Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC Mục tiêu • Biết mục đích thử nghiệm huyết học, nhờ phân tích ý nghóa hữu dụng lâm sàng thử nghiệm huyết học. • Biết cách biện luận kết xét nghiệm huyết học, nhờ thêm bình luận kèm kết xét nghiệm để lâm sàng phân tích sử dụng kết xét nghiệm chẩn đoán phát tác nhân gây bệnh. Mục đích thử nghiệm huyết học Thử nghiệm huyết học có mục đích tìm kháng thể đặc hiệu loại kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh có huyết bệnh nhân, nhờ gián tiếp xác đònh tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Ví dụ: Thử nghiệm Widal chẩn đoán bệnh thương hàn, thử nghiệm tìm HBsAb để xác đònh bệnh nhân có kháng thể đặc hiệu viêm gan B. Biện luận kết thử nghiệm huyết học Vì mục đích tìm kháng thể đặc hiệu kháng nguyên vi sinh vật nên thử nghiệm huyết học thử nghiệm trực tiếp phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, biện luận thử nghiệm huyết học phải dựa vào giá trò đònh lượng kết thử nghiệm. Kết đònh lượng thử nghiệm huyết học thường hiển thò hiệu giá kháng thể đặc hiệu, tức độ pha loãng cao huyết bệnh nhân mà thử nghiệm dương tính (ví dụ thử nghiệm Widal, kết cho biết TO 1/100, có nghóa huyết bệnh nhân pha loãng 1/100 tụ với kháng nguyên O S. typhi thử nghiệm). Hiện nay, với số thử nghiệm ELISA, kết đònh lượng thường hiển thò giá trò OD thực thử nghiệm độ pha loãng huyết bệnh nhân. Có nhiều cách biện luận kết thử nghiệm huyết học dựa vào giá trò đònh lượng để nhờ phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh: 1. Dựa vào huyết kép Thử nghiệm huyết lấy lần cách 7-14 ngày. 147 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Kết [+] hiệu giá huyết lần cao ≥ lần hiệu giá huyết lấy lần 1. Đối với kết đònh lượng hiển thò giá trò OD nhà sản xuất thường đưa công thức tính toán biết có gia tăng có ý nghóa giá trò đònh lượng huyết lần so với huyết lần 1. Phương pháp huyết kép thường hữu dụng lâm sàng thời gian tính, có ý nghiã để chẩn đoán xác đònh 2. Dựa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu thuộc lớp IgM Có thể cần thử nghiệm huyết lấy lần xác đònh kháng thể đặc hiệu thuộc lớp IgM, lớp globulin miễn dòch xuất giai đọan sớm bệnh, tồn có diện tác nhân vi sinh vật gây bệnh thể, biến nhanh sau hết bệnh-không diện vi sinh vật gây bệnh thể. Kết coi [+], tức có diện tác nhân vi sinh vật gây bệnh thể hiệu giá kháng thể hay giá trò OD kết thử nghiệm cao hiệu giá hay giá trò OD cắt, tức hiệu giá hay giá trò OD trung bình người bình thường. Xét nghiệm phát kháng thể đặc hiệu thuộc lớp IgM hữu dụng lâm sàng không thời gian tính, có ý nghiã để chẩn đoán phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà không cần phải thử nghiệm huyết lấy lần 2. Tuy nhiên, có thử nghiệm miễn dòch ELISA, IFA (miễn dòch huỳnh quang), RIA (miễn dòch phóng xạ) xác đònh kháng thể đặc hiệu thuộc lớp nào. 3. Dựa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu so với giá trò cắt Phải xác đònh hiệu giá hay giá trò OD cắt quần thể điều tra huyết dòch tễ học. So sánh hiệu giá hay giá trò OD huyết thử nghiệm với hiệu giá hay giá trò OD cắt cuả quần thể; Nếu hiệu giá huyết thử nghiệm cao ≥ lần hiệu giá cắt, hay OD huyết thử nghiệm cao k x OD giá trò cắt (k trò số nhà sản xuất thử nghiệm qui đònh) cho kết [+] tức cho chẩn đoán xác đònh tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Kết nầy hữu dụng lâm sàng không thời gian tính, nhiên có ý nghiã vừa phải để chẩn đoán xác đònh. 148 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Câu hỏi ôn tập 1. Cho biết mục đích thử nghiệm huyết học. 2. Thử nghiệm huyết học huyết kép nào? Tại phài làm thử nghiệm huyết học huyết kép? Làm để biện luận kết quả? 3. Thử nghiệm huyết học tìm kháng thể thuộc lớp IgM đặc hiệu kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh có ý nghóa chẩn đoán phát tác nhân gây bệnh? 4. Có cần dựa vào kết thử nghiệm huyết học huyết bệnh nhân lấy có lần mà chẩn đoán tác nhân gây bệnh, không cần phải xác đònh kháng thể đặc hiệu tìm thuộc lớp IgM? THỬ NGHIỆM HOÁ MIỄN DỊCH HỌC Mục tiêu • Biết mục đích thử nghiệm hoá miễn dòch học, nhờ phân tích ý nghóa hữu dụng lâm sàng thử nghiệm hóa miễn dòch học. • Biết cách biện luận kết xét nghiệm hoá miễn dòch học, nhờ thêm bình luận kèm kết xét nghiệm để lâm sàng phân tích sử dụng kết xét nghiệm chẩn đoán phát tác nhân gây bệnh. Mục đích thử nghiệm hoá miễn dòch học Mục đích thử nghiệm hoá miễn dòch học phát kháng nguyên tác nhân vi sinh vật bệnh phẩm, nhờ chẩn đoán xác đònh cách tương đối trực tiếp tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Ví dụ thử nghiệm phát kháng nguyên hoà tan vi khuẩn thường gây viêm màng não mủ thuốc thử tụ latex có tên Meningitex thử 149 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác nghiệm hoá miễn dòch; thử nghiệm phát kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (tìm HBsAg) huyết để phát tình trạng nhiễm viêm gan siêu vi B thử nghiệm hoá miễn dòch học bệnh phẩm để thử huyết bệnh nhân; hay thử nghiệm tụ kính vi khuẩn Shigella spp. phân lập với kháng huyết đặc hiệu để đònh nhóm A , B, C, D thử nghiệm hoá miễn dòch học; hay thử nghiệm miễn dòch huỳnh quang trực tiếp phát Chlamydia trachomatis phết cổ tử cung thử nghiệm hoá miễn dòch. Các loại thử nghiệm hoá miễn dòch Tuỳ thuộc vào kháng nguyên phát hiện, có hai loại thử nghiệm hoá miễn dòch, là: 1. Phát kháng nguyên hòa tan Thường, thử nghiệm tụ latex, ELISA, CCIE (Counter Current Immuno- Electrophoresis = điện di miễn dòch đối lưu), thử nghiệm hay dùng để phát kháng nguyên hòa tan có bệnh phẩm. Đối với tụ latex, thường nhà nghiên cứu hay sản xuất gắn kháng thể đặc hiệu kháng nguyên lên hạt latex polystyrene, nhờ gặp kháng nguyên đặc hiệu hạt latex tụ lại kết thấy dễ dàng mắt thường. Đối với thử nghiệm ELISA, nhà nghiên cứu hay sản xuất thường phủ kháng thể đặc hiệu kháng nguyên giếng ELISA polystyrene nhờ tóm bắt kháng nguyên bệnh phẩm (gọi kỹ thuật ELISA tóm bắt kháng nguyên). Đối với thử nghiệm CCIE, nhà nghiên cứu hay sản xuất thường cho kháng thể đặc hiệu kháng nguyên vào giếng bệnh phẩm vào giếng đối diện thạch diện di, sau điện di để kháng thể di chuyển phía cực âm hướng giếng chứa bệnh phẩm kháng nguyên bệnh phẩm di chuyển phía cực dương hướng giếng chứa kháng thể; nhờ gặp gở kháng nguyên-kháng thể hình thành vạch kết tủa thấy thạch hai giếng. Thử nghiệm phát kháng nguyên hòa tan vi khuẩn thường gây viêm màng não mủ N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae phản ứng tụ latex với thuốc thử MENINGITEX; hay thử nghiệm phát Rotavirus phân kỹ thuật CCIE; thử nghiệm phát HBsAg kỹ thuật ELISA tóm bắt kháng nguyên minh họa ba phương pháp nói dùng phát kháng nguyên hoà tan. 150 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác 2. Phát kháng nguyên hữu hình Thường, thử nghiệm miễn dòch huỳnh quang trực tiếp (Direct-ImmunoFluorescent), hay nhuộm kháng thể gắn men peroxidase (Immuno-Peroxidase-Staining), thử nghiệm hay dùng nhất. Trong thử nghiệm miễn dòch huỳnh quang, bệnh phẩm phết lame kính hiển vi, sau để khô cố đònh acetone. Nhỏ kháng thể đặc hiệu kháng nguyên vi sinh vật muốn tìm gắn huỳnh quang (thường FITC = Fluorescent Thio Cyanate) lên phết bệnh phẩm này, sau soi kính hiển vi huỳnh quang. Nếu bệnh phẩm có vi sinh vật muốn tìm vi sinh vật bò bám kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang, bò phát huỳnh quang người làm xét nghiệm dễ dàng thấy hình ảnh vi sinh vật bò phát huỳnh quang tối không phát huỳnh quang Thử nghiệm nhuộm kháng thể gắn men có bước thực giống nhuộm kháng thể huỳnh quang, không cần phải quan sát phết bệnh phẩm qua kính huỳnh quang mà cần qua kính hiển vi quang học thường. Nếu phết bệnh phẩm có chứa kháng nguyên vi sinh vật muốn tìm bò kháng thể gắn men bám vào bò sinh màu kết tủa tác động men đài chất sinh màu. Thử nghiệm nhuộm miễn dòch huỳnh quang trực tiếp phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis quệt cổ tử cung, phát vi khuẩn không điển hình mẫu đàm thử nghiệm thường dùng để chẩn đoán phát tác nhân gây bệnh nói phương pháp nuôi cấy khó thực phòng thí nghiệm lâm sàng. Biện luận kết thử nghiệm hoá miễn dòch học Vì mục đích phát có hay không kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh bệnh phẩm nên thử nghiệm hoá miễn dòch học thường cần thử nghiệm đònh tính, xác đònh có (dương) hay (âm), mà không cần giá trò đònh lượng. Vì trả lời kết thử nghiệm hoá miễm dòch, người làm xét nghiệm không cần thiết phải trả lời số đònh lượng. Mặc dù với nhiều thử nghiệm hóa miễn dòch dựa phản ứng ELISA, kết phải đọc máy quang phổ với giá trò OD, giá trò OD cần cho người làm xét nghiệm để so với OD nhờ biết kết mẫu bệnh phẩm [+] hay [-]. Khi trả lời 151 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác kết cho lâm sàng, không cần thiết phải đưa kết giá trò OD thử nghiệm làm có làm rối trí lâm sàng hay có lâm sàng hiểu nhầm trò số OD lớn nhiễm trùng nặng so với kết có trò số OD nhỏ hơn. Câu hỏi ôn tập 1. Cho biết mục đích thử nghiệm hoá miễn dòch học. 2. Các thử nghiệm thường dùng để phát kháng nguyên hoà tan kháng nguyên hữu hình vi sinh vật gây bệnh có bệnh phẩm? Nói qua nguyên tắc thử nghiệm cho ví dụ minh họa. 3. Hãy cho biết có thử nghiệm hoá miễn dòch cho kết có giá trò đònh lượng không? Nếu có, người làm xét nghiệm có cần thiết phải trả lời cho lâm sàng kết thử nghiệm hóa miễn dòch học với kết đònh lượng kèm theo hay không? Tại cần? không cần? Hình 42: Hình quan sát qua kính hiển vi huỳnh quang phết quệt cổ tử cung nhuộm kháng thể huỳnh quang đặc hiệu C. trachomatis (trái) phết đàm nhuộm kháng thể huỳnh quang đặc hiệu Legionella pneumophila (phải) 152 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Sản phẩm liên quan: TYPHELISAM - Bộ thuốc thử ELISA phát đònh lượng kháng thể IgM đặc hiệu Salmonella typhi để chẩn đoán phát sớm thương hàn. Nguyên tắc hoạt động Bộ thuốc thử hoạt động nguyên tắc phản ứng ELISA gián tiếp phát kháng thể: kháng nguyên S. typhi gắn giếng nhựa polystyrene tóm bắt kháng thể đặc hiệu có huyết người, sau phát kháng thể đặc hiệu bám kháng nguyên xác đònh kháng thể thuộc lớp IgM cộng hợp kháng IgM người đánh dấu men peroxidase. Sàn phẩm kết nghiên cứu CN. Phạm Thái Bình hướng dẫn TS. BS. Phạm Hùng Vân với tài trợ chương trình vườn ươm Thành Đoàn công ty Nam Khoa. Trình bày Có thành phần sau đây, tất giữ 4oC 1. R1: Bản nhựa polystyrene làm ELISA, với 12 rời, có giếng, giếng nầy phủ kháng nguyên trích từ S. typhi. 2. R2: dung dòch rửa PBS-T, 100ml x 5. 3. R3: dung dòch pha loãng PBS-T-BSA, 60ml x 1. 4. R4: cộng hợp kháng thể kháng IgM người gắn men peroxidase (HRPO), 12ml. 5. R5a: Cơ chất TMB, 0.65ml x tube 6. R5b: Peroxide UPR, 0.65ml x 7. R5c: dung dòch đệm chất, 12ml x 1. 8. R6: dung dòch ngưng phản ứng, 12ml x 9. R7a: Huyết chứng (+), 1.5ml x 10. R7b: Huyết chứng (-), 1.5ml x 11. R7c: Huyết chuẩn, 1.5ml x 153 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Tiến hành phản ứng 1. Pha loãng huyết thử nghiệm 1/160 tube eppendorf (10µl huyết cho vào 1590µl R2). Cho vào giếng, giếng 100µl huyết pha loãng này. Để giếng cho 100µl chứng [+], giếng cho 100µl chứng [-], giếng cho 100µl chứng chuẩn. Ủ 37oC 30 phút. 2. Rửa giếng lần với R2, ngâm phút lần rửa cuối. Lưu ý phải giủ sau lần đổ bỏ dung dòch rửa. 3. Cho vào giếng 100µl cộng hợp, gãi nhẹ đáy giếng để trộn đều. Ủ 37oC 30 phút. 4. Rửa giếng lần với R2, ngâm phút lần rửa cuối. Lưu ý phải giủ sau lân đổ bỏ dung dòch rửa. 5. Pha 1ml chất tube Eppendorf cách hút 0.9ml R5c cho vào tube thêm 50µl R5a 50µl R5b. Lắc trộn thật đều. Dung dòch pha sau xong bước 4. 6. Cho vào giếng, giếng 100µl chất vừa chuẩn bò xong. Giữ tối 15 phút. Đọc kết máy đọc ELISA bước sóng 450nm. Đọc kết 1. Xác đònh giá trò OD450 điểm cắt cách lấy gía trò OD450 chứng chuẩn đo (OF) nhân với giá trò OD450 chứng chuẩn (CF) ghi tài liệu hướng dẫn kèm theo thử nghiệm. 2. Xác đònh số kháng thể huyết chứng [+], chứng [-], huyết thử nghiệm cách lấy giá trò OD450 đo mẫu chia cho giá trò OD450 điểm cắt. 3. Biện luận sau: • Chỉ số kháng thể huyết chứng [+] phải > 1.05, huyết chứng [-] phải < 0.95 • Các mẫu huyết thử có số kháng thể > 1.05 dương tính, < 0.95 âm tính. • Các mẫu huyết thử có số kháng thể từ 0.95 đến 1.05 dương tính âm tính. Cần phải làm lại mẫu lấy sau tuần đònh được. 154 . Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 149 Câu hỏi ôn tập 1. Cho biết mục đích của thử nghiệm huyết thanh học. 2. Thử nghiệm huyết thanh học trên huyết thanh kép là. gây bệnh. Do vậy, biện luận thử nghiệm huyết thanh học phải dựa vào giá trò đònh lượng của kết quả thử nghiệm. Kết quả đònh lượng của một thử nghiệm huyết thanh học thường được hiển thò bằng. B. Biện luận kết quả một thử nghiệm huyết thanh học Vì mục đích là tìm kháng thể đặc hiệu kháng nguyên vi sinh vật nên thử nghiệm huyết thanh học không phải là thử nghiệm trực tiếp phát hiện