Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI • ••• Lưu VIẾT THỦY NGHIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberỉs julỉane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI DƯỢC LIỆU • •• LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2014 Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI • ••• Lưu VIẾT THỦY NGHIÊN CỨU TAO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberis juliane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI Dược LIỆU • • • Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2014 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình đế hoàn thành luận văn này: • • Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy tôi: PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thày định hướng nghiên cứu, đồng thời bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thảnh luận văn này. • Tôi xin cảm ơn Cô giáo TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho trình thực luận văn. • Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện cho học tập trường. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Văn Đính - CN Khoa Sinh - KTNN, thầy, cô giáo công tác Khoa Sinh - KTNN tận tình dạy dỗ thời gian qua. • Tôi xin gửi lời cảm ơn tới giúp đỡ CN Nguyễn Khắc Hưng, Th.s Hoàng Đăng Hiếu tập thể cán phòng Công nghệ Tế bào thực vật phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học dành cho suốt trình làm luận văn. • Cảm ơn tất người bạn thực tập với bạn lớp Sinh học thực nghiệm KI 6, đặc biệt bạn Phạm Văn Hoàng giúp đỡ nhiều thời gian thực đề tài. • Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gửi lời cảm ơn chân thành tới người thân ừong gia đình bạn bè - người động viên, giúp đỡ suốt trình học tập. • • • Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Lưu Viết Thủy Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” công trình nghiên cứu tôi. Những số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác. Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc. • • • FT1 ĩ _ _ • 2. Tác gia Lưu Viết Thủy MỤC LỤC • I. II . III. NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT IV. A.rhizogenes Agobacterium rhizogenes V. A.tumefaciens Agobacterium tumefaciens VI. AS Acetosyringone VII. bp Base pair VIII. DNA IX. Gus Escherichia coli - ß - D - glucoronidase gene X. XI. GusA HLG1 XII. HLG2 XIV. XIII. Desoxyribo nucleic acid ß-glucuronidase Hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC. 1824) Hoàng liên gai (.Berberis julianae Schneid. 1913)7 XV. ITS Internal Transcribed Spacer XVI. kp Kilobase pair XVII. LB Lauria Broth XVIII. MS Murashige and Skoog XIX. Ri-plasmid Root inducing plasmid XX. Rol Root locus XXI. sp Species XXII. T- DNA Transfer DNA) XXIII. TDZ Thidiazuron XXIV. XXV. Vir Virulence genes YMB Yeast Malnitol Broth XXVI. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU 1. Danh mục hình ảnh ■ XXVII . XXVIII . 2. Danh mục bảng biểu XXIX. Bảng 1.1: Một số loài thực vật nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học 21 XXX XXXI I. MỞ ĐẦU 1. Đăt vấn đề XXXII. Hoàng liên gai (hay Hoàng mù - Hoàng mộc) Berberỉs juliane thảo dược quý phân bố vùng Tây Bắc Việt Nam. Hoàng Liên gai mọc nhiều Sa Pa - Lào Cai số tỉnh thuộc vùng Tây Nam Trung Quốc. Hoàng liên gai vị thuốc sử dụng tò lâu thuốc Đông y chữa bệnh tiêu hóa như: viêm ruột, tiêu chảy, lỵ, trĩ, viêm túi mật, sốt cao, viêm gan, hoàng đản, viêm ngứa da, mụn nhọt . Thân rễ Hoàng liên gai chứa nhiều họp chất aỉkaloid (5 - 8%), chủ yếu berberin. Ngoài thân rễ Hoàng liên gai có worenin, coptỉsin, paỉmatin . Các alkaloid Hoàng liên gai chia thành nhóm chính: aỉkaloid có nhân phenol aỉkaỉoid nhân phenol. Các thành phần alkaloỉd Hoàng liên gai chứa ừong hầu hết phận cây. Tuy nhiên phận lại có hàm lượng thay đổi, tùy theo mùa phát triển cây. Vào tháng - , hàm lượng berberin thân rễ rễ nhánh cao, ừong đó, vào khoảng tháng 10, hàm lượng alkaỉoid già trước rụng thường cao. Trong số họp chất alkaỉoid nói trên, berberỉn y học quan tâm đến nhiều nhất, sau palmatin. XXXIII. Hiện nay, số lượng cá thể Hoàng liên gai tự nhiên suy giảm mạnh bị khai thác mức. Hoàng liên gai đưa vào danh sách loài thực vật nguy cấp ừong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá "đang nguy cấp" (Bậc E) Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý (nhóm 1) Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng mục đích thương mại. Trước tinh hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá tri y dược Hoàng liên gai Việt Nam, cần đưa phương pháp bảo tồn khai thác hiệu Hoàng liên gai. Bên cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex sỉtu) vườn quốc gia Hoàng liên, việc ứng dựng kỹ thuật công nghệ sinh học vào trình bảo tồn phát triển bền vững Hoàng liên gai theo hướng thu sinh khối tế bào thực vật yêu cầu cấp bách cần thiết. XXXIV. Cùng với xu hướng chung giới, hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất sản phẩm thứ cấp bắt đầu quan tâm phát triển nước. Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy rễ bất định . Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào ừong thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều. Bên cạnh đó, sản lượng ổn định nuôi cấy ừong điều kiện ỉn vitro, yếu tố tác động đến trình nuôi cấy kiểm soát, không bị ảnh hưởng yếu tố tự nhiên dịch bệnh. XXXV. Hiện nay, số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào áp dụng ừên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberỉn ứng dụng y dược. Đinh Thị Thu Hiền công (2003) đưa qui trình tái sinh Hoàng liên gai ỉn vitro tò hạt. Cây Hoàng liên gai in vitro sử dụng làm nguyên liệu cho trình tạo nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng liên gai tạo họp chất berberỉn với hàm lượng cao [1]. Lại Đức Lưu công (2013) ứng dụng kỹ thuật khí canh ừong nghiên cứu nhân giống thu sinh khối rễ Hoàng liên gai. Nhóm tác giả thực thu thập, đánh giá hàm lượng berberin tìm chế độ nuôi cấy môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sinh khối rễ Hoàng liên gai phát triển[4]. XXXVI. Tuy nhiên, trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm tính biệt hóa mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy. vấn đề trở ngại lớn tồn dư chất điều hòa sinh trưởng sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm sức khỏe người sử dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ đời giúp giải vấn đề khó khăn hướng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tại. XXXVII. Rễ tơ bệnh thực vật gây trình tương tác vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tế bào vật chủ. Rễ tơ có có khả sinh trưởng nhanh, phát triển tốt môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều có ý nghĩa dây chuyền sản xuất hợp chất thứ cấp hay dược phẩm sinh học tái tổ họp. Rễ tơ sản xuất lượng lớn họp chất thứ cấp quan biệt hóa nên rễ tơ có di tuyền ổn định nuôi cấy tế bào huyền phù hay nuôi cấy sinh khối mô sẹo. XXXVIII. Xuất phát từ ưu điểm ừên họp chất dược lý quý Hoàng liên gai chủ yếu thu từ rễ, thực đề tài “ Nghiên cứu tạo rễ tơ Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu”. Công trình thực Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. 2. Đổi tượng nghiên cứu XXXIX. Cây Hoàng liên gai (.Berberis Juliane) thuộc chi Hoàng liên Berberis, loài thảo dược quý sử dụng rộng rãi thuốc y học cổ truyền. Thành phần chủ yếu Hoàng liên gai berberin, hoạt chất ứng dụng điều ừị bệnh hệ tiêu hóa. XL. Mau vật nghiên cứu bao gồm quả, Hoàng liên gai phân bố ừong tự nhiên thu thập tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện Sa Pa tỉnh Lào Cai. 3. Mục đích nghiên cứu XLI. Nghiên cứu sở khoa học thực nghiệm việc tạo sinh khối Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược công nghệ nuôi cấy rễ tơ. 4. Nội dung nghiên cứu 4.1. Thu thập nhận dạng mẫu Hoàng liên gai thị phân tử. - Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai phân bố Vườn Quốc gia Hoàng Liên địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai. - Nhận dạng loài Hoàng liên gai thu thập thông qua đặc điểm hình thái. - Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng mẫu Hoàng liên gai. - Bước đầu đưa thị đặc hiệu cho việc nhận dạng Hoàng liên gai tự nhiên phương pháp thị phân tử sử dụng kỹ thuật DNA Barcodỉng. 4.2. Đưa mẫu Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro. XLII. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai kỹ thuật nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ. 4.3. Nghiên cứu tối ưu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium rhizogenes, bước đầu tạo số dòng rễ tơ Hoàng liên gai. - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình chuyển gen tạo rễ tơ Hoàng liên gai qua phương pháp biểu tạm thời với gen thị GusA. - Bước đầu tạo số dòng rễ tơ Hoàng liên gai. 5. Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố, điều kiện sinh sống Hoàng liên gai địa phận Sa Pa - Lào Cai. - Nghiên cứu phòng thỉ nghiệm: Thực thí nghiệm trọng điều kiện in vitro Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. 15 Choi, Y. E., Jeong, J. H., In, J. K., Yang, D. C. (2003). Production of herbicide-resistant transgenic Panax ginseng through the introduction of the phosphinothricin acetyl transferase gene and successful soil transfer, Plant Cell Reports 21:563 — 568. 16 Christey M.C. (2001). Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants, In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 37: 687 -700. DCCCLXXXV. 1'7 Casanova, E., Trilla, M. I., Moysset, L., Vainstein, A. (2004). DCCCLXXXVI. Influence of rol genes in floriculture, Biotechnology Advances 23: — 59. 18 Dupre Patricia, Lacoux Jerome, Neutelings Godfrey, Mattar-Lauran Dominique, Fliniaux Marc-Andre, David Alain and Jacquin Dubreuil Annie (2000). Genetic transformation of Ginkgo biloba by A. tumefaciens, Physiologia Plantarum.108 (4): 413 - 419. 19 M. Dutt, J W Grosser (2009). Evaluation of parameters affecting Agrobacterium-mediated transformation of citrus, Plant Cell Tiss Organ Cult 98: 331-340. 20 Gao N., Shen W., Cao Y., Su Y. and Shi W. (2009). Influence of bacterial density during preculture on Agrobacterium-mediated transformation of tomato, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 98: 321330. 21 Jefferson R. A. (1987). Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Experimental protocols, Plant Mol. Biol. Rep (4): 387 - 405. 22 Kim, J. A., Kwang, H. B., Young, M. S., Sung, H. S., Shin, H. (2009). Hairy Root Cultures of Taxus cuspidata for Enhanced Production of Paclitaxel, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry. 52(2): 144 - 150. 23 Khan M.M.A, Robin A.B.M.A.H.K, Nazimuddowla M.A.N, Talukder DCCCLXXXVII. S.K and Hassan L (2009). Agrobacterium mediated genetic transfomation of two varieties of Brassica: optimization of protocol, Bangladesh J. Agril. Res. 34(2): 287 - 301 24 Kress W.J, Erickson DL (2007). A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding tmH-psbA Spacer Region, Plos One 2(6): e508. 25 Kress W.J, Erickson DL (2008). DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sei USA 105(8): 2761-2762. 26 Liu J, Ding JY, Zhou QY, He L, Wang ZT (2004). Studies on influence of fungal elicitor on hairy root of Panax ginseng biosynthesis ginseng saponin and biomass", China journal of Chinese materia medica 29(4): 302-305. 27 N.M Duc, N.T Nham, R Kasai, A Ito, K Yamasaki and O Tanaka (1993). Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et GRUSHV. Collected in Central Vietnam. I, Chem. Pharm. Bull 41: 2010 - 2014. 28 Mohammad Alimohammadi, Mohammad B Bagherieh Najjar (2009). Agrobacterium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors, African Journal of Biotechnology, 8(20), 51425148. 29 Monica, T. B., Matthew, A. E., Abhaya, M. D. (2008). The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. Agrobacterium: From Biology to Biotechnology, New York: Springer publish, 524 - 565. 30 N. T. Nham, P. V. De, T. C. Luan, N. M. Duc, S. Shibata, O. Tanaka and R. Kasai (1995). Pharmacognostical and chemical studies on Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv (Araliaceae), J. Jpn. Bot. 70(1). 31 Nurhanan, M. Y., L. P. Azimahtol Hawariah (2005). Cytotoxic effects of the root extracts of Eurycoma longifolia Jack, Phytother Res 19(11): 994-996. 32 Paula M. Olhoft, Libby M. Bernal, Leslie B. Grist, D. Steven Hill&S. Luke Mankin&Yuwei Shen, Mary Kalogerakis, HuntWiley, Effie Toren,Hee-Sook Song, Heike Hillebrand, Todd Jones (2007). A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant (43):536-549; 33 Ryan, R., Brian, C. G., Tsafrir, S. M. (2008). Hairy roots organ cultures for the production of human acetylcholinesterase, BMC Biotechnology, 8(95). 34 Saghai-Maroof Li Maoteng, Liu Jianmin, Zhangyi, Wang Pei, Gan Lu and Yu Longjiang, (2007) A Simple DNA Extraction Method for PCR Amplification from Dry Seeds of Brassica napus, Pakistan Journal of Biological Sciences, 10: 1122-1125. 35 Saleh, N. M., Thuc, L. V. (2009). Assessment of hairy roots induction DCCCLXXXVIII. in Solenostemon scutellarioid.es leaves by different strains of Agrobacterium rhizogenes, African Journal of Biotechnology, 8(15) 3519-3523. 36 Sevon, N. and K. M. Oksman-Caldentey (2002). Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids, Planta Med 68(10): 859 - 868. 37 Shi, H. P., Kintizios, S. (2003). Genetic transformation of Pueraria phaseoloides with Agrobacterium rhizogenes and puerarin production in hairy roots, Plant Cell Reports 21(11): 1103 - 1107 38 Sharp, J. M., Doran, P. M. (2001). Characterization of monoclonal antibody fragments produced by plant cells, Biotechnology and Bioengineering 73(5): 338 - 346. 39 Shkryl, Y. N., Veremeichik, G. N., Bulgakov, V. P., Tchemoded, G. K., Mischenko, N. P., Fedoreyev, S. A (2007). Individual and combined effects of the rolA, B and C genes on anthraquinone production in Rubia cordifolia transformed calli, Biotechnology and Bioengineering. Doi:10.1002/bit.21727 published online. 40 Sivakumar, G., Yu, K. W., Hahn, E. J., Paek, K. Y. (2005). DCCCLXXXIX. Optimization of organic nutrients for ginseng hairy roots production in large-scale bioreactors, Current science 89(4) 641 - 649. 41 Sureerat Yenchon and Sompong Te-chato (2012). Effect of bacteria density, inoculation and co-cultivation period on Agrobacteriummediated transformation of oil palm embryogenic callus, Journal of Agricultural Technology 8(4): 1485-1496) 42 Tao J and Li L (2006), Genetic transformation of Torenia fournieri L mediated by Agrobacterium rhizogenes, South African Journal of Botany 72(2): 211-216. 43 Taberlet P, Coissac E, Pompanon F, et al. (2007) Power and limitations of the chloroplast 399 trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding, Nucleic Acids Research 35, el4. 44 Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C. H., Smulders (2009). “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”. Molecular Ecology Resources 9:1086-1091 45 Vincent Savolainen, Mark W Chase, Sara B Hoot, Cynthia M Morton, Douglas E Soltis, Clemens Bayer, Michael F Fay, Anette Y De Bruijn, Stuart Sullivan, Yin-Long Qiu (2003) Phylogenetics of flowering plants based on combined analysis of plastid atpB and rbcL gene sequences 49(2): 306 - 362. 46 Wahyu, W., Ratna, P., Estri, L. A., Edi, P. U., Tatik, W. (2012). Genetic transformation of tomato (Lycopersicon esculentum Mill) with Agrobacterium rhizogenes and production of lycopene in transformed root culture, International Reseach Journal of Biotechnology, 3(9), 158165. 47 Yadav S. K., Katikala S., Yellisetty V., Kannepalle A., Narayana J. L., Maddi V., Mandapaka M., Shanker A. K., Bandi V. and Bharadwaja K. P. (2012). Optimization of Agrobacterium mediated genetic transformation of cotyledonary node explants of Vigna radiata. Springerplus 1(1): 59. 48 Zhi, B. H., Min, D. (2006). Hairy roots and its application in plant genetic engineering, Journal of intergrative plant biology 48(2): 121 — 127. DCCCXC. Zhou,Y. Q., Duan, H. Y., Zhou, C. E., Li, J. J., Gu, F. P., Wang, F., Zhang, Z. Y., Gao, Z. M. (2009). Hairy Root Induction and Plant Regeneration of Rehmannia glutinosa Libosch. f. hueichingensis Hsiao via Agrobacterium rhizogenes -Mediated Transformation, Russian Journal of Plant Physiology 56(2): 224 - 231. LXXIV. PHỤ LỤC LXXV. Phu lue 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS VÀ WPM LXXVI.- *--------*------------------- ----------------------------------------------, LXXVII. Thành LXXVIII. Môi trường phân LXXIX. (Mg/1) LXXX. G LXXXII. Wo M LXXXI. amborg (B5) ody plant urashige LXXXIII. Khoáng đa medium lượng (WPM) LXXXVI. LXXXIV. NH4NO LXXXV. LXXXVII. 400 LXXXIX. XCI. NH4SO 650 LXXXVIII. XC. 134 2.2H20 XCII. CaCl XCIII. XCIV. 150 XCV. 96 XCVII. XCVIII. 332,2 XCVI. Ca(N03)2.4H20 XCIX. 556 C. MgS04.7H20 CI. 370 CII. 250 CIII. 370 CVII. CIV. KNO3 CV. 1900 CVI. 2500 CIX. CX. CVIII. K2S04 CXI. 990 CXIV. CXII. KH2PO4 CXIII. 170 CXV. 170 CXVII. CXIX. CXVI. NaH2P04 CXVIII. 30,5 CXX. Khoáng vi lượng CXXIII. 6,2 CXXI. H CXXII. 3, CXXIV. CXXVIII. ,2 3CXXV. PO3 C CXXVI. CXXVII. 0, 0CXXIX. CI2.6H2O C 0,025 025 CXXX. CXXXI. 0, CXXXII. 0,2 uS0 .5H 0,025 025 CXXXIII. N CXXXIV. CXXXV. CXXXVI. 37, aCXXXVII. EDTA 7,3 7,3 F CXXXVIII. CXXXIX. CXL. 27,8 eS0 .7H 7,8 7,8 CXLIII. CXLI. M CXLII. CXLIV. 22, CXLVIII. 0,0 nS0 .H 6,9 CXLV. K CXLVI. CXLVII. 0, ICXLIX. ,83 75 N CL. 0,25 CLI. 0,25 CLII. 0,25 a2Mo04.2H20Z CLIV. 8,6 CLV. 2,0 CLVI. 8,6 CLIII. nS04.7H20 CLVII. Chât hữu CLIX. 100 CLVIII. M CLX. 100 CLXI. 100 CLXIV. yo-inositol G CLXIII. CLXII. CLXV. 2,0 lycine ,0 CLXVI. A CLXVII. CLXVIII. 1, CLXIX. 0,5 cid nicotinic ,5 CLXX. B CLXXI. CLXXII. 0, CLXXIII. 0,5 lCLXXIV. B CLXXV. ,5 CLXXVI. CLXXVII. 1,0 ,1 0,0 CLXXVIII. Thành phân môi trường LB (Lauria Broth) DCCCXCI. - - - - - - - - - - - - - - - 10 g/1 tryptone - g/1 yeast extract - g/l NaCl - pH 7.2 DCCCXCII. Phụ lục 2: CÁC TRÌNH Tự NUCLEOTIDE KHAI THÁC TRÊN ••• 7 DCCCXCIII. GENBANK VÀ TRÌNH Tự CỦA LOÀI HOÀNG LIÊN GAI ĐĂNG DCCCXCIV. KÝ TRÊN GENBANK 1. Các trình tự nucleotide đoạn gen Hoàng liên gai khai thác Genbank: GU934709, GU934711,GƯ934672, GU934683, DCCCXCV. GƯ93464, GƯ934658, GƯ934673,GƯ934709, GU934669, GƯ934687, GƯ934703, DCCCXCVI. JN012234, JN012239, JN228267, EF488082, EF488083, FJ980428, DCCCXCVII. KJ557009, HM347924,HM347917, HM347882, HM347904, KF176554, DCCCXCVIII. KF718350, FJ626551, AM397156, FJ626552. 2. Thông tin trình tự loài Hoàng liên gai nghiên cứu đăng ký DCCCXCIX. Genbank CM. CMI. Tên mẫu ST T CMIV. CMV. Berberis wallichiana DC CMVIII. CMIX. Berberis wallichiana DC CMXII. CMXIII. Berberis wallichiana DC CMXVI. CMXVII. Berberis wallichiana DC CMXX. CMXXI. Berberis wallichiana DC CMXXIV. CMXXV. Berberis julianae Schneid CMXXVIII. CMXXIX. Berberis julianae Schneid CMXXXII. CMXXXIII. Berberis julianae Schneid CMXXXVI. CMXXXVII. Berber is julianae Schneid CMII. CMIII. Mã sô Đoạn gen Genbank CMVI. CMVII. KM58059 ITS CMX. CMXI. KM58059 psbA-trntì CMXIV. CMXV. KM58059 rpoB CMXVIII. CMXIX. KM58059 rpoCl CMXXII. CMXXIII. KM58059 trnL CMXXVI. CMXXVII. KM58058 ITS CMXXX. CMXXXI. KM58058 psbA-trntì CMXXXIV. CMXXXV. KM58058 rpoB CMXXXVIII.CMXXXIX. KM58058 rpoCỈ CMXL. CMXLI. Berberis CMXLII. CMXLIII. KM58059 10 julianae Schneid trnL CMXLIV. CMXLV. Phụ lục 3: KẾT QUẢ so SÁNH TRÌNH TựDNA THÔNG QUA CÁC CMXLVI. MỒICỦA SẢN PHẨM PCR 1. Trình tự nucleotide thỉ rpoB CMXLVII. CMXLVIII. CMXLIX. CML. CMLI. CMLII. CMLIII. CMLIV CMLV CMLVI. CMLVII . CMLVIII. CMLIX. CMLX. CMLXI. CMLXII. CMLXIII. CMLXIV. CMLXV. CMLXVI. CMLXVII . CMLXVIII.--CMLXIX. CMLXX. CMLXXI. CMLXXII. CMLXXIII. CMLXXIV. CMLXXV. CMLXXVI . CMLXXVII CMLXXVIII. CMLXXIX . CMLXXX. CMLXXXI.--CMLXXXII. CMLXXXIII. CMLXXXIV. CMLXXXV. CMLXXXVI. CMLXXXVII. CMLXXXVIII . CMLXXXIX CMXC . CMXCI. CMXCII . CMXCIII CMXCIV. CMXCV HLGl-p5 AATGGGCTTCTAAATGCGGTATTTCGTTAGTGATTCTTTCAGGGCCTTGGCTTGTCACATGAGTCTGAATTTCATATTTCCGTATATGAAAAGAAGTATA HLG2-p5 . . .A G Berberis.bealei Nandina. domestica A Nelumbo .nncifera .C .T G Nelumbo . lu te a .C .T G Nelumbo .nocifera .C .T G Liriodendron. tnlipi fera . . . .A G. .G Ranunculus .macranthus .G T A .A .G Magnoli a. grandi flora . . . .A G. .G Iryanthera.lancifolia . . . .A .A .G. .G 110 200 ISO | HLGl-p5 | | -------| 120 |------|-------------I . . . . - I 130 I 140 I | | ----------| 150 | lffO | --------| ---------| 170 | ISO | | AATATCTCCATATACCAGACGTTCGCTAATGAGTACCGCATCTTCAAAATTGTAGCCCTCCCyiGGGCATATAAGCTACTAATACGTTTTTTCCTAAAGCG HLG2-p5 Berberis.bealeî Nandina. domestica G A .C .C Nelumbo .nncifera C A T G .G .T .T C Nelumbo . lctea C. .A .T G .G .T .T C Nelumbo .nncifera C A T G .G .T .T C HLG1-P5 AGTTGGGCACCAAGTGTACîCAGCACGATCCGCTAAAATTTGTCCGTTTTTAATGCGTTTACGCGGCGGAAGCCGGGGTTTTTGATGCATACAAGTATTTT HLG2-P5 Berberis.bealei Nandina. domestica .A. A A. . . .T. A G. . . . Nelumbo . ne ci fera .G .T .A .C .T Nelumbo.lutea G .T .A .C .T Nelumbo.nncifera .G .T .A .C .T Li ri odendron. tnlipi fera .A .C .G .A C T. A Ranunculus . macranthus G .A A. .T . . . T . Magnolia, grandi flora A .C .G A C T. A Iryanthera. lancifolia A .C .A .T T. A T 310 320 330 340 350 360 370 3B0 390 400 -------|--------------|----------|--------------|-------|----------|--------|------------|---------------|---------|---------|-----------|----------|---------|-------------| ----------|----------|-------------|-------|----------| HLGl-p5 TGTTCGAACGT TGATACATAACCAATGGGATACTTAGAGTGT CTCCATTACCTGATAAAAOAATCTTGTCAOTAGCAGTATAAACGATCTTTCCCTCGTG BLG2-p5 G Berberis.bealei TC T Nandina. domestica . .G .G. .A. .G .G C .TG .T.G .T Nelumbo .nncifera G .T .A G TG T.G T Nelumbo.lutea . .G T Nelumbo.nncifera .G A G TG T.G T T A .G .TG .T.G T . Li ri odendron. tnlipi fera G .A G T CG A .T.G Liriodendron. tnlipi fera TG.A T .A A. . . Ranunculus .macranthus G. A .G .A A. . . Magnolia.grandiflora TG.A T .A A. . . Iryanthera. lancifolia .TG.A T A. . . A 2. Trinh tw nucleotide cüa chi thi rpoCl CMXCVI. CMXCVII.SO 10 20 30 40 50 60 100 -----------|---------|----------|---------|---------|----------|----------|---------|---------|----------|--------| CMXCVIII. CMXCIX. M. MI. MII. MIII. MIV. MV. MVI. MVII. MVIII. MIX. MX. MXI. MXII. MXIII. MXIV MXV. MXVI.--------------MXVII. MXVIII. MXIX. MXX. MXXI. MXXII. MXXIII. MXXIV. MXXV. MXXVI. MXXVII. MXXVIII. MXXIX. MXXX. MXXXI.MXXXII. MXXXIII. MXXXIV. MXXXV. MXXXVI. MXXXVII. MXXXVIII. MXXXIX. MXL. MXLI. MXLII. MXLIII. MXLIV. MXLV. MXLVI. MXLVII.MXLVIII. MXLIX. ML. MLI. MLII. MLIII. MLIV. MLV. MLVI. MLVII. MLVIII. MLIX. MLX. MLXI. MLXII. MLXIII. MLXIV -------|---------|--------| | | | | 70 | SO | HLG1-P6 ATAGCTGGAaACAGAGATTCATATGAaAAAACATAAGTAAACGAGCCTCCGCTTGATCCTCCAA^GATAAAGGTACATGAACAGCCATTTGATCCCCATC HLG2-p6 Berberis .bergmanniae . Berberis.candidula . Berberis.aararensis . Berberis.bealei . Berberis.sieboldii . Berberis.verracnlosa Berberis.zabeli ana . Berberis.pallida Berberis.paxii . Berberis.gracilis . Berberis. thunbergii . Nandina.domestica .T T Trochodendron.aralioides Helmibo . nucifera .C T .G Megaleranthis.saninullfolia .T 110 140 170 200 120ISO 150IffO ISO190 ----------| | | | | | |----------|----------|---------|---------|----------|--------|----------|--------|----------|------------| -------|-------------------------------------------------------------------------- |---------| BLG1-P6 AAAGTCTGCATTAAATCCCTTACAAACTAATGGATGTAAAAAAATAGCACGTCCTTCCACTAAAATGGGTTGGAATGCCTGTATGCCTAATCTATGCAAA HLG2-p6 . Berberis.bergmanniae . Berberis.candidula Berberis.aararensis Berberis.bealei Berberis.sieboldii Berberis.verracnlosa . Berberis.zabeli ana C Berberis.pallida . .C. Berberis.paxii Berberis.gracilis Berberis.thnnbergii . BLG1-P6 GTAGGTGCTCTATTCAGCAATACAOTATGCCCCTGCATAACTTCTTGAAGTATTTCCCACACAATTGGTTCGTTTTCCOGAATTTGACTTTTGGCAACTC BLG2-p6 . Berberis.bergmanniae Berberis.candidula Berberis.amurensis .T Berberis.bealei .T Berberis.sieboldi i G .T Berberis.verracnlosa T Berberis.zabeli ana G .T Berberis.pallida T Berberis.paxii .T Berberis.gracilis .T Berberis.thunbergii G .T Nandina.domestica .G G .T .T .T . HLG1-P6 CTATGTTGGAAGCAöCATGTTGTTTGATTAGACCAOGAATTACyiAATGTCTGGAAAAöCTCTATTGCTATTTOGCGGGGCAATCCACAGCGATGTAATGA BLG2-p6 Berberi s.bergmanni ae Berberis.candidnla . Berberis.amurensis . Berberis.bealei . Berberis.sieboldi i Berberis.verracnlosa Berberis.zabeliana Berberis.pallida Berberis.paxii . Berberis.gracilis . Berberis. thmibergii . Nandina. domesti ca .G C A C T Trochodendron. aralioides .A .C. A .A T Helnmbo . nucifera .A C .A .T Megaleranthis . sanicnlifolia .A.G C .A A .T MLXV. MLXVI.------| | | | . | . . . | -------------------------------| | | | | | | | | | | ------------------------------------------------------| 4SO MLXVII. MLXVIII. MLXIX. MLXX. MLXXI. MLXXII. MLXXIII. MLXXIV. MLXXV. MLXXVI. MLXXVII. MLXXVIII. MLXXIX. MLXXX. MLXXXI. MLXXXII. MLXXXIII 410 500 420 4S0 440 450 4ffC 470 430 HLG1-P6 AAGGGAÄG[...]... XLV Cung cấp cơ sở cho bảo vệ nguồn gen cây Hoàng liên gai trong tự nhiên qua việc đáp ứng nguồn cung cấp ổn định sinh khối rễ tơ Hoàng liên gai nuôi cấy in vitro 7 Ý nghĩa thực tiễn XLVI Xây dựng quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo tiền đề cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ ừên qui mô bỉoreactor, nhằm thu lượng lớn sinh khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược 1 2 II NỘI... vi (Ex situ) ở vườn Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sapa (Viện Dược liệu) [2],[7].Trước tình hình trên, cần sớm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng yêu cầu làm thuốc 1.2 1.2.1 Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào LXXII Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật đóng góp nhiều cho tiềm năng khai thác các... các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36] IV V Hình 1.5 Các hệ rễ tơ được nuôi cấy XCVIII 1 Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar 2 Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hỵpogaea) 3 Rễ tơ ơ glabra nuôi trong môi trường lỏng 4 Nuôi cấy rễ tơ G.ệỉabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cay (b,c)... TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 Tẳng quan về cây Hoàng liên gai Phân bố địa lý XLVII Hoàng liên gai (Berberis julỉane) là cây thảo dược phân bố nhiều tại vùng Tây Bắc Việt Nam và Tây Nam Trung Quốc (tây Vân Nam, nam Tây Tạng), nên Trung Quốc còn gọi Hoàng liên gai là Vân Nam Hoàng liên) Hoàng liên gai nguyên gốc mọc ở tỉnh Lào Cai (huyện Sa Pa), trên dãy núi cao Hoàng Liên San, vùng núi cao từ 1000 - 2500m Hoàng liên. .. cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Hoàng liên gai LXX Hoàng liên gai có nhiều đặc tính quý hiếm, các hợp chất chiết xuất tò Hoàng liên gai có khả năng ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược Mặt khác, số lượng cá thể Hoàng liên gai ừong tự nhiên đang suy giảm mạnh Bên cạnh đó, đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm, khó nuôi trồng khiến cho việc tái sinh Hoàng liên gai trong tự... xuất rễ tơ nhân sâm với 2 8 bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau ừên thị trường Đã có rất nhiều nghiên cứu thảnh công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [5],[6] CXXI Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục. .. tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai sẽ đưa ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai trong tự nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis XLIV Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên (Berberis' ) XLV... tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên 2 0 gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[l] LXXVII Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy Việc làm này sẽ dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối. .. ửng dụng của nuôi cấy sinh khối rễ tơ CI Công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của mình Rễ chuyển gen có đặc tính là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn định Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hợp chất thứ cấp hay hàng loạt họp chất có liên quan tới thực vật CII Sản xuất hợp chất thứ cấp CIII Thông thường, nuôi cấy rễ cần có... cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này ừong môi ừường nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm và có thể dẫn đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp Tuy nhiên, rễ tơ đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất có giá trị sinh học cao Rễ tơ cũng đã cung cấp . tài Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu là công trình nghiên cứu của tôi. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn. chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo tiền đề cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ ừên qui mô bỉoreactor, nhằm thu lượng lớn sinh khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược. 1 1 II VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 • • • • Lưu VIẾT THỦY NGHIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberỉs julỉane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI DƯỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC •