BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA PROTEASE CHỊU KIỀM TỪ BACILLUS sp. SV1 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN CHÂU SANG MSSV: 3092505 LỚP: CNSHTT K35 Cần Thơ, Tháng 7/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) Dương Thị Hương Giang SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Nguyễn Châu Sang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Dương Thị Hương Giang tận tình hướng dẫn chuyên môn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy Cô giảng viên Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ truyền thụ cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt năm học tập nghiên cứu Viện. Em xin cảm ơn anh Nguyễn Văn Tính, bạn Nguyễn Hoàng Vũ tận tình giúp đỡ suốt trình thực luận văn. Đồng thời, em xin cảm ơn thầy cô anh chị phụ trách Phòng thí nghiệm Viện tạo điều kiện cho em sử dụng trang thiết bị để hoàn thành luận văn. Và gửi lời tri ân đến cha mẹ bên con, ủng hộ vật chất lẫn tinh thần giúp vượt qua khó khăn để hoàn thành luận văn này. Cần Thơ, ngày 03/12/2013 Nguyễn Châu Sang Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Protease kiềm tính từ Bacillus sp. SV1 tinh phương pháp tủa ammonium sulfate bão hòa nồng độ 60%, kết hợp sắc ký trao đổi ion dương SPstreamline sắc ký trao đổi ion âm Unosphere Q với đệm phosphate pH 7,8. Bằng kỹ thuật SDS-PAGE điện di nhuộm hoạt tính với chất casein, protease xác định đơn phân có khối lượng phân tử khoảng 19,2 kDa. Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ lên hoạt tính cho thấy, protease hoạt động mạnh pH tối ưu 9,0 nhiệt độ tối ưu 45 oC. Trong điều kiện thí nghiệm, có mặt 2,5mM ion Ca2+ làm tăng hoạt tính protease gấp hai lần, bên cạnh protease bị ức chế hoàn toàn 2,0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), có khả serine protease . Từ khóa: Bacillus sp. SV1, đơn phân, protease kiềm tính, sắc ký, tinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG . v DANH SÁCH HÌNH . vi TỪ VIẾT TẮT . vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Phân loại protease . 2.1.1. Exopeptidase . 2.1.1.1. Aminopeptidase . 2.1.1.2. Carboxypeptidase 2.1.2. Endopeptidase . 2.1.2.1. Serine protease . 2.1.2.2. Aspatic protease . 2.1.2.3. Cystein/thiol protease 2.1.2.4. Metaloprotease . 2.2. Protease chịu kiềm 2.3. Các đặc điểm alkaline protease. . 2.3.1. Nhiệt độ tối ưu 2.3.1. pH tối ưu . 2.3.3. Điểm đẳng điện (isoelectric point) . 2.3.4. Trọng lượng phân tử . 2.3.5. Ion kim loại chất ức chế 2.4. Ứng dụng protease kiềm tính . 10 2.4.1. Công nghiệp thực phẩm 10 2.4.2. Chất tẩy rửa 10 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT 2.4.3. Thuộc da . 10 2.4.4. Y học 10 2.4.5. Xử lý môi trường 11 2.4.6. Ứng dụng khác 11 2.5. Các phương pháp tinh protease 11 2.5.1. Tủa amonium sulfate . 11 2.5.2. Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography) (Richard and Deuscher, 2010) 13 2.6. Phương pháp điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) (Hames, 1998) 15 2.6. Tình hình nghiên cứu nước 16 2.6.1. Trong nước . 16 2.6.2. Ngoài nước . 17 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Phương tiện nghiên cứu . 19 3.1.1. Địa điểm-thời gian . 19 3.1.2. Nguyên liệu . 19 3.1.3. Thiết bị dụng cụ 19 3.1.4. Hóa chất . 19 3.2. Phương pháp nghiên cứu . 19 3.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn, thu nhận protease thô 19 3.2.2. Tinh protease từ dịch nuôi cấy . 20 3.2.2.1. Kết tủa phân đoạn protease ammonium sulfate bão hòa 20 3.2.2.2. Tinh enzyme protease phương pháp sắc ký trao đổi ion 20 3.2.3. Xác trọng lượng độ tinh protease 21 3.2.4. Xác định hàm lượng protein hoạt tính protease . 21 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ lên hoạt động protease . 21 3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng ion Ca2+ lên hoạt động protease 22 3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng chất ức chế PMSF đến hoạt động protease 22 3.2.8. Phân tích thống kê .22 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1. Tinh protease 23 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT 4.1.1. Kết tủa ammonium sulfate . 23 4.1.2. Tinh phương pháp sắc ký trao đổi ion (ion exchange chrotomagraphy) 24 4.1.2.1. Sắc ký trao đổi ion dương 24 4.1.2.2. Sắc ký trao đổi ion âm . 25 4.2. Khảo sát số yếu tố pH, nhiệt độ, ion Ca2+ chất ức chế PMSF đến hoạt động protease . 27 4.2.1. Ảnh hưởng pH 27 4.2.2. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động protease . 28 4.2.3. Ảnh hưởng ion Ca2+ lên hoạt động protease . 29 4.2.4. Ảnh hưởng PMSF lên hoạt động protease 29 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 31 5.1. Kết luận . 31 5.2. Đề nghị . 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 32 PHỤ LỤC . 39 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần môi trường Horikoshi I . Bảng 2. Bảng tổng kết bước tinh protease 27 Bảng 3. Ảnh hưởng ion Ca2+ đến hoạt động protease 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Tỷ lệ tiêu thụ enzyme toàn giới Hình 2. Phân loại protease dựa vào vị trí xúc tác chất. Hình 3. Ảnh hưởng nồng độ muối lên tính tan protease 12 Hình 4. Kết điện di gel arylamide (A) điện di nhuộm hoạt tính chất casein phân đoạn protein (B) . 23 Hình 5. Biểu đồ sắc ký cột SP-streamline phân đoạn protein 60% bão hòa .24 Hình 6. Biểu đồ sắc ký cột UnosphereQ phân đoạn protein 60% bão hòa .25 Hình 7. Kết điện di phân đoạn protein sau qua cột sắc ký (A) kết điện di nhuộm hoạt tính gel casein (B) 26 Hình 8. Ảnh hưởng pH đến hoạt động protease .27 Hình 9. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động protease .28 Hình 10. Ảnh hưởng chất ức chế đến hoạt động protease 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Han, X.Q. and S. Damodaran. 1998. Purification and characterization of protease Q: A detergent- and ureastable serine endopeptidase from Bacillus pumilus. Agr. Food. Chem., 46:3596–3603. Hartley, B. S. 1960. Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem., 29:45–72. Hibbs, M. S., K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang, and C.L. Mainardi. 1985. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase. Biol. Chem., 260:2493–2500. Horikoshi, K. and T. Akiba. 1982. Alkalophilic Microorganisms: A New Microbial World. Tokyo, Japan: Japan Scientific Societies Press and Berlin, Germany: Springer-Verlag, pp.55. Horikoshi, K. 1971. Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms. Part I. Alkaline protease produced by Bacillus No. 221. Agr. Biol .Chem., 35:1407–414. Horikoshi, K. 1971. Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms. Part II. Alkaline amylase produced by Bacillus No. A-40-2. Agr. Biol. Chem., 35:1783–1791. Horikoshi, K. 1999. Alkaliphiles: Some applications of their products for biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63(4): 735. Horikoshi, K. 2011. Extremophiles handbook. In Extremophiles: Alkiliphiles. Berlin, Germany: Springer, pp. 95 International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 1992. Enzyme nomenclature. Orlando, Fla: Academic Press, Inc. Joo, H., G. Kumar, G., Park, K. T., Kim, S. R., Paik and C., Chang.2002. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii. Proc. Biochem., 38:155. Joo, H., and J., W., Choi. 2012. Purification and characterization of a novel alkaline protease from Bacillus horikoshii. Biol. Chem., 64: 234-235. Kim, S.S, Y.J. Kim and I. Rhee. 2001. Purification and characterization of a novel extracellular protease from Bacillus cereus KCTC 3674. Arch. Microbiol., 175:458. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Kobayashi, T., Y. Hakamada, S. Adachi, J. Hitomi , T. Yoshimatsu, K. Koike, S. Kawai and S. Ito. 1995. Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM-K16. Appl. Microbiol. Biotechnol., 43:473–81. Kobayashi, T., Y. Hakamada, J. Hitomi, K. Koike and S. Ito. 1996. Purification of alkaline proteases from a Bacillus strain and their possible interrelationship. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45:63–71. Kudrya, V.A. and I.A Simonenko. 1994. Alkaline serine proteinase and lectin isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis. Applied. Microbiol. Biotechnol., 41:505. Kumar, C.G. and H. Takagi. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnol. Adv., 17:561. Kumar, C.G. 1997. Studies on microbial alkaline proteases for use in dairy detergents. Ph.D. thesis. National Dairy Research Institute (Deemed University), Karnal, India. Kunitz, M. 1947. Crystalline soyabean trypsin inhibitor. II. Genaral properties. Gen. Physiol., 30: 291-310. Kwon, Y.T., J.O. Kim, S.Y. Moon, H.H. Lee and H.M Rho. 1994. Extracellular alkaline protease from alkalophilic Vibrio metschnikovii strain RH530. Biotechnol. Lett. 16:413-18. Khan, M.A., N. Ahmad, U.A. Zafar, I.A. Nasir, and M.A. Qadir. 2011. Isolation and screening of alkaline protease producing bacteria and physio-chemical characterization of the enzyme. Afr. J. Biotech., 10(33): 6203-6212. Labbe, J. P., P. Rebegrotte, and M. Turpine. 1974. Demonstrating extra-cellular leucine aminopeptidase (EC 3.4.1.1) of Aspergillus oryzae (IP 410): leucine aminopeptidase fraction. C. R. Acad. Sci., 278:2699. Larcher, G., B. Cimon, F. Symoens, G. Tronchin, D. Chabasse and J.P. Bouchara. 1996. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum. Biochem., 315:119–26. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Manachini, P. L, and M. G. Fortina. 1998. Production in sea-water of thermostable alkaline proteases by a halotolerant strain of Bacillus licheniformis. Biotechnol. Letters, 20: 565. Menon, A. S., and A. L. Goldberg. 1987. Protein substrates activate the ATPdependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP. Biol. Chem., 262:14929-14934. Mukhopadhyay, R.P., and A.L. Chandra. 1992. Application of a Streptomycete in the removal of waste keratinous materials. Ed. V.S. Malik and P. Sridhar . Industrial Biotechnology. New Delhi: Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd. pp. 595–97. Nakanishi, T., Y. Matsumura, N. Minamiura and T. Yamamoto. 1974. Purification and some properties of an alkalophilic proteinase of a Streptomyces species. Agric. Biol. Chem., 38:37–44. Rao, M. B., A. M. Tanksale, S. G. Mohini, V. V. Deshpande. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 597. Rawlings, N.D., D.P. Tolle and A.J. Barrett. 2004. Evolutionary families of peptidase inhibitors. Biochem., 378:705-716. Richard, R.B. and M. P. Deutscher. 2010. Guide to Protein Purification. Method in enzymology, 463: 335, 349-370, 373-385. Samal, B.B., B. Karan, C. Parker and Y. Stabinsky. 1991. Isolation and thermal stability of two novel serine proteinases from the fungus Tritirachium album Limber. Enzyme. Microb. Technol., 13:66-70. Shannon, J.D., E.N. Baramova, J.B. Bjarnason and J.W. Fox. 1989. Amino acid sequence of a Crotalus atrox venom metalloprotease which cleaves type IV collagen and gelatin. Biol. Chem., 264:11575-11583. Shih, J.C.H and C.G. Lee. 1993. Method and composition for maintaining animals on a keratin-containing diet. US Patent No., 5186971. Singh, J., N. Batra, R. C. Sobti. 2001. Serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus sp. SSR1. Proc. Biochem., 36: 781. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Shirai, T., A. Suzuki, T. Yamane, T. Ashida, T. Kobayashi, J. Hitomi, S. Ito . 1997. High-resolution crystal structure of M-protease: phylogeny aided analysis of the high-alkaline adaptation mechanism. Protein. Eng., 10:627-634. Shoemaker, S. 1986. Biotechnology in Food Processing. 1986. In The use of enzymes for waste management in the food industry. Ed. S.K. Harlander and T.P. Labuza, Park Ridge, NJ: Noyes Publications, pp. 259-67. Sloma, A., A. Ally, D. Ally, and J. Pero. 1988. Gene encoding a minor extracellular protease in Bacillus subtilis. Bacteriol., 170:5557–5563. Steele, D.B., M.J. Fiske, B.P. Steele and V.C. Kelley. 1992. Production of a low molecular weight, alkaline active, thermostable protease by a novel spiral-shaped bacterium, Kurthia spiroforme sp. nov. Enzyme. Microb. Technol., 14:358-60. Takagi, H., M. Kondou, T. Hisatsuka, S. Nakamori, Y.C. Tsai and M. Yamasaki. 1992. Effects of an alkaline elastase from an alkalophilic Bacillus strain on the tenderization of beef meat. Agric. Food. Chem., 40:2364-68. Takami, H., T. Akiba, K. Horikoshi .1992. Substrate Specificity of Thermostable Alkaline Protease from Bacillus sp. No.AH-101. Biosci. Biotechnol. Biochem., 56:333-334. Takami, H., T. Akiba and K. Horikoshi. 1990. Characterization of an alkaline protease from Bacillus sp. no. AH-101. Appl. Microbiol. Biotechnol., 33:519-23. Tobe, S., T. Takami, Y. Hirose and K. Mitsugi. 1995. Purification and some properties of alkaline proteinases from Bacillus sp. Agric. Biol. Chem., 39:1749-55. Tsujibo, H., K. Miyamoto, T. Hasegawa and Y. Inamori. 1990. Purification and characterization of two types of alkaline serine proteases produced by an alkalophilic Actinomycete. Appl. Bacteriol., 69:520–29. Voet, D., J.G. Voet and C.W. Pratt. 2013. Life at molecular Level. In Fundamental of biochemistry, New York: John Willey and sons, pp. 450-451. Watson, R. R. 1976. Substrate specificities of aminopeptidases: a specific method for microbial differentiation. Meth. Microbiol., 9:1–14. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Weaver, L.H., W.R. Kester and B.W. Matthews. 1977. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon with thermolysin. A model for the presumed catalytic transition state and for the binding of structures. Mol. Biol., 114:119132. Wilhelm, S.M., I.E. Collier, A. Kronberger, A.Z. Eisen, B.L. Marmer, G.A. Grant, E. A. Bauer and G.I. Goldberg. 1987. Human skin fibroblast stromelysin: structure, glycosylation, substrate specificity and differential expression in normal and tumorigenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. , 84:6725-6729. Wilson, S.A., O.A. Young, T. Coolbear and R.M. Daniel. The use of proteases from extreme thermophiles for meat tenderization. Meat. Sci., 1992;32:93–103. Yum, D.Y., H.C. Chung , D.H Bai, D.H. Oh and J.H. Yu. 1994. Purification and characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomyces sp. Biosci. Biotechnol. Biochem., 58:470–74. Zaghloul, T.I., M. AlBahra and H. AlAzmeh. 1998. Isolation, identification, and keratinolytic activity of several feather-degrading bacterial isolates. Appl. Biochem. Biotechnol., 70(2):207–213. Zuidweg, M.H.J., C.J.K. Bos and H. van Welzen. 1972. Proteolytic components of alkaline proteases of Bacillus strains. Zymograms and electrophoretic isolation. Biotechnol. Bioeng., 14:685–714. Trang web http://skhcn.hue.gov.vn/Portal/?GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=201203261 51527 : (ngày 07/07/2013) http://www.prweb.com/releases/industrial_enzymes/proteases_carbohydrases/prweb81 21185.htm : (ngày 07/07/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích 1. Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford Dung dịch protease xác định hàm lượng phương pháp Bradford (1976). Tiến hành theo bước sau: Chuẩn bị dung dịch Bradford gốc Hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 50 mL ethanol 95%. Sau cho thêm 100 mL acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất 1lít. Sau lọc giấy lọc Whatman no. trữ chai tối nhiệt độ phòng. Có thể giữ để sử dụng vài tuần thời gian chất màu bị tủa nên sử dụng cần phải lọc lại. Chuẩn bị dung dịch BSA chuẩn Cân 3mg BSA, hòa tan mL nước cất. Giữ -20oC. Thu dung dịch gốc có nồng độ 3mg/mL. Dựng đường chuẩn BSA Pha loãng dung dịch protein chuẩn để có dãy ống nghiệm với hàm lượng protein tăng dần từ 0-300µg/mL theo bảng sau: Nồng độ BSA (µg/mL) Dung dịch BSA chuẩn (µL) Đệm (µL) Tổng thể tích (µL) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 60 120 180 240 300 10 20 40 60 80 100 1000 990 980 960 940 920 900 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 39 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Phản ứng với thuốc thử Bradford - Chuẩn bị dãy ống nghiệm, đánh số từ 0-7 (thí nghiệm lặp lại lần 7x3= 21 ống nghiệm) - Lấy 100 µL dung dịch protein từ dãy pha loãng cho vào ống theo độ pha loãng tăng dần. - Thêm vào mL thuốc thử Bradford. - Trộn nhẹ ống máy vortex. Tránh tạo bọt. Ủ 20 phút. - Đo quang phổ bước sóng 595nm. Điều chỉnh OD ống giá trị 0. - Ghi nhận lại kết quả. - Tính giá trị trung bình lần lặp lại. - Vẽ biểu đồ đường chuẩn (đường tuyến tính nồng độ protein (mg/mL) với độ hấp thụ bước sóng 595 nm (A595nm)). Định lượng protein - 100 µL mẫu cho phản ứng với thuốc thử Bradford mô tả trên. - Mẫu đối chứng: 100 µL nước + thuốc thử Bradford - Đo độ hấp thụ bước sóng 595 nm (A595nm) Thí nghiệm lặp lại lần, ghi nhận kết tính giá trị trung bình. Dựa vào biểu đồ đường chuẩn xác định hàm lượng protein mẫu. Tính toán kết quả: Hàm lượng protein mẫu xác định theo công thức P = p*V*k đó: P: protein tổng mẫu (mg) p: hàm lượng protein mẫu pha loãng (mg/mL) V: thể tích dịch thô thu k: hệ số pha loãng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Kết dựng đường chuẩn BSA 2. Xác định hoạt tính protease Dịch protease kiểm tra hoat tính phương pháp Kunitz cải tiến. Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân chất casein protease acid amin peptide. Phản ứng dừng lại acid tricloroacetic. Sau đó, sản phẩm sinh đựợc xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 280 nm. Đơn vị đo hoạt tính protease: Đơn vị hoạt protease biểu qua đơn vị tyrosin TU (Tyrosin Unit), lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein cho 1µmol tyrosine (~ 0,181 mg) phút 37oC, and pH 9. Các bước tiến hành Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch đệm Glycine-NaOH 50mM, pH=9 - Dung dịch TCA nồng độ 15% (w/v) - Casein 0,6% (w/v) dung dịch đệm Glycine-NaOH chuẩn bị trên. Casein hòa tan đệm cách đun cách thủy 95oC khoảng 60 phút. Bảo quản lạnh 4oC. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 41 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Dựng đường chuẩn Tyrosin - Chuẩn bị ống nghiệm theo bảng sau Ống nghiệm 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Vtyrosin(µl) 300 600 900 1200 1500 VHCl 0.1N(µl) 1500 1200 900 600 300 Tyrosin (µmol/ml) - Các dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 280nm - Thí nghiệm lặp lại lần, tính giá trị trung bình - Vẽ đường tuyến tính nồng độ tyrosin (µmol/mL) độ hấp thụ. Kêt dựng đường chuẩn Tyrosin Đo hoạt tính protease Thí nghiệm lặp lại ba lần tiến hành eppendorf. Tiến hành cho chất vào ống eppendorf theo sơ đồ bảng bên dưới. Đo độ hấp thụ dung dịch sau thủy phân bước sóng tia UV (280nm) để xác định hàm lượng tyrosine sinh ra. Số đơn vị hoạt tính enzyme có 20 µL enzyme tính theo công thức dựa Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 42 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT vào giá trị độ hấp thụ đo được, từ suy số đơn vị hoạt tính enzyme tổng thể tích enzyme thu nhận xác định số đơn vị enzyme 1g mẫu. - Hoạt tính ml enzyme tính theo công thức: Tu=(a*Vt*k)/(T*Ve), đó: Tu: hoạt tính protease (TU/mL) a : nồng độ Tyrosine Vt: tổng thể tích phản ứng (1400µL) T: thời gian phản ứng (10 phút) Ve: thể tích (40µl) k : hệ số pha loãng - Hoạt tính riêng enzyme = tổng TU/ tổng mg protein mẫu khảo sát. Sơ đồ thí nghiệm kiểm tra hoạt tính protease Mẫu đối chứng: Mẫu thật: 160μl đệm Glycine-NaOH pH 40μL enzyme 160μl đệm glycine-NaOH pH 40μL enzyme Ủ 37oC, 20 phút Ủ 37oC, 20 phút Bổ sung 600μL Casein 1% Bổ sung 600μL TCA 15% Lắc ủ 10 phút, 37oC Bổ sung 600μL TCA 15% Bổ sung 600μL Casein 1% Ổn định 4oC, 10 phút Ly tâm 13.000 v/p, 10 phút, 4oC Ổn định 4oC, 10 phút Ly tâm 13.000 v/p, 10 phút, 4oC Đo độ hấp thụ 280nm Đo độ hấp thụ 280nm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Lắc ủ 10 phút, 37oC 43 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT 3. Kỹ thuật điện di gel acrylamide (SDS PAGE) điện di nhuộm hoạt tính với chất casein Chuẩn bị hộp điện di: Khuôn kính để đổ gel, lược cài hộp điện di phải rửa lau khô cồn. Sau ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel. Chuẩn bị gel phân tích polyarcrylamide 12 % Chuẩn bị gel có tổng thể tích: 10 mL/2 gel Nước cất: 3,3 mL Dung dịch Acrylamide mL Tris-HCl (pH=8,8) 2,5 mL SDS 10% 100 µL APS 100 µL TEMED 4µL - Dung dịch trộn lẫn máy khuấy từ. Sau cho 4μL TEMED vào dung dịch, khuấy nhanh chóng dùng pipet 1000 mL cho vào khung kiếng đổ gel. Gel bơm đến vạch cách lược 0,5 cm. - Bơm tiếp lớp nước cất lên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel đông lại sau 20-30 phút. Chuẩn bị mẫu protein - Pha mẫu tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf 100 μL mẫu protein 100 μL dung dịch đệm pha mẫu chuẩn bị trên. - Lắc giữ mẫu 4oC. Đổ gel tập trung - Gel tập trung thường pha ml nồng độ 4% gel có thành phần sau: - 1M Tris-HCl, pH=6,8 0,5 mL - Acrylamide 30% 0,67 mL - Nước cất 2,7 mL Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 44 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT - SDS 10% 40 µL - APS 10% 40 µL - TEMED µL - Khuấy dung dịch máy khuấy từ. - Tách bỏ phần nước phía gel phân tích cách nghiêng dùng giấy thấm. - Tương tự gel phân tích, sau cho 4µL TEMED vào, dung dịch phải đưa nhanh vào khung đổ gel. - Cho gel tập trung vào, đưa lược vào lớp gel. Chú ý, lược đưa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt phía chân lược. Gel tập trung đông tụ lại khoảng sau 20 phút. Đánh dấu lại vị trí ô giếng. Đưa mẫu vào giếng - Sau gel tập trung đông, lắp khung đổ gel vào khung điện di. - Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên bên điện di. - Cẩn thận lấy lược cho mẫu vào giếng. - Mẫu đưa vào từ đến 20 μL vào lỗ giếng. Chú ý không để mẫu tràn qua giếng bên cạnh. Các mẫu enzyme cần xác định hoạt tính cho vào với thể tích μL, mẫu control để xác định băng protein cho vào với thể tích 15 μL. Tiến hành điện di - Sau hoàn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại cho dòng điện qua. Hiệu điện điện di 80V. - Thời gian để tiến hành điện di vào khoảng giờ. Có thể quan sát trình dịch chuyển protein nhờ vào dải băng màu xanh bromophenol blue R-250. Đưa casein vào gel - Gel lấy khỏi hộp gel. Một gel sau chạy điện di ủ với dung dịch casein 1% đệm glycine-NaOH 50mM pH 9, máy lắc 4oC. Thời Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 45 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT gian cho casein khuếch tán vào gel 1h. Gel lại tiến hành nhuộm với coomassie blue R-250. - Sau trình ủ 1h, gel lắc bếp đun cách thuỷ nhiệt độ 45oC, 15 phút. Sau tiếp tục nhuộm với coomassie blue R-250. Nhuộm gel - Gel cho vào dung dịch nhuộm (30 mL) pha. Để làm nhanh trình nhuộm màu, hệ thống đặt máy lắc. Thông thường, thời gian nhuộm vòng 1h. Tẩy màu - Tẩy gel dung dịch tẩy. Ngâm gel dung dịch tẩy đặt máy lắc từ 2-3h. Kết thúc trình tẩy gel nhận thấy gel lớp màu băng protein rõ gel Phụ lục 2: Kết thí nghiệm 1. Bảng 1: Kết đo hàm lượng protein (OD 595nm) qua phân đoạn Bước tinh Pha loãng OD1 OD2 OD3 OD Hàm lượng trung protein bình (mg/mL) Dịch enzyme thô 0,481 0,49 0,463 0,478 0,176 Tủa phân đoạn 10 0,269 0,263 0,266 0,266 0,780 10 0,263 0,267 0,261 0,264 0,770 0,115 0,151 0,134 0,133 0,017 Sắc ký trao đổi ion dương Sắc ký trao đổi ion âm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 46 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT 2. Bảng 2: Kết đo hoạt tính protease qua phân đoạn Bước tinh Pha loãng OD1 OD2 OD3 Đối chứng OD Hoạt trung tính bình (U/mL) Dịch enzyme thô 0,364 0,370 0,364 0,754 0,366 0,749 Tủa phân đoạn 60 10 0,370 0,362 0,359 0,241 0,364 7,440 Tủa phân đoạn 80 10 0,373 0,353 0,358 0,241 0,361 7,360 10 0,362 0,357 0,37 0,263 0,363 7,410 1,168 1,259 1,247 0,222 1,225 3,643 Sắc ký trao đổi ion dương Sắc ký trao đổi ion âm 3. Bảng 3: Ảnh hưởng pH đến hoạt động protease pH OD1 OD2 0,094 0,090 OD Hoạt trung tính bình (U/mL) 0,098 0,094 0,105 0,102 0,130 0,116 0,116 0,400 0,190 0,200 0,179 0,190 1,390 0,355 0,348 0,364 0,356 3,610 10 0,192 0,182 0,186 0,187 1,350 11 0,101 0,102 0,092 0,098 0,155 12 0,090 0,087 0,086 0,088 0,025 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học OD3 47 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT 4. Bảng 4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động protease 0,114 OD trung bình 0,109 Hoạt tính (U/mL) 0,305 0,206 0,194 0,191 1,400 0,349 0,388 0,333 0,357 3,625 45 0,423 0,393 0,399 0,405 4,265 50 0,203 0,189 0,193 0,195 1,455 55 0,104 0,103 0,109 0,105 0,250 60 0,049 0,034 0,050 0,044 0,000 65 -0,007 -0,006 -0,003 -0,005 0,000 Nhiệt độ OD1 OD2 OD3 30 0,105 0,107 35 0,174 40 5. Bảng 5: Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ đến hoạt động protease 0,355 0,348 0,364 OD trung bình 0,356 Hoạt tính (U/mL) 3,61 2,5 0,627 0,615 0,628 0,623 7,185 0,634 0,621 0,609 0,621 7,160 10 0,630 0,615 0,622 0,622 7,170 Nồng độ Ca2+ OD1 OD2 OD3 6. Bảng 6: Ảnh hưởng chất ức chế PMSF lên hoạt động protease OD Hoạt trung tính bình (U/mL) 1,447 3,643 Nồng độ PMSF OD1 OD2 OD3 1,481 1,481 1,481 0,841 0,795 0,818 0,818 1,959 0,407 0,421 0,377 0,402 0,845 10 -0,001 -0,004 -0,017 -0,007 -1,250 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 48 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT 7. Kết thống kê ảnh hưởng pH lên hoạt động protease Multiple Range Tests for Hoattinh by pH Method: 95,0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups X 12 ,0 X ,103333 X 11 ,165667 X ,398333 X 10 1,32167 X 1,385 X 3,60833 ANOVA Table for Hoattinh by pH Source Sum of Squares Between groups 29,7515 Within groups ,150669 Total (Corr.) 29,9022 Df 14 20 Mean Square 4,95859 ,0107621 F-Ratio 460,75 P-Value , 8. Kết thống kê ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động protease Multiple Range Tests for Hoattinh by Nhietdo Method: 95,0 percent LSD Nhietdo Count Mean Homogeneous Groups X 65 ,0 X 60 ,0 X 55 ,255 X 30 ,298333 X 35 1,40667 X 50 1,45667 X 40 3,62 X 45 4,26667 ANOVA Table for Hoattinh by Nhietdo Source Sum of Squares Df Between groups 58,7784 Within groups ,503717 16 Total (Corr.) 59,2821 23 Mean Square 8,39691 ,0314823 F-Ratio 266,72 P-Value , 9. Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ ion Ca2+ đến hoạt tính protease Multiple Range Tests for Hoattinh by nongdoCa2pl Method: 95,0 percent LSD nongdoCa2plus Count Mean Homogeneous Groups X 3,60833 X 7,165 X 10 7,17667 X 2,5 7,19 ANOVA Table for Hoattinh by nongdoCa2plus Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 28,6591 9,55304 Within groups ,117633 ,0147042 Total (Corr.) 28,7768 11 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 49 F-Ratio 649,68 P-Value , Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... Việt Nam Một trong những loại enzyme có thể đáp ứng được yêu cầu trên đó là protease kiềm tính Trên cơ sở đó, đề tài ' 'Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của protease chịu kiềm từ Bacillus sp .SV1' ' được tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của protease chịu kiềm bởi dòng Bacilus sp .SV1 mới, được phân lập từ phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT CNSH, Đại học Cần Thơ Chuyên... ưu của protease chịu kiềm nằm trong khoảng 50-70oC Đặc biệt, protease từ chủng Bacillus sp B189 có nhiệt độ tối ưu đến 85oC Những chủng Bacillus, Streptomyces và Thermus sản xuất những protease có độ bền cao với nhiệt độ và việc bổ sung Ca2+ có thể giúp gia tăng sự chịu nhiệt của enzyme (Gupta et al., 2002) 2.3.2 pH tối ưu pH tối ưu của protease chịu kiềm thông thường ở khoảng 9-11 Một số protease đặc. .. mại hiện nay, chủ yếu là trung tính và kiềm tính, đều được sản xuất từ chủng Bacillus (Subtilisin) 2.2.1 Protease chịu kiềm từ Bacillus sp Bacillus là những vi khuẩn gram dương, hiếu khí, hình que và có khả năng hình thành nội bào tử Vi khuẩn bacillus chịu kiềm có thể tìm thấy ở hầu hết các môi trường có pH kiềm như đất soda, hồ muối soda và lớp bùn sâu dưới lòng biển Đặc biệt, chúng còn được tìm thấy... Ca2+ Sau đó, hai chủng mới là Bacillus AB42 và PB12 (Aunstrup et al, 1972) được phân lập Chúng hoạt động trong khoảng pH tối ưu rộng 9-12 và nhiệt độ tối ưu lần lượt là 60oC và 50oC Tiếp theo đó, rất nhiều các loại protease kiềm tính khác được thu nhận và nghiên cứu Đáng chú ý là Fujiwara và cộng sự (1993) đã tinh sạch được protease kiềm tính chịu nhiệt từ chủng Bacillus B18' Protease này có thể phân hủy... rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl liên tục từ 0-1 M với tốc độ dòng chảy là 1mL/phút để thu nhận các phân đoạn 3.2.3 Xác trọng lượng và độ tinh sạch của protease Phân đoạn protease thu được sau mỗi bước tinh sạch được kiểm tra và đánh giá độ tinh sạch và trọng lượng bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Hames, 1998) và kỹ thuật điện di nhuộm hoạt tính protease với cơ chất casein trên gel SDS-PAGE (Dương... (~ 0,181 mg) trong một phút ở 37oC, pH 9,0 Hoạt tính đặc hiệu (hoạt tính riêng) là số đơn vị hoạt tính của enzyme trong 1 mg protein (TU/mg) 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của protease Hoạt tính của enzyme được khảo sát ở các giá trị pH khác nhau từ 6 đến 12 (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) Dung dịch cơ chất casein 0,6% được hòa tan trong những dung dịch đệm có pH từ 6 đến 12 khi thực... tính của protease được khảo sát với sự hiện diện của ion Ca2+ ở các nồng độ khác nhau (2.5 mM, 5 mM và 10 mM ) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần 3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng chất ức chế PMSF lên hoạt động protease Hoạt tính của protease được khảo sát khi bổ sung PMSF ở các mức độ khác nhau (0,2 mM, 1 mM và 2 mM) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần *Nồng độ enzyme sử dụng trong các thí nghiệm ở mục 3.2.5, 3.2.6 và. .. tốt đến hoạt động của enzyme Chúng được chia thành 4 nhóm dựa theo cơ chế xúc tác gồm: serine protease, aspartic protease, cysteine protease và metalloprotease 2.1.2.1 Serine protease Serine protease là những protease có sự hiện diện của nhóm serine tại tâm hoạt động Chúng rất đa dạng và đều được tìm thấy ở virus, vi khuẩn và sinh vật nhân thực Chứng tỏ tầm quan trọng của serine protease đối với những... giống Bacillus là nguồn sản xuất của nhiều enzyme quan trọng Chúng có thể được nuôi ủ ở điều kiện nhiệt độ và pH cao để có thể tạo ra được những enzyme có hoạt tính cao và bền Một số đại diện tiêu biểu có khả năng sản xuất protease kiềm tính cao có thể kể đến là những chủng thuộc loài B lincheniformis, B subtilis, B amloliquefaciens, và B Majovensis (Gupta et al., 2002) 2.3 Các đặc điểm của protease kiềm. .. metalloprotease Chúng có thể được tinh sạch từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật (Rao et al., 1998) Tuy nhiên, vi sinh vật vẫn là một nguồn sản xuất protease chính trong thực tiễn, đặc biệt là vi khuẩn Những protease này vẫn hoạt động tốt ở pH cao, độ chuyên biệt cơ chất rộng, nhiệt độ tối ưu vào khoảng 60oC Trong khi đó, protease từ nấm mốc có tốc độ xúc tác chậm và chịu . chịu kiềm 7 2.3. Các đặc điểm của alkaline protease. 8 2.3.1. Nhiệt độ tối ưu 8 2.3.1. pH tối ưu 8 2.3.3. Điểm đẳng điện (isoelectric point) 8 2.3.4. Trọng lượng phân tử 9 2.3.5. Ion kim loại. 1 987 ). Dựa vào trình tự acid amin, protease lại được xếp vào 5 họ khác nhau, các họ này lại được phân chia thành các nhánh là tập hợp các protease có cùng một nguồn gốc (Sloma et al., 1 988 ) chết người trong nọc rắn, và thermolysin từ vi khuẩn (Hibbs et al., 189 5; Shannon, 1 989 ; Weaver et al., 1977; Wilhelm, 1 987 ). Đã có khoảng 30 họ metalloprotease đã được công nhận, trong số đó