BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI BÙI THỊ NGỌC THỰC NGHIÊN cúu TÁC DỤ CHIÉr ■NG CHỐNGVIÊM CỦA DỊCH ■ CÂYKIM NGÂN [LONICERAJAPONWATHUNB. CAPRIFOLIACEAR KÍT HỢPVỚI ALPHA- AMYLASE ■ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHOÁ 1999 -2004) Người hướng dẫn: - ThS. Lê Thị Diễm Hồng - Nơi thực hiện: GS.TS. Nguyễn Xuân Thắng Bộ môn Hoá sinh - Trường ĐH Dược HN Thời gian thực hiện: 2/2004 - 5/2004 IV £ M 2" i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn õẫu 5ấc tái GS.Tô Nguyễn Xuân ThắngChủ nhiệm Ỉ3Ộ môn Hoá ôinh Trường Đạ\ học Dược Hà nội Th.5 Lê Thị Diễm Hẩng - Giảng viên Bộ môn Hoá ỡinh đẵ tận tình hướng dấn, giúp (đỡ suôt (\uá trình học tạp ngiên cứu khoa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thây cô giáo dẵ trực tiếp truyêVi đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập trường. Tôi xin cảm ơn eự giúp đỡ tạo điều kiện tối đa cắc thầy cô giáo cô kỹ th u ậ t viên 3Ộ môn Hoá ỗinh Trường Đại học Dược Hà nội cho trình học tạp thực khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến cha mẹ, người thân bạn bè dã động viên cổ vũ vằ giúp đỡ trình học tệp hoàn thành luân văn tố t nghiệp. Hà nội, tháng năm 2004 Sinh viền: Bùi Thị Ngọc Thực KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẤT BC Bạch cầu ESR Erythrocyte sedimentation (Tốc độ lắng hồng cầu) FKN Flavonoid kim ngân Km Hằng số Michaelis Menten u Đơn vị hoạt độ enzym Vmax Tốc độ cực đại phản ứng enzym MỤC LỤC Trang Đặt vấn đ ề Chương I: Tổng quan . 1.1. Cơ sơ lý thuyết viêm . 1.2. Các thuốc chống viêm 1.3. Cây kim ngân Chương II: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu .12 2.1. Nguyên liệu 12 2.2. Súc vật thí nghiệm . . 14 2.3. Thiết bị dụng cụ .14 2.4. Hoá chất thí nghiệm . 14 2.5. Phương pháp nghiên cứu .15 Chương n i: Thực nghiệm kết q u ả 19 3.1. Ảnh hưởng dịch chiết ũavonoid kim ngân toàn phần hoạt tính a-amylase 19 3.2. Kết thử tác dụng in vivo 25 Chương IV: Bàn luận .29 Kết luận đề xuất . . 32 Tài liệu tham khảo ĐẶT VÂN ĐỂ Viêm bệnh lý phổ biến, gặp nhiều bệnh, nhiều nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm phản ứng bảo vệ thể, giúp thể chống lại tác nhân gây viêm. Tuy nhiên, viêm nặng kéo dài dẫn đến rối loạn chức quan, phận thể, gây nhiều ảnh hưởng xấu, có nguy hiểm tới tính mạng người bệnh. Vì vậy, việc ngăn ngừa yếu tố có hại viêm cần thiết quan trọng. Từ nhiều năm nay, loại thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược đời ứng dụng rộng rãi như: thuốc có cấu trúc steroid thuốc chống viêm phi steroid. Các thuốc có ưu điểm tác dụng tốt đạt hiệu cao việc hạn chế ngăn chặn trình viêm. Tuy nhiên, chúng có nhiều yếu tố bất lợi thể như: suy giảm miễn dịch, xốp xương, teo cơ, loét dày tá tràng, ảnh hưởng tới trình đông máu, tạo máu . Chính vậy, việc sử dụng enzym nội sinh có tác dụng chống viêm coi trọng a-chymotrypsin, papain, serratiopeptidase, aamylase . Chúng chất gần gũi với thể, gây ảnh hưởng xấu tới thể, phần khắc phục nhược điểm nhóm thuốc chống viêm steroid phi steroid, chúng dùng cho bệnh nhân không sử dụng thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược. Song song với hướng nghiên cứu enzym chống viêm nghiên cứu dược liệu trình viêm ý. Ở nước ta có nhiều loại dược liệu có tác dụng chống viêm tốt. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nhóm hoạt chất xuất nhiều dược liệu có khả chống viêm ílavonoid. Cây kim ngân thuốc phổ biến Việt nam có thành phần Aavonoid dùng vị thuốc chống viêm, chống dị ứng giải độc. Trên sở đó, tiến hành đề tài: "Nghiên cứu tác dụng chống viêm dịch chiết kim ngân (Lonicera japonica Thunb. Caprỉfoliaceae) kết họp với alpha- amylase " Đề tài thực hiên nhằm số mục tiêu: 1. Bước đầu tìm hiểu tác dụng dịch chiết ílavonoid toàn phần kim ngân hoạt động a-amylase in vitro. 2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp dịch chiết Aavonoid toàn phần kim ngân kết hợp với a-amylase in vivo. Chương I TỔNG QUAN 1.1. c s LÝ THUYẾT VỂ VIÊM Viêm trình bệnh lý nguy hiểm, : - Có vô số yếu tố cụ thể gây viêm - Bất quan mô bị viêm. Cách 2000 năm Celcius đặt móng quan trọng ông đưa khái niệm tổng kết viêm, với tính chất : sưng, nóng, đỏ, đau. Từ đó, người ta thấy viêm bệnh cụ thể mà biểu bệnh lý nói chung, gặp nhiều bệnh khác nhau. Tuy nhiên, Celcius nêu biểu bên ngoài, mang tính chất hình thái viêm. Galen bổ xung thêm tính chất viêm gây rối loạn chức năng. Tóm lại, nói viêm phản ứng thể mô liên kết biểu thực bào chỗ, có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm sửa chữa tổn thương; đồng thời kèm theo biểu bệnh lý. Như vậy, viêm vừa phản ứng bảo vệ thể chống lại yếu tố gây bệnh, vừa phản ứng bệnh lý trình viêm gây tổn thương, hoại tử, rối loạn chức quan . mức độ nặng nề, nguy hiểm [2, 202]. 1.1.1. Nguyên nhân gây viêm * Nguyên nhân bên - Do nhiễm khuẩn, virút, ký sinh trùng, sản phẩm chuyển hoá, kháng nguyên ngoại lai -Tác nhân lý, hoá học: Chấn thương, nhiệt, xạ ion, tác dụng acid, kiềm, hoá chất. * Nguyên nhân bên - Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng. - Hình thành phức hợp miễn dịch, thay đổi nội sinh chất giao bào [10, 6]. 1.1.2 Phân loại viêm * Theo nguyên nhân: Viêm nhiễm trùng viêm vô trùng. * Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong. * Theo thành phần dịch rỉ viêm: Viêm dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ. * Theo tính chất: - Viêm đặc hiệu: thường viêm mãn tính phản ứng kháng nguyên kháng thể. - Viêm không đặc hiệu: thường viêm cấp [2, 203]. 1.1.3. Các phản ứng xảy trình viêm. Trong trình viêm, ổ viêm thể diễn hàng loạt phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác nhau. Các phản ứng tóm tắt hình 1.1: QUÁ TRÌNH VIÊM (Xâm nhập tác nhân gây viêm ) PHẢN ỨNG TẠI CHỖ PHẢN ÚNG HỆ THỐNG Giãn, chậm tuần hoàn mao mạch Tăng thân nhiệt Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mô Đau Ngưng hồng cầu, đông vón tiểu cầu Tăng BC hạt, lympho bào Giải phóng chất trung gian hoá học Tăng ESR, fibrinogen Hình thành cục máu đông __ ^1 . Tăng protein c hoạt hoá Tích tụ BC trung tính, lympho Giảm albumin Tăng thực bào, phá huỷ mô Tăng a, p, Yglobulin Tăng enzym huyết Giảm sắt, tăng đồng Giải phóng enzym lysosom bào tương Tăng glycoprotein Tăng sinh phì đại nội mô Tăng mucoprotein (4). GIAI ĐOẠN TOÀN THỂ (ế) TẾ BÀO CHẾT VÀ HOẠI TỬ PHỤC HỚI THOÁT DỊCH MÀNG TÊ BÀO (Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng bào tương) Hình 1.1.Các phản ứng chỗ hệ thông trình viêm [16,28]. 1.2. CÁC THUỐC CHỐNG VIÊM 1.2.1. Thuốc chống viêm steroid. Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với hormon steroid vỏ thượng thận hydrocortison, prednisolon, dexamethason, betamethason. Nhóm thuốc ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin, làm giảm tổng hợp leucotrien prostaglandin, nên có tác dụng chống viêm. Các thuốc có tác dụng chống viêm nguyên nhân học, hoá học, miễn dịch nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, chúng có nhiều tác dụng phụ thể loét dày- tá tràng, loãng xương, xốp xương, teo cơ, suy thượng thận cấp dừng đột ngột .[13, 632]. 1.2.2. Thuốc chống viêm phi steroid Là nhóm thuốc chống viêm cấu trúc steroid aspirin, indomethacin, piroxicam, diclofenac, .Cơ chế chống viêm nhóm thuốc ức chế enzym cyclooxygenase (COX) nên làm giảm tổng hợp prostaglandin. Bên cạnh hiệu đạt lâm sàng nhóm thuốc có nhiều yếu tố bất lợi thể gây loét dày, suy thận, chảy máu kéo dài .[13, 631]. 1.2.3. Amylase • Một số nghiên cứu enzym chống viêm. Các enzym có tác dụng chống viêm a-chymotrysin, serratiopeptidase, chymopapain, a-amylase . sử dụng ngày rộng rãi. Bên cạnh thuốc chống viêm steroid phi steroid, enzym có ưu điểm chất gần gũi với thể người phần giảm tác dụng không mong muốn. Mặc dù có nguồn gốc, cấu tạo chất khác nhau, enzym có khả chống viêm động vật thực nghiệm người. Cơ chế tác động enzym chưa thực làm sáng tỏ, nhiên chúng đạt hiệu cao định chống Chương III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT FLAVONOID KIM NGÂN TOÀN PHẦN ĐỐI VỚI HOẠT TÍNH CỦA ALPHA-AMYLASE. • Kết xác định sơ hàm lượng a-amylase nước bọt. + Kết vẽ biểu đồ mẫu albumin chuẩn 5mg/ml. Tiến hành vẽ biểu đồ mẫu theo phương pháp nêu phần 2.5.1. Kết thu sau: Bảng 3.1. Kết đo quang dung dịch albumin. Ống Dung dịch albumin 5mg/ml (ml) 0,3 0,5 0,6 0,8 1,0 Lượng albumin tương ứng (mg) 1,5 2,5 3,0 4,0 5,0 Mật độ quang 0,062 0,095 0,120 0,160 0,201 Lượng albumin tương ứng (mg) Hình 3.1. Biểu đồ mẫu albumin chuẩn 5mg/ml 19 + Sơ xác định hàm lượng a-amylase nước bọt. Trước tiến hành thử nghiệm in vitro, nước bọt người xác định sơ hàm lượng a-amylase theo phương pháp nêu mục 2.5.1. Kết thu sau: Bảng 3.2. Kết đo quang dung dịch nước bọt Ống thử Thể tích dung dịch nước bọt (ml) Mật độ quang (D) 1,0 0,140 1,0 0,142 1,0 0,131 1,0 0,134 1,0 0,128 Trung bình 1,0 0,135 Như vậy, mật độ quang trung bình thu 0,135, đối chiếu với biểu đồ mẫu albumin 5mg/ml suy hàm lượng a-amylase nước bọt 3,5mg/ml. Dựa vào kết để tiến hành thử nghiệm tiếp theo. 3.1.1. Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần đối vói hoạt tính a-amylase Với mục đích tìm nồng độ thích hợp dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần kích thích hoạt tính a-amylase mạnh nhất, tiến hành xác định hoạt tính a-amylase kết hợp với dịch chiết Havonoid kim ngân toàn phần nồng độ khác điều kiện nêu phần 2.5.2. Kết thu trình bày bảng sau: 20 Bảng 3.3: Ẳnh hưởng nồng độ dịch chiếtỷlavonoid kim ngân toàn phần hoạt tính a-amyỉase. Nồng độ % tinh bột bị %thay đổi dịch chiết FKN thuỷ phân hoạt tính 31,5 ±0,7 100,00 0,005 49,7 ±2,1 157,8 p[...]... tính của ocamylase 3 Dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần với liều tương ứng l,5g kim ngân/ kg có tác dụng chống viêm trên mô hình chống viêm cấp 4 Khi kết hợp dịch chiết Havonoid kim ngân và a -amylase với liều tương ứng l,5g kim ngân/ kg + 6000 u/kg, tác dụng chống viêm tăng cao thể hiện tác dụng hiệp đồng của 2 hoạt chất trên mô hình gây viêm cấp Tác dụng hiệp đồng này tương đương với indomethacin liều... ta thấy: dịch chiết ũavonoid kim ngân toàn phần với liều tương ứng l,5g kim ngân /kg có tác dụng giảm phù chân chuột rõ rệt, tỷ lệ ức chế phù là 34,6%, a -amylase với liều 6000 u/kg có tác dụng giảm phù chân chuột cao, tỷ lệ ức chế phù là 45,5%, khi kết hợp dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần (với liều l,5g kim ngân/ kg) với a -amylase 6000 u/kg tác dụng chống viêm tăng lên tới 58,3% (P . chống viêm, chống dị ứng và giải độc. 1 Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài: " ;Nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb. Caprỉfoliaceae). vitro. 2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết Aavonoid toàn phần của cây kim ngân khi kết hợp với a -amylase trên in vivo. 2 Chương I TỔNG QUAN 1.1. c ơ sở LÝ THUYẾT VỂ VIÊM Viêm là. phận dùng: + Hoa kim ngân (Flos Lonicera) là hoa phoi hay sấy khô của cây kim ngân. + Cành và lá kim ngân (Caulis cum íolium Lonicerae) là cành và lá phơi hay sấy khô của cây kim ngân [7, 75]. •