BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN, TỔNG HỢP IAA VÀ ENZYME CHITINASE CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VÙNG RỄ LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. NGUYỄN THỊ PHA NGUYỄN THỊ PHƯƠNG OANH MSSV: 3092498 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Viện Nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, nhận nhiều quan tâm, động viên từ gia đình dạy tận tình quý thầy cô với giúp đỡ, hỗ trợ bạn bè. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Bố Mẹ, người quan tâm cổ vũ, động viên tạo điều kiện tốt để phấn đấu học tập nghiên cứu khoa học. Cô Nguyễn Thị Pha, người tận tình bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quan tâm giúp đỡ em suốt tiến trình thí nghiệm. Cô Trần Thị Xuân Mai, cô Nguyễn Thị Liên anh Trần Văn Bé Năm tạo điều kiện thuận lợi sẵn sàng hỗ trợ để em hoàn thành tốt luận văn. Cám ơn thầy Huỳnh Xuân Phong, cố vấn học tập, quý thầy cô giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức quý báu thời gian học tập trường. Các anh chị học viên cao học bạn sinh viên làm việc phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, cám ơn người tận tình giúp đỡ động viên suốt thời gian thực luận văn. Thân gửi đến tập thể lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 35 lời cám ơn thân thương đồng hành học tập hoạt động khác suốt năm tháng đại học. Xin kính chúc quý thầy cô, tập thể sinh viên Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học lời chúc sức khỏe thành công. Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Nguyễn Thị Phương Oanh Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Vi khuẩn vùng rễ có khả kích thích sinh trưởng thực vật (Plant GrowthPromoting Rhizobacteria – PGPR) xem nguồn tài nguyên sẵn có đầy tiềm để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm thay dần loại hóa chất nông nghiệp sử dụng phổ biến nay. Trong đề tài này, khả hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA môi trường không bổ sung tryptophan tổng hợp enzyme chitinase 18 dòng vi khuẩn có khả cố định đạm phân lập từ đất vùng rễ lúa khảo sát. Từ 18 dòng vi khuẩn, dòng vi khuẩn có khả tổng hợp chitinase tiếp tục chọn để khảo sát khả đối kháng nấm Pyricularia oryzae điều kiện in vitro. Kết cho thấy 18 dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân khó tan, hàm lượng lân hòa tan tạo cao sau 10 15 ngày chủng. Trong đó, dòng TV2B3 dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân khó tan tốt nhất, hàm lượng lân hòa tan đạt 465,010 mg/L thời điểm 10 ngày sau chủng. Khi kiểm tra khả tổng hợp IAA môi trường không bổ sung tryptophan, sau ngày, 12/18 dòng vi khuẩn có khả tổng hợp IAA vào ngày sau chủng, hàm lượng IAA tổng hợp thấp, dao động khoảng 0,329 µg/mL (dòng NT4) – 3,630 µg/mL (dòng TV2B7). Sau 10 ngày ủ, dòng vi khuẩn có khả tổng hợp chitinase biểu khả đối kháng nấm Pyricularia oryzae, với dòng CT14 AM3 dòng vi khuẩn có tính đối kháng mạnh nhất, tỉ lệ ức chế nấm đạt 64,44% 61,48%, khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức 5% so với dòng vi khuẩn lại. Kết phân tích khác biệt di truyền kỹ thuật BOX-PCR cho thấy chưa phát khác biệt trình tự phân bố yếu tố lặp BOX (cụ thể tiểu đoạn boxA) gen dòng vi khuẩn này. Từ khóa: BOX-PCR, chitinase, IAA, lân khó tan, vi khuẩn đối kháng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ . TÓM LƯỢC . i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH BẢNG . iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT vi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2. Mục tiêu đề tài .2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược lúa .3 2.2. Vi khuẩn vùng rễ có khả kích thích sinh trưởng thực vật (Plant GrowthPromoting Rhizobacteria - PGPR) .7 2.2.1. Vi khuẩn chi Azotobacter .8 2.2.2. Vi khuẩn chi Azospirillum 2.2.3. Vi khuẩn chi Bacillus .10 2.2.4. Vi khuẩn chi Pseudomonas 11 2.2.5. Vi khuẩn chi Azoarcus .11 2.3. Khả cố định đạm sinh học loài vi khuẩn vùng rễ 12 2.4. Khả hòa tan lân khó tan 13 2.5. Khả tổng hợp IAA 14 2.6. Khả tổng hợp chất kháng sinh, hoạt chất diệt nấm enzyme thuỷ phân ngoại bào .16 2.7. Kỹ thuật BOX-PCR (BOX – Polymerase Chain Reaction) 17 2.8. Tình hình nghiên cứu 18 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1. Phương tiện nghiên cứu 21 3.1.3. Hóa chất 22 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT 3.1.4. Địa điểm .24 3.2. Phương pháp nghiên cứu .24 3.2.1. Xử lý mẫu .24 3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả hòa tan lân khó tan .24 3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả tổng hợp IAA .26 3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả tổng hợp chitinase vi khuẩn .28 3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả đối kháng nấm in vitro dòng vi khuẩn có khả tổng hợp chitinase .29 3.2.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát khác biệt di truyền dòng vi khuẩn có khả tổng hợp chitinase kỹ thuật BOX-PCR 30 3.2.7. Xử lý số liệu .32 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1. Kết khảo sát khả hòa tan lân khó tan .33 4.2. Kết khảo sát khả tổng hợp IAA .39 4.3. Kết khảo sát khả tổng hợp chitinase 41 4.4. Kết khảo sát khả đối kháng nấm in vitro dòng vi khuẩn có khả tổng hợp chitinase .42 4.5. Kết phân tích khác biệt di truyền dòng vi khuẩn kỹ thuật BOX-PCR 44 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. Kết luận .46 5.2. Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phản ứng màu thí nghiệm khảo sát khả hòa tan lân khó tan tổng hợp IAA dòng vi khuẩn Phụ lục 2: Các enzyme cắt giới hạn sử dụng thành phần phản ứng cắt enzyme Phụ lục 3: Kết thí nghiệm Phụ lục 4: Kết thống kê Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Một số loài Azospirillum nguồn phân lập .10 Bảng 2. Hàm lượng NH4+ (mg/L) IAA (µg/mL) trung bình cao tổng hợp dòng vi khuẩn chọn .21 Bảng 3. Thành phần môi trường Burk’s không đạm .22 Bảng 4. Thành phần môi trường NBRIP .23 Bảng 5. Công thức môi trường Luria-Bertani (LB) 23 Bảng 6. Công thức môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) .23 Bảng 7. Thành phần dãy đường chuẩn P2O5 .26 Bảng 8. Thành phần cho phản ứng BOX-PCR 25 L 31 Bảng 9. Các bước chu kỳ nhiệt phản ứng BOX-PCR .31 Bảng 10. Chỉ số hòa tan lân dòng vi khuẩn sau ngày ủ .33 Bảng 11. Sự thay đổi pH môi trường sau 15 ngày chủng vi khuẩn .35 Bảng 12. Lượng lân hoà tan tạo dịch nuôi vi khuẩn xác định phương pháp so màu Oniani (mg/L) .36 Bảng 13. Hàm lượng IAA sinh dịch nuôi vi khuẩn xác định phương pháp so màu bước sóng 530 nm 40 Bảng 14. Tỷ lệ ức chế nấm (%) dòng vi khuẩn có khả tổng hợp enzyme chitinase .43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Biểu đồ sinh trưởng giống lúa 120 ngày không quang cảm .4 Hình 2. Bệnh đạo ôn lúa, khuẩn lạc môi trường PDA bào tử đính nấm Pyricularia oryzae .6 Hình 3. Vi khuẩn Azotobacter .8 Hình 4. Chu trình nitơ 13 Hình 5. Các đường tổng hợp IAA từ tiền tố tryptophan vi khuẩn .15 Hình 6. Kiểm soát nấm Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn đối kháng .16 Hình 7. Phổ điện di sản phẩm BOX-PCR 18 chủng Burkholderia pseudomallei 17 Hình 8. Đường chuẩn IAA với nồng độ từ 0-80 µg/mL .28 Hình 9. Sơ đồ thử khả đối kháng nấm dòng vi khuẩn đất vùng rễ 30 Hình 10. Khảo sát khả hòa tan lân khó tan môi trường NBRIP đặc .34 Hình 12. Đường chuẩn lân (trái) phản ứng màu số nghiệm thức chủng vi khuẩn vào ngày 15 sau chủng 38 Hình 13. Hàm lượng lân hoà tan trung bình (mg/L) tạo môi trường qua 15 ngày dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân tốt thời điểm 10 ngày sau chủng 38 Hình 15. Hàm lượng IAA tổng hợp dòng vi khuẩn qua ngày .41 Hình 16. Vòng phân giải chitin hình thành dòng vi khuẩn TN4 AM3 .42 Hình 17. Thử nghiệm đối kháng nấm P. oryzae số dòng vi khuẩn .43 Hình 18. Kết điện di sản phẩm khuếch đại cặp mồi BOXA1R 44 Hình 19. Kết phân cắt vùng gen tiểu đoạn boxA với enzyme AluI (trái) enzyme MboI .45 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Bp Base pair BPB Bromophenol blue BVTV Bảo vệ thực vật CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DAPG diacetyl phloroglucinol DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide Ha Héc-ta HCN Hydrogen cyanide IAA Indole-3-acetic acid LB Luria Broth PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar PGPR Vi khuẩn vùng rễ có khả kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) PSI Phosphate solubilization index (chỉ số hòa tan lân) pv. Pathovar REP-PCR Repetitive Extragenic Palindromic PCR SDS Sodium doecyl sulfate TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris-EDTA USD United States Dollar Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Lúa gạo (Oryza sativa L.) vốn xem loại trồng mùa vụ quan trọng Việt Nam từ nhiều thập kỷ qua. Hiện tại, bối cảnh dân số không ngừng tăng nhanh, hoạt động sản xuất lúa gạo khẳng định vai trò chủ đạo vấn đề đảm bảo an ninh lương thực mang lại nguồn thu nhập không nhỏ cho nước ta từ hoạt động xuất khẩu. Theo báo cáo Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (Bộ NN&PTNN), diện tích canh tác lúa nước năm 2012 7.753,2 nghìn héc-ta (ha), tăng 97,8 nghìn so với năm 2011 sản lượng đạt 43,7 triệu tấn, tăng 1,3 triệu tấn, kim ngạch xuất đạt tỉ USD. Tuy đạt tín hiệu đáng mừng vậy, thực tế, hoạt động sản xuất lúa gạo phải đối mặt với nhiều khó khăn, đe dọa khả đáp ứng lương thực thời gian tới: diện tích chuyên canh lúa có xu hướng bị thu hẹp sách quy hoạch, điều kiện thời tiết diễn biến thất thường, dịch bệnh có nguy bùng phát lây lan nhanh diện rộng,…. Để trì đà tăng sản lượng, người nông dân buộc phải thâm canh, tăng vụ phải tăng đầu tư loại phân bón hóa học thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nhằm làm tăng suất. Hiện tại, Việt Nam 15 quốc gia tiêu thụ phân bón nhiều giới, tổng lượng phân bón sử dụng năm 2010 dao động từ 9-9,5 triệu tiếp tục tăng qua năm. Hiệu suất sử dụng thấp (chỉ từ 40-60%, cao đạt 75%) kết hợp với việc lạm dụng phân bón hóa học (phân đạm, lân, NPK,…) gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí, tăng nguy nhiễm sâu bệnh trồng. Thêm vào đó, năm, lượng thuốc BVTV khổng lồ đa dạng chủng loại sử dụng cho gần 100% diện tích canh tác nông nghiệp: trung bình từ 15.000-25.000 tấn, ước tính số có 1.000 loại có độc tính cao (Báo Sài Gòn Giải Phóng, 2013). Việc sử dụng tràn lan thuốc BVTV làm xấu tình trạng môi trường làm cân sinh học làm giảm tính đa dạng sinh học hệ sinh thái nông nghiệp, tăng tượng kháng thuốc sâu bệnh tăng nguy sức khỏe người tiêu dùng. Ngoài ra, sử dụng phân bón hóa học thuốc BVTV không cách gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng gạo, giảm giá trị khả cạnh tranh thị trường. Chính tác động bất lợi phân bón hóa học thuốc BVTV thúc đẩy nghiên cứu Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Nguyễn Thị Phi Oanh, Hứa Văn Ủ Dirk Springael. 2011. Vi khuẩn phân hủy 2,4-D đất lúa Tiền Giang Sóc Trăng. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 18a:65-70. Nguyễn Thị Phương Oanh, Trần Bửu Minh, Nguyễn Ngọc Trâm, Lý Thành Nghĩa. 2012. Khảo sát ảnh hưởng số dòng vi khuẩn vùng rễ lên phát triển giống lúa OM3536 điều kiện in vitro. Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường năm 2012, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thị Phương Thảo, Ngô Thanh Phong Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập nhận diện vi khuẩn cố định đạm đất vùng rễ lúa trồng đất phù sa tỉnh Vĩnh Long. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4):521-528. Nguyễn Trần Minh Đức. 2013. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ lúa thuộc đất nhiễm mặn có khả cố định đạm tổng hợp IAA. Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. Phạm Thị Ánh Loan. 2012. Phân lập số dòng Pseudomonas vùng rễ có khả tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ứng dụng lúa. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. Phùng Văn Tạo. 2013. Phân lập, khảo sát đặc tính nhận diện số dòng vi khuẩn nội sinh mè. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. Trần Thanh Phong Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh khóm (Ananas cosmosus L.) trồng đất phèn huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(1):125-132. Tiếng Anh Alagawadi, A.R. and A.C. Gaur. 1988. Associative effect of Rhizobium and phosphate solubilizing bacteria on the yield and nutrient uptake of chickpea. Plant and Soil, 105:241-246. Antoun, H. and D. Prévost. 2005. Ecology of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. In PGPR: Biocontrol and Biofertilization, ed. Z.A, Siddiqui, Springer, pp.1-38. Barriuso, J., B.R. Solano, J.A. Lucas, A.P. Lobo, A. García-Villaraco and F.J.G Manero. 2008. Ecology, genetic diversity and screening strategies of Plant Growth-promoting Rhizobacteria (PGPR). In Plant-bacteria interactions: Strategies and techniques to promote plant growth, ed. I. Admad, J. Pichtel and S. Hayat, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp.1-17. Cattenlla, A.J., P.G. Hartel and J.J Fuhrmann. 1999. Screening for plant growth-promoting rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil Science Society of America, 63:1670-1680. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 48 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Currie, B.J., D. Gal, M. Mayo, L. Ward, D. Godoy, B.G. Spratt and J.J. LiPuma. 2007. Using BOX-PCR to exclude a clonal outbreak of melioidosis. BMC Infectious Diseases. Chan, Y., W.L. Barraquio and R. Knowles. 1994. N2-fixing Pseudomonas and related soil bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 13:95-118. Chung, H., M. Park, M. Madhaiyan, S. Seshadri, J. Song, H. Cho and T. Sa. 2005. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea. Soil Biology & Biochemistry, 37:1970-1974. Dobbelaere, S., Vanderleyden, J. and Okon, Y., 2003. Plant growth-promoting effects of diazotrophs in the rhizosphere, Critical Reviews in Plant Science, 22:107-149. Foster, R.C., A.D. Rovira and T.W. Cock. 1983. Ultrastructure of the Root-Soil Interface. The American Phytopathological Society, St. Paul, MN., pp.157. Fridlender, M., J. Inbar and I. Chet. 1993. Biological control of soilborne plant pathogens by a β-1,3-glucanase-producing Pseudomonas cepacia. Soil Biology & Biochemistry, 25:1211-1221. Fuentes-Ramirez, L.E. and J. Caballero-Mellado. 2005. Bacteria fertilizer. In PGPR: Biocontrol and Biofertilization, ed. Z.A, Siddiqui, Springer, pp.143-172. Goldstein, A.H. 1994. Involvement of the quinoprotein glucose dehydrogenase in the solubilization of exogenous phosphates by Gram-negative bacteria. In Phosphate in Microorganisms: Cellular and Molecular Biology, ed. A. Torriani-Gorini, E. Yagil, S. Silver, ASM Press, Washington DC, pp.197-203. Gopalakrishnan, S., P. Humayun, B.K. Kiran, I.G.K. Kannan, M.S. Vidya, K. Deepthi and O. Rupela. 2010. Evaluation of bacteria isolated from rice rhizosphere for biological control of charcoal rot of sorghum caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid World Journal of Microbiological Biotechnology. Gray, E.J. and D.L. Smith. 2005. Intracellular and extracellular PGPR: Commonalities and distinction in the plant-bacterium signaling processes. Soil Biology & Biochemistry, 37:395-412. Gyaneshwar, P., E.K. Janes, N. Mathan, P.M. Reddy, B. Reinhold-Hweh and J.K. Ladha. 2002. Endophytic colonization of rice by adiazothropic strain of Serratia marcescens. Journal of Bacteriology, 183:2634-2643. Han, H.S., Supanjani and K.D., Lee. 2006. Effect of co-inoculation with phosphate and potassium solubilizing bacteria on mineral uptake and growth of pepper and cucumber. Plant Soil and Environment, 52(3):130-136. Harari, A., J. Kigel and Y. Okon. 1988. Involvement of IAA in the interaction between Azospirillum brasilense and Panicum miliaceum roots, Plant and Soil, 110:275-282. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 49 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Hariprasad, P. and S.R. Niranjana. 2009. Isolation and characterization of phosphate solubilizing rhizobacteria to improve plant health of tomato. Plant and Soil, 316:13-24. Kamil, Z., M. Rizk, M. Saleh and S. Moustafa. 2007. Isolation and identification of rhizosphere soil chitinolytic bacteria and their potential in antifungal biocontrol. Global Journal of Molecular Sciences, 2(2):57-66. Kapulnik, Y., Y. Okon and Y. Henis. 1985. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation. Canadian Journal of Microbiology, 31:881-887. Karnwal, A. 2009. Production of Indole acetic acid by Pseudomonas fluorescens in the presence of L-tryptophan and rice root exudates. Journal of Plant Pathology, 91(1):61-63. Kaushik, B.D., A.K. Saxena and R. Prasanna. 2004. Techniques in Microbiology: A Laboratory Manual for Post Graduate students. Publs. Director IARI. ISBN:8188708-02-X Kaymak, H.C., F. Yarali, I. Guvenc and M.F. Donmez. 2008. The effect of inoculation with plant growth-promoting Rhizobacteria (PGPR) on root formation of mint (Mentha piperita L.) cuttings. African Journal of Biotechnology, 7(24):4479-4483. Kloepper, J.W., R. Lifshitz and R.M. Zablotowics. 1989. Free-living bacterial inocula for enhancing crop productivity. Trends in Biotechnology, 7(2):39-44. Kloepper, J.W., R. Rodriguez-Ubana, G.W. Zehnder, J.F. Murphy, E. Sikora and C. Fernandez. 1999. Plant root-bacterial interactions in biological control of soilborne diseases and potential extension to systemic and foliar diseases. Australasian Plant Pathology, 28:21-26. Kloepper, J.W., S. Tuzun, L. Liu and G. Wei. 1993. Plant growth-promoting rhizobacteria as inducers of systemic disease resistance. In Pest Management: Biologically Based Technologies, ed. R.D Lumsden and J. Waughn, pp.156-165, Washington, DC: American Chemical Society Books. Koeuth, T., J. Versalovic and J.R., Lupski. 1995. Differential subsequence conservation of interspersed repetitive Streptococcus pneumoniae BOX elements in diverse bacteria. Genome Research, 5:408-418. Khalid, A., S. Tahir, M. Arshad and Z.A. Zahir. 2004. Relative efficiency of rhizobacteria for auxin biosynthesis in rhizosphere and non-rhizosphere soils. Aus J Soil Res, 42:921-926. Lambert, B. and J. Joos. 1989. Fundamental aspects of rhizobacterial plant growth promotion research. Trends in Biotechnology, 7:215–219. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 50 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Lim, H.S., Y.S. Kim and S.D. Kim. 1991. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot. Applied and Environmental Microbiology, 57:510-516. Lisek, A., L. S. Paszt, M. Oskiera, P. Trzciński, A. Bogumił, A. Kulisiewicz and E. Malusá. Use of the rep-PCR technique for differentiating isolates of rhizobacteria. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 19(1):5-12. Louden, B.C., D. Haarmann and A.M. Lynne. 2011. Use of blue agar CAS assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education, 12(1). Lupski, J.R. and G.M. Weinstock. 1992. Short, interspersed repetitive DNA sequences in prokaryotic genomes. Journal of bacteriology, 174(14):4525-4529. Martínez-Viveros, O., M.A. Jorquera, D.E Crowley, G. Gajardo and M.L. Mora. 2010. Mechanisms and practical considerations involved in plant growth promotion by rhizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, 10(3):293-319. Moran, L.A., H.R. Horton, K.G. Scringeour and M.D. Perry. In Principle of Biochemistry, ed. A. Jaworski, Pearson, pp.515-516. Nelson, W.O.V. 2007. A review on beneficial effects of rhizosphere bacteria on soil nutrient availability and plant nutrient uptake. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín, 60(1):3621-3643. Noori, M.S.S. and H.M. Saud. 2012. Potential plant growth-promoting activity of Pseudomonas sp. isolated from paddy soil in Malaysia as biocontrol agent. Plants Pathology & Microbiology, 3(2). Oliveira, C.A., V.M.C. Alves, I.E. Marriel, E.A. Gomes, M.R. Scotti, N.P. Carneiro, C.T. Guimarães, R.E. Schaffert and N.M.H. Sá. 2009. Phosphate solubilizing microorganisms isolated from rhizosphere of maize cultivated in an oxisol of the Brazilian Cerrado Biome. Soil Biology & Biochemistry, 41:1782-1787. Oliveira, F.L, E.M. Ferreira and M.E. Pampulha. 1997. Nitrogen fixation, nodulation and yield of clover plants co-inoculated with root-colonizing bacteria. Symbiosis, 23:35-42. Ordentlich, A., Y. Elad and I. Chet. 1988. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii. Phytopathology, 78:84-88. Patten, C.L. and B.R. Glick. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Canadian J Microbiol, 42:207-220. Prithiviraj, B., X. Zhou, A. Souleimanov, W.M. Kahn and D.L. Smith. 2003. A host-specific bacteria-to-plant signal molecule (Nod factor) enhances germination and early growth of diverse crop plants. Planta, 21:437-445. Ramyasmruthi, S., O. Pallavi, S. Pallavi, K. Tilak and S. Srividya. 2012. Chitinolytic and secondary metabolite producing Pseudomonas fluorescens isolated from Solanaceae Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 51 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT rhizosphere effective against broad spectrum fungal phytopathogens. Asian Journal of Plant Science and Research, 2(1):16-24. Saharan, B.S. and V. Nehra. 2011. Plant Growth-promoting Rhizobacteria: A Critical Review. Life Sciences and Medicine Research, 21:1-30. Shahab, S., N. Ahmed and N.S. Khan. 2009. Indole acetic acid production and enhanced plant growth promotion by indigenous PSBs. African Journal of Agricultural Research, 4(11):1312-1316. Shyamala, L. and P.K.Sivakumaar. 2012. Antifungal activity of rhizobacteria isolated from rice rhizosphere soil against rice blast fungus Pyricularia oryzae. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives, 3(3):692- 696. Spaepen, S. and J. Vanderleyden. 2010. Auxin and Plant-Microbe Interactions. Cold Spring Harbor Perspective in Biology, 10:1-13. Spaepen, S., J. Vanderleyden and R. Remans. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. Federation of European Microbiological Societies Microbiol Review, 31: 425–448. Steenhoudt, O. and J. Vanderleyden. 2000. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiology Reviews, 24:487-506. Steenhout, O. and J. Vanderlayden. 2000. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. Federation of European Microbiological Societies, 24:487-506. Supanjani, H.S Han, J.S Jung, and K.D. Lee. 2006. Rock phosphate-potassium and rocksolubilising bacteria as alternative, sustainable fertilisers. Agronomy for Sustainable Development, 26(4):233-240. Tien, T.M., M.H Gaskins and D.H. Hubbell. 1979. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum americanum L.), Applied and Environmental Microbiology, 37:1016-1024. Versalovic, J., T. Koeuth and J.R. Lupski. 1991. Distribution of repetitive DNAsequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19(24):6823-6831. Zaim, S., L. Belabid and M. Bellahcene. 2013. Biocontrol of chickpea Fusarium wilt by Bacillus spp. Rhizobacteria. Journal of Plant Protection Research, 53(2):177-183. Zehnder, G.W., J.F. Murphy, E.J Sikora and J.W. Kloepper. 2001. Application of rhizobacteria for induced resistance. European Journal of Plant Pathology, 107:39-50. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 52 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Azospirillum: (ngày 14/08/2012) http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas: (ngày 14/08/2012) http://www.answersingenesis.org/articles/aid/v6/n1/serratia-marcescens-miracle-bacteria: (ngày 22/02/2013) http://www.dpi.nsw.gov.au/_data/assets/pdf_file/0004/ ./Rhizosphere.pdf: (ngày 07/06/2013) http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1570118: (ngày 05/8/2013) http://www.lsuagcenter.com/en/crops_livestock/crops/rice/Diseases/photos/sheath_blight/SB+ 1.htm: (ngày 15/8/2013) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139311002551: http://www.sggp.org.vn/nongnghiepkt/2012/11/304535: (ngày 22/02/2013) (ngày 07/02/2013) http://www.sites.google.com/site/azotobacterwebsite/nutritional-requirements: (ngày 14/08/2012) http://www.vaas.org.vn/images/caylua/10/069_benhdaoon.htm: (ngày 22/02/2013) http://www.vast.ac.vn/1.0/index.php?option=com_content&view=article&id=1387%3Anghie n-cu-va-s-dng-ch-phm-sinh-hc-t-vi-khun-i-khang-kim-soat-nm-hi-cay-trng&catid=27%3 Asan-pham-cong-nghe&Itemid=143&lang=vi: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 53 (ngày 11/11/2013) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phản ứng màu thí nghiệm khảo sát khả hòa tan lân khó tan tổng hợp IAA dòng vi khuẩn Hình 21. Sự đổi màu môi trường NBRIP nghiệm thức chủng vi khuẩn thời điểm ngày sau chủng Hình 22. Sự đổi màu môi trường NBRIP nghiệm thức chủng vi khuẩn thời điểm 10 ngày sau chủng Hình 23. Sự đổi màu môi trường NBRIP nghiệm thức chủng vi khuẩn thời điểm 15 ngày sau chủng Hình 24. Phản ứng màu số dòng vi khuẩn với thuốc thử R2 (ngày nuôi thứ 4) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Các enzyme cắt giới hạn sử dụng thành phần phản ứng cắt enzyme Bảng 16. Các enzyme cắt giới hạn sử dụng Tên Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết AluI Arthrobacter luteus MboI Moraxella bovis HaeIII Haemophilus aegyptius 5…A G^C T…3 3…T C^G A…5 5…N^G A T C N…3 3…N C T A G^N…5 5…G G^C C…3 3…C C^G G…5 Nhiệt độ ủ Thời gian ủ Buffer (C) (giờ) phù hợp 37C 1-6 Tango 37C 1-6 R 37C 1-6 R  Thành phần phản ứng cắt enzyme Nước cất lần vô trùng 4,3 L Buffer 10X 1,5 L Enzyme 10U/L 1,2L DNA (sản phẩm PCR) 7L Thể tích cuối cùng/tube 1,5 mL Sau pha hỗn hợp phản ứng, ủ nhiệt độ thích hợp giờ. Phụ lục 3: Kết thí nghiệm 1. Kết thí nghiệm Bảng 17. Kết khảo sát khả hòa tan lân khó tan môi trường NBRIP đặc STT 10 11 12 13 14 15 Dòng vi khuẩn CT1.21c CT1.N2 TV3A4 TN20 TV2B7 CTA3 CTB3 AM3 NT4 PT10 PT4 CT14 TC3 NT3 PT19 d(khuẩn lạc) (mm) 7,5 8 6,5 7,5 8 8,5 7,5 9,5 12 12 11 8 11 11 11 10 12 11 11 11 10 9 8 10 10 14 17 18 d(vòng sáng) (mm) 9 8,5 8,5 8,5 12,5 12,5 12 11,5 10,5 10,5 10,5 13 12 10 13 13,5 14 15 15 16 12 11 11 16 16,5 16 13 16 16 15 14 14 12 13 15 11 12 13 19 22 23 2,800 2,214 2,389 2,769 2,067 2,529 2,733 2,250 2,500 2,455 2,300 2,364 2,333 2,375 2,357 PSI 2,500 2,200 2,563 2,500 2,313 2,333 2,421 2,250 2,571 2,500 2,333 2,273 2,444 2,200 2,294 2,700 2,214 2,500 2,750 2,000 2,250 2,556 2,455 2,375 2,455 2,455 2,400 2,875 2,300 2,278 Bảng 18. Đường chuẩn P2O5 STT Thời điểm khảo sát Ngày Ngày 10 Ngày 15 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Phương trình đường chuẩn y=0,031x+0,009 (R2=0,999) y=0,032x+0,009 (R2=0,999) y=0,032x+0,007 (R2=0,999) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 19. Kết OD880nm nghiệm thức chủng vi khuẩn (dịch nuôi vi khuẩn pha loãng 10 lần) hàm lượng lân hoà tan tạo thành (đã nhân cho hệ số pha loãng) qua 15 ngày nuôi TT Dòng vi khuẩn 10 11 12 13 14 15 16 17 18 TV2B3 TV3A4 TN20 CT1.N2 CTA3 PT19 AM3 TC3 CTB3 TV2B7 CT14 CT1.21c TN4 VL2.27a PT4 PT10 NT3 NT4 OD880 0,355 0,236 0,496 0,100 0,532 0,001 0,344 0,001 0,288 0,483 0,099 0,034 0,024 0,023 0,062 0,042 0,091 0,025 0,411 0,243 0,510 0,130 0,565 0,001 0,340 0,001 0,338 0,482 0,111 0,064 0,023 0,025 0,066 0,037 0,091 0,029 0,358 0,277 0,492 0,126 0,555 0,001 0,350 0,001 0,311 0,474 0,099 0,046 0,023 0,029 0,066 0,045 0,118 0,016 Ngày Hàm lượng lân hoà tan (mg/L) 114,097 132,161 115,065 75,710 77,968 88,935 159,581 164,097 158,290 31,903 41,581 40,258 171,194 181,839 178,613 0,000 0,032 0,000 110,548 109,258 112,484 0,000 0,000 0,000 92,484 108,613 99,903 155,387 155,065 152,484 31,581 35,387 31,677 10,806 20,323 14,677 7,290 7,226 7,258 7,065 7,613 9,032 19,774 21,000 20,871 13,129 11,677 14,226 28,935 29,000 37,839 7,613 9,194 4,871 OD880 1,561 0,825 1,312 1,459 1,422 1,358 1,149 0,272 1,317 1,323 0,595 0,426 0,365 0,338 0,223 0,546 0,326 0,326 1,592 0,766 1,252 1,345 1,450 1,490 1,521 0,385 1,353 1,298 0,570 0,469 0,326 0,184 0,224 0,330 0,278 0,228 1,537 0,810 1,345 1,321 1,423 1,206 1,121 0,366 1,307 1,269 0,555 0,440 0,334 0,830 0,223 0,354 0,282 0,182 Ngày 10 Hàm lượng lân hoà tan (mg/L) 464,281 473,969 456,781 234,281 2215,844 229,594 386,469 367,719 396,781 432,406 396,781 389,281 420,844 429,594 421,156 400,844 442,094 345,531 335,531 451,781 364,969 92,719 96,781 90,844 388,031 399,281 384,906 389,906 382,094 373,031 162,406 154,594 149,906 109,594 123,031 113,969 90,531 78,344 80,844 82,094 96,469 96,156 46,156 46,469 46,156 84,594 79,594 87,094 78,344 63,344 64,594 78,344 47,719 64,594 OD880 1,042 1,236 1,415 1,366 1,195 1,292 1,236 1,352 1,284 1,068 0,792 0,828 0,729 0,735 0,336 0,245 0,222 0,132 1,464 1,623 1,408 1,346 1,318 1,206 1,243 1,087 1,145 1,159 0,801 0,724 0,776 0,662 0,426 0,472 0,321 0,158 1,617 1,567 1,566 1,307 1,346 1,272 1,188 1,202 1,130 1,161 0,810 0,801 0,702 0,725 0,338 0,326 0,184 0,139 Ngày 15 Hàm lượng lân hoà tan (mg/L) 427,156 434,031 481,844 362,781 483,719 466,219 418,719 416,531 465,906 403,406 397,156 384,969 349,969 388,406 397,156 380,281 353,406 374,031 362,781 364,969 347,781 399,031 316,219 352,156 377,781 334,344 329,656 310,281 338,719 339,344 224,031 226,844 229,656 235,281 202,781 226,844 204,344 219,031 195,031 206,219 183,406 203,094 81,531 109,656 82,156 53,094 124,031 78,406 45,906 76,844 34,031 17,781 25,906 19,969 2. Kết thí nghiệm Bảng 20. Đường chuẩn IAA (Đợt 1) STT Thời điểm khảo sát Ngày (21/8/2013) Ngày (23/8/2013) Ngày (25/8/2013) Ngày (27/8/2013) Phương trình đường chuẩn y=0,0166x+0,1023 (R2=0,970) y=0,0174x+0,1100 (R2=0,964) y=0,0161x+0,1040 (R2=0,961) y=0,0175x+0,0738 (R2=0,972) Bảng 21. Đường chuẩn IAA (Đợt – dành cho dòng AM3, VL2.27a, CT1.21c, CT14 NT4) STT Thời điểm khảo sát Ngày (22/8/2013) Ngày (24/8/2013) Ngày (26/8/2013) Ngày (28/8/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Phương trình đường chuẩn y=0,0175x+0,0938 (R2=0,971) y=0,0174x+0,0876 (R2=0,975) y=0,0172x+0,0930 (R2=0,978) y=0,0172x+0,0783 (R2=0,971) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 22. Kết OD530nm nghiệm thức chủng vi khuẩn hàm lượng IAA sinh dịch vi khuẩn thời điểm ngày sau chủng Ngày Ngày STT Dòng TN20 - - - - - - 0,096 0,096 0,103 1,269 1,269 1,669 TV2B7 0,112 0,115 0,119 0,497 0,683 0,932 0,125 0,118 0,140 2,926 2,526 3,783 CTA3 0,112 0,109 0,107 0,497 0,311 0,186 0,137 0,135 0,106 3,611 3,497 1,84 CTB3 0,110 0,116 0,373 0,621 0,745 0,108 0,112 0,114 1,954 2,183 2,011 PT10 0,124 0,125 0,116 1,242 1,304 0,745 0,112 0,109 0,101 2,183 2,011 1,554 PT4 - - - - - - 0,096 0,101 0,098 1,269 1,554 1,383 TC3 0,114 0,109 0,110 0,621 0,311 0,373 0,085 0,092 0,087 0,640 1,040 0,754 NT3 0,123 0,128 0,136 1,180 1,491 1,988 0,080 0,080 0,085 0,354 0,354 0,640 PT19 0,147 0,139 0,146 2,671 2,174 2,609 - - - - - - 10 VL2.27a 0,140 0,150 0,153 2,733 3,314 3,488 - - - - - - 11 CT14 0,109 0,104 0,109 0,930 0,640 0,930 - - - - - - 12 NT4 0,099 0,095 0,102 0,349 0,116 0,523 - - - - - - OD (530nm) 0,114 IAA (µg/mL) OD (530nm) IAA (µg/mL) 3. Kết thí nghiệm Bảng 23. Số liệu khảo sát tính đối kháng nấm vi khuẩn STT Dòng vi khuẩn ĐC không chủng vi khuẩn TN4 TV2B3 AM3 NT4 CT14 PT10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Ngày Bán kính hệ sợi nấm – R (mm) Tỷ lệ ức chế nấm – I (%) 32 33,5 30 26 26,5 24,5 18,75 20,90 18,33 25 27 25 21,88 19,40 16,67 17,5 16,5 17,5 45,31 50,75 41,67 21,5 22,5 22 32,81 32,84 26,67 16 16,5 15,5 50,00 50,75 48,33 20,5 23,5 24 35,94 29,85 20,00 Ngày 10 Bán kính hệ sợi nấm – R (mm) Tỷ lệ ức chế nấm – I (%) 45 45 45 27 26,5 26,5 18 18,5 18,5 24 27 23 21 18 22 18 17,5 16,5 27 27,5 28,5 18 24 22 27 21 23 16 16,5 15,5 29 28,5 29,5 20,5 23,5 24 24,5 21,5 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 4: Kết thống kê 1. Kết thống kê thí nghiệm a) Kết phân tích số PSI Summary Statistics for PSI Dòng VK AM3 CT1.21c CT1.N2 CT14 CTA3 CTB3 NT3 NT4 PT10 PT19 PT4 TC3 TN20 TV2B7 TV3A4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 45 Average 2,31833 2,66667 2,20933 2,34567 2,37067 2,57 2,29167 2,482 2,47 2,30967 2,36267 2,55067 2,673 2,12667 2,484 2,4154 Standard deviation 0,118357 0,152753 0,0080829 0,0654548 0,143263 0,15647 0,0877971 0,0992321 0,0259808 0,0417652 0,0816476 0,286312 0,150123 0,16481 0,0880965 0,188965 Coeff. of variation 5,10525% 5,72822% 0,365853% 2,79046% 6,04316% 6,08834% 3,83115% 3,99807% 1,05185% 1,80828% 3,45574% 11,225% 5,61628% 7,74969% 3,54656% 7,82336% Standard error 0,0683333 0,0881917 0,00466667 0,0377904 0,082713 0,0903383 0,0506897 0,0572917 0,015 0,0241132 0,0471393 0,165302 0,0866737 0,0951531 0,0508626 0,0281693 Minimum 2,25 2,5 2,2 2,273 2,25 2,421 2,2 2,375 2,455 2,278 2,3 2,333 2,5 2,0 2,389 2,0 Maximum 2,455 2,8 2,214 2,4 2,529 2,733 2,375 2,571 2,5 2,357 2,455 2,875 2,769 2,313 2,563 2,875 ANOVA Table for PSI by Dòng VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1,0656 0,505549 1,57115 Df 14 30 44 Mean Square 0,0761143 0,0168516 F-Ratio 4,52 P-Value 0,0003 Multiple Range Tests for PSI by Dòng VK Method: 95,0 percent Duncan Dòng VK Count 3 3 3 3 3 3 3 TV2B7 CT1.N2 NT3 PT19 AM3 CT14 PT4 CTA3 PT10 NT4 TV3A4 TC3 CTB3 CT1.21c TN20 Mean 2,12667 2,20933 2,29167 2,30967 2,31833 2,34567 2,36267 2,37067 2,47 2,482 2,484 2,55067 2,57 2,66667 2,673 Homogeneous Groups X X XX XXX XXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXX XX X X b) Kết phân tích lượng lân hoà tan sinh dịch nuôi vi khuẩn sau ngày chủng Summary Statistics for Nong lân hoà tan (mg/L) Dong vi khuan AM3 CT1.21c CT1.N2 CT14 CTA3 CTB3 NT3 NT4 PT10 PT19 PT4 TC3 TN20 Count 3 3 3 3 3 3 Average 110,763 15,2687 37,914 32,8817 177,215 100,333 31,9247 7,226 13,0107 0,0106667 20,5483 160,656 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Standard deviation Coeff. of variation 1,62374 1,46596% 4,78601 31,3453% 5,24754 13,8406% 2,17021 6,60007% 5,4584 3,08009% 8,07311 8,04629% 5,12207 16,0442% 2,18733 30,2703% 1,27861 9,82742% 0,0184752 173,205% 0,673687 3,27855% 0% 3,0491 1,89791% Minimum 109,258 10,806 31,903 31,581 171,194 92,484 28,935 4,871 11,677 19,774 Maximum 112,484 20,323 41,581 35,387 181,839 108,613 37,839 9,194 14,226 0,032 21,0 Range 3,226 9,517 9,678 3,806 10,645 16,129 8,904 4,323 2,549 0,032 1,226 158,29 164,097 5,807 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Dong vi khuan TN4 TV2B3 TV2B7 TV3A4 VL2.27a Total Count 3 3 54 Average 7,258 120,441 154,312 80,871 7,90333 59,9188 Trường ĐHCT Standard deviation Coeff. of variation 0,032 0,440893% 10,1614 8,43679% 1,59126 1,0312% 7,0743 8,74763% 1,01513 12,8443% 60,446 100,88% Minimum 7,226 114,097 152,484 75,71 7,065 Maximum 7,29 132,161 155,387 88,935 9,032 181,839 Range 0,064 18,064 2,903 13,225 1,967 181,839 ANOVA Table for Nong lân hoà tan (mg/L) by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 192943,0 704,053 193647,0 Df 17 36 53 Mean Square 11349,6 19,557 F-Ratio 580,33 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for Nong lân hoà tan (mg/L) by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan TC3 PT19 NT4 TN4 VL2.27a PT10 CT1.21c PT4 NT3 CT14 CT1.N2 TV3A4 CTB3 AM3 TV2B3 TV2B7 TN20 CTA3 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 0,0106667 7,226 7,258 7,90333 13,0107 15,2687 20,5483 31,9247 32,8817 37,914 80,871 100,333 110,763 120,441 154,312 160,656 177,215 Homogeneous Groups X X XX XX X XX XX X X X X X X X X X X X c) Kết phân tích lượng lân hoà tan sinh dịch nuôi vi khuẩn sau 10 ngày chủng Summary Statistics for Nong lân hoà tan (mg/L) 10 Dong vi khuan AM3 CT1.21c CT1.N2 CT14 CTA3 CTB3 NT3 NT4 PT10 PT19 PT4 TC3 TN20 TN4 TV2B3 TV2B7 TV3A4 VL2.27a Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 54 Average 371,364 115,531 406,156 155,635 423,865 390,739 68,7607 63,5523 83,7607 396,156 46,2603 93,448 383,656 83,2397 465,01 381,677 226,573 91,573 235,942 Standard deviation 69,7802 6,85339 23,0404 6,31473 4,9642 7,56052 8,32291 15,3391 3,81881 48,4519 0,180711 3,03489 14,7337 6,43701 8,61718 8,44522 9,58257 8,21055 157,09 Coeff. of variation 18,7902% 5,93206% 5,67279% 4,05739% 1,17118% 1,93493% 12,1042% 24,1361% 4,5592% 12,2305% 0,390638% 3,24768% 3,84035% 7,73311% 1,85312% 2,21266% 4,22935% 8,96612% 66,58% Minimum 326,781 109,594 389,281 149,906 420,844 384,906 63,344 47,719 79,594 345,531 46,156 90,844 367,719 78,344 456,781 373,031 215,844 82,094 46,156 Maximum 451,781 123,031 432,406 162,406 429,594 399,281 78,344 78,344 87,094 442,094 46,469 96,781 396,781 90,531 473,969 389,906 234,281 96,469 473,969 Range 125,0 13,437 43,125 12,5 8,75 14,375 15,0 30,625 7,5 96,563 0,313 5,937 29,062 12,187 17,188 16,875 18,437 14,375 427,813 ANOVA Table for Nong lân hoà tan (mg/L) by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1,29029E6 17616,2 1,3079E6 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Df 17 36 53 Mean Square 75899,1 489,338 F-Ratio 155,11 P-Value 0,0000 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for Nong lân hoà tan (mg/L) by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 PT4 NT4 NT3 TN4 PT10 VL2.27a TC3 CT1.21c CT14 TV3A4 AM3 TV2B7 TN20 CTB3 PT19 CT1.N2 CTA3 TV2B3 Mean 46,2603 63,5523 68,7607 83,2397 83,7607 91,573 93,448 115,531 155,635 226,573 371,364 381,677 383,656 390,739 396,156 406,156 423,865 465,01 Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX XX X X X X X X XX XX XX X X d) Kết phân tích lượng lân hoà tan sinh dịch nuôi vi khuẩn sau 15 ngày chủng Summary Statistics for Nong lân hoà tan (mg/L) 15 Dong vi khuan AM3 CT1.21c CT1.N2 CT14 CTA3 CTB3 NT3 NT4 PT10 PT19 PT4 TC3 TN20 TN4 TV2B3 TV2B7 TV3A4 VL2.27a Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 54 Average 358,51 221,635 395,177 226,844 378,51 347,26 52,2603 21,2187 85,177 369,239 91,1143 355,802 433,719 206,427 447,677 329,448 437,573 197,573 275,287 Standard deviation 9,35606 16,8645 9,37646 2,8125 25,1017 26,5354 22,1025 4,20418 35,95 14,0637 16,0606 41,5262 27,8965 11,7024 29,7885 16,6021 65,3601 12,3681 139,76 Coeff. of variation 2,6097% 7,6091% 2,37273% 1,23984% 6,63171% 7,64136% 42,2931% 19,8136% 42,2062% 3,80882% 17,6269% 11,6712% 6,43194% 5,66901% 6,65401% 5,03935% 14,937% 6,26% 50,769% Minimum 347,781 202,781 384,969 224,031 349,969 329,656 34,031 17,781 53,094 353,406 81,531 316,219 416,531 195,906 427,156 310,281 362,781 183,406 17,781 Maximum 364,969 235,281 403,406 229,656 397,156 377,781 76,844 25,906 124,031 380,281 109,656 399,031 465,906 219,031 481,844 339,344 483,719 206,219 483,719 Range 17,188 32,5 18,437 5,625 47,187 48,125 42,813 8,125 70,937 26,875 28,125 82,812 49,375 23,125 54,688 29,063 120,938 22,813 465,938 Multiple Range Tests for Nong lân hoà tan (mg/L) by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan NT4 NT3 PT10 PT4 VL2.27a TN4 CT1.21c CT14 TV2B7 CTB3 TC3 AM3 PT19 CTA3 CT1.N2 TN20 TV3A4 TV2B3 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 21,2187 52,2603 85,177 91,1143 197,573 206,427 221,635 226,844 329,448 347,26 355,802 358,51 369,239 378,51 395,177 433,719 437,573 447,677 Homogeneous Groups X XX X X X X X X X XX XXX XXX XXX XX XX XX XX X Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT ANOVA Table for Nong lân hoa tan (mg/L) by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1,01068E6 24567,6 1,03525E6 Df 17 36 53 Mean Square 59451,7 682,434 F-Ratio 87,12 P-Value 0,0000 2. Kết thống kê thí nghiệm a) Kết phân tích lượng IAA sinh dịch nuôi vi khuẩn sau ngày chủng Summary Statistics for Ham luong IAA Dong vi khuan CT14 CTA3 CTB3 NT3 NT4 PT10 PT19 TC3 TV2B7 VL2.27a Total Count 3 3 3 3 3 30 Average 0,833333 0,331333 0,579667 1,553 0,329333 1,097 2,48467 0,435 0,704 3,17833 1,15257 Standard deviation 0,167432 0,156494 0,189413 0,407552 0,204211 0,306413 0,270825 0,164037 0,218259 0,395361 0,965056 Coeff. of variation 20,0918% 47,2316% 32,6762% 26,2429% 62,0075% 27,9319% 10,8999% 37,7096% 31,0027% 12,4393% 83,7311% Minimum 0,64 0,186 0,373 1,18 0,116 0,745 2,174 0,311 0,497 2,733 0,116 Maximum 0,93 0,497 0,745 1,988 0,523 1,304 2,671 0,621 0,932 3,488 3,488 Range 0,29 0,311 0,372 0,808 0,407 0,559 0,497 0,31 0,435 0,755 3,372 ANOVA Table for Ham luong IAA by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 25,6201 1,38859 27,0087 Df 20 29 Mean Square 2,84668 0,0694293 F-Ratio 41,00 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for Ham luong IAA by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan NT4 CTA3 TC3 CTB3 TV2B7 CT14 PT10 NT3 PT19 VL2.27a Count 3 3 3 3 3 Mean 0,329333 0,331333 0,435 0,579667 0,704 0,833333 1,097 1,553 2,48467 3,17833 Homogeneous Groups X X XX XX XXX XX X X X X b) Kết phân tích lượng IAA sinh dịch nuôi vi khuẩn sau ngày chủng Summary Statistics for Ham luong IAA Dong vi khuan CTA3 CTB3 NT3 PT10 PT4 TC3 TN20 TV2B7 Total Count 3 3 3 3 24 Average 3,63033 2,14467 0,449333 1,85867 1,402 0,811333 1,40233 3,07833 1,84712 Standard deviation 0,143977 0,174684 0,165122 0,263849 0,143447 0,206071 0,23094 0,642196 1,06271 Coeff. of variation 3,96594% 8,14502% 36,7483% 14,1956% 10,2316% 25,3991% 16,4683% 20,8618% 57,533% Minimum 3,497 1,954 0,354 1,554 1,269 0,64 1,269 2,526 0,354 Maximum 3,783 2,297 0,64 2,011 1,554 1,04 1,669 3,783 3,783 Range 0,286 0,343 0,286 0,457 0,285 0,4 0,4 1,257 3,429 ANOVA Table for Ham luong IAA by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 24,6211 1,35383 25,9749 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Df 16 23 Mean Square 3,5173 0,0846147 F-Ratio 41,57 P-Value 0,0000 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for Ham luong IAA by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan Count 3 3 3 3 NT3 TC3 PT4 TN20 PT10 CTB3 TV2B7 CTA3 Mean 0,449333 0,811333 1,402 1,40233 1,85867 2,14467 3,07833 3,63033 Homogeneous Groups X X X X XX X X X 3. Kết thống kê thí nghiệm a) Kết phân tích tỉ lệ ức chế phát triển nấm dòng vi khuẩn sau ngày Summary Statistics for Ti le uc che nam Dong vi khuan AM3 CT14 NT4 PT10 TN4 TV2B3 Total Count 3 3 3 18 Average 45,91 49,6933 30,7733 28,5967 19,3267 19,3167 32,2694 Standard deviation 4,56964 1,2388 3,55362 8,04357 1,37863 2,606 12,693 Coeff. of variation 9,95347% 2,4929% 11,5477% 28,1277% 7,13333% 13,4909% 39,3343% Minimum 41,67 48,33 26,67 20,0 18,33 16,67 16,67 Maximum 50,75 50,75 32,84 35,94 20,9 21,88 50,75 Range 9,08 2,42 6,17 15,94 2,57 5,21 34,08 ANOVA Table for Ti le uc che nam by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 2522,02 216,871 2738,89 Df 12 17 Mean Square 504,405 18,0726 F-Ratio 27,91 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for Ti le uc che nam by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan Count 3 3 3 TV2B3 TN4 PT10 NT4 AM3 CT14 Mean 19,3167 19,3267 28,5967 30,7733 45,91 49,6933 Homogeneous Groups X X X X X X b) Kết phân tích tỉ lệ ức chế phát triển nấm dòng vi khuẩn sau 10 ngày Summary Statistics for Ti le uc che nam 10 Dong vi khuan AM3 CT14 NT4 PT10 TN4 TV2B3 Total Count 3 3 3 18 Average 61,48 64,4433 52,5933 49,63 40,74 45,1867 52,3456 Standard deviation 1,69555 1,115 6,78767 4,20239 0,640859 4,6269 9,2318 Coeff. of variation 2,75789% 1,73021% 12,9059% 8,46744% 1,57305% 10,2395% 17,6363% Minimum 60,0 63,33 46,67 46,67 40,0 40,0 40,0 Maximum 63,33 65,56 60,0 54,44 41,11 48,89 65,56 Range 3,33 2,23 13,33 7,77 1,11 8,89 25,56 Multiple Range Tests for Ti le uc che nam 10 by Dong vi khuan Method: 95,0 percent LSD Dong vi khuan TN4 TV2B3 PT10 NT4 AM3 CT14 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Count 3 3 3 Mean 40,74 45,1867 49,63 52,5933 61,48 64,4433 Homogeneous Groups X XX XX X X X Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT ANOVA Table for Ti le uc che nam 10 by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1269,51 179,339 1448,84 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Df 12 17 Mean Square 253,901 14,9449 F-Ratio 16,99 P-Value 0,0000 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... vi khuẩn đất vùng rễ có tiềm năng ứng dụng cao, cung cấp nguyên liệu cho các thí nghiệm sản xuất phân bón vi sinh khác 1.2 - Mục tiêu đề tài Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan, tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) và enzyme chitinase của 18 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm phân lập từ đất vùng rễ lúa - Khảo sát khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae trong điều kiện in vitro của các dòng vi. .. đã phân lập được 25 dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng cố định đạm cao từ vùng đất phù sa tại tỉnh Vĩnh Long Năm 2010, Ngô Thanh Phong et al đã phân lập được 51 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốt từ đất vùng rễ lúa thu tại mẫu đất phù sa thuộc tỉnh Kiên Giang Phạm Thị Ánh Loan (2012) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn Pseudomonas từ tám mẫu đất vùng rễ lúa, 28 dòng vi khuẩn này đều có khả năng. .. trồng khác nhau (Lambert và Joos, 1989) nên các đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của các loài vi khuẩn này cần được nghiên cứu ở phạm vi rộng và chuyên sâu hơn để có thể tận dụng tiềm năng của chúng một cách tối ưu trong sản xuất nông nghiệp Từ nhu cầu thực tế đó, đề tài Khảo sát khả năng hòa tan lân, tổng hợp IAA và enzyme chitinase của vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa được thực hiện nhằm... thấy 3 chủng vi khuẩn hòa tan lân thu được từ đất vùng rễ (đường kính vòng hòa tan lân lên đến 20-40mm) được khảo sát đều có khả năng tổng hợp IAA Khi xử lý hạt đậu xanh với từng chủng vi khuẩn, cả 3 chủng đều kích thích sự sinh lông hút và rễ bên cũng như làm tăng chiều dài rễ Bảy chủng vi khuẩn vùng rễ lúa được sử dụng trong nghiên cứu của Gopalakrishnan et al (2010) biểu hiện khả năng đối kháng nấm... sự thay đổi của nồng độ IAA như bộ rễ Khả năng tổng hợp IAA của các loài PGPR khác nhau có sự khác biệt rõ rệt, thậm chí các chủng khác nhau trong cùng một loài cũng có lượng IAA sinh ra không giống nhau, tùy thuộc vào lượng tryptophan có sẵn trong dịch tiết rễ hoặc khả năng tự tổng hợp tryptophan của vi khuẩn Chính vì vậy, khi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA bởi vi khuẩn trong... khuẩn này đều có khả năng sinh tổng hợp IAA Năm 2012, Nguyễn Thị Phương Oanh et al đã phân lập được 57 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm từ đất vùng rễ lúa thuộc tỉnh Cần Thơ và Trà Vinh Bốn chủng có hàm lượng đạm và IAA cố định đạm cao nhất trong số 57 dòng này còn biểu hiện khả năng hòa tan lân khó tan và khả năng kích thích sinh trưởng cây lúa OM3536 Nguyễn Bá Hữu và Đặng Thị Cẩm Hà (2007) đã... cỏ ba lá, A brasilense Sp7 cho thấy khả năng khử acetylene, tạo nốt rễ giả và làm tăng trọng lượng khô của cây (Oliveira et al., 1997) Nhiều vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm tốt thuộc các chi Azoarcus, Burkholderia, Gluconacetobacter và Pseudomonas cũng đã được phân lập từ các vùng đất rễ khác nhau 2.4 Khả năng hòa tan lân khó tan Khả năng hoà tan lân khó tan được xem là hoạt động tăng cường... khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan phân lập từ vùng rễ cây táo và cây anh đào chua Shyamala và Sivakumaar (2012) đã sử dụng chủng vi khuẩn Pseudomonas flourescens phân lập từ vùng rễ lúa để thử khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn sử dụng có khả năng ức chế sự phát triển hệ sợi của nấm, đồng thời nó còn tiết protease, IAA và siderophore giúp... có khả năng tổng hợp IAA, siderophore, HCN bên cạnh khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và đối kháng nấm hiệu quả từ vùng đất rễ của một số loài cây thuộc họ Cà (Solanaceae) Hạt ớt được xử lý với chủng vi khuẩn này cho chỉ số nảy mầm 100% và giảm nhiễm các bệnh gây bởi Collectotrichum gleosporidose OGC1 đến gần 50% Zaim et al (2013) đã phân lập được 131 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ cây đậu hồi/đậu... BOXPCR để phân tích sự khác biệt giữa 3 dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng 2,4Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa Dioxin tại Đà Nẵng Nguyễn Thị Phi Oanh et al (2011) cũng đã sử dụng phương pháp BOX-PCR để phân tích di truyền của 32 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D phân lập từ các mẫu đất lúa ở Tiền Giang và Sóc Trăng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Vi n NC&PT . al. (1 986 ) Tarrand et al. (1 9 78 ) A. lipoferum Rễ lúa mì và rễ bắp, Brasil Tarrand et al. (1 9 78 ) A. amazonense Rễ và vùng rễ cây họ hòa bản ở vùng Amazone, Brasil Tarrand et al. (1 9 78 ) A chủng vi khuẩn đối kháng 16 Hình 7. Phổ điện di sản phẩm BOX-PCR của 18 chủng Burkholderia pseudomallei 17 Hình 8. Đường chuẩn IAA với nồng độ từ 0 -80 µg/mL 28 Hình 9. Sơ đồ thử khả năng đối. NN&PTNN), diện tích canh tác lúa của cả nước năm 2012 là 7. 753,2 nghìn héc-ta (ha), tăng 97, 8 nghìn ha so với năm 2011 trong khi sản lượng đạt 43 ,7 triệu tấn, tăng 1,3 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu