BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THỜ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ PRIMER CHUYÊN BIỆT ĐỂ NHẬN DIỆN VI TẢO NHÓM THRAUSTOCHYTRID CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.S Trần Thị Xuân Mai SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN LAM MINH MSSV: 2102371 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THỜ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ PRIMER CHUYÊN BIỆT ĐỂ NHẬN DIỆN VI TẢO NHÓM THRAUSTOCHYTRID CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.S Trần Thị Xuân Mai SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN LAM MINH MSSV: 2102371 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) Trần Thị Xuân Mai SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Nguyễn Lam Minh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ hướng dẫn, giúp đỡ tận tình ThS. Trần Thị Xuân Mai. Cảm ơn cô nhiệt tình dạy truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài. Xin cảm ơn hỗ trợ giúp đỡ cán quản lý phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học. Cảm ơn anh chị học viên cao học bạn sinh viên phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài. Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Vi tảo đối tượng nhận nhiều quan tâm sản xuất acid béo không no nhiều nối đôi Omega3 Omega6, đặc biệt acid docosahexaenoic (DHA) acid eicosapentaenoic (EPA). Việc nhận diện nhóm vi tảo biển dị dưỡng phương pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn. Bằng quan sát hình thái vi tảo kính hiển vi, bước đầu nhận diện chín dòng vi tảo cung cấp thuộc nhóm thraustochytrid. Thông qua nghiên cứu này, với chín dòng vi tảo cung cấp thông qua kỹ thuật sinh học phân tử nhận diện dòng vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrium Schizochytrium hai cặp mồi chung thiết kế dựa trình tự vùng gen mã hóa 18S rRNA số loài vi tảo bao gồm Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium aggregatum, Schizochytrium minutum, Schizochytrium limacinum Schizochytrium aggregatum. Bước đầu nhận diện dòng vi tảo thuộc Thraustochytrium Schizochytrium, có dòng vi tảo M19 D14 thuộc nhóm Thraustochytrium dòng lại thuộc Schizochytrium dựa cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium. Hơn nữa, nghiên cứu này, dòng vi tảo giải trình tự cặp mồi chung với kích thước khoảng 1000bp B3, M6 D14. Dựa vào phân tích phả hệ kết BLAST từ NCBI cho thấy dòng B3 M6 có quan hệ gần với dòng Schizochytrium Aurantiochytrium (trong dòng B3 đồng hình cao với Schizochytrium sp. SKA10 mức độ 79% dòng M6 đồng hình mức 98% với Schizochytrium sp. KRT1), dòng D14 thuộc nhóm Thraustochytrium, đồng hình mức 93% với Thraustochytrium sp. BP3.2.2. Bằng cặp mồi chung cặp mồi chuyên biệt nghiên cứu giúp việc nhận diện nhanh dòng vi tảo thuộc nhóm thraustochytrid. Từ khóa: Acid béo không no, Schizochytrium, Thraustochytrium, vi tảo dị dưỡng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến i Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT . LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC .i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2. Mục tiêu CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .2 2.1. Giới thiệu vi tảo . 2.1.1. Giới thiệu sơ lược vi tảo .2 2.1.2. Hệ thống phân loại vi tảo .2 2.1.3. Vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid . 2.2. Sản xuất acid béo không no nhiều nối đôi từ vi tảo dị dưỡng thraustochytrid .8 2.2.1. Giới thiệu .8 2.2.2. Khả sản xuất acid béo không no vi tảo thraustochytrid .9 2.2.3. Thị trường cho acid béo không no nhiều nối đôi 10 2.2.4. Tiềm thraustochytrid 11 2.3. Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .13 2.3.1. Sơ lược kỹ thuật PCR .13 2.3.2. Các giai đoạn phản ứng PCR: 14 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR . 15 2.4. Kỹ thuật điện di gel agarose 16 2.4.1. Nguyên lý 16 2.4.2. Các thiết bị thành phần cần thiết cho điện di 18 2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di . 18 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến ii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.5. Thiết kế mồi 19 2.5.1. Những điều cần ý thiết kế mồi 19 2.5.2. Các phần mềm thiết kế mồi .20 2.6. Xây dựng phả hệ phần mềm MEGA 6.0 .22 2.7. Các nghiên cứu trước dòng vi tảo Thraustochytrid 23 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 25 3.1. Phương tiện nghiên cứu 25 3.1.1. Thời gian địa điểm nghiên cứu . 25 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu . 25 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ 25 3.1.4. Hóa chất .26 3.2. Phương pháp .26 3.2.1. Quy trình nuôi tăng sinh khối vi tảo 26 3.2.2. Quy trình trích DNA vi tảo CTAB . 27 3.2.3. Phản ứng PCR . 28 3.2.4. Phân tích sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose 29 3.2.5. Phân tích trình tự phương pháp xây dựng phả hệ 30 3.3. Bố trí thí nghiệm .30 3.3.1. Thiết kế đoạn mồi PCR .30 3.3.2. Thực phản ứng PCR để kiểm tra tính đặc hiệu mồi 30 3.3.3. Thực giải trình tự dòng vi tảo phân lập .31 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1. Quan sát dòng vi tảo kính hiển vi: . 32 4.2. Kết thiết kế mồi . 34 4.2.1. Hai cặp mồi chung Thraustochytrium Schizochytrium 34 4.2.2. Cặp mồi nhận biết dòng Schizochytrium: 36 4.2.3. Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium striatum .37 4.2.4. Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium aureum 38 4.3. Kết kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế kỹ thuật PCR: .38 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 4.3.1. Kết PCR mồi Thraus-Schi1 (khoảng 500bp) .38 4.3.2. Kết PCR mồi Thraus-Schi2 (khoảng 1000bp) . 40 4.3.3. Kết PCR mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium (khoảng 600bp) 41 4.3.4. Kết PCR mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium striatum 42 4.3.5. Kết PCR mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium aureum .43 4.4. Giải trình tự 43 4.5. Xây dựng phả hệ: . 46 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 5.1. Kết luận .51 5.2. Đề nghị .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 52 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Các thông số điện di DNA gel agarose 18 Bảng 2. So sánh thời gian xử lý phương pháp NJ, MP, ML BI . 23 Bảng 3. Các dòng vi tảo nguồn gốc dòng vi tảo phân lập . 25 Bảng 4. Thành phần môi trường NM-5 27 Bảng 5. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi1 28 Bảng 6. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi2 28 Bảng 7. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Schi 29 Bảng 8. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus. striatum 174F 705R . 29 Bảng 9. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thaus. aureum 171F 716R 29 Bảng 10. Đặc điểm khuẩn lạc tế bào dòng vi tảo phân lập 33 Bảng 11. Chu kỳ nhiệt tối ưu hóa cho mồi Thraus-Schi2 .40 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến v Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Độ khuếch đại phản ứng PCR. .13 Hình 2. Các giai đoạn phản ứng PCR .14 Hình 3. Kết quan sát dòng vi tảo kính hiển vi. 32 Hình 4. Vùng đồng hình thứ dòng Thraustochytrium Schizochytrium .35 Hình 5. Vùng đồng hình thứ hai dòng Thraustochytrium Schizochytrium 35 Hình 6. Vùng đồng hình thứ ba dòng Thraustochytrium Schizochytrium .36 Hình 7. Primer forward để nhận biết Schizochytrium . 36 Hình 8. Primer reverse để nhận biêt Schizochytrium 37 Hình 9. Primer forward nhận biết Thraustochytrium striatum 37 Hình 10. Primer reverse nhận biết Thraustochytrium striatum .37 Hình 11. Primer forward để nhận biết Thraustochytrium aureum 38 Hình 12. Primer reverse để nhận biết Thraustochytrium aureum .38 Hình 13. Kết sản phẩm PCR cặp mồi Thraus-Schi1 điện di gel 1,5% Agarose .39 Hình 14. Kết điện di gel Agarose 1,5% với mồi Thraus-Schi2 . 40 Hình 15. Kết điện di gel Agarose mồi Thraus-Schi2 nhiệt độ bắt mồi 52°C . 41 Hình 16. Kết điện di gel Agarose với dòng vi tảo mồi Thraus-Schi2 .41 Hình 17. Kết sản phẩm PCR với mồi Schi điện di gel 1,5% Agarose 42 Hình 18. Kết BLAST từ NCBI dòng B3 44 Hình 19. Kết BLAST từ NCBI dòng D14 . 45 Hình 20. Kết BLAST từ NCBI dòng M6 . 46 Hình 21. Cây phả hệ dòng B3. 47 Hình 22. Cây phả hệ dòng M6 48 Hình 23. Cây phả hệ dòng D14 .49 Hình 24. Cây phả hệ chung cho dòng vi tảo B3, M6 D14 .50 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến vi Viện NC&PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT ATTTTTGGATTTTCGAAAAACCGAATTAAGGGGAGGCCTTTTCCAAACAAG TTTTCCTTAAACAAGAAAAAAAATTTGGGGGTTGAAAAAGATTTAAAACC ATTGGGGTTTAGGCCCTAAAAAAAGCCCACCTGGGAATTTTGGGGGCTTTT TTTAAGGGCCTCAGCAGCCGCCCCTGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGG GGGGGGTATGGTTGCAAGGGTGAAAATTAAAGGAAATGGCGGAAGGGCC CCCCCCGGGGGGGGGCCCGCGGGTTAATTTGACTCAACCCGGGAAAAATT TCCCGGTCCCGACAAAGGGAGGATTGACAGATTGAGGGGTTTTTCAAGGTT TTATGGGGGGGGGGGCATGGCCGTTTTTAGGTGGGGGGGGGAATTGTTTG GGTAATTCCGTTAAAGAAAGGGACCTCGGCCTACTAAAAAGGGGGGGGGA AGGCAACAAAGGACGTTTTTAACTTTTTAAAGGGACATGTCCGGTTTACGG GCAGGAAGTTGGAGGCAATAACAGGTTGGGGATGCCCTTAAAGGTTTTGG GCCCCCCCCCCGCTCCACTAAGGGGTTCATCGGGTTTAAATTCAATATTTA TGGATATTGAGTGCTTCTAGGAATGG Khi so sánh trình tự gen dòng B3 với ngân hàng GenBank NCBI cho thấy dòng B3 có đồng hình với Schizochytrium sp. SKA10 với 79%. Hình 18. Kết BLAST từ NCBI dòng B3 - Dòng 14: AGTAGTTGAATTATCTTANGCACTGGGTCGACCGGTGCTTTCCTATGA ATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTTTCTTTTCTTTATTGG GGAGAAATCTTTCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATG ACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGT TGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTA TTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGC GAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGG ATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACT TGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTATGGGCCCCACCACCACCCCACGAGAAAA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 44 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CTAAATCTTTTGGGTCCCGGGGGGGAATGGGCCCAAGGGGGAAACTCTAA GGAAATTAGGGAAAGGGACCCCCCGGGGTGGGGCCCGCGGGTTTATTTTA CTCTCAACGGGAAAACTTTCCCCGGGCCCACACATGGGGGGTTTTCACATT TAGAGCTCTCTCTCGAGACTATGGGGGGGGGGGCGCGGGGCCTCTCATTTT GGGTAGAGATATGTGTGGGGAATTCCCTGTACGCACGAGACCCCGCGCTCT CCTAAATGGCGTGTGGTGGGCCCATATAAAGCTTTTACGCTTTAAAACGGG CATTTTGCGTGTATCGGGGCGGAAATCTAGGGAAATACAGTCCTGTGAAGC CACTCAAAGATTATGGGCGCANCGCCGCATCAGATGGCGCTGTCGAGGGT GTATAATCTGTTTCTATGCATATNAGAGATATACAGAAGGTCTTGGAGAAG CTCGTGTAA Khi so sánh trình tự gen dòng D14 với ngân hàng GenBank NCBI cho thấy dòng D14 có đồng hình với Thraustochytrium sp. BP3.2.2 với 93%. Hình 19. Kết BLAST từ NCBI dòng D14 - Dòng M6 TATATAATAAATANNCCTTTTCTTATTTCCCCGCTCCAATAGCAATAT GCTAAACGTTGTCTGCAGATAAAAAAGCTCGTAGTTGAAATTCTTGGCATG GGCCGACCGGTGCTTTTCCCTGAAATGGGGATTGATTTGTCTGTGTTGCCTT GGCCATTTTTTTCTTTTCTTTATTGATAAGAAATCTTTCACTGTAATCAAAG CAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATA AGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTA ATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTG GATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCAT TAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAG TCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTTATGG GCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAG TATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 45 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT GAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGT CCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTATGGG TGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCC GTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACAT AGTACGTTTTAACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTT CGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTTTGGGCCGCACGCGC GCTACACTGATGGGTTCATTAGGGCAGAGTTATATTTTAGGATATTGACTG CTTCT Khi so sánh trình tự gen dòng M6 với ngân hàng GenBank NCBI cho thấy dòng M6 có đồng hình với Schizochytrium sp. KRT1 với 98%. Hình 20. Kết BLAST từ NCBI dòng M6 4.5. Xây dựng phả hệ: Dựa vào trình tự ba dòng vi tảo B3, M6 D14, phả hệ xây dựng phần mềm MEGA 6.0 phương pháp Maximum likelihood với số bootstrap 1.000. Cây phả hệ dòng B3: Kết BLAST từ NCBI (Hình 18) cho thấy dòng B3 có đồng hình cao với dòng Schizochytrium sp. SKA10, từ phả hệ (Hình 21) thấy dòng B3 có mối quan hệ họ hàng gần với dòng Aurantiochytrium sp. BRMP4-A1. Cũng phả hệ dòng B3 thấy dòng vi tảo Schizochytrium Aurantiochytrium có mối quan hệ mật thiết với nhau, khó phân biệt rõ ràng. Theo nhiều nghiên cứu trước đây, dựa vào đặc điểm hình thái chi Aurantiochytrium Schizochytrium xếp vào chi Schizochytrium. Theo nghiên cứu Yokoyama Honda (2007), dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử, chi Aurantiochytrium tách khỏi chi Schizochytrium. Mặc dù vậy, nghiên cứu này, dựa vào phả hệ, hai chi Aurantiochytrium Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 46 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Schizochytrium thuộc nhóm. Như vậy, dòng B3 thuộc nhóm Schizochytrium Aurantiochytrium. Hình 21. Cây phả hệ dòng B3. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 47 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Cây phả hệ dòng M6: Tương tự dòng B3, dòng M6 có kết BLAST (Hình 22) từ NCBI đồng hình cao với Schizochytrium sp. KRT1, kết phả hệ (Hình 22) cho thấy mối quan hệ thân thuộc với dòng thuộc Aurantiochytrium Schizochytrium. Từ cho thấy dòng M6 thuộc nhóm Aurantiochytrium Schizochytrium. Hình 22. Cây phả hệ dòng M6 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 48 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Cây phả hệ dòng D14: Dựa vào phả hệ (Hình 23) kết BLAST (Hình 19) từ NCBI thấy dòng D14 có thuộc chi Thraustochytrium. Hình 23. Cây phả hệ dòng D14 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 49 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Cây phả hệ chung cho dòng vi tảo B3, M6 D14: Dựa vào phả hệ thấy dòng vi tảo B3, M6 D14 có mối quan hệ gần gũi với nhau, ba dòng vi tảo phân lập vùng biển thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long. Đặc biệt, dòng vi tảo B3 M6 có mối quan hệ gần gũi so với dòng D14. Cây phả hệ cho thấy dòng B3 M6 thuộc dòng vi tảo Auratiochytrium Schizochytrium, dòng D14 thuộc nhóm Thraustochytrium. Điều phù hợp với kết nhận diện cặp mồi nghiên cứu này. Từ cho thấy cặp mồi chuyên biệt thiết kế nghiên cứu sử dụng để nhận diện nhanh vi tảo cho hiệu cao. Cũng từ phả hệ cho thấy dòng vi tảo B3, M6 D14 có khoảng cách di truyền xa so với loài vi tảo Thraustochytrium striatum Thraustochytrium aureum. Điều phù hợp với kết nhận diện hai cặp mồi chuyên biệt cho hai loài vi tảo này. Hình 24. Cây phả hệ chung cho dòng vi tảo B3, M6 D14 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 50 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Trong số dòng vi tảo nghiên cứu, kết nhận diện cặp mồi thiết kế cho thấy tất dòng thuộc nhóm Thraustochytrium Schizochytrum, có dòng thuộc Thraustochytrium (dòng D14 M19) dòng thuộc Schizochytrium (B1, B3, M3, M6, M7, M8 M10). 5.2. Đề nghị Hai cặp mồi chung để nhận diện Thraustochytrium Schizochytrium, cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium cần nghiên cứu sâu nhiều dòng vi tảo thuộc thraustochytrid. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 51 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Aki, T., K. Hachida, M. Yoshinaga, Y. Katai, T. Yamasaki, S. Kawamoto, T. Kakizono, T. Maoka, S. Shigeta, O. Suzuki and K. Ono. 2003. Thraustochytrid as a potential source of carotenoids. J. Am. Oil Chem. Soc, 80:789-794 Arafiles, K.H.V., J.C.O. Alcantara, J.A.L. Batoon, F.S. Galura, P.R.F. Cordero, E.M. Leaño and G.R. Dedeles. 2011. Cultural optimization of Thraustochytrids for biomass and fatty acid production. Mycosphere, 2(5):521–531. Bongiorni, L., R. Jain, S. Raghukumar and R.K. Aggarwal. 2005. Thraustochytrium gaertnerium sp. nov.: a New Thraustochytrid Stramenopilan Protist from Mangroves of Goa, India. Protist, vol.156, pp.303-315. Bremer, G.B. 1976. The ecology of marine lower fungi. Recent Advances in Aquatic Mycology. Elek Sclence. London, pp.313-331. Bremer, G.B. 1995. Lower marine fungi (Labyrinthulomycetes) and the decay of mangrove leaf litter. Hydrobiologia, 295: 89-95 Bremer, G.B. and G. Talbot. 1995. Cellulolytic enzyme activity in the marine protist SchizochyMum aggregatum. Bot Mar., 38: 37-41 Burja, A.M., H. Radianingtyas, A. Windust and C.J. Barrow. 2006. Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: screening of strains and optimization of omega-3 production. Appl Microbiol Biotechnol, 72(6):1161-1169. Burja, A.M., R.E. Armenta, H. Radianingtyas and C.J. Barrow. 2007. Evaluation of Fatty Acid Extraction Methods for Thraustochytrium sp. ONC-T18. J. Agric. Food Chem., 55, pp.4795−4801. Carvalho, A.P., L.A. Meireles and F.X. Malcata, 2006. Microalgal reactors: a review of enclosed system designs and performances. Biotechnol. Prog, 22: 1490-1506. Cavalier-Smith, T., M.T.E.P. Allsopp and E.E. Chao. 1994. Thraustochytrids are chromists, not fungi: 18S rDNA signatures of heterokonia. Philos Trans R Soc Lond Ser B Biol Sci, 346:387-397. Chatdumrong, W., W. Yongmanitchai, S. Limtong and W. Worawattanamateekul. 2007. Optimization of Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến docosahexaenoic 52 acid (DHA) production and Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT improvement of astaxanthin content in a Schizochytrium limacinum isolated from mangrove forest in Thailand. Kasetsart Journal (Nat. Schi.), 41: 324-334. Coleman, N.Y. and J.R. Vestal. 1987. An epifluorescent microscopy study of enzymatic hydrolysis of fluorescein diacetate associated with the ectoplasmic net elements of the protist Thraustochytrium striatum. Can J Microbiol, 33:841-843 Colorado State University. n.d. Agarose Gel Electrophoresis of DNA. Retrieved June 13, 2014, from http://www.arbl.cvmbs.colostate.edu. Colorado State University. n.d. Principles of Gel Electrophoresis. Retrieved June 12, 2014, from http://www.arbl.cvmbs.colostate.edu. Croome, R.L. and P.A. Tyler. 1985. Distribution of silica-scaled Chrysophyceae (Paraphysomonadaceae and Mallomonadaceae) in Australian inland waters. Australian Journal of Marine and Freshwater Research, 36(6): 839-853. Fell J.W. and S.Y. Newell. 1998. Molecular approaches to the study of the ocean, Chapter 12. Chapman & Hall Publishers, London, pp.262-263. Fitch Haumann, B. 1999. Alternative sources for n-3 fatty acids. INFORM, 9:1108– 1119 Gandhi, S.R., and Weete, J.D. 1991. Production of the polyunsaturated fatty acids arachidonic acid and eicosapentaenoic acid by the fungus Pythium ultimum. J Gen Microbiol, 137:1825–1830 Giuseppe, C.Z. and M.L. Gijsbert, 2005. Molecular phylogeny of the genus Tribonema (Xanthophyceae) using rbcL gene sequence data: monophyly of morphologically simple algal species. Phycologia, 44(4):384-392. Gordon, D.A. and S.J. Giovannoni, 1996. Detection of stratified microbial populations related to Chlorobium and Fibrobacter species in the Atlantic and Pacific Oceans. Appl Environ Microbiol, 62:1171-1177. Hall, B.G. 2008. Phylogenetic Trees Made Easy: A How-to Manual 3rd Ed. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, pp. 60-160. Hall, B.G. 2013. Building Phylogenetic Trees from Molecular Data with MEGA. Mol Biol Evol., 30(5): 1229-1235 Hibberd, D.J. and G.F. Leedale, 1971. A new algal class - The Eustigmatophycaee. Taxon, 20(4):523-525. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 53 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Honda, D., T. Yokochi, T. Nakahara, S. Raghukumar, A. Nakagiri, K. Schumann and T. Higashihara. 1999. Molecular phylogeny of Labyrinthulids and Thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene. J. Eukaryot. Microbiol, 46(6):637-647. Jostensen, J.P., and Landfald, B. 1997. High prevalence of polyunsaturated fatty acid– producing bacteria in arctic invertebrates. FEMS Microbiol Lett, 151:95–101. Kinsella, J.E. 1987. Seafoods and Fish Oils in Human Health and Disease. New York: Marcel Decker. Krienitz, L., B. Christina, K. Kotut and L. Wei. 2012. Picocystis salinarum (Chlorophyta) in saline lakes and hot springs of East Africa. Phycologia 51(1):22-32. Lewis T. E., P. D. Nichol and T. A. McMeekin. 1999. The biotechnological potential of thraustochytrids. Mar Biotechnol, 1:580-587. Lewis, T.E., Mooney, B.D., McMeekin, T.A., and Nichols, P.D. 1998a. New Australian microbial sources of polyunsaturated fatty acids. Chem Aust, 65:37– 39. Lewis, T.E., Nichols, P.D., Hart, P.R., Nichols, D.S., and McMeekin, T.A. 1998b. Enrichment of rotifers (Brachionus plicatilis) with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid produced by bacteria. J World Aquacult Soc, 29:313–318 Lombardi, A.T. and A.A.H. Vieira, 1998. Copper and lead complexation by high molecular weight compounds produced by Synura sp. (Chrysophyceae). Phycologia, 37(1):34-39. Marie, A.R.T. and M.O. Larrance, 1976. Influence of pesticides on Chlorella, Chlorococcum, Stigeoclonium (Chlorophyceae), Tribonema, Vaucheria (Xanthophyceae) and Oscillatoria (Cyanophyceae). Phycologia 15(1):25-36. Michael, J.W. and S. Loiseaux, 1976. Recent advances in life history studies of the Phaeophyta. Phycologia 15 (3 and 4):435-452. Mo, C., J. Douek and B. Rinkevich. 2002. Development of a PCR strategy for thraustochytrid identification based on 18S rDNA sequence. Marine Biology, 140:883-889. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 54 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Molyneaux, M., and Chong, M.L. 1998. The U.S. market for marine nutraceutical products. Food Technol, 52:56–57. Moss, S.T. 1986. Biology and phylogeny of the Labyrinthuales and Thraustochytoriales. In Moss ST (ed) The biology of marine fungi. Cambridge Universlty Press, Cambridge, pp.105-129. Mukherjee, K.D. 1999. Production and use of microbial oils. INFORM, 10:308–313. Naganuma, T., H. Takasugi and H. Kirnura. 1998. Abundance of thraustochytrids in costal plankyon. Mar Ecol Prog Ser, 162:105-110 Nakahara T., T. Yokochl, T. Higashihara, S. Tanaka, T. Yaguchi and D. Honda. 1996. Production of docosahexaenoic and docosapentaenoic acid by Schizochytrium sp. isolated from Yap Islands. JAOCS, 73:1421-1426 New, M., and Csavas, I. 1995. The use of marine resources in aquafeeds. In: Sustainable Fish Farming: Proceedings of the First International Symposium on Sustainable Fish Farming, Reinertsen, H., and Harlaand, H. (eds.). Rotterdam: A.A. Balkema, pp.43–78. Nichols, D.S., Hart, P., Nichols, P.D., and McMeekin, T.A. 1996. Enrichment of the rotifer Brachionus plicatilis fed an Antarctic bacterium containing polyunsaturated fatty acids. Aquaculture, 147:115–125. Nichols, D.S., Nichols, P.D., and McMeekin, T.A. 1993. Polyunsaturated fatty acids in Antarctic bacteria. Antarct Sci, 5:149–160. Paul, A.B., O. Shuji and I. Manfred, 1997. A comparison of strains of Xanthonema (Heterothrix, Tribonematales, Xanthophyceae) from Antarctica, Europe, and New Zealand. Phycologia, 36(2):164-171. Paula, E.J. de and E.C. Oliveira, 1982. Wave exposure and ecotypical differentiation in Sargassum cymosum (Phaeophyta - Fucales). Phycologia, 21(2):145-153. Perveen, Z., H. Ando, A. Ueno, Y. Ito, Y. Yamamoto, Y. Yamada, T. Takagi, T. Kaneko, K. Kogame and H. Okuyama, 2006. Isolation and characterization of a novel thraustochytrid like microganism that efficiently produces docosahexaenoic acid. Biotechnol Lett, 28(3):197-202. Phillips, T. n.d. Requisites for Superior PCR Results. Retrived June 12, 2014, from http://biotech.about.com. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 55 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Pike, I.H., and Barlow, S.M. 1999. Fish meal and oil to the year 2010: supplies for aquaculture. Presented at World Aquaculture, Sydney, Australia. Abstract, 603. Prasad, A.K.S.K., J.A. Nienow, and R.J. Livingston, 1990. The genus Cyelotella (Bacillariophyta) in Choctawhatchee Bay, Florida, with special reference to C. striata and C. choctawhatcheeana sp. nov. Phycologia: , 29(4): 418-436. Raghukumar, S., C. Rahukumar and A. Rajendran. 1990. Abundance of thraustochytrid fungi in the Arabian Sea. Estuar Coast Shelf Sci, 31:351-358. Raschke, R.L., 1993. Diatom (Bacillariophyta) community response to phosphorus in the Everglades National Park, USA. Phycologia, 32(1): 48-58. Ratledge, C. 1993. Single cell oils—have they a biotechnological future? Trends Biotechnol., 11:278–284. Rees, J.F., Cure, K., Piyatiratitivorakul, S., Sorgeloos, P., and Menasveta, P. 1994. Highly unsaturated fatty acid requirements of Penaeus monodon postlarvae—an experimental approach based on Artemia enrichment. Aquaculture, 122:193–207 Robert, E.D.W., 1976. The phenology of three species of Sargassum (Sargassaceae, Phaeophyta) in Hawaii. Phycologia, 15(2):175-183. Rogers, S.O., and A.J. Bendich. 1988. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual, A6:1 – 10. Sajbidor, J., Dobronova, S., and Certik, M. 1990. Arachidonic acid production by Mortierella sp S-17: influence of C/N ratio. Biotechnol Lett, 12:455–456. Salhi, M., Izquierdo, M.S., Hernandezcruz, C.M., Gonzalez, M., and Fernandezpalacios, H. 1994. Effect of lipid and n-3 HUFA levels in microdiets on growth, survival and fatty acid composition of larval Gilthead seabream (Sparus aurata). Aquaculture, 124:275– 282. Schneider, J. 1977. Fungi. In: Rheinhelmer G (ed) Microbial ecology of a brackish water environment. Springer-Ver- lag, Berlin, pp.90-102. Shafique S. 2012. Polymerase Chain Reaction: Procedure, Principles, Real time PCR, Optimization, Applications, PCR Arrays, Array System Performance, Protocol, Variations. Lambert Academic Publishing, pp.15-17. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 56 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Simopoulos, A.P. 1989. Summary of NATO Advanced Research Workshop on dietary w3 and w6 fatty acids: biological effects and nutritional essentiality. J Nutr, 119:521–528. Sylvia, A.E., 1968. Phaeophyta of the Eastern Gulf of Mexico. Phycologia 7(2):71254. Tacon, A.G.J. 1995. Feed ingredients for carnivorous fish species: alternatives to fishmeal and other fishery resources. In: Sustainable Fish Farming; Proceedings of the First International Symposium on Sustainable Fish Farming, Reinertsen, H., and Harlaand, H. (eds.). Rotterdam: A.A. Balkema, pp.89–116 Tacon, A.G.J. 1997. Aquafeeds and feeding strategies. FAO Fisheries Circular 886 (Rev 1) 1–6. Takahata, K., Monobe, K., Tada, M., and Weber, P.C. 1998. The benefits and risks of n-3 polyunsaturated fatty acids. Biosci Biotechnol Biochem, 62:2079–2085. Tatyana, A.K., Sung-Ho Kang, Ga Youn Cho, Curt M. Pueschel, John A. West, and Gwang Hoon Kim, 2006. Biology of a terrestrial green alga, Chlorococcum sp. (Chlorococcales, Chlorophyta), collected from the Miruksazi stupa in Korea. Phycologia, 45(3):349-358. Vierstraete, A. 1999. Principle of the PCR. Retrieved from http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html. Volkman, J.K., Jeffrey, S.W., Nichols, P.D., Rogers, G.I., and Garland, C.D. 1989. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture. J Exp Mar Biol Ecol, 128:219–240. Ward, O. 1995. Microbial production of long-chain PUFAs. INFORM, 6:683–688. Watanabe, K., Sezaki, K., Yazawa, K., and Hino, A. 1992. Nutritive fortification of the rotifer Brachionus plicatilis with eicosapentaenoic acid-producing bacteria. Nippon Suis Gakkai, 58:271– 276. Yamaoka, Y., M.L. Carmona and S. Oota. 2004. Growth and Carotenoid Production of Thraustochytrium sp. CHN-1 Cultured under Superbright Red and Blue Lightemitting Diodes. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (7): 1594-1597. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 57 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Yang, H.L., C.K. Lu and S.F. Chen. 2009. Isolation and Characterization of Taiwanese Heterotrophic Microalgae: Screening of Strains for Docosahexaenoic Acid (DHA) Production. Mar Biotechnol, 12:173-185. Yokochi, T., Honda, D., Nakahara, T., and Higashihara, T. 1997. Classification of DHA-producing thraustochytrids by their fatty acid profile. Presented at the 4th International Marine Biotechnology Conference, Italy. Abstract, 263. Yokoyama R. and D. Honda. 2007. Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogenety (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov. Mycoscience, 48:199-211. Tiếng Việt Dương Tấn Phát. 2013. Phân lập số dòng vi tảo biển dị dưỡng Thraustochytrid sản xuất carotenoid tỉnh Cà Mau. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học. Đại Học Cần Thơ. Hoàng Thị Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Ngô Thị Hoài Thu Đặng Diễm Hồng. 2010. Phân lập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Thraustochytrium giàu DHA carotenoid từ đầm ngập mặn Thị Nại - Bình Định. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 8(3A). tr:459-465. Lê Bích Tuyền. 2013. Phân lập nhận diện số dòng vi tảo biển dị dưỡng có khả sản xuất carotenoid. Luận văn tốt nghiệp Cao học. Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học. Đại Học Cần Thơ. Mạc Văn Trọng. 2013. Thiết bị điện di. Khoa Công Nghệ Sinh Học - Đại Học Văn Lang Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Hoài Hà. 2006. Chương trình vi sinh vật học. Vietsciences, Hà Nội. Trần Nhân Dũng Nguyễn Vũ Linh. 2011. Giáo trình Tin Sinh Học. Nhà Xuất Bản Đại Học Cần Thơ, trang 65-81. Trần Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Liên, Lê Bích Tuyền Dương Tấn Phát. 2014. Nhận diện tuyển chọn số dòng vi tảo biển dị dưỡng Thraustochytrid có khả sản xuất acid béo không no carotenoid số vùng biển thuộc Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 58 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Đồng Sông Cửu Long. Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Trường. Đại học Cần Thơ. Trang Web http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction, (ngày 16/10/2013) http://sinhhoc.blogspot.com/2011/10/phan-mem-dnaclub.html (ngày 15/06/2014) http://sinhhoc.blogspot.com/2012/07/huong-dan-su-dung-primer3-e-thiet-ke.html (ngày 15/06/2014) http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html (ngày 14/06/2014 ). http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html (ngày 14/06/2014) http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html (ngày 14/06/2014). http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html (ngày 14/06/2014) https://dnacore.mgh.harvard.edu/cgi-bin/sequencing/PCR_Primer_Design_Guidelines .html (ngày 14/06/2014) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 59 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... biển để xác định các vi sinh vật này Do sự khác biệt về môi trường dinh dưỡng dẫn đến sự không ổn định trong biểu hiện hình thái đặc trưng của vi tảo Điều đó dẫn đến những khó khăn trong vi c nhận diện vi tảo dựa trên hình thái tế bào Để giải quyết khó khăn đó, đề tài Thiết kế primer để nhận diện các dòng vi tảo thraustochytrid đã được thực hiện nhằm giúp vi c nhận diện nhanh các dòng vi tảo này ở Vi t... Mục tiêu Thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhận biết các dòng vi tảo thraustochytrid Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 1 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về vi tảo 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về vi tảo Vi tảo là tất cả những giống tảo có kích thước hiển vi Vi tảo chiếm khoảng 2/3 số lượng giống tảo trên... được 9 dòng vi tảo dị dưỡng dựa trên các mẫu lá thu về từ rừng ngập mặn ở tỉnh Cà Mau Bên cạnh sự nhận diện sơ bộ bằng hình thái, nghiên cứu còn sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để nhận diện những dòng vi tảo được phân lập bằng cặp mồi chung được thiết kế cho trình tự gen mã hóa 18S rDNA của một số loài thuộc thraustochytrid Dương Tấn Phát (2013) đã kết luận rằng tất cả những dòng vi tảo được phân... những chủng thraustochytrid Với 26 dòng vi tảo phân lập được kiểm tra bằng phương pháp PCR, bài nghiên cứu cho thấy rằng không phải tất cả đều giống nhau về các band PCR, chứng tỏ sự đa dạng trong nhóm vi tảo này Từ đó, Mo đưa ra kết luận rằng dựa vào kỹ thuật PCR trong phân loại vi tảo dựa trên vùng 18S rDNA là một cung cấp hữu hiệu trong vi c nghiên cứu vi tảo thraustochytrid Cavalier-Smith et al (1994)... hoạt cho thiết kế mồi real time và mẫu dò (http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html ngày 14/06/2014 ) 2.5.2.3 PrimerPlex PrimerPlex là một công cụ hiệu quả và tinh vi để thiết kế các đoạn mồi cho khảo nghiệm multiplex Khảo nghiệm multiplex hỗ trợ cho vi c nhân lên của một số lượng lớn đối tượng trong 1 phản ứng, tiết kiệm thời gian và chi phí thí nghiệm PrimerPlex thiết kế các đoạn... cho ra kết quả thích hợp nhất Ngoài ra, phần mềm này có thể được sử dụng để thiết kế mồi cho xác định kiểu gen SNP, khảo nghiệm với nhiều loại mồi (http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html, ngày 14/06/2014) 2.5.2.2 Beacon Designer Phần mềm này có thể dùng để thiết kế mồi cho real time PCR và các mẫu dò Nó được sử dụng rộng rãi trên thế giới bởi các nhà sinh học phân tử để thiết kế mồi... xanh, vàng, đỏ, nâu trong các ao tù thường là váng tảo mắt Một số chi thường gặp: Euglena viridis, Euglena gracilis, Euglena polymorpha, Menoidium tortuosum,… (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006) 2.1.3 Vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid Thraustochytrid là nhóm vi tảo biển dị dưỡng thuộc ngành Heterokonta (Ngành Tảo lông roi), giới Chromista Thraustochytrid thường được tìm thấy ở các hồ nước... và Nguyễn Vũ Linh (2011), FastPCR là chương trình thiết kế mồi được cung cấp miễn phí với các tính năng thiết kế mồi cho PCR, PCR ngược, Real-Time PCR, PCR phức, PCR suy biến… Bên cạnh đó còn có tính năng sắp xếp trình tự chuỗi, phân tích nhóm hay tìm kiếm những trình tự lặp 2.5.2.6 Primer3 Primer3 là chương trình được sử dụng phổ biến để thiết kế mồi (primer) cho phản ứng PCR Đây là chương trình mã... của một số nhóm thuộc thraustochytrid và đã xây dựng thành công hệ thống cây phát sinh loài Những kết quả đạt được đã thúc đẩy các nghiên cứu sâu hơn về vi tảo thraustochytrid, cũng như mang lại kiến thức nền cho những nghiên cứu về phân lập thraustochytrid bằng dấu phân tử 18S rDNA Trong thí nghiệm của Mo et al (2002), ba bộ mồi được thiết kế trên vùng 18S rDNA để phân loại những chủng thraustochytrid. .. 1986, Raghukumar et al 1990) Phương pháp để nhận diện nhanh thraustochytrid là đếm trực tiếp tế bào bằng thuốc nhóm huỳnh quang acriflavine Thuốc nhuộm này giúp phân biệt giữa thraustochytrid với những Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 6 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT sinh vật đơn bào nhân thực khác Acriflavine nhuộm cả DNA và vách tế bào (làm . vi c nhận diện vi tảo dựa trên hình thái tế bào. Để giải quyết khó khăn đó, đề tài Thiết kế primer để nhận diện các dòng vi tảo thraustochytrid đã được thực hiện nhằm giúp vi c nhận diện. ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ PRIMER CHUYÊN BIỆT ĐỂ NHẬN DIỆN VI TẢO NHÓM THRAUSTOCHYTRID CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VI N THỰC HIỆN Th.S Trần Thị Xuân Mai NGUYỄN. THỜ VI N NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ PRIMER CHUYÊN BIỆT ĐỂ NHẬN DIỆN VI TẢO NHÓM THRAUSTOCHYTRID