TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  DƢƠNG DUY KHÁNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2013 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS GVHD: Sinh viện thực hiện: PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU DƢƠNG DUY KHÁNH MSSV: 3092671 LỚP: THÚ Y – K 35 Cần Thơ, 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt xác định kháng thể kháng virus” sinh viên Dƣơng Duy Khánh thực phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013 Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013 Duyệt giáo viên hƣớng dẫn Duyệt môn PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013 Duyệt Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân. Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố luận văn trước đây. Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013 Tác giả luận văn Dƣơng Duy Khánh ii LỜI CẢM TẠ Con kính dâng luận văn với lòng biết ơn vô hạn đến ba mẹ, người sinh thành dưỡng dục, suốt đời tận tụy mong cho công thành danh toại. Tôi xin tỏ lòng tri ân sâu sắc đến cô Hồ Thị Việt Thu, người hết lòng dìu dắt, truyền đạt nhiều kiến thức kinh nghiệm quí báu giúp đỡ cho mặt suốt trình thực luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn đến: Cô Nguyễn Thị Bé Mười cố vấn học tập tận tình dạy giúp đỡ suốt năm học vừa qua. Quý thầy cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt thầy cô môn Thú y môn Chăn nuôi thú y khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cho suốt năm qua. Xin bày tỏ lòng biết ơn đến anh Lê Trần Hoài Khanh tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cám ơn tất bạn lớp Thú Y K35 chia sẻ buồn vui trình học tập hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ suốt thời gian qua. Xin kính gởi đến quý thầy, cô, người thân, anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe, thành công xin nhận nơi lòng biết ơn sâu sắc. Cuối xin cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo dành thời gian đọc, xem xét đóng góp ý kiến quý báu cho đề tài tốt nghiệp tôi. iii TÓM LƢỢC Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt xác định kháng thể kháng virus” sinh viên Dương Duy Khánh thực phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. Trong đề tài nghiên cứu phân lập virus viêm gan vịt số môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt qua thí nghiệm sau: (i) tính số TCID50/0,1ml tế bào xơ phôi vịt (DEF Duck Embryo Fibroblast), kết cho thấy độ pha loãng 10-4,74, 0,1ml huyễn dịch virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy sử dụng liều pha loãng 100TCID50 để dùng thí nghiệm sau; (ii) so sánh tính thích ứng virus viêm gan vịt type thông qua việc khảo sát thời gian trung bình tạo bệnh tích tế bào (CPE – Cytopathic Effect) loại tế bào, thu nhận kết sau, tế bào xơ phôi vịt (DEF) 39,13 giờ, tế bào thận phôi vịt (DEK - Duck Embryo Kidney) 35,38 tế bào gan phôi vịt (DEL - Duck Embryo Liver) 31,63 sau gây nhiễm virus; so sánh hiệu hai loại thuốc nhuộm cho thấy khả quan sát bệnh tích tế bào nhuộm crystal violet tốt nhuộm neutral red; (iii) phản ứng vi trung hòa thực ba loại tế bào phôi vịt với mẫu huyết âm tính, mẫu huyết miễn dịch mẫu huyết kiểm tra. Kết cho thấy mẫu huyết âm tính mẫu huyết kiểm tra xuất bệnh tích tế bào, cho kết âm tính (hiệu giá kháng thể 4log2) kháng thể có kháng thể với hàm lượng thấp. Còn mẫu huyết miễn dịch cho kết dương tính với hiệu lượng kháng thể cao ≥ 4log2. iv MỤC LỤC TRANG DUYỆT LUẬN VĂN . i LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM TẠ iii TÓM LƯỢC iv MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH viii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT . ix Chƣơng 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1. Tổng quan nuôi cấy tế bào động vật . 2.1.1. Đặc tính tế bào động vật nuôi cấy 2.1.2. Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật 2.1.3. Các giai đoạn phát triển tế bào nuôi cấy 2.1.4. Các dòng tế bào nuôi cấy 2.1.5. Dụng cụ nuôi cấy tế bào . 2.1.6. Một số môi trường nuôi cấy tế bào . 2.1.7. Các biểu bệnh tích tế bào tác động virus môi trường tế bào lớp đơn . 2.1.8. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào . 2.1.9. Đánh giá tình trạng nuôi cấy . 2.1.10. Các vấn đề cần nuôi cấy tế bào động vật 2.2. Virus viêm gan vịt . 2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại virus 2.2.2. Sức đề kháng virus viêm gan vịt type . 2.2.3. Cơ chế sinh bệnh virus viêm gan vịt type . 2.2.4. Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type . 2.2.5. Nuôi cấy tế bào phôi vịt 10 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1. Thời gian địa điểm 11 3.1.1. Thời gian . 11 3.1.2. Địa điểm 11 v 3.2. Vật liệu hóa chất . 11 3.2.1. Đối thượng thí nghiệm 11 3.2.2. Các dụng cụ thiết bị thí nghiệm . 11 3.2.3. Các hóa chất môi trường 12 3.3. Nội dung nghiên cứu . 13 3.4. Phương pháp nghiên cứu . 13 3.4.1. Chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy . 13 3.4.2. So sánh tính thích ứng chủng DHV-1 ba loại tế bào sơ cấp . 14 3.4.3. Xác định kháng thể kháng DHV-1 môi trường tế bào qua phản ứng vi trung hòa . 16 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu 18 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 19 4.1. Kết thu nhận lớp tế bào DEF, DEK DEL 19 4.2. Chuẩn độ virus . 22 4.3. So sánh tính thích ứng chủng DHV-1 ba loại tế bào sơ cấp 23 4.3.1. Thời gian trung bình xuất CPE ba loại tế bào 23 4.3.2. So sánh mức độ xuất CPE loại tế bào thông qua nhuộm crystal violet neutral red . 25 4.4. Kết phản ứng vi trung hòa 28 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 31 5.1. Kết luận . 31 5.2. Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 32 Phụ chƣơng 1. CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM . 35 Phụ chƣơng 2. XỬ LÝ SỐ LIỆU 37 Phụ chƣơng 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 45 vi DANH SÁCH BẢNG Hình Tên hình Trang Bảng 4.1. Kết tỷ lệ CPE DHV-1 gây theo nồng độ virus môi trường tế bào DEF . 22 Bảng 4.2. Thời gian xuất CPE trung bình ba loại tế bào sau gây nhiễm23 Bảng 4.3. So sánh hiệu quan sát CPE quan sát tươi, nhuộm Crystal violet Neutral red tế bào DEF . 25 Bảng 4.4. So sánh hiệu quan sát CPE quan sát tươi, nhuộm Crystal violet Neutral red tế bào DEK 25 Bảng 4.5. So sánh hiệu quan sát CPE quan sát tươi, nhuộm Crystal violet Neutral red tế bào DEL 26 Bảng 4.6. Kết phản ứng vi trung hòa loại tế bào . 28 vii DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 2.1. Bình Roux (T-flask) Hình 2.2. Đĩa microplate . Hình 2.3. Erlenmeyer Hình 2.4. Spinner flask . Hình 2.5. Các môi trường nuôi cấy tế bào Hình 3.1. Bố trí thí nghiệm chuẩn độ virus . 14 Hình 3.2. Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu sử dụng hai loại thuốc nhuộm hai loại tế bào 16 Hình 3.3. Bố trí thí nghiệm phản ứng vi trung hòa . 17 Hình 4.1. Thời gian tạo lớp tế bào DEF . 20 Hình 4.2. Thời gian tạo lớp tế bào DEK . 20 Hình 4.3. Thời gian tạo lớp tế bào DEL . 21 Hình 4.4. Biểu đồ thời gian trung bình xuất CPE 23 Hình 4.5. Tế bào tạo bệnh tích CPE sau gây nhiễm 24 Hình 4.6. Các biểu CPE tế bào nhiễm DHV-1 quan sát tươi . 27 Hình 4.7. Các biểu CPE tế bào nhiễm DHV-1 nhuộm Crystal violet 27 Hình 4.8. Các biểu CPE tế bào nhiễm DHV-1 nhuộm Neutral red . 28 Hình 4.9. Kết phản ứng vi trung hòa tế bào 29 Hình 4.10. Kết phản ứng vi trung hòa qua nhuộm Crystal violet 29 viii Đối với tế bào DEK DEL, HTMD HTMD cho kết dương tính với hiệu giá kháng thể 6log2 5log2. HT HT có kháng thể với hàm lượng thấp không bảo vệ tế bào cho kết âm tính. Tóm lại, mẫu huyết miễn dịch lấy từ vịt gây nhiễm virus diện với hàm lượng kháng thể cao nên bảo hộ tế bào, mẫu huyết lấy từ đàn vịt khảo sát có hàm lượng kháng thể thấp kháng thể nên không bảo vệ tế bào. Cho thấy đàn vịt tiếp xúc với mầm bệnh nên có kháng thể với hàm lượng thấp số chưa tiếp xúc với mầm bệnh nên kháng thể. 30 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Virus viêm gan vịt từ bệnh phẩm nuôi cấy môi trường tế bào DEF có số TCID50/0,1ml 10-4,74. Thời gian tạo CPE sớm tế bào DEL (31,63 giờ), DEK (35,38 giờ) chậm DEF (39,13 giờ). Cả loại tế bào DEF, DEK DEL bắt màu thuốc nhuộm crystal violet tốt neutral red. Kết phản ứng vi trung hòa thực ba loại tế bào cho thấy ứng dụng để khảo sát hiệu giá kháng thể trung hòa DHV-1 cho kết tốt. 5.2. Đề nghị Nên sử dụng crystal violet để nhuộm quan sát bệnh tích tế bào. Có thể sử dụng loại tế bào để nuôi cấy virus viêm gan vịt thực phản ứng vi trung hòa. 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cann A. J., 2005. “Pathogenesis”. Principles of Molecular Virology (Eds. A. J. Cann). 4th ed, Elseveir Academic Press, London, UK, pp. 208. 2. Davis D., 1987. Temperture and pH stability of duck hepatitis virus. Avian Pathology, 16 (1): 21-30. 3. Finter, N. B., 1969. Dye Uptake Methods for Assessing Viral Cytopathogenicity and thier Application to Interferon Assays. In: J. gen. Virol 5, pp. 419-427. 4. Fitzgerald, J. E., Hanson, L. E., and Wingard, M., 1963. Cytopathic effects of Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Kidney Cell Cultures. Biol Med 114 (3), pp.814-816. 5. Hiến Thị Mỹ Trang, 2011. Thử nghiệm hoạt tính kháng virus Newcasle interferon alpha gà biểu hệ thống nấm men pichia pastoris điều kiện in vitro. Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. 6. Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc gia cầm. NXB Đại học Cần Thơ, tr. 283-288. 7. Hwang J., 1965. Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Fibroblast Cultures. Avian Diseases 9(2), pp. 285-290 8. Hwang J., 1966. Duck hepatitis virus in duck embryo liver cell culture. Avian Diseases 10(4), pp. 508-512. 9. Lê Trần Hoài Khanh, 2009. Xác định số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà lớp thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle. Luận văn tốt nghiệp ngành Thú y, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ. 10. Levine P. P. Fabricant J., 1950. A hitherto – undescribed virus diseases of ducks in North America. Cornell Vet 40, pp. 71-78. 11. Maiboroda A. D., 1972. Formation of duck hepatitis virus in culture cells. Veterinaria 8, pp. 50-52. 12. Nguyễn Bá Hiên Nguyễn Minh Tâm, 2007. Giáo trình vi sinh vật bệnh truyền nhiễm vật nuôi. NXB Hà Nội, tr. 290-296. 13. Nguyễn Đức Hiền, 2012. Bệnh truyền nhiễm gia cầm. NXB Đại học Cần Thơ. tr. 75-84. 32 14. Nguyễn Đức Lưu Vũ Như Quán, 2002. Bệnh viêm gan virus vịt. Khoa học kỹ thuật Thú y. Hội Thú y Việt Nam, tr. 87-90. 15. Nguyễn Ngọc Thanh Thảo, 2007. Cải thiện quy trình thu hoạch bảo quản xơ phôi gà. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 16. Nguyễn Xuân Bình. 2002. Bệnh vịt biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr. 56-59. 17. Phạm Sỹ Lăng, Tô Long Thành, Cù Hữu Phú Nguyễn Hoài Nam, 2005. Bệnh gia cầm kỹ thuật phòng trị. NXB Nông Nghiệp, tr.100106. 18. Phạm Văn Kim, 2000. Vi sinh học đại cương. Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp Sinh học Ứng Dụng, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, tr. 114-116. 19. Phạm Văn Ty, 2005. Virus học. NXB Giáo Dục, tr. 50-54. 20. Phan Kim Ngọc Phạm Văn Phúc, 2007. Công nghệ sinh học người động vật. NXB Giáo Dục, tr. 127-205. 21. Renault, T., Torchy, C. and de Kinkelin, P., 1991. Spectro photometric method for titration of trout interferon, and its application to rainbout fry experimentally infected with viral haemorrhagic septicaemia virus. In: Dis.aquat.Org, 10, pp. 23-29. 22. Reuss, U., 1959. Versuche zur aktiven und passiven Immunisierung bei der Virus hepatitis der Entenkuken. Zentrabl Veterinaermed 6, pp. 808-815. 23. Woolcock P. R. Fabricant J., 1997. Duck Hepatitis. Diseases of Poultry (Calnek B. W., Barnes H. J., Beard C. W., McDougald L. R.). Saif Y. M., Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp. 661-670. 24. Woolcock, 1989. Duck virus hepatitis. A laboratory manual for the isolation and indentification of avian pathogens, the American association of avian pathologists, pp.152-155. 25. 96-well PS plate, V bottom, pinch bar, sterile. http://www.usascientific.com/96-well-plate-v-bottom-pinch-bar-sterile.aspx 26. Corning® Proculture® Spinner Flasks. http://www.krackeler.com/products/1165-Spinner/15148-Corning-ProcultureSpinner-Flasks.htm 33 27. DMEM, high glucose, pyruvate. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11995065# 28. E-MEM (Earle's solution) without Glutamine. http://www.kohjin-bio.co.jp/english/products/?id=1269908974-900746 29. Instrumentos de laboratorio. http://www.museohistoricodeenfermeria.org/lista_colecciones.php?cat=3&ins trumento=1&scat1=5&scat2=131 30. MEM. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11095080# 31. OIE (2008) Chapter 2.3.8. Duck virus hepatitis. Terrestrial Manual 2008 http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/ 2008/pdf/2.03.08_DVH.pdf 32. Tissue Culture Flask http://www.cosmobrand.com.cn/product/cell-culture/tissue-culture-flask/ 34 Phụ chƣơng 1. CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 1.1. Quy trình tạo lớp đơn tế bào DEF, DEK DEL - Soi trứng vịt, chọn trứng có phôi 16 ngày tuổi. Sau lau trứng cồn 700. - Dùng kéo cắt vòng quanh đầu vỏ trứng buồng khí. Dùng kẹp đặt cổ kéo phôi (phôi sống) cho vào đĩa Petri (chứa sẳn DPBS) - Cắt bỏ đầu, chi nội tạng. Thu lại phần mô cơ, thận, gan cắt nhỏ, chuyển mô cắt sang bình erlen, rửa lại 2-3 lần với DPBS - Rửa với trypsin – EDTA 0,05% (đã làm ấm 370C) - Tiếp tục cho vào 10ml dung dịch trypsin – EDTA 0,05% vào, khuấy từ nhiệt độ phòng 30 phút, lọc lấy dịch qua lớp vải gạc vào ống falcon - Ly tâm 1000 vòng/phút 15 phút, thu cặn - Cho DPBS vào, ly tâm 1000 vòng/phút 15 phút thu cặn - Cho MTTT vào, ly tâm 1000 vòng/phút 15 phút thu cặn - Cho MTTT vào, dùng micropipette để huyền phù tế bào. Sau tính số tế bào/ml buồng đếm Neubauer - Phân phối dịch tế bào vào đĩa môi trường với mật độ 5.105 ủ đĩa 370C, 5% CO2, 80% độ ẩm. Ta thu lớp tế bào DEF, DEK DEL. 1.2. Chuẩn bị lớp tế bào DEF, DEK DEL Mục tiêu: Tạo môi trường tế bào DEF, DEK DEL chuẩn bị thử nghiệm sau. Chuẩn bị: Trước tiến hành nuôi cấy, tủ nuôi cấy dụng cụ phải vô trùng chiếu tia UV 15 phút. Sau thực quy trình tạo lớp loại tế bào phụ chương 1.1 Tính số lượng tế bào/ml buồng đếm Neubauer đưa tế bào vào đĩa nuôi cấy mật độ 5.105 tế bào/ml. Số lượng tế bào chứa 1ml hỗn hợp dịch tế bào tính theo công thức: x = (a x 1000 x 2) / y Trong đó: x: số lượng tế bào 1ml a: số tế bào đếm buồng đếm 35 y: thể tích buồng đếm tính cm3 2: hệ số pha loãng hỗn dịch tế bào với thuốc nhuộm 1.3. Quy trình thu nhận huyễn dịch virus từ bệnh phẩm - Bệnh phẩm gan, lách đem nghiền hòa nước đảm bảo huyễn dịch 10%. - Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút 40C, thu dịch lọc qua đầu lọc vô trùng 0,22µm. - Thêm 5000UI/ml penicillin, 500µg/ml streptomycin amphotericilin, sau trữ -700C đến sử dụng. 100µg/ml 1.4. Quy trình hoạt hóa nhân số lƣợng virus cấy chuyền virus 3-5 lần môi trƣờng tế bào DEF - Đĩa với giếng có lớp đơn tế bào DEF - Rút bỏ môi trường, rửa lần với DPBS - Cho vào 100µl virus nồng độ pha loãng 10-1 ủ đĩa 370C, 5% CO2. - Loại môi trường, rửa lần với DPBS - Cho 100µl MTDT vào giếng - Quan sát thấy CPE xuất tiến hành đông – 700C rã đông nhiệt độ phòng lần. Sau thu huyễn dịch, trữ -700C dung. 1.5. Chuẩn độ virus - Đĩa với giếng có lớp đơn tế bào DEF phủ 90% - Loại môi trường rửa lần với PBS. Pha loãng dịch virus với MTPL theo log10, phân phối vào ống giữ điều kiện lạnh. - Cho 100µl độ pha loãng vào giếng - Phủ đĩa ủ 370C, 5%CO2 - Rút bỏ virus, cho 100µl MTDT vào giếng ủ 370C, 5%CO2 - Theo dõi giếng xuất CPE ổn định. Sau đó, xác định số TCID50/0,1ml theo phương pháp Reed Muench (1938). 36 Phụ chƣơng 2. XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng: Thời gian xuất CPE giếng nuôi cấy ban đầu Số giếng xuất CPE (giếng) DEF DEK DEL Thời gian theo dõi xuất CPE giếng (giờ) 12 24 30 36 48 54 Tổng số giếng theo dõi 21 17 48 23 21 48 28 12 48 So sánh thời gian tạo lớp ba loại tế bào One-way ANOVA: DEF, DEK, DEL Source Factor Error Total DF 141 143 S = 10.43 SS 1350 15334 16684 Level DEF DEK DEL MS 675 109 F 6.21 R-Sq = 8.09% N 48 48 48 Mean 39.13 35.38 31.63 StDev 9.26 11.63 10.26 P 0.003 R-Sq(adj) = 6.79% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --------+---------+---------+---------+(--------*-------) (-------*--------) (-------*--------) --------+---------+---------+---------+31.5 35.0 38.5 42.0 Pooled StDev = 10.43 Grouping Information Using Fisher Method DEF DEK DEL N 48 48 48 Mean 39.13 35.38 31.63 Grouping A A B B Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 87.83% DEF subtracted from: DEK DEL Lower -7.96 -11.71 Center -3.75 -7.50 Upper 0.46 -3.29 ---+---------+---------+---------+-----(--------*-------) (-------*-------) ---+---------+---------+---------+------10.0 -5.0 0.0 5.0 DEK subtracted from: 37 Lower -7.96 DEL Center -3.75 Upper 0.46 ---+---------+---------+---------+-----(--------*-------) ---+---------+---------+---------+------10.0 -5.0 0.0 5.0 So sánh hiệu quan sát CPE quan sát tươi, nhuộm Crystal violet Neutral red tế bào DEF Tế bào kết cụm Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 24 20.00 0.800 Nhuộm Crystal violet 16 20.00 0.800 4.00 4.000 4.00 4.000 Total 24 24 48 Total 40 Chi-Sq = 9.600, DF = 1, P-Value = 0.002 cells with expected counts less than 5. Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 24 18.00 2.000 Nhuộm Neutral red 12 18.00 2.000 6.00 6.000 12 6.00 6.000 12 Total 24 24 48 Total 36 Chi-Sq = 16.000, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 16 14.00 0.286 Nhuộm Neutral red 12 14.00 0.286 10.00 0.400 12 10.00 0.400 Total 28 20 38 Total 24 24 48 Chi-Sq = 1.371, DF = 1, P-Value = 0.242 Vết hoại tử, vệt tan Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 20 21.00 0.048 Nhuộm Crystal violet 22 21.00 0.048 3.00 0.333 3.00 0.333 Total 24 24 48 Total 42 Chi-Sq = 0.762, DF = 1, P-Value = 0.383 cells with expected counts less than 5. Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 20 13.50 3.130 Nhuộm Neutral red 13.50 3.130 10.50 4.024 17 10.50 4.024 21 Total 24 24 48 Total 27 Chi-Sq = 14.307, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 22 14.50 3.879 Nhuộm Neutral red 14.50 3.879 9.50 5.921 17 9.50 5.921 19 Total 24 24 48 Total 29 Chi-Sq = 19.601, DF = 1, P-Value = 0.000 39 So sánh hiệu quan sát CPE quan sát tươi, nhuộm Crystal violet Neutral red tế bào DEK Tế bào co tròn Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 24 22.50 0.100 Nhuộm Crystal violet 21 22.50 0.100 1.50 1.500 1.50 1.500 Total 24 24 48 Total 45 Chi-Sq = 3.200, DF = 1, P-Value = 0.074 cells with expected counts less than 5. Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 24 22.50 0.100 Nhuộm Neutral red 21 22.50 0.100 1.50 1.500 1.50 1.500 Total 24 24 48 Total 45 Chi-Sq = 3.200, DF = 1, P-Value = 0.074 cells with expected counts less than 5. Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 21 21.00 0.000 Nhuộm Neutral red 21 21.00 0.000 3.00 0.000 3.00 0.000 Total 24 24 48 Total 42 Chi-Sq = 0.000, DF = 1, P-Value = 1.000 cells with expected counts less than 5. 40 Kết cụm tế bào Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 15 11.50 1.065 Nhuộm Crystal violet 11.50 1.065 12.50 0.980 16 12.50 0.980 25 Total 24 24 48 Total 23 Chi-Sq = 4.090, DF = 1, P-Value = 0.043 Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 15 10.00 2.500 Nhuộm Neutral red 10.00 2.500 14.00 1.786 19 14.00 1.786 28 Total 24 24 48 Total 20 Chi-Sq = 8.571, DF = 1, P-Value = 0.003 Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 6.50 0.346 Nhuộm Neutral red 6.50 0.346 16 17.50 0.129 19 17.50 0.129 35 Total 24 24 48 Total 13 Chi-Sq = 0.949, DF = 1, P-Value = 0.330 Vết hoại tử, vệt tan Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts 41 Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 9.00 0.444 Nhuộm Crystal violet 11 9.00 0.444 17 15.00 0.267 13 15.00 0.267 30 Total 24 24 48 Total 18 Chi-Sq = 1.422, DF = 1, P-Value = 0.233 Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 6.00 0.167 Nhuộm Neutral red 6.00 0.167 17 18.00 0.056 19 18.00 0.056 36 Total 24 24 48 Total 12 Chi-Sq = 0.444, DF = 1, P-Value = 0.505 Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 11 8.00 1.125 Nhuộm Neutral red 8.00 1.125 13 16.00 0.563 19 16.00 0.563 32 Total 24 24 48 Total 16 Chi-Sq = 3.375, DF = 1, P-Value = 0.066 So sánh hiệu quan sát CPE quan sát tươi, nhuộm Crystal violet Neutral red tế bào DEL Sự kết cụm tế bào Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm 42 Quan sát tươi 13 13.00 0.000 Crystal violet 13 13.00 0.000 11 11.00 0.000 11 11.00 0.000 22 Total 24 24 48 Total 26 Chi-Sq = 0.000, DF = 1, P-Value = 1.000 Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 13 11.50 0.196 Nhuộm Neutral red 10 11.50 0.196 11 12.50 0.180 14 12.50 0.180 25 Total 24 24 48 Total 23 Chi-Sq = 0.751, DF = 1, P-Value = 0.386 Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 13 11.50 0.196 Nhuộm Neutral red 10 11.50 0.196 11 12.50 0.180 14 12.50 0.180 25 Total 24 24 48 Total 23 Chi-Sq = 0.751, DF = 1, P-Value = 0.386 Vết hoại tử, vệt tan Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 18 17.00 0.059 Nhuộm Crystal violet 16 17.00 0.059 Total 34 43 7.00 0.143 7.00 0.143 14 Total 24 24 48 Chi-Sq = 0.403, DF = 1, P-Value = 0.525 Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Quan sát tươi 18 14.00 1.143 Nhuộm Neutral red 10 14.00 1.143 10.00 1.600 14 10.00 1.600 20 Total 24 24 48 Total 28 Chi-Sq = 5.486, DF = 1, P-Value = 0.019 Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Crystal violet 16 13.00 0.692 Nhuộm Neutral red 10 13.00 0.692 11.00 0.818 14 11.00 0.818 Total 26 22 Total 24 24 48 Chi-Sq = 3.021, DF = 1, P-Value = 0.082 44 Phụ chƣơng 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Máy ấp trứng Tủ sấy Máy hấp autoclave Máy ly tâm lạnh Kính hiển vi soi ngƣợc Tủ cấy vô trùng 45 [...]... tế cho người chăn nuôi Mặc dù việc nghiên cứu các phương pháp phân lập và khống chế bệnh viêm gan vịt do virus đã nhiều trên môi trường tế bào tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế Từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu loại môi trường tế bào. .. bào sơ cấp phù hợp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và ứng dụng xác định kháng thể kháng virus trên môi trường tế bào 1 Chƣơng 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 2.1.1 Đặc tính của tế bào động vật nuôi cấy Tế bào động vật có tính cơ học yếu do chúng có kích thước tương đối lớn, trung bình khoảng 10µm và không có thành tế bào Do đó, trong điều kiện in vitro, tế bào động... liệu và hóa chất 3.2.1 Đối thƣợng thí nghiệm Trứng vịt có phôi 16 – 20 ngày tuổi (từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan vịt và được xác định không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt) Nguồn virus viêm gan vịt type 1 phân lập từ tỉnh Kiên Giang (chủng virus này được định type 1 tại Viện Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ) Huyết thanh miễn dịch kháng virus viêm gan vịt type 1 (thu được từ vịt. .. dinh dưỡng Nuôi cấy tế bào ứng dụng trong định danh và phân lập virus, cách thức xâm nhập và phát triển trong cơ thể Đánh giá hiệu quả sử dụng của các loại thuốc: các tế bào nuôi cấy được sử dụng riêng và kết hợp với xét nghiệm in vitro để nghiên cứu hiệu quả của thực phẩm, hóa chất tồn tại và phát triển các loại tế bào khác nhau Cung cấp các hệ thống xét nghiệm để xác định phương pháp và thuốc thích hợp... thuộc vào từng loại virus, số lượng virus được cấy và loại virus tế bào nuôi cấy mà thời gian nhân lên của virus có khác nhau, nói chung là 2-10 ngày Có thể dùng kính hiển vi quan sát các bệnh tích tế bào (CPE) do virus gây ra để phát hiện sự nhân lên của virus trong tế bào (Phạm Văn Ty, 2005) Có thể nuôi cấy DHV trên môi trường tế bào xơ phôi gà, xơ phôi vịt và thận phôi vịt Virus gây bệnh tích tế bào, ... việt Bệnh tích tế bào Cộng tác viên Tế bào xơ phôi vịt Tế bào thận phôi vịt Tế bào gan phôi vịt Vi rút viêm gan vịt Muối đệm phosphate Dulbecco Huyết thanh bào thai bò Tế bào ung thư cổ tử cung người Môi trường nuôi cấy tế bào Môi trường tăng trưởng Khoảng cách tỷ lệ Sai số chuẩn Liều gây chết 50% Ánh sáng tia cực tím Thận khỉ xanh Châu Phi Chƣơng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ... với trypsin b Tế bào DEF sau 24 giờ c Tế bào DEF sau 48h d Tế bào DEF sau 72h Hình 4.1 Thời gian tạo lớp của tế bào DEF a Tế bào sau khi xử lý với trypsin b Tế bào DEK sau 24h c Tế bào DEK sau 48h d Tế bào DEK sau 72h Hình 4.2 Thời gian tạo lớp của tế bào DEK 20 a Tế bào sau khi xử lý với trypsin b Tế bào DEL sau 24h c Tế bào DEL sau 48h d Tế bào DEL sau 72h e Tế bào DEL sau 96h f Tế bào DEL sau 120h... bào đó để nuôi cấy virus (Phạm Văn Kim, 2000) Muốn có tế bào lớp đơn để nuôi cấy trước hết phải dùng trypsin phá vở mô liên kết gắn giữa các tế bào và tách chúng ra thành các tế bào riêng lẻ Sau đó ly tâm với dung dịch muối đệm để loại trypsin, rồi đổ môi trường dinh dưỡng vào để nuôi tế bào Đem ủ ở nhiệt độ 370C, sau từ 3-7 ngày các tế bào sẽ mọc và dính chặt vào đáy bình và tạo thành một lớp tế bào. .. loại tế bào sơ cấp Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của DHV-1 gây bệnh tích trên ba loại tế bào qua thời gian và mật độ CPE trên từng loại tế bào Tế bào nào có mật độ CPE cao thì tính thích ứng của DHV-1 đối với tế bào đó cao 3.4.2.1 Phương pháp nhuộm bằng neutral red - Dùng micropipette hút bỏ môi trường duy trì trong các giếng chứa tế bào đã nhiễm virus viêm gan vịt và cho biểu hiện bệnh lý tế bào ổn định. .. cơ thể sống Các sinh vật đa bào được cấu tạo từ nhiều loại mô Các mô được cấu tạo từ những tế bào cùng loại Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1938) đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào thực vật và động vật Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học trong đó việc nuôi cấy virus . CỨU 11 3.1. Thời gian và địa điểm 11 3.1.1. Thời gian 11 3.1.2. Địa điểm 11 vi 3.2. Vật liệu và hóa chất 11 3.2.1. Đối thượng thí nghiệm 11 3.2.2. Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 11. (http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product /119 95065#) Môi trƣờng MEM (http://www.lifetechnologies.com/order/catal og/product /110 95080#) Môi trƣờng E’MEM (http://www.kohjin-bio.co.jp/english/ products/?id=1269908 974 -90 074 6) Hình. biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi quan sát tươi 27 Hình 4 .7. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Crystal violet 27 Hình 4.8. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1