BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------****-------- NGUYỄN ðĂNG THẾ HƯNG ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA ðỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL TRONG THỊT VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------****-------- NGUYỄN ðĂNG THẾ HƯNG ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA ðỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL TRONG THỊT VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI LỢN Chuyên ngành Mã số : CHĂN NUÔI : 60.62.01.05 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. PHẠM KIM ðĂNG Hà Nội – 2015 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ñược công bố công trình khác. Tôi xin cam ñoan giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn ðăng Thế Hưng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập, nghiên cứu thực ñề tài tốt nghiệp, nỗ lực thân, nhận ñược nhiều quan tâm giúp ñỡ quý báu nhà trường, thầy giáo, cô giáo bạn ñồng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Kim ðăng, người ñã ñộng viên, hướng dẫn bảo tận tình cho suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn chân thành tới cán Phòng thí nghiệm Trung tâm, thầy giáo, cô giáo Bộ môn Sinh lý – Tập tính ñộng vật, Khoa Chăn nuôi & Nuôi trồng thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã góp ý bảo ñể luận văn ñược hoàn thành. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán Trung tâm Khuyến nông tỉnh Hưng Yên, Sở Nông nghiệp&PTNT Chi cục Thú y, phòng nông nghiệp, trạm thú y chủ sở kinh doanh thức ăn chăn nuôi, hộ chăn nuôi lợn ñịa bàn tỉnh Hưng Yên, Thái Bình, Hải Dương, nơi ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ thực ñề tài hoàn thành luận văn. ðể hoàn thành luận văn này, nhận ñược ñộng viên, khích lệ người thân gia ñình bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn tình cảm cao quý ñó. Tác giả Nguyễn ðăng Thế Hưng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN LỜI CẢM ƠN . ii MỤC LỤC . iii DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . viii MỞ ðẦU .1 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1. Một số thông tin chung Clenbuterol . 1.1.1. Cơ chế tác dụng β-agonist .5 1.1.2. Dược ñộng học β-agonists 1.1.3. Phân loại .7 1.2. Thông tin liên quan ñến việc sử dụng Clenbuterol chăn nuôi . 1.3. Tình hình nghiên cứu nước 15 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nước 15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nước .16 1.4. Các phương pháp phân tích kiểm tra chất kích thích sinh trưởng thức ăn sản phẩm chăn nuôi . 17 1.4.1. Phương pháp sàng lọc (Screening Test) 17 1.4.2. Phương pháp khẳng ñịnh ñịnh luợng xác .19 1.5. Các qui ñịnh liên quan ñến chất kích thích sinh trưởng chăn nuôi 21 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1. ðối tượng, ñịa ñiểm thời gian nghiên cứu 24 2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 24 2.1.2. ðịa ñiểm nghiên cứu 24 2.1.3. Thời gian nghiên cứu .24 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.2. Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị . 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 25 2.3.1. Một số ñặc ñiểm hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn thuốc thú y số tỉnh vùng ðồng sông Hồng .25 2.3.2. Nghiên cứu ñánh ñánh giá khả phân tích phát Clenbuterol thịt lợn thức ăn chăn nuôi phương pháp ELISA .25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp ñiều tra .26 2.4.2. Phương pháp tách chiết mẫu thức ăn chăn nuôi mẫu thịt 27 2.4.3. Phương pháp ñánh giá tham số phương pháp 29 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu .30 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Một số ñặc ñiểm hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi thuốc thú y dùng chăn nuôi lợn số tỉnh ñịa bàn ðồng sông Hồng 31 3.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi .31 3.1.2. Hoạt ñộng kinh doanh thuốc thú y 34 3.1.3. Quản lý nhà nước thức ăn chăn nuôi, hóa chất thuốc thú y 38 3.2. ðánh giá khả phân tích Clenbuterol thức ăn chăn nuôi thịt lợn phương pháp ELISA 39 3.2.1. Thăm dò tính ổn ñịnh phương pháp thông qua thử nghiệm xây dựng ñường chuẩn .39 3.2.2. Thăm dò ngưỡng phát kít ELISA .42 3.2.3. Kết xác ñịnh khả phát (CCβ) 44 3.2.4. Kết xác ñịnh ñộ ñặc hiệu, ñộ chọn lọc ñộ xác thực phương pháp 47 3.2.5. Thử nghiệm phân tích mẫu củng cố mẫu thực ñã khẳng ñịnh phương pháp sắc ký nồng ñộ khác 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 52 4.1. Kết luận 52 4.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi thuốc thú y tỉnh thuộc ñịa bàn Vùng ðồng sông Hồng 52 4.1.2. Khả phát Clenbuterol phương pháp ELISA 52 4.2. ðề nghị . 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số ñặc ñiểm cấu tạo tính chất lý hóa Clenbuterol salbutamol Bảng 1.2. Kết kiểm tra giám sát sử dụng kháng sinh chất cấm năm 2014 14 Bảng 1.3. Giới hạn tồn dư tối thiểu cho phép (MRPL) phòng thí nghiệm tham chiếu ðức . 21 Bảng 1.4. Quy ñịnh mẫu dương tính theo phương pháp ñịnh lượng . 23 Bảng 2.1. Dung lượng mẫu ñiều tra 27 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm xác ñịnh tham số phương pháp . 30 Bảng 3.1. Kết ñánh giá ñiều kiện kinh doanh ñại lý cửa hàng thuốc thú y 36 Bảng 3.2. Kết kiểm tra tính ổn ñịnh ñường chuẩn 40 Bảng 3.3. Kết thử tính ổn ñịnh phương pháp thông qua việc xây dựng ñường chuẩn . 42 Bảng 3.4. Kết xác ñịnh giới hạn phát phương pháp 43 Bảng 3.5. Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố ñể xác ñịnh khả phát (CCβ) phương pháp . 45 Bảng 3.6. Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố clenbuterol nồng ñộ ppb ñối với mẫu thức ăn chăn nuôi lợn 48 Bảng 3.7. Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố clenbuterol nồng ñộ ppb ñối với mẫu thịt lợn 48 Bảng 3.8. Kết ñánh giá tham số phương pháp nên mẫu khác (%) 49 Bảng 3.9. Kết thử nghiệm phân tích mẫu củng cố nồng ñộ khác 50 Bảng 3.10. Kết thử nghiệm phân tích mẫu thực nồng ñộ khác 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH Hình 1.2. Bao chất tạo nạc Super Weight 02 ñược phát ðồng Nai ngày 10/3/2011 12 Sơ ñồ 3.1. Mạng lưới phân phối thức ăn chăn nuôi 32 Hình 3.1. Sản phẩm nhãn mác hướng dẫn sử dụng . 34 Sơ ñồ 3.2. Mạng lưới phân phối thuốc thuốc thú y 35 Hình 3.2. ðường chuẩn biểu diễn tương quan nồng ñộ clenbuterol ñộ hấp phụ . 41 Hình 3.3. Kết xác ñịnh ñường Cut-off giá trị CCβ phương pháp phân tích clenbuterol thức ăn chăn nuôi 46 Hình 3.4. Kết xác ñịnh ñường Cut-off giá trị CCβ phương pháp phân tích clenbuterol thịt lợn . 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải CCβ Khả phát cs Cộng ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ESI Bộ nguồn ion hóa phun ñiện tử FAO Food Agricultural Organization FDA Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm Mỹ FSIS Cơ quan tra quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao KHKTNN Khoa học kỹ thuật nông nghiệp LC/MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) NN&PTNT Nông nghiệp Phát triển nông thôn ppb Phần tỷ (Parts per billion) TĂCN Thức ăn chăn nuôi UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii 3.2.3. Kết xác ñịnh khả phát (CCβ) Một thông số cần ñánh giá ñối với phương pháp phân tích tồn dư khả phát (CCβ) phương pháp (657/2002/EC). Nghiên cứu ñã xác ñịnh dựa việc phân tích mẫu trắng mẫu ñược củng cố nồng ñộ 0,075 ppb ñối với mẫu thịt lợn. Mẫu thức ăn chăn nuôi phân tích 20 mẫu trắng 20 mẫu củng cố nồng ñộ 0,2 ppb (ñúng nồng ñộ qui ñinh thông tư 57/2012/BNNPTNT) Kết cho thấy: ðối với mẫu thức ăn chăn nuôi giá trị lớn phân tích mẫu trắng 0,039 ppb, ñó giá trị bé phân tích mẫu củng cố clenbuterol nồng ñộ 0,2 0,87 ppb. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 Bảng 3.5. Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố ñể xác ñịnh khả phát (CCβ) phương pháp Kí hiệu mẫu Thức ăn chăn nuôi lợn Thịt lợn Mẫu trắng Mẫu củng cố Mẫu trắng Mẫu củng cố (0 ppb) (0,2 ppb) (0 ppb) (0,075 ppb) Mẫu 0,014 0,169 0,025 0,078 Mẫu 0,002 0,123 0,007 0,071 Mẫu 0,002 0,166 0,004 0,066 Mẫu 0,019 0,15 0,015 0,065 Mẫu 0,027 0,177 0,037 0,071 Mẫu 0,014 0,098 0,008 0,078 Mẫu 0,002 0,152 0,006 0,05 Mẫu 0,025 0,158 0,008 0,046 Mẫu 0,007 0,117 0,006 0,071 Mẫu 10 0,017 0,119 0,016 0,069 Mẫu 11 0,018 0,168 0,027 0,072 Mẫu 12 0,005 0,115 0,046 0,055 Mẫu 13 0,005 0,158 0,009 0,067 Mẫu 14 0,039 0,117 0,005 0,068 Mẫu 15 0,008 0,117 0,007 0,056 Mẫu16 0,007 0,087 0,029 0,053 Mẫu 17 0,008 0,115 0,018 0,056 Mẫu 18 0,034 0,119 0,022 0,066 Mẫu 19 0,016 0,17 0,007 0,06 Mẫu 20 0,009 0,095 0,035 0,073 Trung Bình 0,014 0,135 0,017 0,065 SD 0,011 0,029 0,013 0,009 CCβ ≤ 0,2 ppb Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 0,075 ppb Page 45 ðiều ñó có nghĩa giá trị “Cut-off” phương pháp phân tích Clenbuterol nằm khoảng từ 0,39 ñến 0,87 ppb ñó mẫu phân tích có kết giá trị “cut-off” (bé 5% theo qui ñịnh Ủy ban Châu Âu số 657/2002/EC), hay nói cách khác giá trị CCβ kít ELISA phân tích Clenbuterol thức ăn chăn nuôi có giá trị bé 0,2 ppb (Bảng 3.5 hình 3.3). Cut-off Hình 3.3. Kết xác ñịnh ñường Cut-off giá trị CCβ phương pháp phân tích clenbuterol thức ăn chăn nuôi ðối với mẫu thịt lợn giá trị lớn phân tích mẫu trắng 0,46 ppb ñúng giá trị bé phân tích mẫu củng cố clenbuterol nồng ñổ 0,075. ðiều ñó có nghĩa giá trị “Cut-off” phương pháp phân tích Clenbuterol nằm khoảng 0,46 ppb ñó có 1/20 (tương ñương 5%) mẫu củng cố nồng ñộ quan tâm nhỏ giá trị Cut-off ñáp ứng qui ñịnh Ủy ban Châu Âu số 657/2002/EC. Hay nói cách khác giá trị Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 CCβ kít ELISA phân tích Clenbuterol thịt lợn ñúng 0,075 ppb (Bảng 3.4 hình 3.4). Cut-off (0.046) Hình 3.4. Kết xác ñịnh ñường Cut-off giá trị CCβ phương pháp phân tích clenbuterol thịt lợn 3.2.4. Kết xác ñịnh ñộ ñặc hiệu, ñộ chọn lọc ñộ xác thực phương pháp Theo thiết kế, loại mẫu tiến hành phân tích 20 mẫu trắng (ñược xem mẫu âm tính thật) 20 mẫu trắng củng cố Clenbuterol nồng ñộ 0,2 ppb ñối với mẫu thức ăn 1ppb ñối với mẫu thịt (ñược xem dương tính thật), kết phân tích ñược tổng hợp bảng 3.6 (ñối với thức ăn chăn nuôi 3.7 ñối với thịt lợn. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Bảng 3.6. Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố clenbuterol nồng ñộ ppb ñối với mẫu thức ăn chăn nuôi lợn Mẫu thực dương tính (N+) Mẫu thực âm tính (N-) (mẫu củng cố, n=20) (mẫu trắng, n=20) Dương tính 19 Âm tính 20 Kết test Từ kết phân tích, tham số phương pháp ñã ñược tính toán theo công thức ñã ñược trình bày mục 2.3.4. ðối với mẫu thức ăn phương pháp có khả phát với ñộ xác thực 97,5%, ñộ ñặc hiệu 100%, ñộ nhạy 95%, ñộ lệch dương ñộ lệch âm 4,8% (bảng 3.8). Bảng 3.7. Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố clenbuterol nồng ñộ ppb ñối với mẫu thịt lợn Mẫu thực dương tính (N+) Mẫu thực âm tính (N-) (mẫu củng cố, n=20) (mẫu trắng, n=20) Dương tính 19 Âm tính 18 Kết test Trong ñó, tham số phương pháp mẫu thịt có khác so với mẫu thức ăn. Cụ thể, phương pháp có khả phát với ñộ xác thực 92,5%, ñộ ñặc hiệu 90%, ñộ nhạy 95%, ñộ lệch dương 9,5% ñộ lệch âm 5,3% (bảng 3.8). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Bảng 3.8. Kết ñánh giá tham số phương pháp nên mẫu khác (%) Tham số ñánh Mẫu thức ăn Mẫu thịt giá Qui ñịnh 657/2002/EC ðộ xác thực 97,5 92,5 ≥90 ðộ ñặc hiệu 100,0 90,0 ≥90 95,0 95,0 ≥90 9,5 ≤10 4,8 5,3 ≤10 ðộ nhạy ðộ lệch dương ðộ lệch âm ðối chiếu qui ñịnh Ủy ban Châu Âu, tham số phương pháp ñạt yêu cầu phương pháp phân tích bán ñịnh lượng ñối vơi chất tồn dư clenbuterol thức ăn chăn nuôi thịt lợn. 3.2.5. Thử nghiệm phân tích mẫu củng cố mẫu thực ñã khẳng ñịnh phương pháp sắc ký nồng ñộ khác 3.2.5.1. Thử nghiệm phân tích mẫu trắng ñược củng cố Clenbuterol nồng ñộ khác ðể ñánh giá khả phân tích mẫu, nghiên cứu ñã tiến hành phân tích mẫu thức ăn chăn nuôi thịt ñược củng cố mức nồng ñộ khác từ 0,15 ñến 1,0 ppb (Bảng 3.9). Kết phân tích cho thấy giải nồng ñộ củng cố từ 0,15 ñến 1,0 ppb Clenbuterol ñộ thu hồi giao ñộng từ 85,33 ñến 88,22% ñối với mẫu thức ăn chăn nuôi, cao cao so với mẫu thịt củng cố giải nồng ñộ. ðộ thu hồi ñối với mẫu thịt giao ñộng từ 80,27 ñến 87,33% (Bảng 3.9). Khi nghiên cứu khả ứng dụng phương pháp ELISA ñể phân tích Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi, ðoàn Thị Khang cs (2006) sử dụng kít ELISA hãng với nghiên cứu kết nghiên cứu cho thấy ñộ thu hồi ñạt từ 72,4 ñến 76,33% phân tích mẫu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 củng cố giải nồng ñộ từ ñến ppb. Như vậy, ñộ thu hồi, kết nghiên cứu cao so với kết nghiên cứu ðoàn Thị Khang cs (2006). Sở dĩ có khác biệt ñó kít hệ ñược cải thiện khác biệt giải nồng ñộ thử nghiên cứu phù hợp với khoảng tuyến tính ñường chuẩn. Bảng 3.9. Kết thử nghiệm phân tích mẫu củng cố nồng ñộ khác Nền mẫu Nồng ñộ củng cố (ppb) Kết phân tích (ppb) Mean SD ðộ thu hồi (%) Thức ăn chăn 0,15 0,132 0,011 88,22 nuôi 0,3 0,263 0,012 87,50 (n=4) 0,45 0,389 0,012 86,33 1,0 0,853 0,054 85,33 Thịt lợn 0,15 0,131 0,007 87,33 (n=4) 0,3 0,254 0,017 84,72 0,45 0,364 0,031 80,86 1,0 0,803 0,120 80,27 3.2.5.2. Thử nghiệm phân tích mẫu thực ñã ñược khẳng ñịnh nồng ñộ ðể phân tích khả phát phương pháp ELISA, nghiên cứu ñã sử dụng mẫu ñã ñược khẳng ñịnh phương pháp phân tích sắc ký Phòng thí nghiệm tham chiếu cung cấp, kết cho thấy ñối với mẫu Thức ăn chăn nuôi kết phân tích ELISA thấp so với nồng ñộ công bố từ 15,77 ñến 16,85%. Trong ñó mẫu thịt sai khác lớn giao ñộng từ 24,08 ñến 36,12%. Như thấy mẫu khác ảnh hưởng ñến kết phân tích. Nếu so sánh với kết ñánh giá ñộ thu hồi phân tích mẫu trắng củng cố kết phân tích tương ñối phù hợp thống ñối mẫu thức ăn. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Còn mẫu thịt lợn mẫu thực cho kết ñộ thu hồi thấp hơn. ðiều mẫu thức ăn củng cố có chất tương tự với mẫu thức ăn có trộn Clenbuterol. Còn mẫu thịt lợn thực nhiễm Clenbuterol có chất khác với việc củng cố, việc tách chiết Clenbuterol khỏi mẫu thịt khó khăn so với mẫu củng cố. So với kết ðoàn Thị Khang cs (2006) khác biệt kết hai phương pháp phân tích ELISA phương pháp GC/MS thí khác biết rõ gần 50% (ELISA cho kết 3,074 ppb, phương pháp GC/MS cho kết 5,978 ppb). Sở dĩ có sai khác ñó phân tích khẳng ñịnh nghiên cứu LC/MS nghiên cứu ðoàn Thị Khang cs (2006) lại GS/MS. Ngoài kít ELISA có khác biệt hệ, kít sử dụng nghiên cứu sản xuất vào năm 2011 nghiên cứu ðoàn Thị Khang cs (2006) sử dụng Kít sản xuất vào năm 2005. Bảng 3.10. Kết thử nghiệm phân tích mẫu thực nồng ñộ khác Loại mẫu Thức ăn chăn nuôi Thịt lợn Kí hiệu TACN_Clen_1 TACN_Clen_2 TACN_Clen_3 Pork_Clen_1 Pork_Clen_2 Pork_Clen_3 Nồng ñộ Nồng ñộ Sự sai khẳng ñịnh phân tích khác so với LC/MS ELISA công bố (ppb) (ppb) (%) 3,68 15,46 30,56 2,27 17,83 24,58 3,06 11,98 25,74 1,45 12,53 18,66 - 16,85 - 22,51 - 15,77 - 36,12 - 29,73 - 24,08 Như vậy, kết luận phương pháp ELISA có giá trị sử dụng ñể sàng lọc, khả ñịnh lượng xác. Nên phân tích cho kết dương tính với Clenbuterol cần khẳng ñịnh ñịnh lượng lại xác phương pháp sắc ký khối phổ trước công bố kết quả. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 4.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi thuốc thú y tỉnh thuộc ñịa bàn Vùng ðồng sông Hồng Thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y ñịa bàn ñiều tra ña dạnh chủng loại mẫu mã. Sản phẩm cung cấp cho người chăn nuôi theo hai hình thức, gián tiếp thông qua hệ thống ñại lý cập 1, cấp hệ thống bán lẻ trực tiếp từ công ty sản xuất ñến người chăn nuôi. ðiều kiện kinh doanh ñối với thức ăn chăn nuôi khắt khe so với thuốc thú y tỷ lệ hộ kinh doanh không ñạt yêu cấu theo qui ñịnh cao. ðặc biệt hệ thống bán lẻ có 50% không ñạt yêu cầu ñịa ñiểm kinh doanh ñiều kiện bày bán bảo quản. Trong ñó, thuốc thú y qui ñịnh ñiều kiện kinh doanh chặt chẽ tỷ lệ hộ kinh doanh không ñạt yêu cầu cao, chủ yếu ñại lý cấp ñặc biệt hệ thống bán lẻ ñại ña số không ñạt yêu cầu ñịa ñiểm, vệ sinh cấp người bán. Ngoài kênh phân phối thông thường số sản phẩm ñược ñưa vào chăn nuôi thông qua thị trường chợ ñen nguồn từ thuốc dùng cho nhân y. Mặc dù qui ñịnh, văn pháp lý tương ñối hoàn thiện, chức nghiệm vụ quan quản lý rõ ràng thực tế công tác tra, quản lý sở nhiều hạn chế. ðại ña số thực kiểm tra hành chưa có nhiều hoạt ñộng kiểm tra kỹ thuật yêu cầu thực tế. 4.1.2. Khả phát Clenbuterol phương pháp ELISA Kết khảo sát khả phân tích Clenbuterol thức ăn chăn nuôi thịt lợn Kit ELISA sử dụng nghiên cứu cho thấy ngưỡng phát hiện, khả phát hiện, ñộ ñặc hiệu, ñộ chọn lọc ñộ xác thực hoàn toàn ñáp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 ứng tiêu chí phương pháp sàng lọc theo qui ñịnh Quyết ñịnh 2002/657/EC ñiều kiện Thông tư 57/2002. Kết phân tích mẫu thực ñã ñược khẳng ñịnh phương pháp sắc ký khối phổ cho thấy phương pháp ELISA có giá trị sàng lọc, ñịnh tính. Kết phân tích ñược công bố thức mẫu nghi ngờ sau phân tích ELISA ñã ñược khẳng ñịnh lại phương pháp khẳng ñịnh ñịnh lượng xác. 4.2. ðề nghị - ðề nghị tăng cường quản lý sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y, ñặc biệt chất cấm từ nguồn cung cấp. - Tiếp tục nghiên cứu ñánh giá liên phòng thí nghiệm ñể xem xét khả ứng dụng phương pháp ELISA khiểm soát tồn dư hormone Clenbuterol nói riêng hormone nói chung trước ứng dụng phân tích sàng lọc mẫu vào thực tế. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2002). Quyết ñịnh số 54/2002 Qð-BNN ngày 20 tháng 06 năm 2002 việc cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông sử dụng số loại kháng sinh hóa chất sản xuát kinh doanh thức ăn chăn nuôi. 2. Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn (2008). Quyết ñịnh số 3762 /Qð – BNN – CN ngày 28/11/2008 việc quản lý chất MELAMINE chăn nuôi nuôi nuôi trồng thủy sản. 3. Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn (2011). Thông tư 66/2011/TTBNNPTNT quy ñịnh chi tiết số ñiều Nghị ñịnh số 08/2010/Nð-CP ngày 05/02/2010 Chính phủ quản lý thức ăn chăn nuôi 4. Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2012). Thông tư số 57/2012/TTBNNPTNT ngày 07 tháng 11 năm 2012 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn quy ñịnh việc kiểm tra, giám sát chất thuộc nhóm Betaagonist chăn nuôi. 5. Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2014). Thông tư 28/2014/TTBNNPTNT ngày 4/9/2014 ban hành danh mục hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh sử dụng thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Việt Nam 6. Bùi Quốc Anh (2009). “bộ kit phát nhanh chất clenbuterol thịt gia súc gia cầm thời gian giờ” . Công ty Inotech – Thành phố Hồ Chí Minh. 7. Bùi Thị Phương Hòa (2008), Thực trạng công tác vệ sinh an toàn thực phẩm ngành chăn nuôi thú y giải pháp khắc phục, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XV, số 2-2008, tr. 293-299 8. ðoàn Thị Khang, Phan Thanh ðạm, Dương Thị Thu Anh ðào ðức Hảo (2008). Ứng dụng kỹ thuật ELISA ñể xác ñịnh Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi số 13, tháng 8/2008. 9. Dương Thanh Liêm, Bùi Như Phúc Dương Duy ðồng (2002). Thức ăn dinh dưỡng vật nuôi, NXB ðại học Nông Lâm, TP. HCM, tr 146-179. 10. Lã Văn Kính(2010), Tác hại hocmone kích thích tăng trưởng họ betaagonists ñối với sức khỏe chúng ta. 11. Lê Quốc Thịnh (2012), Hiểu thêm thuốc bị cấm chăn nuôi, Truy cập ngày 20/1/2013 từ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 http://suckhoedoisong.vn/201232192119243p44c116/hieu-them-ve-thuocbi-cam-trong-chan nuoi.htm 12. Lê Tấn Lam Anh (2012). Kinh hoàng thịt lợn tạo nạc Clenbuterol, Truy cập ngày 13/12/2012 từ http://vnexpress.net/gl/ban-docviet/2012/03/kinh-hoang-thit-lon-tao-nac-bang-clenbuterol/ 13. Lê Thanh Hà (2006), Dùng clenbuterol ñể tăng trọng heo, bò, gà: Thịt chín, thuốc còn, Truy cập ngày 22/4/2013 từ http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=2755 14. Nghị ñịnh Phủ (2010). Nghị ñịnh 08/2010/Nð-CP ngày 05/02/2010 quản lý thức ăn chăn nuôi. 15. Ngọc Lê (2012). ðã kiểm soát ñược chất tạo nạc, Truy cập ngày 22/3/2013 từ http://vietbao.vn/Kinh-te/Da-kiem-soat-duoc-chat-tao-nac/55447631/88/ 16. Nguyễn Tâm (2012). Ba tỉnh phát có mẫu thịt chứa chất tạo nạc, Truy cập ngày 20/3/2013 từ http://vtc.vn/321-328138/suc-khoe/ba-tinh-phathien-co-mau-thit-chua-chat-tao-nac.htm 17. Nguyễn Thị Chân cộng (2010) “ Xác ñịnh Clenbuterol thịt heo phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS). 18. Phạm Kim ðăng, Guy DEGAND, Phạm Hồng Ngân, Guy MAGHUINROGISTER, Marie-Louise SCIPPO (2008): Ứng dụng phương pháp ELISA ñể phân tích tồn dư tồn dư quinlone tôm số tỉnh phía bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học Phát triển 2008: Tập VI, Số 3:; 261-267. 19. Phạm Nho Huỳnh Hồng Quang (2012). β-agonist: Ứng dụng nguy ảnh hưởng ñến sức khỏe người, Truy cập ngày 22/3/2013 từ http://www.impe-qn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1092&ID=5756 20. Phạm Thị Kiều Nga (2008). Bước ñầu khảo sát dư lượng Dexamethasone Clenbuterol thịt bò, heo gà TP.HCM, Luận văn, ðại học Nông lâm TP.HCM . 21. Phòng thức ăn chăn nuôi- Cục chăn nuôi (2014). Tình hình quản lý, sử dụng kháng sinh chất cấm thức ăn chăn nuôi. Hội thảo quản lý chất lượng thức ăn chăn nuôi. Do Cục chăn nuôi – Bộ NN&PTNT tổ chức ngày 18/12/2014 Hà Nội. 22. Ủy ban Thường vụ Quốc hội số 8/2004/PL-UBTVQH11 ban hành ngày 29/4/2004. 23. VTC News (2012). Hà Nội: Phát thịt lợn nhiễm chất tạo nạc, Truy cập ngày 10/1/2013 từ http://vtc.vn/649-331252/suc-khoe/an-toan-thucpham/ha-noi-phat-hien-thit-lon-nhiem-chat-tao-nac.htm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 24. Vương Xuân (2012). Nhiều mẫu thịt lợn TP HCM nhiễm chất ñộc, Truy cập ngày 20/12/2012 từ http://giadinh.vnexpress.net/tin-tuc/to-am/nhieumau-thit-lon-tp-hcm-nhiem-chat-doc-2278188.html Tài liệu tiếng nước 25. Beermann, D. H. (1984). β-adrenergic agonists and growth. In M. P. Shreibman, C. G. Scanes and P. K. T. Pang. The Endocrinology of Growth, Development and Metabolism in Vertebrates: 345-366. 26. EC (1990). Official Journal of the European Communities L224, of 18 August 1990, Council Regulation 2377/90/EC; consolidated version of the Annexes to IV updated up to 22.12.2004 obtained from www.emea.eu.int.) 27. EC (2002) Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC establishes criteria and procedures for the validation of analytical methods to ensure the quality and comparability of analytical results generated by official labolatories 28. EC (2003) Commission Decision 2003/181/CE, 13 March 2003. Official Journal of the European Communities., L71, pp. 17–18. 29. EU (1996)Council Directive 96/23/EC on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and repealing directives 85/358/eec and 86/469/eec and decisions 89/187/eec and 1/664/eec. 30. EU (2002): EU regulation, European commission decision 2002/657/EC. 31. EU (2010) Commision regulation No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin. Off. J. Eur. Communities., 2010, L15, 1-72. 32. G. Van Vyncht, S. Preece, P. Gaspar, G.Maghuin-Rogister and E. Depauw (1996). Gas and liquid chromatography coupledto tandem mass spectrometry for the multiresidue analysis of β-agonist in biological matrices, Journal of chromatography A: 43 -49. 33. Gianfranco Brambilla,Maurizio Fiori,Barbara Rizzo,Vittorio Crescenzi, and Giancarlo Masci (2001), Use of molecularly imprinted polymers in the solid-phase extraction of clenbuterol from animal feeds and biological matrices, Journal of Chromatography B 759, pp 27–32 34. Guy Degand and Anne Bernes-Duyckaerts (1993). Determination of pagonists in urine by an enzyme immunoassay based on the use of an anti-salbutamol antiserum, Analytica Chimica Acta, 275: pp.241-247. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 35. Maltin cs.; 1987. CLENBUTEROL, a Beta Agonist, induces Growth in Innervated and denevated rat Soleus Muscle via Apparently Different Mechanisms. 36. Michael and O'Keefe (1999). Methods for veterinary drug residue analysis in food, The National Food Centre, Dunsinea, Castleknock, Dublin 15: – 25. 37. Peter Batjoens, Dirk Courtheyn, Hubert F. De Brabander, Jan Vercam men, Katia. De Wasch and Maureen Logghe (1996). Gas chromatography _ tandem mass spectrometry analysis of clenbuterol residue in faeces, Journal of chromatography A: 133 -139. 38. Taylor and Francis Issue (2005). Food Additives & Contaminants, Publisher, 22(6): 563 – 566 39. RF Witkamp, M Wang, RJAN Lamers, HAAJ Korthout, JHJ van Nesselrooij(1996) . Toxicology and applied pharmacology, 137(2), pp.237244. 40. Woodward, KN.(2000) regulation of veterinaty drugs, In: General and Applied Toxicology( eds B, Ballantyne, T. Marrs and T.Syversen), 2nd edn, pp.1633-1652. 41. Warriss, P.D.(1990) the handling of cattle pre-slaughter and effects on carcass meat quality, applied animal Behaviour sciene 28, Pp.171-186 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 PHỤ LỤC Ảnh 1. Clenbuterol ELISA Test Kit Ảnh 2. Hệ thống bay mẫu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 Ảnh 3. Chuyên gia hướng dẫn sử dụng trước lúc thử nghiệm Ảnh 4. Máy ñọc ELISA sử dụng nghiên cứu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 [...]... beta-agonists núi chung v Clenbuterol núi riờng v n ủ c s d ng trong thỳ y nhng theo qui ủ nh ch ủ c phộp dựng Clenbuterol ủ tr b nh cho cỏc lo i ủ ng v t khụng ph c v cung c p th c ph m cho con ng i nh chú, mốo, ủ ng v t c nh, ng a Trong thỳ y, v i tỏc d ng lm gión c ủ ng hụ h p, Clenbuterol ủ c s d ng r ng rói trong ủi u tr cỏc d ng hụ h p ng a, chú, mốo M v Canada, clenbuterol ch ủ c s d ng trong thỳ y ủ tr... Khang va cs (2008) ng d ng k thu t ELISA ủ xỏc ủ nh Clenbuterol v Salbutamol trong th c n chn nuụi - Ph m Kim ng v cs (2008): ng d ng phng phỏp ELISA ủ phõn tớch t n d t n d quinlone trong tụm t i m t s t nh phớa b c Vi t Nam - Nm 2009, Bựi Qu c Anh (cụng ty Inotech Thnh ph H chớ Minh) nghiờn c u ủ ti b kit phỏt hi n nhanh ch t clenbuterol trong th t gia sỳc gia c m trong th i gian 2 gi Tuy nhiờn,... t, khi s d ng cỏc h p ch t ny trong chn nuụi r t d gõy t n d trong s n ph m chn nuụi, nh h ng khụng t t ủ n s c kh e ng i tiờu dựng Theo cụng b c a m t nghiờn c u Anh, Clenbuterol l ch t b n v i nhi t, h u nh khụng b bi n ủ i, m t ủi trong khi n u nhi t ủ sụi, ch b phỏ h y Chớnh vỡ th , nm 1996 2600C trong kho ng 5 phỳt y ban Chõu u ủó chớnh th c c m s d ng Clenbuterol trong chn nuụi t i cỏc n c thnh... bỏch Khụng ch ủ m b o qui ủ nh trong thụng t 57/2012/BNNPTNT c a B NN&PTNT m cũn ph c v cho s phỏt tri n chn nuụi b n v ng, b o v s c kh e ng i tiờu dựng trong n c Tr c yờu c u ủú, nghiờn c u ti n hnh ỏnh giỏ kh nng ng d ng c a phng phỏp ELISA ủ phỏt hi n Clenbuterol cú trong th t v th c n chn nuụi l n M c ủớch ủ ti: - ỏnh giỏ tỡnh hỡnh kinh doanh húa ch t v thu c thỳ y dựng trong chn nuụi thỳ y t i m... ch t trong s n xu t kinh doanh th c n chn nuụi trong ủú cú cỏc ch t thu c nhúm Beta-Agonist Tuy nhiờn, trong th c t chn nuụi vỡ ch y theo l i nhu n ng i chn nuụi v n s d ng b t h p phỏp Clenbuterol ủ kớch thớch tng tr ng v tng t l n c cho gia sỳc l y th t (Bựi Th Phng Hũa, 2008) Chớnh vỡ v y, t khi cú qui ủ nh c m ủ n nay, v n liờn t c cú nh ng c nh bỏo v s d ng b t h p phỏp v t n d Clenbuterol trong. .. nh qu n lý c bi t, trong chi n d ch tng c ng ki m tra Clenbuterol do C c Chn nuụi t ch c, Vi n KHKTNN Mi n Nam H c vi n Nụng nghi p Vi t Nam Lu n vn Th c s Khoa h c Nụng nghi p Page 1 cụng b 6,3% s m u th t ủ c xột nghi m ch a Clenbuterol Trong khi ủú, khi ki m tra cỏc m u nghi ng , Chi c c Thỳ Y TP HCM phỏt hi n 16% m u th t dng tớnh v i Clenbuterol G n ủõy, k t qu ki m tra trong 3 thỏng ủ u nm... i ủỏnh giỏ l i cỏc phng phỏp ủang ủ c ỏp d ng, trong ủú cú phng phỏp EILSA Xu t phỏt t th c t ủú vi c ủỏnh giỏ th c tr ng s d ng thu c v húa ch t trong chn nuụi v tri n khai ủỏnh giỏ cỏc phng phỏp cú ủ chớnh xỏc, ủ nh y, ủ ủ c hi u cao nh phng phỏp húa mi n d ch enzyme (ELISA) ủ ki m soỏt tỡnh tr ng t n d thu c thỳ y núi chung v Clenbuterol núi riờng trong H c vi n Nụng nghi p Vi t Nam Lu n vn Th... Issue, 2005) T i Chõu , v ng ủ c liờn quan ủ n Clenbuterol liờn t c x y ra nghiờm tr ng t i Trung Qu c M c dự Clenbuterol cng ủó b c m s d ng trong chn nuụi gia sỳc nhng v n cú hng nghỡn ng i dõn ủó b ng ủ c do n th t l n cú t n d Clenbuterol T p chớ chn nuụi Trung Qu c k 3, quy n 40 nm 2004 ủó thụng tin v ch ph m "Shoự roự Jing" cú tỏc d ng tng t l n c ch a Clenbuterol Thỏng 5-1998 cú 17 ng i Hong Kong... mi ng khụ ủ c nghi l do n th t l n ch a Clenbuterol Trung tõm kh ng ch v d phũng Tri t Giang ủó l y m u th t ti n hnh ki m tra, phõn tớch v phỏt hi n"Shoự roự Jing" ch a hm l ng Clenbuterol trong cỏc m u t 80 - 1020 g/kg Thỏng 9/2006, 336 ng i Th ng Hói b ng ủ c do n th t l n ch a ch t Clenbuterol Thỏng 2/2009, trờn 70 ng i Qu ng ụng b ng ủ c khi n lũng l n cú Clenbuterol H c vi n Nụng nghi p Vi t Nam... Beta-agonist trong chn nuụi, m t trong cỏc n i dung quan tr ng nh t c a phng phỏp ny liờn quan ủ n qui trỡnh phõn tớch, phng phỏp th nhanh v ELISA mu n ủ c cụng nh n k t qu ph i cú gi i h n phỏt hi n nh hn 0,2 ppb (B NN&PTNT, 2012) K t ủú nhi u phũng thớ nghi m ủó ủ c trang b h th ng ELISA, nhi u l p t p hu n v ký thu t phõn tớch nhng vi c s d ng ủ phõn tớch, ủ c bi t phõn tớch cỏc ch t c m nh Clenbuterol . về thức ăn chăn nuôi, hóa chất và thuốc thú y 38 3.2. ðánh giá khả năng phân tích Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và thịt lợn bằng phương pháp ELISA 39 3.2.1. Thăm dò tính ổn ñịnh của phương. ñánh giá khả năng phân tích phát hiện Clenbuterol trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp ñiều tra 26 2.4.2. Phương pháp. **** NGUYỄN ðĂNG THẾ HƯNG ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA ðỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL TRONG THỊT VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI LỢN Chuyên ngành : CHĂN NUÔI Mã số : 60.62.01.05