 8/3 Phơi khô, không mốc 10,40 17,7 - 18 Chợ 8/3 Phơi khô, không mốc 10,50 12 - 19 Chợ 8/3 Phơi khô, không mốc 9,00 20 Chợ 8/3 Phơi khô, không mốc 9,90 25,6 9,79 40,0 TT Hàm ẩm hạt (%) Tỷ lệ hạt nhiễm A.ílavus Trung bình - Sô' mẫu nhiễm aílatoxin tổng số mẫu phân tích 4/20 Hàm lượng aílatoxin Bì trung bình có mẫu bị nhiễm (ppb) 165 Hàm lượng aílatoxin B.| dao động mẫu bị nhiễm (ppb) 17,5-434 Ghi chú: Hàm lượng aílatoxin B1 (ppb) không phát aflatoxin B, có mẫu phân tích 32 - Kết phân tích aílatoxin Bj mẫu hạt sen bảng cho thấy: 4/20 mẫu hạt sen nhiễm aílatoxin Bị (ảnh 5) hàm lượng aAatoxin Bị dao động từ 17,5 ppb đến 434 ppb trung bình 165 ppb mẫu phát thấy aílatoxin Bị. Đây mức độ nhiễm cao theo tiêu chuẩn ngành Y tế, giới hạn aílatoxin Bị tối đa cho phép mẫu thực phẩm không 10 ppb. Các mẫu hạt sen lấy hiệu thuốc đông dược có tỷ lệ nhiễm A.ỷlavus aAatoxin B| cao nhiều so với mẫu sen lấy chợ thực phẩm, mẫu sen thuốc khô. Điều sen thuốc có tâm sen (các mẫu sen chợ bị lấy tâm sen) có chứa asparagin axit amin có khả tăng hàm lượng aílatoxin. Tuy nhiên điều cần phải nghiên cứu sâu thêm. Ảnh 5: sắc ký đồ aỷlatoxin B ị chuẩn aịĩatoxin B ị chiết suất từ hạt sen thu thập hiệu thuốc Hà Nội. Chuẩn: sắc kỷ đồ aỷlatoxin Bị chuẩn S ĩ2 : Sắc kỷ đồ aflatoxin BỊ chiết xuất từ hạt sen thu thập 386 Bạch Mai. STj : Sắc ký đồ aỷỉatoxin BI chiết xuất từ hạt sen thu thập 26 Đội cấn. STị : Sắc ký đồ aỷlatoxin Bị chiết xuất từ hạt sen thu thập 162 A Đội Cấn. 33 2.2.5.2. Độc tô aflatoxin Bj mẫu hạt sen Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An Do điều kiện thời gian không cho phép, chọn số mẫu có tỷ lệ nhiễm loài A.ỷlavus cao để phân tích aílatoxin B). Kết trình bày bảng 7. Bảng 7: Mức độ nhiễm aílatoxin B, hạt sen số hiệu thuốc Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An TT Địa điểm lấy mẫu Tình Hàm ẩm trạng hạt hạt (%) Mức độ nhiễm loài A.ýỉavus Hàm lượng aílatoxin Bi (%) Thị xã Thái Bình Kiến Xương-Thái Bình Kiến Xương-Thái Bình Hậu lộc- Thanh Thóa Thanh Chương-Nghệ An Không mốc 10,8 57 Không mốc 10,2 67 — Không mốc 9,9 73 — Không mốc 10,3 62 - Không mốc 9,5 71 10,1 66 Trung bình - - Qua kết trình bày bảng thấy mẫu hạt sen đại diễn thu thập từ tỉnh Thái Bình, Thanh Thóa Nghệ An, có tỷ lệ nhiễm loài A.flavus với tỷ lệ cao từ 57-73% không phát thấy aílatoxin B|(ảnh 6). Điều chủng nấm nhiễm mẫu hạt sen khả sinh aAatoxin, chưa gặp điều kiện thuận lợi để phát triển sinh độc tố. 34 Ảnh 6: sắc ký đồ aflatoxin Bị chuẩn dịch chiết từ hạt sen thu thập hiệu thuốc đông dược Thái Bình, Thanh Hoá Nghệ An s : Sắc ký đồ aỷlatoxin B ị chuẩn Tị : Sắc kỷ đồ dịch chiết hạt sen thị xã Thái Bình. : Sắc kỷ đồ dịch chiết hạt sen Kiến Xương, Thái Bình T4 : Sắc kỷ đồ dịch chiết hạt sen Hậu Lộc, Thanh Hóa. T5 : Sắc ký đồ dịch chiết hạt sen Thanh Chương, Nghệ An. T2 , T ị 35 PHẨN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 3.1. Kết luận Qua nghiên cứu mức độ nhiễm loài A.flavus, A.parasiticus độc tố aflatoxin B, hạt sen số địa điểm Hà Nội, Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An, rút kết luận sau: 1. Tất mẫu hạt sen nghiên cứu thu thập Hà Nội, Thái Bình Thanh Hóa Nghệ An có hàm ẩm đạt yêu cầu DĐVN III (< 11%) bị nhiễm loài A.ỷlavus với tỷ lệ trung bình từ 34-40%. Trong mẫu Hà Nội có tỷ lệ nhiễm cao (40%) tỷ lệ nhiễm thấp mẫu Thanh Hoá Nghệ An (34%). 2. Không thấy có mặt loài A.parasiticus mẫu hạt sen nghiên cứu. 3. Tất mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm nấm mốc với tỷ lệ trung bình dao động từ 56-83%. Ngoài loài nấm quan trọng A.flavus nói mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm loài A.niger với tỷ lệ trung bình dao động từ 10,3-12,5%, chi Fusarium nhiễm với tỷ lệ 6,0-8,3% chi Penicillium xuất với tỷ lệ 8,6-14%. 4. Đã phát thấy 4/20 mẫu hạt sen lấy hiệu thuốc đông dược chợ Hà Nội bị nhiễm aAatoxin B| với hàm lượng dao động 17,5 - 434 ppb, tỷ lệ nhiễm trung bình mẫu dương tính 165 ppb, vượt xa so với quy định ngành Y tế (ìoppb). Trong mẫu phân tích lấy tỉnh Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An có tỷ lệ nhiễm loài A.flavus cao (57-73%) song không phát thấy aílatoxin B |. 5. Hạt sen hiệu thuốc Hà Nội có tỷ lệ nhiễm loài A.ỷlavus aílatoxin B| cao so với mẫu hạt sen chợ. 36 3.2. Một sô đề xuất Qua kết nghiên cứu mức độ nhiễm loài A.flavus, A.parasiticus aílatoxin B, số mẫu hạt sen Hà Nội, Thái Bình, Thanh Hóa Nghệ An kiến nghị số điểm sau: 1. Cần mở rộng phạm vi nghiên cứu khu vực địa lý số lượng mẫu khảo sát để có kết luận xác mức độ nhiễm loài nấm A./lavus, A.parasiticus aílatoxin hạt sen. 2. Nghiên cứu biện pháp thu hoạch, chế biến bảo quản hạt sen hợp lý để phòng tránh phát triển loài A.ỷlavus tạo thành aflatoxin hạt sen. 3. Cần có khuyên cáo kịp thời tới người tiêu dùng, nhà kinh doanh, nuôi trồng chế biến dược liệu nguy nhiễm nấm mốc độc tố nấm mốc dược liệu làm thuốc mà trước mắt hạt sen. Đồng thời cần có qui chế, qui định cụ thể văn tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thuốc phương diện nấm mốc mycotoxin dược liệu, đôi với kiểm tra việc thực qui định để đảm bảo tốt chất lượng dược liệu, nâng cao hiệu điều trị tránh rủi ro đáng tiếc cho sức khoẻ người tiêu dùng độc tố nấm mốc gây ra. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Xuân Đồng (1993), Nấm mốc độc nông sản thực phẩm Việt Nam, Hội thảo khoa học Cục quản lý chất lượng hàng hoá đo lường, Bộ thương mại. 2. Bùi Xuân Đồng cộng (1963), "Một số nhận xét sơ vấn đề nấm mốc dược liệu", Tạp chí Dược học, số 3, Tr. 3-6. 3. Đỗ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt nam, NXB KHKT, Hà Nội. 4. Nguyễn Thị Sinh (1984), Góp phần nghiên cứu hệ vi nấm đặc trưng dược liệu kho, Luận án PTS Dược học, Đại học Dược Hà nội. 5. Nguyễn Hữu Tuấn (1992), Thăm dồ cố mặt Aspergillus ỷlavus Link ex Fries khả tạo thành aỷìatữxin vị thuốc nam bắc cố nguồn gốc thực vật, Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học khoá 1987 - 1992. 6. AOAC (1990), Official methods o f analysis. 7. Bainton S.J, R.D Cooker, B.D Jones, E.M Morley, H.J. Nagler, and R.L Turner (1980), Mycotoxin Training Manual, Tropical Product Institute. 176 p. 8. Betina V. (1984), Mycotoxins production, isolatỉon, separation and puriỷication. 527 p. 9. Champ B.R et al (1991), Fungi and mycotoxins in stored Products, the Griffin Press Ltd, Netley, South Australia. 10. Christensen M., Kauímann H. (1969), Grain storage, University of Minesota. 11. Doronina o . and Makshimenko K., (1984) , Analytical methods o f detection, identiỷỉcation, and quantitative determination ofaflatoxin infoodstuffs andỷodder, FAO ì UNEP Ị USSR International training 38 Coursse "Training activities on food contamination control and monừoring with special reỷerence to mycotoxin", Moscow. 12. Goldblatt (1969), Aflatoxins, Scienti/ic background, control and implication, New York, Academic press, 472 p. 13. Hussein s. et al (2001), Toxicity, metabolism and impact o f mycotoxins on human and animals Toxicol 167: 101. 14. J.I.Pitt (1991), Methods for isolation, enumeration and identiỷication offungi, Lecture note, Biotrop íourth training course on pests of stored Products, Bogor, Indonesia. 15. J.I. Pitt and A.D. Hocking (1985), Fungi and food spoilage, Academic press, Sydney. Y~ 16. Raper K.B and Fennell D.I (1965), genus Aspergillus, Baltimo, USA. 17. R.A Samson et al. (1995), Introduction to food-borne Fungi, Wageningen, the Netherlands. 18.Wogan G.N (1976), Aflatoxin cancernogenesis, New York, Academic press. pp 309-344. 19. World Health Organization (1994), Mycotoxins, Published unde the joint sponsorship of United Nations Enviroment Programme and the World health organization. 39 [...]... Xương, Thái Bình (môi trường PDA, 35°c, 3 ngày tuổi) 2.2.3 Mức độ nhiễm các loài A. flavus, A. parasiticus, các chi và loài nấm khác trên hạt sen ở Thanh H a và Nghệ An Qua nghiên cứu mức độ nhiễm các loài A. ỷỉavus, A. parasiticus và các chi nấm khác trên 10 mẫu hạt sen lấy ở một số hiệu thuốc ở 2 tỉnh Thanh H a và Nghệ An, kết quả được trình bày ở bảng 4 23 Bảng 4: Mức độ nhiễm nấm mốc trên hạt sen c a một. .. loài A. ịlavus, A. parasiticus, các chi và loài nấm khác trên hạt sen ở Thái Bình Để biết thêm về tác động c a điều kiện khí hậu, phơi sấy và bảo quản chúng tôi đã tiến hành khảo sát thêm các mẫu hạt sen ở một một số hiệu thuốc đông dược c a một số tỉnh Thái Bình, Thanh H a và Nghệ An Dưới đây là kết quả về mức độ nhiễm các loài A. ýĩavus, A. parasiticus, các chi và loài nấm khác trên các mẫu hạt sen ở Thái. .. bày ở phần đặt vấn đề Với các lý do trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự nhiễm độc tố aflatoxin Bị trên các mẫu hạt sen ở Hà Nội và một số mẫu ở Thái Bình, Thanh H a và Nghệ An 2.2.5.1 Độc tô a latoxin Bj trên các mẫu hạt sen ỏ 'Hà Nội Kết quả khảo sát a latoxin B, trên 20 mẫu hạt sen ở Hà Nội được trình bày ở bảng 6 31 Bảng 6: Mức độ nhiễm a latoxin Bị trên hạt sen ở một số hiệu thuốc và chợ c a Hà. .. một số hiệu thuốc ở 2 tỉnh Thanh H a và Nghệ An Tỷ lệ % STT Đ a điểm lấy hạt bị mẫu nhiễm nấm mốc 1 2 3 4 5 6 Tỷ lệ các chi và loài nấm thường gặp (%) Vĩnh lộc, Thanh H a Vĩnh lộc, Thanh H a Vĩnh lộc, Thanh H a Hậu Lộc, Thanh H a Hoàng H a, Thanh H a Hậu Lộc, Thanh H a Aspergillus Penicillium Fusarium A. ỷlavus A. niger 67 35 17 14 2 40 14 11 8 9 54 27 9 11 5 70 47 17 7 6 13 8 1 7 4 80 62 10 4 5 7 Thanh. .. asparagin và ancaloit [3] Để nghiên cứu mức độ nhiễm các loài A. ỷlavus , A. parasiticus, các chi và các loài nấm khác trên hạt sen ở Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thu thập 20 mẫu hạt sen ở 20 đ a điểm khác nhau Kết quả được trình bày ở bảng 2 19 Bảng 2: Mức độ nhiễm nấm mốc trên hạt sen ở một sô đ a điểm thuộc đ a bàn Hà Nội * TT 1 Đ a điểm lấy mẫu (từ mẫu 1-10 lấy ở hiệu thuốc; từ mẫu 10-20 lấy ở các. .. nhiều độc tố Ảnh 3: Nấm mốc nhiễm trên hạt sen ở hiệu thuốc đông dược Thanh Chương, Nghệ An (môi trường PDA, 35°c, 3 ngày tuổi) 25 2.2.4 Đặc điểm phân loại c a các chủng thuộc loài A. flavus phân lập từ các mẫu hạt sen nghiên cứu Qua quá trình phân loại các chủng A. ỷlavus phân lập từ các mẫu hạt sen nghiên cứu, chúng tôi thấy các đặc điểm khuẩn lạc và vi học c a các chủng c a loài này thay đổi trong một. .. VÀ NHẬN XÉT 2.2.1 Mức độ nhiễm các loài A. flavus, A. parasiticus, các chi và loài nấm khác trên hạt sen ở Hà Nội Hạt sen (Semen Nelumbinis) còn gọi là liên nhục là hạt còn màng mỏng c a quả già đã phơi hay sấy khô c a cây sen (Nelumbo nuciíera Gaertn) Thành phần h a học có nhiều tinh bột, đường, protit ( 16,6%), chất béo ( 2%) Ngoài ra còn có một tỷ lệ nhỏ canxi, photpho và sắt Trong tâm sen có asparagin... Khuẩn lạc sau 1 tuần trên môi trường Czapek ở 25°c c a chủng A. ỷlavus N°18 phân lập ở Thái Bình Anh 4b: Hình ảnh các conidi c a chủng A. ỷlavus N°18 phân lập ở Thái Bình Ảnh 4c: Cấu trúc bọng có cuống thể bình và thể bình c a chủng A. /lavus N°18 phân lập ở Thái Bình Anh 4d Cấu trúc bọng chỉ có thể bình c a chủng A. /lavus N°18 phân lập ở Thái Bình 30 2.2.5 Kết quả khảo sát aAatoxin trên hạt sen Từ các kết... quan trọng trong các quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý bằng kiềm làm giảm hàm lượng aAatoxin trong sản phẩm.Tuy nhiên nếu xử lý bằng kiềm nhẹ thì việc axit h a sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo a ìatoxin ban đầu [19] 1.2.2.2 Các loài nấm sinh aflatoxin Khả năng tạo a latoxin chủ yếu ở các chủng c a hai loài Aspergillus flavus Link và A parasiticus speare Cả hai loài là thành phần c a. .. a latoxin và ung thư ở người đã được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế công bố năm 1976 Các số liệu nghiên cứu về các vùng dân cư khác nhau ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy hàm lượng a latoxin trong lương thực đã liên quan tới tai biến ung thư gan ở các vùng đó Những số liệu cụ thể c a các nước Kenya, Thái Lan, Swaziland, Mozămbic và Trung Quốc về tỷ lệ ung thư gan đã đi kèm với những số liệu mức . mức độ nhiễm các loài A. ýlavus, A. parasiticus và aflatoxin trên hạt sen ở một số đ a điểm tại Hà Nội, Thái Bình, Thanh H a và Nghệ An với các mục tiêu sau: 1. Phân lập các loài Aspergillus flavus. Dược HÀ NỘI PHÙNG KẾTOẠI NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM CÁC LOÀI ASPERGILLUSFLAVUS LINK, A. PARASITICUS SPEARE VÀ AFLATOXIN B 1 TRÊN HẠT SEN C A MỘT SÔ HIỆU THUỐC ở HÀ NỘI, THÁI BÌNH, THANH H A VẢ NGHỆ. nấm khác trên hạt sen ở Thái Bình 22 2.2.3. Mức độ nhiễm các loài A. flavus, A. parasiticus, các chi và loài nấm khác trên hạt sen ở Thanh H a và Nghệ A n 23 2.2.4. Đặc điểm phân loại c a các chủng