TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG HUỲNH THỊ CẨM MY SỰ PHÂN HỦY YẾM KHÍ CHLORPYRIFOS ETHYL BỞI HỆ VI KHUẨN TỪ NỀN ĐẤT CHUYÊN CANH LÚA TẠI CAI LẬY-TIỀN GIANG VÀ PHỤNG HIỆP-HẬU GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG HUỲNH THỊ CẨM MY SỰ PHÂN HỦY YẾM KHÍ CHLORPYRIFOS ETHYL BỞI HỆ VI KHUẨN TỪ NỀN ĐẤT CHUYÊN CANH LÚA TẠI CAI LẬY-TIỀN GIANG VÀ PHỤNG HIỆP-HẬU GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH MSSV: 3108291 Người hướng dẫn khoa học: TS DƯƠNG MINH VIỄN Cần Thơ, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thân thầy hướng dẫn Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố tài liệu trước Người hướng dẫn Tác giả luận văn Ký tên Ký tên TS Dương Minh Viễn Huỳnh Thị Cẩm My i LÝ LỊCH CÁ NHÂN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC Họ tên: Huỳnh Thị Cẩm My Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 27/09/1992 Nơi sinh: Hậu Giang Quê quán: Vị Thanh, Hậu Giang Dân tộc: Kinh Địa liên lạc: Khu Vực 5, Phường 3, TP Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang Điện thoại: 0939663453 E-mail: myhuynh0103@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP Năm 1998-2003: học trường tiểu học Trần Quốc Toản, Khu Vực 2, Phường 5, TP Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang Năm 2003-2007: học trường THCS Lê Q Đơn, Khu Vực 1, Phường 3, TP Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang Năm 2007-2010: học trường THPT Vị Thanh, Khu Vực 1, Phường 3, TP Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang Năm 2010-2014: học ngành Nông Nghiệp Sạch Trường Đại Học Cần Thơ, Phường Xuân Khánh, Quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ Cần Thơ, ngày 17 tháng năm 2014 Người khai ký tên Huỳnh Thị Cẩm My ii LỜI CẢM ƠN Để có thành này, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Dương Minh Viễn, thầy Nguyễn Khởi Nghĩa cô Đỗ Thị Xn ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho nhiều kiến thức kinh nghiệm q báu giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn cô Nguyễn Đỗ Châu Giang quý thầy cô thuộc khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng đã nhiệt tình giảng dạy cung cấp cho kiến thức tảng vững Chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Tố Quyên, anh Nguyễn Vũ Bằng hỗ trợ nhiều mặt q trình tơi thực đề tài Cảm ơn anh chị bạn phịng thí nghiệm Sinh Học Đất tập thể lớp Nông Nghiệp Sạch K36, người quan tâm giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình tôi, bên cạnh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt khóa học Huỳnh Thị Cẩm My iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH SÁCH BẢNG vii TỪ VIẾT TẮT viii TÓM LƯỢC ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 T ng quan thuốc bảo vệ thực vật 1.1.1 Sơ lược lịch sử sử dụng thuốc bảo vệ thực vật 1.1.2 Mối nguy hại sử dụng thuốc BVTV 1.1.3 Một số đường chuyển hóa thuốc BVTV môi trường 1.2 T ng quan Chlorpyri os thyl 1.2.1 Tình hình sử dụng thuốc tr sâu Chlorpyri os thyl giới .7 1.2.2 Tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl mơ hình canh tác 1.2.3 Tính chất Chlorpyrifos ethyl .9 1.2.4 Sự phân hủy chuyển hóa Chlorpyri os thyl đất 12 1.3 Sự phân hủy yếm hí độc chất hữu vi huẩn 15 1.4 T ng quan số phương pháp sinh học phân tử sử ụng thí nghiệm 18 1.4.1 Phản ứng chuỗi Polymerase .18 1.4.2 Phương pháp điện di biến tính tăng cấp DGGE .19 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Phương tiện 21 2.1.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 21 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 21 2.1.3 Hóa chất dùng thí nghiệm .21 2.2 Phương pháp 22 2.2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl 22 2.2.2 Kiểm tra tính đa dạng hệ vi khuẩn khử chlor yếm hí đất .25 2.2.3 Phương pháp thống kê xử lí số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 iv 3.1 Một số đặc tính lý hóa đất khu vực thu mẫu 28 3.2 Khảo sát khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn đất 28 3.2.1 Kết đánh giá so sánh phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn .28 3.2.2 Khảo sát hình thành sản phẩm trung giang Chlorpyrifos ethyl 32 3.3 Đa ạng vi khuẩn yếm khí phân hủy Chlorpyri os thyl đất .34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận .38 4.2 Kiến nghị .38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 Vỏ chai thuốc BVTV bị vứt b a bãi đồng ruộng Hình 1.2 Tác động thuốc BVTV đến mơi trường đường thuốc Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo Chlorpyrifos ethyl 10 Hình 1.4.Một số chế phẩm có chứa Chlorpyri os thyl sử dụng ph biến Việt Nam 11 Hình 1.5 Con đường chuyển hóa t ng quát Chlorpyrifos ethyl .15 Hình 1.6 Quá trình cho nhận điện tử khử chlor Dioxins 16 Hình 1.7 Thiết bị PCR 18 Hình 2.1 Bố trí thí nghiệm yếm khí 23 Hình 2.2 Trích làm dịch trích cột Alumina 25 Hình 2.3 Trích DNA Kit PowerSoil(R) DNA Isolation .25 Hình 3.1 Khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn CL01 CL02 29 Hình 3.2 So sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức hệ vi khuẩn CL01 CL02 thời điểm 300-350 ngày 30 Hình 3.3 Khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn PH01 PH02 30 Hình 3.4 So sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức hệ vi khuẩn PH01 PH02 thời điểm 300-350 ngày 31 Hình 3.5 Tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức b sung acid hữu không b sung acid hữu giai đoạn 330-350 ngày .32 Hình 3.6 Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức b sung acid hữu 33 Hình 3.7 Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức không b sung acid hữu 33 Hình 3.8 Điện i đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 338F/1101R .35 Hình 3.9 Điện i đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 341F-GC/534R 35 Hình 3.10 Điện i đồ sản phẩm PCR (DGGE) nghiệm thức mẫu đất PH01 36 Hình 3.11 Độ tương đồng vi khuẩn nhóm Chloroflexi mẫu đất PH01 37 vi DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại độ độc thuốc BVTV .4 Bảng 1.2 Phân chia nhóm độc theo WHO Bảng 3.1 Một số đặc tính lý hóa loại đất sử dụng thí nghiệm ……28 vii TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt 2,4-D Từ gốc 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AchE Bp BVTV CL ĐBSCL DCM DDT DGGE DNA GC/MS HP/LC LC50 Acetylcholinesterase Base pair Bảo vệ thực vật California Department of Pesticide R gulation’s Cai Lậy Đồng sông Cửu Long Dichloromethane Dichlodiphenyl trichloetan Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Deoxyribonucleic acid Gas Chromatography Mass Spectometry High Performance Liquid Chromatography Medium lethal concentrate LD50 Lethal Dose 50 LT50 PCR PH TCP TMP VSV rRNA WHO Medium lethal time Polymerase Chain Reaction Phụng Hiệp 3,5,6 - trichloro – 2-pyridinol 3,5,6- trichloro-2-methoxypiridyne Vi sinh vật Ribosomal ribonucleic acid World Health Organization CDPR viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chi cục BVTV Cần Thơ, 2010 Báo cáo trạng sử dụng giống, phân bón, thuốc BVTV loại trồng năm 2010 Chi cục BVTV Cần Thơ, Cần Thơ 48 trang Dương Minh Viễn, 2011 Khả phân hủy Dioxins cộng đồng vi khuẩn hiếu khí yếm khí Báo cáo t ng kết đề tài Khoa học Công nghệ cấp Trường Đại Học Cần Thơ.pp 65, 67 Lê Trường, Nguyễn Trần Oánh Đào Trọng Ánh, 2005 T điển sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 499 trang Lê Văn Khoa, 2010 Ơ nhiễm mơi trường đất biện pháp xử lý Nhà xuất Giáo Dục & Đào Tạo 104-114 Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng Trần Quốc Dung, 2009 Giáo trình DNA tái t hợp NXB Đại học quốc gia TP HCM TP Hồ Chí Minh 243 trang Nguyễn Thị Anh Thy, 2012 Khảo sát khả chlor Dioxin yếm khí cộng đồng vi khuẩn điểm nóng chất độc a cam sân bay Biên Hòa Chuyên đề, đề tài cấp trường Đại Học Cần Thơ Cần Thơ Nguyễn Thị Lan Hương, 2013 Khảo sát lưu tồn phân lập khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl mô hình canh tác rau, màu số huyện Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn thạc sĩ trường Đại Học Cần Thơ Cần Thơ Nguyễn Thị Phi Oanh, 2011 Phân lập khảo sát khả phân hủy nông ược vi sinh vật số tỉnh Đồng sông Cửu Long Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Tố Quyên Khảo sát lưu tồn phân hủy sinh học Preticlachlor số ruộng chuyên lúa thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long, 2013 Luận văn tốt nghiệp Cao học ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học cần thơ Cần Thơ 10 Nguyễn Trần Oánh, 2007 Giáo trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Nhà xuất Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Hà Nội tr 9, 28-29 11 Nguyễn Vũ Bằng, 2012 Khảo sát khả chlor Dioxins yếm khí cộng đồng vi khuẩn đất trầm tích điểm nóng ô nhiễm chất độc da cam sân bay Đà Nẵng Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Nông Nghiệp Sạch Đại Học Cần Thơ Cần thơ 12 Phạm Văn Toàn, 2013 Thực trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật số biện pháp giảm thiểu việc sử dụng thuốc khơng hợp lí sản xuất lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học trường Đại Học Cần Thơ, số 28: 47-53 39 13 Trần Anh Đức, 2013 Phân lập vi khuẩn phân hủy Butachlor đất chuyên canh lúa số huyện thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Nông Nghiệp Sạch Đại Học Cần Thơ Cần Thơ 14 Trần Quang Hùng, 1999 Thuốc Bảo Vệ Thực Vật NXB Nông Nghiệp Hà Nội Hà Nội 348 trang 15 Trần Văn Hai, 2009 Giáo trình hóa bảo vệ thực vật Nhà xuất Đại Học Cần Thơ Cần Thơ 364 trang Tiếng Anh 16 Anwar, S., F Liaquat, Q.M.Khan, Z.M.Kalid and S.Iqal, 2009.Biodegradation of chlorpyrifos and its hydrolysis product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by Bacillus pumilus strain C2A1 Journal of Hazardous Materials, 168(1), pp 400-405 17 Arias, E.M., L.P Periago, G.J.Simal and J.C Mejuto, 2008 The mobility and degradation of pesticides in soils and the pollution of groundwater resources Agriculture, Ecosystems & Environment, 123(4):247–260 18 Barr DB, R.Allen, AO Olsson, R.Bravo, L.M Caltabiano, A.Montesano, S.Udunka, D.Walden, RD Walker, G.Weerasekera, RDJ Whitehead, SE Schober and LL Needham, 2005 Concentrations of selective metabolites of organophosphorus pesticides in the United States population Environ Res 99(3):314–326 19 Barron, M.G., K.B Woodburn, 1995 Ecotoxicology of chlorpyrifos Rev Environ Contam Toxicol, 144:1–93 20 Beutel, M.W., D.R Yonge, M.Flury and J.B.Harsh, 2012 Adsorption and Desorption of Chlorpyrifos to Soils and Sediments Doctoral dissertation, Washington State University United States 21 Buchholz, B.E.E., et al., 1997 Screening for Genetic Diversity of Isolates of Anaerobic Fe(II)-oxidizing Bacteria Using DGGE and Whole-cell Hybridization Systematic and applied Microbiology, 20 (2): 301–309 22 Case, R J., Y Boucher, I Dahllöf, C Holmström, W F Doolittle and S Kjelleberg 2007 Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies Appl Environ Microbiol 73 (1): 278–288 23 Ciglasch, H., J.Busche , W.Amelung, S.Totrakool, M.Kaupenjohann, 2008 Field aging of insecticides after repeated application to a northern Thailand ultisol J Agric Food Chem, 56(20):9555–9562 24 Clarridge, J E III., 2004 Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases Clin Microbiol Rev, 17: 840–862 25 Daniel, A A, 1990 Aerobic and Anaerobic Biodegradation of PCBs: A Review Biological Sciences Laboratory, 10(3): 241-25 40 26 F ns RA,C.Lu, D Barr D, L.N ham, 2002 Chil r n’s xposur to chlorpyrifos and parathion in an agricultural community in central Washington State Environ Health Perspect, 110(5):549–553 27 Gebremariam, S.Y, 2011 Mineralization, sorption and desorption of chlorpyrifos in aquatic sediments and soils Doctor of Philosophy, Washington State University United States 198 pp 28 Gebremariam, S.Y, M.W Beutel, D.R.Yonge, M.Flury, and J.B.Harsh, 2012 Adsorption and Desorption of Chlorpyrifos to Soils and Sediments Doctor of Philosophy, Washington State University United States.157 pp 29 Havens, P.L., S Kieatiwong and K.Shepler, 1992 The Photochemical Degradation of Chlorpyrifos on Soil by Natural Sunlight PTRL Project No 254W 30 Hill, R.H.J., S.L Head, S.Baker, M.Gregg, D.B Shealy, S.L Bailey, C.C Williams, E.J Sampson, L.L Needham, 1995 Pesticide residues in urine of adults living in the United States: reference range concentrations Environ Res, 71(2):99–108 31 Ghanem, M Orfi and M Shamma, 2007 Biodegration of Chlorpyrifos by Kepsiella sp Isolated an active sluge sample of waste water Treatment plant in Damascus Folia Microbiol, 52(4), 423-427 32 Irani Mukherjee and madhuban Gopal, 1996 Degradation of chlorpyrifos by two soil fungi Aspergillus niger and trichoderma viride Toxicological & Environmental Chemistry, 57(1), p145 33 Jagnow, G., K Haider, P.C.Ellwardt, 1977 Anaerobic dechlorination and degradation of hexachlorocyclohexane isomers by anaerobic and facultative anaerobic bacteria Archives of microbiology, 115 (3), pp 285-292 34 Kanazawa, J., 1989 Relationship between the soil sorption constants for pesticides and their physi- cochemical properties Environ Toxicol Chem, 8(6):477–484 35 Kulshrestha, G and A.Kumari, 2011 Fungal degradation of chlorpyrifos by Acremonium sp strain (GFRC-1) isolated from a laboratory-enriched red agricultural soil Biology and Fertility of Soils, 47(2), pp 219-225 36 Laabs,V., W.Amelung, 2005 Sorption and aging of corn and soybean pesticides in tropical soils of Brazil J Agric Food Chem, 53(18):7184–7192 37 Muyzer, G., E.C Dewaal and A.G Uiterlinden, 1993 Profiling of complex microbial-populations by Denaturing Gradient Gel-Electrophoresis of Polymerase Chain reaction-Ampli fied genes-coding for 16S ribosomal-RNA Application Environment Microbiology59, 695-700 38 Myers, R.M., S.G Fisher S.G, L.S lemon and T.Maniatis, 1985 Nearly all single base substitutions in DNA fragments joned to GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis Nucl Acids Res, 13: 3131-3145 41 39 NRA, 2000 The NRA review of Chlorpyrifos NRA, Australia 80 pp 40 Osman, T and C.Temur, 2010 The Fate of Pesticide in the Environment J Biol Environ, 4(10) 29-38 41 Racke, KD., 1993 Enviromental fate of Chlorpyrifos Rev Envition contain toxicol, 131: 1-151 42 Ranjan, K B and A.Malik, 2008 Utilization of Chlorpyrifos as a sole source of cacbon by bacteria isolated from wastewater Irrigated Agriculture Soil in an Industrial Area of Western Uttar Pradesh, India Reseach Journal of Microbiology3, 293-307 43 Savadogo, P.W., A.S.Ouattara, M.P.Sedogo, S traoré, 2007 Anaerobic biodegradation of Sumithion an organophosphorus insecticide used in Burkina Faso Agriculture by Acclimatized Indigenous Bacteria.Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(11): 1896-905 44 Singh, B.K., A.Walker, J.A.W.Morgan and D.J Wright, 2004 Biodegradation of chlorpyrifos by Enterobacter strain B-14 and its use in bioremediation of contaminated Soils Applied and Environmental Microbiology, 70: 4855-4863 45 Spieszalski WW, Niemczyk HD, Shetlar DJ (1994) Sorption of chlorpyrifos and fonofos on four soils and turfgrass thatch using membrane filters J Environ Sci Health, 29(6):1117–1136 46 Tagatz, M.E., N.R Gregory and G.R Plaia 1982 Effects of chlorpyrifos on fieldand laboratory-devel- oped estuarine benthic communities J Toxicol Environ Health, 10:411–421 47 Tuli, A., 2013 Use information and air monitoring recommendation for chlorpyrifos in California Enviromental hazard assessment program California 23 pp 48 Xiao, Y., 1997 Dissipation and Leachability of Formulated Chlorpyrifos and Atrazine in Organically- amended Soils Doctor thesis of Philosophy in Entomology The Virginia Polytechnic 106 pp 49 Yang, L.,Y.Zhao,B Zhan, C.H Yang and X Zhang, 2005 Isolation and characterization of a chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol degrading bacterium Journal Microbiology, 251 (1): 67-73 50 Zhang, W., F Jiang and J.F Ou, 2011 Global pesticide consumption and population: with China as focus Article of International Academy of Ecology and Enviromental Sciences, 1(2): 125-144 42 PHỤ CHƯƠNG I CÁC PHƯƠNG TIỆN VÀ QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM Phụ chương 1: Danh sách địa điểm thu mẫu STT Tên nông dân Địa điểm Ký hiệu Trần Văn Dẫn Mỹ Thành Nam – Cai Lậy CL01 Lê Văn Đồ Long Khánh- Cai Lậy CL02 Huỳnh Văn Tây Hòa An – Phụng Hiệp PH01 Trần Phước Huệ Hòa An – Phụng Hiệp PH02 Phụ chương 2: Mơi trường khống đa lượng Hóa chất g/L KH2PO4 1,77 NaCl 0.3 NH4Cl 0.3 CaCl2.2H2O 0,11 MgCl2.2H2O 0,1 NaHCO3 0,8 Ghi Làm ung ịch cách sục hí N2 40 phút Sau ùng hỗn hợp (70% N2, 30% CO2) sục lại phút, hi sục cho NaHCO3 vào Sau hi sục đậy lọ nút cao su mang tiệt trùng ướt Tiếp th o pha ung ịch vi lượng i Phụ chương 3: Mơi trường khống i lượng Muối vi lượng 1/L g/L MnCl2.2H2O 0,05 H3PO4 0,05 ZnCl2 0,05 CoCl2.6H2O 0,05 NiCl2.6H2O 0,05 CuCl.2H2O 0,03 FeCl2.4H2O (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,05 ALCl3 0,05 EDTA 0,5 HCl đậm đặc 1mL Dung ịch phải tiệt trùng ướt sục hí Argon Kế đến pha ung ịch vitamin Phụ chương 4: Dung dịch itamin Vitamin/L D-biotin Folic acid Pyrodoxin hydrochloride Thiamin hydrochloride Riboflavin Nicotinic acid DL- calcium pantothenate g/L 0,02 0,02 0,1 0,05 0,05 0,05 0,05 Vitamin B12 p- aminobenzoic acid Lipoic acid ( thiotic acid) 1,4- napthaquinone Nicotiamide Hemin 0,01 0,05 0,05 0,04 0,1 0,01 Dung ịch vitamin phải trùng ước sục hí Argon ii Hỗn hợ acid hữu gồm hóa chất sau: pyruvic aci (hoặc pyruvat ) + ac tic (hoặc ac tat ) + butyric (hoặc butyrat ) + lactic ( propiovat ) 250µM chất Đ m trùng màng lọc sục hí Argon Pha mơi trương yếm khí ới thể tích 1L: 1L mơ trường hống đa lượng + mL mơi trường hoáng vi lượng + 0,1 mL hỗn hợp vitamin + mL hỗn hợp l ctron donner Phụ chương 5: Quy trình chạy điện di biến tính tăng cấ (DGGE) Chuẩn bị nồng độ g l 8% ống nhựa thí nghiệm th o bảng sau: 40% 60% Stacking 100% DS 4,80 7,20 0,00 0,00 DW 4,56 2,16 3,32 8,30 40% PAGE 2,40 2,40 0,60 1,50 50 x TAE 0,24 0,24 0,08 0,20 Sum 12,00 12,00 4,00 10,00 Thêm 100 μL APS 10% cho hai ống 60% 40% Thêm μL TEMED vào ống 60%, trộn cho vào ống tiêm Thêm μL TEMED vào ống 40%, trộn cho vào ống tiêm Đ g l vào Cho mL butanol lên bề mặt trơn láng Để yên nhiệt độ phòng 2h Khởi động làm nóng máy chạy DGGE hoảng 1h nhiệt độ 600C Sau tạo ung ịch stac ing hoảng 2h t máy hi bắt đầu hởi động 10 Thêm 33 μL APS 10% μL TEMED vào mL hỗn hợp stac ing 11 Trộn đều, đ Lên bề mặt g l, để nhiệt độ phòng 30 phút 12 Lấy mẫu thử: 20 μL 2x thuốc nhuộm + 20 μL sản phẩm chạy PCR 13 Mẫu chạy điện i ung ịch đệm TAE 1X 60oC 16h với hiệu điện 45V iii PHỤ CHƯƠNG II BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI CỦA CÁC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi huẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 1371,2 685,6 50.35 0.000 Sai số 81,7 13,6 T ng cộng 1452,9 Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi huẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 576,5 288,2 10,84 0,010 Sai số 159,6 26,6 T ng cộng 736,1 Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi huẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 260,8 130,4 3,66 0,092 Sai số 214,0 35,7 T ng cộng 474,8 Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi huẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 1064,805 532,403 742,41 0,000 Sai số 4,303 0,717 T ng cộng 1069,108 iv Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi huẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 2326,329 1163,164 4651,33 0,000 Sai số 1,250 0,250 T ng cộng 2327,579 Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi huẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 1541,5 770,7 42,60 0,000 Sai số 108,5 18,1 T ng cộng 1650,0 Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi huẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 630,38 315,19 312,75 0,000 Sai số 6,05 1,01 T ng cộng 636,43 Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi huẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 2093,79 1046,89 131,34 0,000 Sai số 47,83 7,79 T ng cộng 2141,61 v Bảng Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi huẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 1176,25 588,12 183,96 0,000 Sai số 19,18 3,20 T ng cộng 1195,43 Bảng 10 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi huẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 884,49 442,24 155,12 0,000 Sai số 17,11 2,85 T ng cộng 901,60 Bảng 11 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi huẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 358,13 179,07 111,92 0,000 Sai số 2,43 0,41 T ng cộng 360,566 Bảng 12 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi huẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Nghiệm thức 700,77 350,38 7162,87 0,000 Sai số 0,195 0,05 T ng cộng 700,96 vi Bảng 13 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi huẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 47 24 0,09 0,919 Sai số 1663 277 T ng cộng 1710 Bảng 14 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi huẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 476 238 2,34 0,178 Sai số 611 102 T ng cộng 1087 Bảng 15 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi huẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 582,4 291,2 3,37 0,105 Sai số 519,1 86,5 T ng cộng 1101,5 Bảng 16 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi huẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 7838 3919 15,08 0,001 Sai số 938 156 T ng cộng 8775 vii Bảng 17 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi huẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 4693,4 2346,7 112,76 0,000 Sai số 104,1 20,8 T ng cộng 4797,5 Bảng 18 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi huẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 4693,4 2346,7 112,76 0,000 Sai số 104,1 20,8 T ng cộng 4797,5 Bảng 19 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi huẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 4972 2486 11,43 0,009 Sai số 1305 218 T ng cộng 6277 Bảng 20 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi huẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 6389,4 3194,7 45,11 0,000 Sai số 424,9 70,8 T ng cộng 6814,2 viii Bảng 21 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi huẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 3136,37 1568,18 1024,11 0,000 Sai số 4,59 1,53 T ng cộng 3140,96 Bảng 22 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi huẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 2780 1390 5,56 0,043 Sai số 1499 250 T ng cộng 4278 Bảng 23 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi huẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 1061,90 530,95 3543,12 0,000 Sai số 0,75 0,15 T ng cộng 1062,64 Bảng 24 Bảng phân tích phương sai phân hủy Chlorpyri os thyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi huẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự o T ng bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Thời gian 953,79 476,9 71,28 0,003 Sai số 20,07 6,69 T ng cộng 973,87 ix Bảng 25 Bảng phân tích phương saitốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức b sung acid hữu hệ vi khuẩn CL01, CL02, PH01, PH02 giai đoạn 330-350 ngày Nguồn biến động Hệ vi khuẩn Sai số T ng cộng Độ tự 11 T ng bình phương 8,196 4,862 13,854 Trung bình bình phương 2,72 0,608 Giá trị F Giá trị P 4,47 0,04 Bảng 26 Tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức không b sung acid hữu giai đoạn 330-350 ngày Nguồn biến động Hệ vi khuẩn Sai số T ng cộng Độ tự 11 T ng bình phương 5,900 7,425 13,825 Trung bình bình phương 1,967 0,928 Giá trị F Giá trị P 2,12 0,176 Bảng 27 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu CL01 Nguồn biến động Nghiệm thức Sai số P-value Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn 0,563 1,967 0,48 1,2 0,928 0,58 0,458 Bảng 28 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu CL02 Nguồn biến động Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn Nghiệm thức 2,808 0,652 0,38 Sai số 1,800 0,836 0,40 P-value 0,198 x Bảng 29 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu PH01 Nguồn biến động Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn Nghiệm thức 2,422 0,366 0,21 Sai số 2,043 0,980 0,57 P-value 0,594 Bảng 30 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu PH02 Nguồn biến động Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn Nghiệm thức 1,11 1,48 0,85 Sai số 3,40 0,193 0,11 P-value 0,056 xi ... NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG HUỲNH THỊ CẨM MY SỰ PHÂN HỦY YẾM KHÍ CHLORPYRIFOS ETHYL BỞI HỆ VI KHUẨN TỪ NỀN ĐẤT CHUYÊN CANH LÚA TẠI CAI LẬY-TIỀN GIANG VÀ PHỤNG HIỆP-HẬU GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP... Chlorpyrifos ethyl Do đó, đề tài ? ?Sự phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn từ đất chuyên canh lúa Cai Lậy- Tiền Giang Phụng Hiệp- Hậu Giang? ?? thực với mục tiêu: Khảo sát phân hủy yếm khí. .. phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn từ đất lúa thuộc Cai Lậy- Tiền Giang Phụng Hiệp- Hậu Giang? ?? Luận Văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Nơng Nghiệp Sạch, khóa 36, khoa Nông Nghiệp Sinh Học