BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY LÚA NƯƠNG TRỒNG TẠI HUYỆN TUY AN, TỈNH PHÚ YÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP HUỲNH THÚY PHƯƠNG MSSV: 3092432 LỚP: CNSHTT K35 Cần Thơ, Tháng 11/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp Huỳnh Thúy Phương DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Đầu tiên xin gửi lời cám ơn chân thành đến cha mẹ người gia đình sinh dưỡng dạy dỗ hôm nay! Xin chân thành cám ơn tất quý thầy cô thuộc Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học truyền đạt cho nhiểu kiến thức bổ ích trình học tập trường! Xin bày tỏ lòng sâu sắc biết ơn đến thầy hướng dẫn Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp, tận tâm dìu dắt, tận tình dẫn suốt thời gian học tập thực luận văn này! Cám ơn thầy Huỳnh Xuân Phong - cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 35 quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập lúc thực luận văn tốt nghiệp! Cám ơn chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, chị Trần Thị Giang - cán phòng thí nghiệm, chị Văn Thị Phương Như anh chị em phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật Đất - Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học tất bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 35 nhiệt tình giúp đỡ cho nhiều lời khuyên bổ ích lúc học tập thực luận văn! Cuối lời, xin kính chúc cha mẹ, quý thầy cô anh chị em vui vẻ, mạnh khỏe thành công. Chúc bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 35 báo cáo luận văn thành công tốt đẹp. Cần Thơ, ngày 21 tháng 11 năm 2013 Huỳnh Thúy Phương Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Vi khuẩn nội sinh vi khuẩn sống mô thực vật, có khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan tổng hợp IAA. Từ 25 mẫu rễ thân lúa gạo đỏ giống Tàu Cúc thu huyện Tuy An tỉnh Phú Yên phân lập hai mươi dòng vi khuẩn môi trường Nfb RMR tỉ lệ 10:10. Qua phép thử sinh hóa tất dòng vi khuẩn thỏa mãn đặc tính vi khuẩn nội sinh, phù hợp với nhiều công trình nghiên cứu trước đây. Kết cho thấy dòng AN6, AN9, AN15 AN17 có khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan tổng hợp IAA tốt nhất. Các dòng vi khuẩn phân lập xác định vi khuẩn nội sinh kỹ thuật PCR 16S rRNA. Trong kết giải trình tự cho thấy đoạn DNA dòng AN6, AN9, AN15 AN17 có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự DNA dòng Pseudomonas hibiscicola, Enterobacter cloacae, Acinetobacter radioresistens, Bacillus sp Từ khóa: đặc tính, gen 16S rRNA, lúa nương, nhận diện, vi khuẩn nội sinh ABSTRACT Plant-associated bacteria that live inside plant tissues without causing any harm to plants are defined as endophytic bacteria. Twenty bacterial isolates were isolated from root and stem of the samples taken in Tuy An, Phu Yen province. Ten isolates (AN1-AN10) were cultured on Nfb medium and ten isolates (AN1-AN10) were cultured on RMR medium. All of them were tested about the ability of nitrogen-fixation, phosphate-solubilization and IAA production. Twenty isolates were identified as endophytes by PCR 16S rRNA technique. Four of twenty isolates (AN6, AN9, AN15, AN17) were chosen to sequence, DNA sequencing was compared with Genbank database of NCBI by BLASTN software. The result showed that AN6 isolate was similarity of 99% with JQ659719 Pseudomonas hibiscicola strain R4-790; AN9 isolate was a 99% similarity with JX495602 Enterobacter cloacae strain Bio103; AN15 isolate was 97% of the identity with AB859674 Acinetobacter radioresistens strain MTCC 9821, AN17 isolate was 99% identity with KF417540 Bacillus flexus strain PHCDB8. Key words: characteristics, endophytic bacteria, identification, upland rice, 16S rRNA gene Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC MỤC LỤC .i DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT . vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .1 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Vị trí địa lý huyện Tuy An .2 2.2. Sơ lược c y lú .2 2.3. Vi khuẩn nội sinh 2.3.1. Vai trò 2.3.2. Nguồn gốc cách xâm nhập 2.3.3. Đa dạng sinh học .5 2.4. Một số đặc tính vi khuẩn nội sinh 2.4.1. Khả cố định đạm .7 2.4.2. Khả hòa tan lân khó tan 2.4.3. Khả tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) .8 2.4.4. Đối kháng sinh học 2.4.5. Sản phẩm thiên nhiên từ vi khuẩn nội sinh .10 2.4.6. Khả phân hủy sinh học .10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT 2.5. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .11 2.5.1. Ly trích hay tách chiết DNA .11 2.5.2. Phản ứng PCR .12 2.5.3. Kỹ thuật điện di .13 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Phương tiện nghiên cứu .16 3.1.1. Dụng cụ, thiết bị 16 3.1.2. Nguyên vật liệu 16 3.1.3. Hóa chất .16 3.2. Phương pháp nghiên cứu .17 3.2.1. Thu thập xử lý mẫu .17 3.2.2. Phân lập vi khuẩn 17 3.3.3. Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc .18 3.3.4. Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn .18 3.3.5. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn .18 3.3.6. Khảo sát khả cố định đạm .19 3.3.7. Khảo sát khả hòa tan lân khó tan 20 3.3.8. Khảo sát khả tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) 21 3.3.9. Nhận diện vi khuẩn nội sinh kỹ thuật PCR 22 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Kết phân lập 26 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn .27 4.3. Đặc điểm tế bào vi khuẩn 28 4.4. Khả cố định đạm .29 4.5. Khả hò t n l n khó t n .32 4.6. Khả tổng hợp IAA .34 4.7. Nhận diện dòng vi khuẩn nội sinh kỹ thuật PCR 38 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1. Kết luận .44 5.2. Đề nghị .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG ảng 1. Đường chuẩn NH4+ 20 ảng 2. Đường chuẩn P2O5 . 21 ảng 3. Đường chuẩn IAA 22 ảng 4. Thành phần phản ứng PCR . 23 ảng 5. Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập môi trường Nfb RMR 26 ảng . Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập môi trường Nfb RMR . 27 ảng . Đặc điểm tế bào 20 dòng vi khuẩn phân lập . 28 ảng . iá trị dinh dưỡng lúa gạo tính theo tỉ lệ phần trăm chất khô so với số lấy hạt khác . 51 ảng . Thành phần môi trường NFb 51 ảng 10. Thành phần môi trường RMR 52 ảng 11. Công thức môi trường Burk . 52 ảng 12. Công thức môi trường NBRIP lỏng . 53 ảng 13. Thành phần môi trường LB 53 ảng 14. ết thống kê khả cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập môi trường Nfb 53 ảng 15. ết thống kê khả cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập môi trường RMR 58 ảng . Kết so sánh nghiệm thức thông qua giá trị LSD dòng vi khuẩn phân lập môi trường Nfb RMR . 63 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cây lúa Hình 2. Azospirillum brasilense kính hiển vi điện tử, x15000 . Hình 3. Herbaspirillum seropedica . Hình 4. Azotobacter spp. . Hình 5. Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA Enterobacter cloacae Hình 6. Máy gia nhiệt (máy PCR) điện di . 15 Hình 7. Thang chuẩn . 15 Hình 8. Chu trình PCR 16S rRNA 24 Hình 9. Vi khuẩn sau 36 nuôi cấy môi trường bán đặc Nfb (trái) RMR (phải) tạo màng mỏng bề mặt môi trường 27 Hình 10. Khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh cấy môi trường Nfb RMR 27 Hình 11. Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) trung bình 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường Nfb 30 Hình 12. Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian . 30 Hình 13. Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) trung bình 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường RMR . 31 Hình 14. Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường RMR theo thời gian . 31 Hình 15. Khả hòa tan lân khó tan (mg P2O5/l) trung bình 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường Nfb 33 Hình 16. Khả hòa tan lân khó tan (mg P2O5/l) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian . 33 Hình 17. Khả hòa tan lân khó tan (mg P2O5/l) trung bình 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường RMR 34 Hình 18. Khả hòa tan lân (mg P2O5/l) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường RMR theo thời gian . 34 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 19. Khả tổng hợp IAA (mg/l) trung bình 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường Nfb 35 Hình 20. Khả tổng hợp IAA (mg/l) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian . 35 Hình 21. Khả tổng hợp IAA (mg/l) trung bình 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường RMR . 36 Hình 22. Khả tổng hợp IAA (mg/l) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường RMR theo thời gian . 36 Hình 23. Khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA trung bình 10 dòng vi khuẩn môi trường Nfb . 37 Hình 24. Khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA trung bình 10 dòng vi khuẩn môi trường RMR . 37 Hình 25. Phổ điện di sản phẩm PCR nhân lên từ đoạn 16S rRNA 20 dòng vi khuẩn . 38 Hình 26. Kết so sánh trình tự AN6 với trình tự dòng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI . 39 Hình 27. Kết so sánh trình tự AN9 với trình tự dòng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI . 40 Hình 28. Kết so sánh trình tự AN15 với trình tự dòng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI . 41 Hình 29. Kết so sánh trình tự AN17 với trình tự dòng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI . 42 Hình 30. Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ bốn dòng vi khuẩn nội sinh thực theo phương pháp Maximum-Likelihood với 1500 lần lặp lại (Bootstrap) dựa theo trình tự gen 16S rRNA . 43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Siciliano, S.D., H. Goldie and J.J. Germida. 1998. Enzymatic activity in root exudates of dahurian wild rye (Elymus dauricus) that degrades 2-chlorobenzoic acid. J Agric Food Chem 46:5–7. Siciliano, S.D., N. Fortin, A. Mihoc, G. Wisse, S. Labelle, D. Beaumier, D. Ouellette, R Roy, LG. Whyte, MK. Banks, P. Schwab, K. Lee, CW. Greer. 2001. Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination. Applied Environmental Microbiology 67:2469–2475. Taghavi, S., T. Barac, B. Greenberg, B. Borremans, J. Vangronsveld and D. Van Der Lelie. 2005. Horizontal gene transfer to endogenous endophytic bacteria from poplar improved phyto-remediation of toluene. Appl Environ Microbiol 71:8500– 8505. Theologis, A., PM. Ray. 1982 Early auxin-regulated polyadenylated mRNA sequences in pea stem tissue. Biological Science 79:418-412 Triplett, E.W. 1996. Diazotrophic endophytes: progress and prospects for nitrogen fixation in monocots. Plant Soil 186:29-38. Xu, H., M. Griffith, C. L. Patten and B. R. Glick, 1998. Isolation and characterization of an antifreeze protein with ice nucleation activity from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2. J. Appl. Microbiol. 44: 64–73. Van Aken, B., C.M. Peres, S. Lafferty Doty, J.M. Yoon and J.L. Schnoor. 2004. Methylobacterium populi sp. nov., a novel aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing bacterium isolated from poplar trees (Populus deltoides×nigra DN34). Int J Syst Evol Microbiol 54:1191–1196. Van Berkum, P., B.B. Bohlool. 1980. Evaluation of nitrogen fixation by bacteria in association with roots of tropical grasses. Microbiol. Rev. 44:491-517. Zinniel D.K., P. Lambrecht, N.B. Harris, Z. Feng, D. Kuczmarski, P. Higley, C.A. Ishimaru, A. Arunakumari, R.G. Barletta and A.K. Vidaver. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Appl. Environ. Microbiol. 68:2198-2208. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 48 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Trang web http://congnghesinhhock18.blogspot.com/2012/03/vi-khuan-noi-sinh.html (ngày 20/02/2013) http://web.mst.edu/~microbio/bio221_1999/A_brasilense.html (ngày 20/02/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Azotobacter (ngày 20/02/2013) http://biofertilizer.com/azotobacter (ngày 20/02/2013) http://funpar.ufpr.br:8088/funpar/index.php?option=com_content&view=article&id=7 (ngày 11/03/2013) http://www.cuctrongtrot.gov.vn/Tech_Science.aspx?index=detail&type=b&idtin=218 (ngày 21/03/2013) http://www2.hcmuaf.edu.vn/data/nhtri/Chuong%207%20Cac%20KT%20trong%20SH PT.pdf (ngày 20/04/2013) http://gs.ctu.edu.vn/tomtat_LATS/VSVH_NTPhong.pdf (ngày 23/04/2013) http://www.dasco.vn/chitietsanpham.php?id=5&cat=1 (ngày 25/04/2013) http://www.biogro.com.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=66&Ite mid=28&lang=vi(ngày 05/06/2013) http://duybiotech.wordpress.com/tag/li-trich-dna/ (ngày 12/06/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90i%E1%BB%87n_di (ngày 12/06/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR#Th.E1.BB.B1c_nghi.E1.BB.87m_PCR (ngày 12/06/2013) http://www.vaas.org.vn/images/caylua/01/02_giatridinhduong.htm (ngày 10/07/2013) http://www.cgenetool.com/products/Biorad_c1000.shtml (ngày 20/07/2013) http://regentsgenetictechnology.wikispaces.com/Gel+Electrophoresis+3-4, (ngày 20/07/2013) http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis/generuler-100-bpplus-dna-ladder-100-to-3000-bp/ (ngày 20/07/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 49 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT http://khotailieu.vn/f13/nghien-cuu-ung-dung-vi-khuan-noi-sinh-de-phong-tru-benhdom-la-kho-canh-ngon-keo-lai-acacia-auriculiformis-x-acacia-mangium-do-namcolletotrichum-gloeosporioides-penz-sacc-g-ay-hai-14299.html (ngày 20/07/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%BA_H%C3%B2a,_Ph%C3%BA_Y%C3%AAn (ngày 20/07/2013) http://www.phuyen.gov.vn/wps/portal/phuhoa (ngày 20/07/2013) http://www.phuyen.gov.vn/wps/portal/!ut/p/c5/04_SB8K8xLLM9MSSzPy8xBz9CP0o s3g3Z0tnT8tgYzNzSzdLA0_zQM8wZy9nAzNjA_1wkA7cKkIMIfIGOICjgb6fR 35uqn5Bdnaao6OiIgDcK8zv/dl3/d3/L2dJQSEvUUt3QS9ZQnZ3LzZfRkM5Q0k 5UzM2TjAxMDBJNzE1T0NHQjIwODY!/ (ngày 20/07/2013) http://phuyen.gov.vn/wps/portal/bando (ngày 21/07/2013) http://phanbonsumo.com.vn/chi-tiet/Kinh-nghiem-cham-soc-lua-mua--2-xanh-2-vang.48.html (ngày 23/07/2013) http://www.baophuyen.com.vn/Kinh-te-82/9905805705706405906489 (ngày 16/09/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 50 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Bảng 8. Giá trị dinh dưỡng lúa gạo tính theo tỉ lệ phần trăm chất khô so với số lấy hạt khác Hàm lượng Loại hạt Lúa Lúa mì Ngô Cao lương Tinh bột Protein Lipid Cellulose Tro Nước 62,4 63,8 69,2 71,7 7,9 16,8 10,6 12,7 2,2 2,0 4,3 3,2 9,9 2,0 2,0 1,5 5,7 1,8 1,4 1,6 11,9 13,6 12,5 9,9 (*Nguồn: http://www.vaas.org.vn/images/caylua/01/02_giatridinhduong.htm, ngày 10/07/2013) Bảng 9. Thành phần môi trường NFb (a) Hó chất Nồng độ Malic acid g/l K2HPO4 g/l MgSO4.7H2O 0,2 g/l CaCl2 0,02 g/l NaCl 0,1 g/l KOH 4,5 g/l FeEDTA (1,64%) ml/l Dung dịch nguyên tố vi lượng (a) ml/l Dung dịch vitamin (b) ml/l Bromothymol blue 0,5% KOH 0,2N ml/l Agar Môi trường đặc: g/l Môi trường bán đặc: 1, g/l pH 5,5 Dung dịch nguyên tố vi lượng gồm: 0,4 g/l CuSO4; 0,12 g/l ZnSO4.7H2O; 1,4 g/l H3BO3; 1,5 g/l MnSO4.H2O g/l Na2MoO4.2H2O (b) Dung dịch vitamin gồm: mg/l biotin (vitamin H) mg/l pyridoxine-HCl (*Nguồn: Kireg and Dobereiner, 1984) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Bảng 10. Thành phần môi trường RMR Dung dịch A Dung dịch Hó chất Nồng độ KH2PO4 0,2 g/l K2HPO4 0,8 g/l NaCl 0,1 g/l Mannitol g/l Malic acid g/l Sucrose g/l Na2MoO4.2H2O 25 mg/l Na2FeEDTA 28 mg/l Yeast extract 100 mg/l Sodium lactase 60% 0,5 ml/l Agar Môi trường đặc: g/l Môi trường bán đặc: 1, g/l Nước cất 900 ml pH 7,0 MgSO4.7H2O 0,2 g/l CaCl2.2H2O 0,06 g/l Nước cất 100 ml/l (*Nguồn: Elbeltagy et al., 2001) Các dung dịch A dung dịch B sau khử trùng riêng lẻ trộn lại với bổ xung thên µg/l biotin, 1,25 ml dịch trích chồi lúa với ethanol 1,25 ml dịch trích chồi lúa với nước cất khử trùng qua lọc. Bảng 11. Công thức môi trường Burk Hó chất Nồng độ (g/l) Sucrose 10 KH2PO4 0,41 K2HPO4 0,52 Na2SO4 0,05 CaCl2 0,2 MgSO4.7H2O 0,1 FeSO4.7H2O 0,005 Na2MoO4.2H2O 0,0025 Agar cho môi trường đặc 1, cho môi trường bán đặc pH 7,0 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Bảng 12. Công thức môi trường NBRIP lỏng Hó chất Nồng độ (g/l) Sucrose 10 Apatit MgCl2.6H2O MgSO4.7H2O 0,25 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1 pH 7,0 (*Nguồn: Nautiyal, 1999) Bảng 13. Thành phần môi trường LB Hóa chất Nồng độ (g/l) Bacto tryptone 10 Bacto yeast extract NaCl 10 (*Nguồn: Sambrook and Russell, 2001, Gerhardt, et al. 1994) Bảng 14. Kết thống kê khả cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập môi trường Nfb LL2 LL3 Hàm lượng N (mg/l) TC TB BP1 NT Ngày DC LL1 BP2 BP3 0,01 0,02 0,02 0,05 0,02 AN1 0,68 0,65 0,73 2,06 AN2 0,39 0,37 0,44 AN3 0,49 0,58 AN4 0,49 AN5 BP TB 0,0001 0,0004 0,0004 0,0025 0,69 0,4594 0,4276 0,5264 4,2324 1,20 0,40 0,1532 0,1351 0,1928 1,4354 0,61 1,68 0,56 0,2370 0,3391 0,3675 2,8070 0,51 0,56 1,56 0,52 0,2370 0,2609 0,3119 2,4214 1,54 1,51 1,49 4,54 1,51 2,3623 2,2896 2,2179 20,6060 AN6 3,64 3,71 3,66 11,01 3,67 13,2295 AN7 1,92 1,97 2,04 5,92 1,97 3,6820 3,8675 4,1542 35,0894 AN8 1,06 1,04 1,08 3,18 1,06 1,1229 1,0729 1,1740 10,1060 AN9 4,21 4,23 4,26 12,70 4,23 17,7243 AN10 1,63 1,54 1,56 4,73 48,62 1,58 2,6649 13,7554 13,4036 121,1576 17,9258 18,1285 161,3324 2,3623 127,229 2,4363 22,3758 381,5659 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Ngày DC 0,01 0,02 0,02 0,05 0,02 0,0001 AN1 5,81 5,82 5,86 17,49 5,83 33,7454 AN2 1,05 1,13 1,10 3,28 1,09 1,1060 AN3 4,31 4,31 4,34 12,95 4,32 18,5479 AN4 1,36 1,40 1,43 4,19 1,40 1,8622 1,9486 2,0370 17,5376 AN5 2,24 2,23 2,21 6,68 2,23 5,0221 4,9522 4,8828 44,5697 AN6 6,18 6,14 6,09 18,41 6,14 38,2501 37,6715 37,0974 339,0439 AN7 4,15 4,13 4,06 12,34 4,11 17,2244 17,0948 16,4539 152,3042 AN8 2,68 2,73 2,69 8,10 2,70 7,1780 AN9 6,47 6,45 6,50 19,41 6,47 41,8137 AN10 2,12 2,18 2,15 6,44 109,35 2,15 4,4766 4,7454 507,316 4,6101 41,4905 1521,883 Ngày DC 0,01 0,01 0,02 0,04 0,01 0,0001 0,0001 0,0004 0,0016 AN1 4,55 4,49 4,55 13,60 4,53 20,7428 20,1277 20,7428 184,8305 AN2 4,42 4,38 4,32 13,12 4,37 19,5220 19,2226 18,6307 172,1094 AN3 3,53 3,57 3,60 10,70 3,57 12,4893 12,7308 12,9747 114,5774 AN4 4,01 3,91 3,98 11,89 3,96 16,0817 15,2737 15,8101 141,4805 AN5 5,51 5,61 5,61 16,72 5,57 30,3249 31,4591 31,4591 279,7086 AN6 4,28 4,28 4,32 12,88 4,29 18,3382 18,3382 18,6307 165,9189 AN7 3,87 3,98 3,94 11,79 3,93 15,0090 15,8101 15,5408 139,0635 AN8 2,58 2,51 2,62 7,71 2,57 6,6648 AN9 3,60 3,74 3,64 10,98 3,66 12,9747 AN10 1,22 1,09 1,15 3,46 112,90 1,15 1,4911 1,1773 463,251 1,3296 11,9660 1389,598 Ngày DC 0,01 0,02 0,03 0,06 0,02 0,0001 0,0004 0,0009 0,0036 AN1 2,30 2,35 2,29 6,95 2,32 5,3087 5,5458 5,2503 48,3078 AN2 2,91 2,89 2,89 8,69 2,90 8,4958 8,3481 8,3481 75,5749 AN3 1,49 1,53 1,54 4,56 1,52 2,2196 2,3348 2,3738 20,7801 AN4 2,15 2,18 2,16 6,49 2,16 4,6285 4,7387 4,6834 42,1508 AN5 3,04 3,03 3,03 9,10 3,03 9,2537 9,1764 9,1764 82,8193 AN6 2,84 2,80 2,81 8,45 2,82 8,0566 7,8414 7,9128 71,4305 AN7 1,74 1,72 1,74 5,21 1,74 3,0425 2,9544 3,0425 27,1168 AN8 1,24 1,26 1,27 3,77 1,26 1,5261 1,5897 1,6219 14,2108 AN9 2,46 2,43 2,42 7,31 2,44 6,0356 5,9112 5,8495 53,3866 AN10 0,98 0,99 1,02 2,99 63,58 1,00 0,9622 0,9873 148,255 1,0385 8,9619 444,7431 Tổng = 334,4 CF = 847,8 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 0,0004 0,0004 0,0025 33,9274 34,2930 305,8941 1,2767 1,2069 10,7592 18,5479 18,8185 167,7410 7,4318 7,2621 65,6125 41,6116 42,2195 376,9310 6,3182 6,8416 59,4577 13,9734 13,2209 120,4768 2,5337 CV (%) = 1,44 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT ANOVA Nguồn NT VK TĐ V XTĐ Sai số Tổng df 43 10 30 88 131 SS 398,553 180,5 95,3194 122,734 0,11761 398,671 MS 9,269 18,05 31,77 4,091 0,001 F tính 6934,97 13505,26 23773,1 3061,06 Ngày Ngày Ngày Ngày LSD.01 (Tương tác) = F bảng 5% 1% 1,54 1,84 1,95 2,55 2,72 4,04 1,61 1,94 48,61802 109,3458 112,8971 63,58417 2363,712 11956,5 12745,76 4042,947 31108,92 LSD.01 = 1,473 3,314 3,421 1,927 0,024 0,079 Hàm lượng l n dễ tiêu (mg/l) NT LL1 LL2 LL3 TC TB BP1 BP2 BP3 BP TB Ngày DC 0,01 0,03 0,04 0,08 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 AN1 47,38 48,27 47,91 143,56 47,85 2244,91 2329,56 2295,51 20608,76 AN2 31,10 31,45 31,45 94,00 31,33 967,04 989,19 989,19 8836,00 AN3 15,88 15,88 16,58 48,34 16,11 252,05 252,05 275,03 2336,40 AN4 25,08 25,79 25,26 76,12 25,37 628,99 665,00 637,90 5794,85 AN5 114,64 115,35 114,81 344,80 114,93 13141,68 13304,50 13182,29 118884,60 AN6 173,40 173,22 173,04 519,66 173,22 30066,95 30005,60 29944,31 270050,38 AN7 162,07 161,72 161,54 485,33 161,78 26266,94 26152,33 26095,11 235542,72 AN8 17,65 17,82 17,65 53,12 17,71 311,38 317,66 311,38 2821,21 AN9 54,11 53,93 54,46 162,50 54,17 2927,48 2908,36 2965,91 26404,81 AN10 51,63 51,81 51,63 155,06 51,69 2665,48 2683,79 2665,48 24044,21 2082,56 238443,07 715323,93 Ngày 10 DC 0,01 0,03 0,01 0,05 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 AN1 78,69 78,39 78,39 235,47 78,49 6192,39 6145,15 6145,15 55447,86 AN2 73,88 74,63 74,48 222,99 74,33 5458,21 5569,87 5547,45 49725,65 AN3 41,10 41,55 41,70 124,35 41,45 1689,02 1726,31 1738,83 15461,89 AN4 47,71 47,41 47,56 142,69 47,56 2276,65 2248,04 2262,33 20360,93 AN5 124,71 125,01 125,31 375,02 125,01 15551,78 15626,88 15702,16 140641,92 AN6 224,86 224,71 225,01 674,57 224,86 50560,73 50493,13 50628,38 455046,61 AN7 170,42 170,12 170,87 511,41 170,47 29043,34 28940,92 29197,30 261543,80 AN8 31,77 32,53 32,38 96,68 32,23 1009,61 1057,96 1048,20 9346,38 AN9 121,10 120,50 121,25 362,84 120,95 14664,66 14519,34 14701,11 131654,39 AN10 86,21 86,66 85,91 258,78 86,26 7432,25 7510,24 7380,49 66968,10 3004,86 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 402067,90 1206197,5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Ngày 15 DC 0,03 0,04 0,03 0,10 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 AN1 62,65 63,49 63,07 189,21 63,07 3924,76 4031,36 3977,88 35800,90 AN2 70,82 71,10 71,24 213,15 71,05 5015,03 5055,01 5075,06 45435,02 AN3 35,04 34,90 35,18 105,13 35,04 1227,96 1218,11 1237,85 11051,64 AN4 44,62 44,62 44,76 134,00 44,67 1990,92 1990,92 2003,51 17956,00 AN5 139,83 140,54 140,11 420,48 140,16 19552,70 19750,15 19631,56 176802,48 AN6 171,94 171,80 171,24 514,99 171,66 29564,62 29516,21 29322,94 265210,49 AN7 162,37 162,79 163,07 488,23 162,74 26362,78 26500,17 26591,96 238363,99 AN8 29,13 29,55 29,27 87,94 29,31 848,37 873,16 856,59 7734,09 AN9 89,69 89,83 90,11 269,63 89,88 8044,32 8069,61 8120,29 72702,39 AN10 93,63 94,06 93,35 281,04 93,68 8767,29 8846,59 8714,62 78984,75 2703,90 316682,31 950041,77 Ngày 20 DC 0,04 0,04 0,04 0,12 0,04 0,00 0,00 0,00 0,01 AN1 64,03 63,40 63,56 190,99 63,66 4100,03 4019,76 4039,75 36477,99 AN2 66,55 65,92 66,71 199,18 66,39 4429,06 4345,61 4450,05 39673,11 AN3 33,80 33,64 33,64 101,07 33,69 1142,12 1131,50 1131,50 10215,32 AN4 36,63 36,94 36,79 110,36 36,79 1341,75 1364,92 1353,31 12179,82 AN5 135,84 135,21 136,00 407,06 135,69 18453,19 18282,45 18496,00 165693,87 AN6 126,71 126,39 126,55 379,65 126,55 16055,08 15975,37 16015,20 144136,81 AN7 139,94 140,72 140,41 421,07 140,36 19582,37 19803,36 19714,81 177300,67 AN8 26,87 27,34 27,18 81,39 27,13 721,79 747,40 738,81 6623,65 AN9 75,37 76,16 75,69 227,21 75,74 5680,65 5799,96 5728,23 51625,56 AN10 75,37 76,16 75,84 227,37 75,79 5680,65 5799,96 5752,09 51697,15 2345,47 CF = Tổng = 778444 10137 231876,74 695623,98 76,794 CV (%) = 0,38 ANOVA F bảng Nguồn NT df 43 SS 410618 MS 9549 F tính 5% 1% 110458,05 1,54 1,84 VK 10 376087 37609 435026,51 1,95 2,55 TĐ 14846,1 4949 57242,36 2,72 4,04 V XTĐ 30 19685,3 656,2 7590,13 1,61 1,94 Sai số 88 7,60773 0,086 Tổng 131 410626 Ngày 2082,558 4337047 63,108 Ngày 3004,862 9029196 91,056 Ngày 2703,903 7311090 81,936 Ngày 2345,474 5501250 71,075 26178583 LSD.01 = LSD.01 (Tương tác) = Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 0,193 0,639 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 NT Ngày DC AN1 AN2 AN3 AN4 AN5 AN6 AN7 AN8 AN9 AN10 LL1 LL2 LL3 0,02 6,43 6,14 6,71 9,29 3,86 4,71 6,71 7,86 28,71 8,14 0,03 6,71 6,14 7,00 9,57 3,86 4,71 6,71 7,29 29,00 7,57 0,02 5,86 6,43 6,71 9,00 4,14 4,71 7,00 7,57 29,86 7,86 Trường ĐHCT Hàm lượng IAA (mg/l) TC TB BP1 0,07 19,00 18,71 20,43 27,86 11,86 14,14 20,43 22,71 87,57 23,57 266,36 0,02 6,33 6,24 6,81 9,29 3,95 4,71 6,81 7,57 29,19 7,86 0,00 41,33 37,73 45,08 86,22 14,88 22,22 45,08 61,73 824,51 66,31 BP2 0,00 45,08 37,73 49,00 91,61 14,88 22,22 45,08 53,08 841,00 57,33 3802,74 BP3 0,00 34,31 41,33 45,08 81,00 17,16 22,22 49,00 57,33 891,45 61,73 BP TB 0,00 361,00 350,22 417,33 776,02 140,59 200,02 417,33 515,94 7668,76 555,61 11402,82 Ngày DC AN1 AN2 AN3 AN4 AN5 AN6 AN7 AN8 AN9 AN10 0,01 12,30 11,34 7,94 9,43 3,89 5,38 7,30 5,38 28,47 5,91 0,02 12,19 11,13 7,83 9,43 3,79 5,06 7,19 5,60 28,26 5,91 0,01 12,19 11,34 7,72 9,21 3,68 5,17 7,51 5,38 28,36 5,60 0,04 36,68 33,81 23,49 28,06 11,36 15,62 22,00 16,36 85,09 17,43 289,93 0,01 12,23 11,27 7,83 9,35 3,79 5,21 7,33 5,45 28,36 5,81 0,00 151,24 128,61 62,98 88,84 15,16 28,98 53,26 28,98 810,43 34,99 0,00 148,63 123,82 61,31 88,84 14,34 25,64 51,72 31,31 798,36 34,99 4165,55 0,00 148,63 128,61 59,65 84,88 13,55 26,73 56,41 28,98 804,39 31,31 0,00 1345,48 1143,02 551,75 787,58 129,09 243,89 484,00 267,71 7239,48 303,65 12495,64 Ngày DC AN1 AN2 AN3 AN4 AN5 AN6 AN7 AN8 AN9 AN10 0,03 11,63 10,44 5,92 6,75 4,37 2,94 5,68 4,13 18,18 3,77 0,02 11,87 10,80 5,80 6,87 4,25 2,82 5,44 3,89 17,94 3,65 0,02 11,51 10,80 5,68 6,63 4,37 2,46 5,44 3,77 18,06 3,54 0,07 35,01 32,04 17,39 20,25 12,99 8,23 16,56 11,80 54,18 10,96 219,47 0,02 11,67 10,68 5,80 6,75 4,33 2,74 5,52 3,93 18,06 3,65 0,00 135,28 109,00 35,01 45,56 19,09 8,65 32,25 17,06 330,46 14,24 0,00 140,87 116,59 33,61 47,18 18,06 7,96 29,60 15,15 321,86 13,36 2223,83 0,00 132,52 116,59 32,25 43,97 19,09 6,07 29,60 14,24 326,15 12,50 0,00 1225,83 1026,29 302,51 410,06 168,69 67,67 274,22 139,18 2935,32 120,22 6669,99 Ngày DC AN1 AN2 AN3 AN4 AN5 AN6 AN7 AN8 AN9 AN10 0,02 8,72 4,51 3,07 2,93 2,01 1,62 3,59 1,09 8,99 1,09 0,03 8,20 4,51 3,20 2,93 2,14 1,75 3,46 1,22 8,72 1,36 0,05 8,59 5,96 3,07 2,80 2,41 1,49 3,33 1,49 8,86 1,49 0,10 25,51 14,99 9,33 8,67 6,57 4,86 10,38 3,80 26,57 3,93 114,71 890,47 0,03 8,50 5,00 3,11 2,89 2,19 1,62 3,46 1,27 8,86 1,31 0,00 76,10 20,37 9,40 8,61 4,05 2,62 12,90 1,19 80,76 1,19 0,00 67,20 20,37 10,22 8,61 4,60 3,06 11,98 1,50 76,10 1,84 651,21 0,00 73,82 35,53 9,40 7,85 5,80 2,21 11,08 2,21 78,42 2,21 0,01 650,92 224,61 87,03 75,19 43,11 23,57 107,78 14,46 705,74 15,48 1947,89 CV (%) = 3,37 CF = Tổng = 6007,09 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 6,75 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT ANOVA Nguồn NT VK TĐ V XTĐ Sai số Tổng df 43,00 10,00 3,00 30,00 88,00 131,00 SS 4831,69 3526,59 548,47 756,64 4,55 4836,25 MS 112,36 352,66 182,82 25,22 0,05 F tính 2171,86 6816,41 3533,70 487,49 F bảng 0,05 1,54 1,95 2,72 1,61 Ngày Ngày Ngày Ngày 266,36 289,93 219,47 114,71 LSD.01 (Tương tác = 0,01 1,84 2,55 4,04 1,94 70945,37 84061,50 48169,17 13157,30 216333,34 LSD.01 = 8,07 8,79 6,65 3,48 0,15 0,49 Bảng 15. Kết thống kê khả cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập môi trường RMR NT Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 LL1 LL2 LL3 Hàm lượng N (mg/l) TC TB BP1 BP2 BP3 BP TB 0,01 1,16 3,83 3,64 3,64 6,98 4,88 5,36 6,88 5,36 5,64 0,02 1,20 3,92 3,66 3,64 7,03 4,93 5,38 6,84 5,38 5,74 0,02 1,25 3,88 3,68 3,68 7,05 4,90 5,40 6,93 5,40 5,69 0,05 3,61 11,63 10,98 10,96 21,05 14,71 16,14 20,65 16,14 17,07 142,99 0,02 1,20 3,88 3,66 3,65 7,02 4,90 5,38 6,88 5,38 5,69 0,00 1,33 14,65 13,23 13,23 48,70 23,80 28,68 47,38 28,68 31,83 0,000 1,447 15,395 13,404 13,229 49,368 24,266 28,939 46,722 28,939 32,919 762,427 0,000 1,564 15,023 13,579 13,579 49,704 24,031 29,196 48,036 29,196 32,373 0,003 13,022 135,203 120,633 120,109 443,309 216,279 260,449 426,388 260,449 291,358 2287,201 0,01 1,74 4,09 3,99 4,87 7,22 3,43 5,56 4,93 5,00 3,43 0,02 1,76 4,06 4,03 4,89 7,28 3,46 5,61 4,89 5,04 3,45 0,02 1,77 4,07 4,06 4,89 7,23 3,48 5,62 4,92 5,03 3,48 0,05 5,27 12,22 12,08 14,64 21,73 10,37 16,79 14,74 15,06 10,35 133,29 0,02 1,76 4,07 4,03 4,88 7,24 3,46 5,60 4,91 5,02 3,45 0,00 3,03 16,71 15,95 23,72 52,09 11,77 30,90 24,33 24,95 11,77 0,000 3,083 16,454 16,201 23,871 53,000 11,983 31,423 23,871 25,424 11,875 649,991 0,000 3,138 16,581 16,454 23,871 52,319 12,092 31,599 24,177 25,267 12,092 0,003 27,748 149,230 145,808 214,377 472,229 107,523 281,756 217,136 226,929 107,199 1949,937 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,01 1,29 3,60 2,72 1,22 4,69 2,65 4,96 2,92 3,53 3,19 0,01 1,26 3,53 2,62 1,09 4,66 2,51 5,00 2,89 3,64 3,13 0,02 1,15 3,57 2,55 1,15 4,55 2,62 5,03 2,96 3,53 3,23 0,04 3,70 10,70 7,88 3,46 13,90 7,78 14,99 8,77 10,70 9,55 91,47 0,01 1,23 3,57 2,63 1,15 4,63 2,59 5,00 2,92 3,57 3,18 0,00 1,66 12,97 7,39 1,49 22,00 7,02 24,63 8,54 12,49 10,20 0,000 1,575 12,489 6,842 1,177 21,683 6,318 24,966 8,339 13,221 9,771 321,187 0,000 1,330 12,731 6,490 1,330 20,743 6,842 25,307 8,737 12,489 10,419 0,002 13,670 114,577 62,109 11,966 193,248 60,511 224,694 76,831 114,577 91,157 963,342 Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,01 1,16 2,25 2,00 0,93 2,66 2,05 1,44 0,90 1,69 1,77 0,02 1,16 2,27 2,01 0,88 2,65 2,08 1,43 0,88 1,66 1,74 0,03 1,13 2,28 2,04 0,92 2,67 2,04 1,40 0,89 1,67 1,76 0,06 3,45 6,80 6,05 2,73 7,98 6,16 4,27 2,68 5,02 5,27 50,45 0,02 1,15 2,27 2,02 0,91 2,66 2,05 1,42 0,89 1,67 1,76 0,00 1,34 5,08 3,99 0,86 7,08 4,20 2,07 0,82 2,87 3,13 0,0004 1,34336 5,13432 4,04593 0,77288 7,00969 4,30589 2,03407 0,77288 2,73974 3,04249 94,0373 0,0009 1,285 5,1921 4,1489 0,8414 7,1451 4,1489 1,9621 0,7954 2,782 3,087 0,0036 11,91391 46,20886 36,5671 7,433601 63,69502 37,96504 18,19793 7,158688 25,16567 27,78336 282,0928 Tổng = 1324,9 418,2 CV (%) = 1,16 CF = 3,16817 ANOVA Nguồn NT VK TĐ V XTĐ Sai số Tổng df 43 10 30 88 131 SS 502,6 254,28 163,66 84,668 0,1187 502,72 MS 11,69 25,43 54,55 2,822 0,001 LSD.01 (Tương tác = Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến F tính 8665,21 18850,86 40442,4 2092,27 F bảng 5% 1,54 1,95 2,72 1,61 Ngày Ngày Ngày Ngày 142,986 133,289 91,4686 50,4544 1% 1,84 2,55 4,04 1,94 20444,87 17766,07 8366,5 2545,647 49123,09 LSD.01 = 4,333 4,039 2,772 1,529 0,024 0,080 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 NT Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 LL1 0,01 7,03 13,04 65,08 5,61 140,12 44,55 39,24 5,26 10,21 12,69 LL2 LL3 Trường ĐHCT Hàm lượng l n dễ tiêu (mg/l) TC TB BP1 0,03 0,04 7,56 6,67 13,75 12,87 65,43 65,96 5,96 5,61 140,48 140,30 45,08 44,73 39,42 39,42 41,19 40,30 10,74 10,92 13,22 12,87 0,08 0,03 21,26 7,09 39,66 13,22 196,48 65,49 17,19 5,73 420,90 140,30 134,35 44,78 118,07 39,36 86,74 28,91 31,88 10,63 38,78 12,93 1105,39 0,00 49,37 170,15 4235,36 31,48 19634,71 1984,58 1539,69 27,63 104,29 161,04 BP2 BP3 BP TB 0,00 57,12 189,12 4281,56 35,58 19734,03 2032,17 1553,62 1696,27 115,42 174,80 87548,23 0,00 44,52 165,57 4351,33 31,48 19684,34 2000,38 1553,62 1624,16 119,25 165,57 0,01 451,84 1573,21 38603,56 295,35 177159,04 18050,99 13940,71 7524,41 1016,09 1503,79 260119,01 Ngày 10 DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,01 35,38 16,44 71,17 14,63 270,72 56,74 118,09 43,20 29,22 41,40 0,03 0,01 35,53 35,53 17,04 16,74 70,87 71,62 14,93 15,23 270,12 270,27 56,14 56,44 117,49 117,79 43,05 43,05 29,37 29,22 41,40 41,55 0,05 0,02 106,45 35,48 50,21 16,74 213,67 71,22 44,80 14,93 811,11 270,37 169,31 56,44 353,37 117,79 129,31 43,10 87,80 29,27 124,35 41,45 2090,43 0,00 1251,99 270,15 5065,59 214,08 73290,30 3219,07 13945,30 1866,50 853,69 1713,84 0,00 1262,65 290,28 5022,87 222,97 72964,98 3151,18 13803,60 1853,53 862,50 1713,84 304282,9 0,00 1262,65 280,12 5130,01 232,05 73046,24 3185,03 13874,36 1853,53 853,69 1726,31 0,00 11331,84 2521,10 45654,52 2006,77 657903,95 28665,29 124869,24 16720,63 7709,63 15461,89 912844,86 Ngày 15 DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,03 28,85 16,17 74,48 35,32 244,34 38,14 125,46 88,56 28,56 40,96 0,04 0,03 29,27 28,56 16,59 16,17 74,34 74,62 34,90 34,90 244,76 244,48 38,70 38,42 125,04 124,90 88,70 88,42 29,13 28,85 41,24 41,52 0,10 0,03 86,68 28,89 48,93 16,31 223,44 74,48 105,13 35,04 733,58 244,53 115,27 38,42 375,41 125,14 265,69 88,56 86,54 28,85 123,72 41,24 2164,47 0,00 832,04 261,44 5547,10 1247,78 59701,07 1454,72 15741,41 7843,47 815,87 1677,54 0,00 856,59 275,28 5526,14 1218,11 59907,73 1498,02 15635,57 7868,44 848,37 1700,69 285542,1 0,00 815,87 261,44 5568,10 1218,11 59769,92 1476,29 15600,36 7818,54 832,04 1724,00 0,01 7512,74 2394,10 49923,92 11051,64 538135,90 13286,62 140931,50 70591,25 7488,34 15306,22 856622,25 Ngày 20 DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,04 20,88 16,47 63,72 33,17 173,95 39,15 86,39 82,93 18,99 40,41 0,04 0,04 21,04 21,35 17,10 16,79 64,03 63,56 33,95 33,64 173,80 173,48 39,62 39,78 86,87 86,39 83,40 83,24 19,46 19,62 41,20 40,72 0,12 0,04 63,28 21,09 50,36 16,79 191,31 63,77 100,76 33,59 521,23 173,74 118,55 39,52 259,65 86,55 249,57 83,19 58,08 19,36 122,33 40,78 1735,24 7095,52 53,75 0,00 436,05 271,34 4059,80 1099,94 30259,56 1532,69 7463,87 6877,24 360,70 1632,92 0,00 442,66 292,49 4100,03 1152,79 30204,80 1569,91 7545,73 6955,82 378,87 1697,18 162358,3 0,00 456,01 281,82 4039,75 1131,50 30095,42 1582,41 7463,87 6929,58 385,02 1658,48 0,01 4003,80 2536,35 36598,40 10151,75 271678,99 14054,38 67419,96 62287,58 3373,14 14964,80 487069,18 CF = Tổng = 381412,15 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến CV (%) = 5,77 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT ANOVA Nguồn NT VK TĐ V XTĐ Sai số Tổng df 43,00 10,00 3,00 30,00 88,00 131,00 SS 457472,95 396478,24 21246,40 39748,30 846,34 458319,29 MS 10638,91 39647,82 7082,13 1324,94 9,62 F tính 1106,21 4122,48 736,38 137,76 Ngày Ngày Ngày Ngày F bảng 0,05 1,54 1,95 2,72 1,61 1105,39 2090,43 2164,47 1735,24 0,01 1,84 2,55 4,04 1,94 1221886,47 4369880,61 4684913,92 3011051,30 13287732,29 LSD.01 = 33,50 63,35 65,59 52,58 2,03 LSD.01 (Tương tác) = 6,74 NT Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 LL1 LL2 Hàm lượng IAA (mg/l) LL3 TC TB BP1 0,02 15,29 13,00 7,29 9,57 22,14 15,57 10,14 13,00 21,57 8,43 0,03 15,00 12,43 7,29 9,29 22,43 14,71 9,86 13,57 20,71 8,14 0,02 14,71 12,71 7,57 9,57 21,57 15,57 10,14 13,57 21,29 8,43 0,07 45,00 38,14 22,14 28,43 66,14 45,86 30,14 40,14 63,57 25,00 404,64 0,02 15,00 12,71 7,38 9,48 22,05 15,29 10,05 13,38 21,19 8,33 0,00 233,65 169,00 53,08 91,61 490,31 242,47 102,88 169,00 465,33 71,04 BP2 BP3 0,00 225,00 154,47 53,08 86,22 503,04 216,51 97,16 184,18 429,08 66,31 6149,51 0,00 216,51 161,65 57,33 91,61 465,33 242,47 102,88 184,18 453,08 71,04 BP TB 0,00 2025,00 1454,88 490,31 808,18 4374,88 2102,88 908,59 1611,45 4041,33 625,00 18442,49 Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,01 15,60 12,19 10,06 11,02 21,13 10,91 13,68 13,79 23,04 11,23 0,02 15,38 11,98 9,85 11,13 20,91 11,13 13,47 13,68 22,83 11,34 0,01 15,49 12,19 9,85 11,02 21,02 11,02 13,57 13,57 22,94 11,13 0,04 46,47 36,36 29,77 33,17 63,06 33,06 40,72 41,04 68,81 33,70 426,21 0,01 15,49 12,12 9,92 11,06 21,02 11,02 13,57 13,68 22,94 11,23 0,00 243,23 148,63 101,28 121,47 446,38 119,13 187,17 190,09 530,96 126,20 0,00 236,64 143,49 97,04 123,82 437,43 123,82 181,39 187,17 521,20 128,61 6584,00 0,00 239,92 148,63 97,04 121,47 441,89 121,47 184,27 184,27 526,07 123,82 0,00 2159,28 1322,17 886,01 1100,26 3977,05 1093,22 1658,40 1684,49 4734,61 1135,83 19751,33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,03 12,46 10,92 15,68 11,75 16,75 10,80 11,75 11,99 15,68 16,87 0,02 11,99 10,80 15,44 11,75 16,51 10,56 11,75 11,87 15,44 16,75 0,02 12,23 10,80 15,56 11,99 16,87 10,80 11,87 11,99 15,56 16,63 Trường ĐHCT 0,07 36,68 32,51 46,68 35,49 50,13 32,15 35,37 35,85 46,68 50,25 401,86 0,02 12,23 10,84 15,56 11,83 16,71 10,72 11,79 11,95 15,56 16,75 0,00 155,36 119,17 245,82 138,06 280,56 116,59 138,06 143,71 245,82 284,56 0,00 143,71 116,59 238,41 138,06 272,64 111,50 138,06 140,87 238,41 280,56 5542,86 0,00 149,48 116,59 242,10 143,71 284,56 116,59 140,87 143,71 242,10 276,59 0,00 1345,32 1057,02 2178,89 1259,40 2513,11 1033,93 1250,97 1284,88 2178,89 2525,06 16627,48 Ngày DC AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 0,02 10,17 8,59 12,41 7,28 10,57 6,49 7,14 11,49 9,78 10,96 0,03 10,04 9,12 12,28 7,01 10,43 6,36 6,75 10,96 9,38 11,22 0,05 9,91 8,72 11,75 6,75 10,04 6,22 7,14 11,36 9,64 10,70 0,10 30,12 26,43 36,43 21,04 31,04 19,07 21,04 33,80 28,80 32,88 280,76 0,03 10,04 8,81 12,14 7,01 10,35 6,36 7,01 11,27 9,60 10,96 0,00 103,45 73,82 153,96 52,94 111,64 42,08 51,05 131,95 95,58 120,13 0,00 100,79 83,15 150,71 49,18 108,87 40,39 45,56 120,13 88,01 125,97 2734,23 0,00 98,17 76,10 138,06 45,56 100,79 38,73 51,05 128,94 93,02 114,43 0,01 907,12 698,77 1327,45 442,66 963,45 363,50 442,66 1142,62 829,59 1081,20 8199,03 CF = Tổng = 1513,47 17352,86 11,47 CV (%) = 1,82 ANOVA Nguồn NT VK TĐ V XTĐ df 43,00 10,00 3,00 30,00 SS 3653,92 2522,94 395,71 735,26 MS 84,97 252,29 131,90 24,51 Sai số 88,00 3,83 0,04 Tổng 131,00 3657,75 LSD.01 (Tương tác = Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến F tính 1951,13 5792,98 3028,69 562,75 F bảng 0,05 1,54 1,95 2,72 1,61 Ngày Ngày Ngày Ngày 404,64 426,21 401,86 280,76 0,01 1,84 2,55 4,04 1,94 163734,69 181655,15 161488,02 78825,00 585702,84 12,26 12,92 12,18 8,51 LSD.01 = 0,14 0,45 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Bảng 16. Kết so sánh nghiệm thức thông qua giá trị LSD dòng vi khuẩn phân lập môi trường Nfb RMR Môi trường RMR Môi trường Nfb Nghiệm thức AN1 AN2 AN3 AN4 AN5 AN6 AN7 AN8 AN9 AN10 LSD.01 = CV (%) Đạm Lân IAA 3,34b 2,19f 2,49e 2,01g 3,09c 4,23a 2,94d 1,90h 4,20a 1,47i 63,27f 60,78g 31,57i 38,60h 128,95c 174,07a 158,84b 26,59k 85,18d 76,85e 9,68b 8,30c 5,89e 7,07d 3,56g 3,57g 5,78e 4,56f 21,12a 4,66f 0,038 0,309 1,44 0,38 Nghiệm thức AN11 AN12 AN13 AN14 AN15 AN16 AN17 AN18 AN19 AN20 Đạm Lân IAA 1,34h 3,45f 3,08f 2,65g 5,39a 3,25e 4,35b 3,90c 3,91cd 3,52de 23,14g 15,76h 68,74c 22,32g 207,24a 44,79e 92,21b 60,94d 22,02g 34,10f 13,19b 11,12e 11,25e 9,84h 17,53a 10,85f 10,61g 12,57c 17,32a 11,82d 0,239 0,039 3,261 0,219 3,37 1,16 5,77 1,82 Những số theo sau chữ (cùng cột) không khác biệt ý nghĩa mức độ 1% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... thiết để đạt được đầy đủ tiềm năng và hiệu quả cho các ứng dụng thực tiễn trong tương lai 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện vi khuẩn nội sinh ở cây lúa nương trồng tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên nhằm chọn ra một số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 1 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại... CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Vị trí địa lý huyện Tuy An Huyện Tuy An thuộc địa phận hành chính tỉnh Phú Yên, vùng Duyên hải Nam Trung Bộ Vị trí huyện nằm ven biển tỉnh Phú Yên, phía bắc giáp với thị xã Sông Cầu và Đồng Xuân, phía nam là thành phố Tuy Hòa, phía Tây giáp với huyện Sơn Hòa và phía đông là biển Đông Địa hình ở Tuy An đa dạng gồm có đồi núi, đồng bằng và biển Tuy An nằm ở phía Đông dãy... giống lúa Tàu cúc được nhiều người dân lựa chọn vì có thời gian sinh trưởng phù hợp và năng suất khá; 2 giống Bát quạt, Đuôi nai có thời gian sinh trưởng dài hơn nên số hộ dân sản xuất các giống này không còn nhiều 2.3 Vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn cư trú trong các mô sống của cây chủ mà không làm tổn hại đến cây (Misaghi et al., 1990) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 3 Vi n... 99% 3.3.9 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR A Ly trích DNA của vi khuẩn Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng và lắc ủ qua đêm Chuyển 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tube eppendoft 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường và tủa vi khuẩn Loại bỏ phần dung dịch trong có trong tube, giữ lại phần cặn Cho 250µl dung dịch TE pH8 vào phần... khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở trong tủ lạnh và được xem là một dòng vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 17 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT 3.3.3 Qu n sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc ta đồng... thập và xử lý mẫu Mẫu lúa nương đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh, có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh nhiều nhất được thu tại nhiều địa điểm khác nhau tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, loại bỏ những lá già, để ráo tự nhiên; cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ bằng dao bén, để riêng trong túi nylon sạch, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa phân. .. quyển, và giải phóng dưới dạng các ion amoni vào đất Đại diện đầu tiên của chi, Azotobacter chroococcum, được phát hiện và mô tả năm 1 01 bởi nhà vi sinh học và thực vật học người Hà Lan Martinus Beijerinck Azotobacter là vi khuẩn Gram âm Chúng được tìm thấy trong đất trung tính và kiềm, trong nước và sống nội sinh trong thực vật Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 5 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học... các chất gây ô nhiễm đất và đóng vai trò quan trọng trong vi c cải tạo đất thông qua khả năng hòa tan lân khó tan và cố định đạm Khai thác vi khuẩn nội sinh dẫn đến vi c thúc đẩy sức khỏe thực vật và đóng một vai trò quan trọng trong các ứng dụng nông nghiệp bền vững cho cả thực phẩm và cây trồng Sự hiểu biết về các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cùng với phương pháp nghiên cứu và ứng dụng chúng sẽ là... chế này có vai trò quan trọng hàng đầu cho vi c sử dụng cây trồng làm nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học và hấp thụ carbon thông qua sản xuất sinh khối Như vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh đã được chứng minh là có khả năng thúc đẩy thực vật tăng trưởng nhờ vào vi c sản xuất các phytohormones, các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất, điều hòa tăng trưởng, như etylen, 1aminocyclopropane-1-carboxylic... cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường NFb và RMR bán đặc, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, sau đó đậy nắp ống nghiệm lại và đem ủ ở 30oC khoảng 2-4 ngày Sau 2-4 ngày quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh Lần lượt cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường NFb và RMR đặc và ủ ở 30oC; sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn . strain R4- 79 0 ; AN9 isolate was a 99 % similarity with JX 495 602 Enterobacter cloacae strain Bio103; AN15 isolate was 97 % of the identity with AB8 596 74 Acinetobacter radioresistens strain MTCC 98 21,. AN9, AN15, AN 17) were chosen to sequence, DNA sequencing was compared with Genbank database of NCBI by BLASTN software. The result showed that AN6 isolate was similarity of 99 % with JQ6 5 97 19. 16S rRNA. Trong đó kết quả giải trình tự cho thấy đoạn DNA của các dòng AN6, AN9, AN15 và AN 17 có tỉ lệ đồng hình 99 % lần lượt với trình tự DNA của các dòng Pseudomonas hibiscicola, Enterobacter