1 Chương 1 Tổ chức hệ gen người và kỹ thuật di truyền tế bào người Nội dung  Tổ chức hệ gen người  Nhiễm sắc thể người – Nguyên phân, giảm phân và chu trình tế bào  Các phương pháp di truyền tế bào người  Các bất thường nhiễm sắc thể ở người Readings: Ch.9: 9.1, 9.3 Ch.2: 2.1, 2.3 - 2.5 1.1. Tổ chức hệ gen người  Kích thước: 3x10 9 bp  Hệ gen nhân: ~30,000 gen  Hệ gen ty thể: ~37 gen Tổ chức hệ gen người  Các trình tự bảo thủ cao:  1.5%: ADN mang mã  các trình tự mã hóa mRNA (các gen được dịch mã): 90-95%  các gen mã hóa tARN, rARN  3%: các trình tự điều hòa và các trình tự không được dịch mã khác  ADN không mang mã: >95% hệ gen  ADN lặp lại không mã hóa: >50% hệ gen  các trình tự lặp vận động:đoạn lặp kế tiếp hoặc rải rác  vùng dị nhiễm sắc  các trình tự khác Hệ gen nhân Tổ chức hệ gen người Hệ gen nhân  Trình tự mã hóa:  được sắp xếp trong các họ gen, kế tiếp hoặc phân tán  tạo thành bởi sự nhân lặp gen   các gen giả và các đoạn gen (~ 20 000 gen giả ở hệ gen người) Hệ gen ty thể 2 Hệ gen ty thể  16.6 kb  ADN sợi kép: các sợi nặng (H) giàu G và sợi nhẹ (L) giàu C  Một số phần có cấu trúc ADN sợi ba (7S DNA – D loop)  có hàng ngàn bản sao trong tế bào, khác nhau tùy thuộc loại tế bào  93%: là trình tự mã hóa Hệ gen ty thể  gồm 37 gen không chứa intron  28 gen với sợi nặng là sợi có nghĩa  9 gen với sợi nhẹ là sợi có nghĩa  24 gen là các gen mã hóa RNA (22 gen mã hóa mt tRNA, 2 gen mã hóa mt rRNA: 23S và 16S)  13 gen mã hóa 13 chuỗi polypeptide cấu tạo nên các phức hợp hô hấp tế bào Hệ gen người  Số lượng: 30 000 – 35 000 gen  ~1400 gen/nhiễm sắc thể  Phân bố gen trong hệ gen :  chất dị nhiễm sắc cơ định: không mang  chất đồng nhiễm sắc: chứa gen, mật độ khác nhau tùy thuộc vùng nhiễm sắc thể và tùy nhiễm sắc thể mật độ gen cao ở vùng gần đầu mút (các băng G) nhiễm sắc thể 19, 22 (giàu GC) chứa nhiều gen, nhiễm sắc thể X, 18 ít gen Tổ chức, phân bố và chức năng của các gen mã hóa protein Gen người khác nhau về kích thước và tổ chức bên trong. Con số % chỉ độ dài exon Tổ chức, phân bố và chức năng của các gen mã hóa protein  Các gen giống nhau về chức năng: rất ít, tạo thành từ nhân lặp gen  tập hợp thành cụm, trên một nhiễm sắc thể: gen -globin  trên các nhiễm sắc thể khác nhau: các gen histone, ubiquitin  Các gen tương tự nhau về chức năng Functionally similar genes: các họ  liên quan gần nhưng không giống nhau  nằm thành cụm do nhân lặp gen kế tiếp hoặc nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau. VD: các gen -globin và -globin  Các gen liên quan nhau về chức năng:  không liên quan gần nhau về trình tự nhưng liên quan về chức năng  mã hóa các tiểu đơn vị của cùng protein hoặc các thành phần của một con đường trao đổi chất  không nằm thành cụm, thường trên các nst khác nhau Các gen trùm nhau, gen trong gen và các đơn vị phiên mã polycistronic cũng có thể được thấy ở hệ gen người Sự sắp xếp gen theo hai hướng (các gen sửa chữa DNA) và các gen trùm nhau một phần (Các gen ở vùng nhóm III của phức HLA trên nst 6p21.3). Intron 26 của gen neurofibromatosis type 1 – NFI chứa 3 gen bên trong có 2 exon, mỗi gen phiên mã từ một sợi đối diện với sợi để sợi kia được sử dụng để phiên mã gen NF1. 3 1.2. Nhiễm sắc thể người và sự phân bào  Bộ nhiễm sắc thể người: 2n = 46  Hàm lượng ADN = 3.5 pg  24 phân tử ADN sợi kép khác nhau trong 24 nhiễm sắc thể khác nau (22 nst thường, X và Y)  được xếp thành nhóm theo kích thước và vị trí tâm động.  Vùng đồng nhiễm sắc (3000 Mb)  Vùng dị nhiễm sắc cơ định (3200 Mb)  Vùng dị nhiễm sắc không bắt buộc 02_03.jpg The functional elements of a yeast chromosome Sự phân bào 02_02.jpg 4 02_07.jpg 02_08.jpg Sự phân chia của các tế bào HeLa. ADN được nhuộm với DAPI, vi ống được nhuộm với kháng thể -tubulin. 02_09.jpg Sự hình thành giao tử ở người 02_10.jpg Giảm phân: sự phân ly độc lập của các nst tương đồng bắt nguồn từ bố và từ mẹ ở giảm phân I tạo ra sự đa dạng di truyền n=23  2 23 kiểu tổ hợp các nst nguồn bố và nguồn mẹ khác nhau ở tế bào lưỡng bội 1.3. Các phương pháp nghiên cứu di truyền tế bào người  Các nhiễm sắc thể có thể được quan sát ở tế bào đang phân chia  Nghiên cứu nhiễm sắc thể người:  Nguyên phân: Thu tế bào chưa phân chia, nuôi trong phòng thí nghiệm: tế bào máu, sợi cơ  Giảm phân: nghiên cứu ở mẫu tinh hoàn hoặc buồng trứng (khó khăn hơn)  Phân tích giảm phân được sử dụng để nghiên cứu vô sinh nam Các kỹ thuật nghiên cứu di truyền tế bào học người  Nghiên cứu nhiễm sắc thể trong sự phân bào Nhiễm sắc thể trong nguyên phân, giảm phân Nhuộm băng nhiễm sắc thể  Di truyền tế bào phân tử: kỹ thuật FISH nhiễm sắc thể  Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang nhiễm sắc thể (chromosome painting) 5 Nghiên cứu nhiễm sắc thể người  Sử dụng các kỹ thuật di truyền tế bào học  Làm tiêu bản nhiễm sắc thể  Nhuộm băng nhiễm sắc thể  Các kỹ thuật phân tử: lập bản đồ gen, ADN tái tổ hợp  Xác định số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào người  Những năm 1950: hai kỹ thuật nổi bật: Sử dụng phytohemagglutinin (PHA) từ thực vật để kích thích bạch cầu phân bào Sử dụng dung dịch hypotonic làm tế bào hút nước, trương lên  nhiễm sắc thể phân tách và dễ quan sát. Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể  Các thuốc nhuộm:  aceto-orcein: nhuộm trực tiếp  phân biệt theo kích thước và vị trí tâm động  chia nhóm nst người từ A đến G  quinicrine mustard (QM) và quinacrine nhuộm chính xác nst  quan sát nhiễm sắc thể với kính hiển vi huỳnh quang  băng huỳnh quang sáng, tối (Q-band)  Kỹ thuật nhuộm băng nhiễm sắc thể:  Sử dụng các thuốc nhuộm khác nhau  thu được các băng khác nhau  Ứng dụng: xác định thay đổi cấu trúc nst Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể  Các kỹ thuật tiên tiến: phát hiện được những biến đổi nhỏ về cấu trúc nhiễm sắc thể  dựa vào trình tự ADN đã biết (mẫu dò)  lai ADN tại chỗ Xác định kiểu nhân (Karyotype) và nhuộm băng nhiễm sắc thể  Kiểu nhân (Karyotype): toàn bộ số lượng nhiễm sắc thể trong nhân tế bào được biểu diễn theo thứ tự  kiểu nhân bình thường ở người nam: 46, XY; người nữ: 46,XX  Nhuộm băng nhiễm sắc thể: xác định mỗi nhiễm sắc thể và các biến đổi cấu trúc (nếu có): đứt gãy chuyển đoạn, mất đoạn  có thể phân giải khoảng 400, 550 hoặc 850 băng ở nhiễm sắc thể người (bands, sub-bands hoặc sub-sub-bands) Nhiễm sắc thể đồ tế bào người nam bình thường Xác định kiểu nhân (Karyotype) và nhuộm băng nhiễm sắc thể  Nhiễm sắc thể đồ (Karyogram): hiển thị bộ nhiễm sắc thể bằng cách cắt ảnh các nhiễm sắc thể tương đồng, trải theo thứ tự sử dụng chương trình phân tích ảnh bằng máy tính.  Nhuộm băng nhiễm sắc thể:  Băng G: nhiễm sắc thể được xử lý với tripsin trước khi nhuộm với Giemsa (thuốc nhuộm DNA) Các băng G: băng tối, băng sáng là băng G âm tính.  Băng Q: sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang bám ADN giàu AT (Quinacrine, DAPI), quan sát bằng UV.  Băng R  Băng T  Băng C  Băng M (nhuộm băng nhiều màu): quan sát đột biến nst. 6 Nghiên cứu hình thái nhiễm sắc thể  Quan sát bộ nhiễm sắc thể dễ dàng nhất ở tiền kỳ giữa hoặc ở kỳ giữa nguyên phân  Dạng điển hình: nhiễm sắc thể với hai cánh (ngắn và dài), phân cách nhau bởi tâm động (eo sơ cấp)  Mỗi nhiễm sắc thể đặc trưng bởi độ dài và vị trí tâm động  Các dạng nhiễm sắc thể:  NST tâm rất cân (metacentric)  NST tâm gần cân (submetacentric)  NST tâm lệch (very submetacentric)  NST tâm đầu (acrocentric)  NST tâm mút (telocentric) Hình thái học nhiễm sắc thể và thuật ngữ Đột biến khuếch đại gen từ tế bào ở người bệnh ung thư tuyến tiền liệt. http://www.odec.ca/projects/2005/anna5m0/public_html/cancer.htm Di truyền tế bào phân tử: FISH  FISH (fluorescence in-situ hybridization): lai mẫu dò ADN đánh dấu với ADN nst đã biến tính trên tiêu bản hiển vi tế bào phân chia ở kỳ giữa nguyên phân.  Quan sát bằng kín hiển vi huỳnh quang. 02_16.jpg Cơ sở của kỹ thuật FISH và tô màu nhiễm sắc thể 7 Kỹ thuật tô màu nhiễm sắc thể (Chromosome painting)  Lai nhiều dòng ADN đánh dấu với các màu khác huỳnh quang khác nhau bắt nguồn từ nhiều locus khác nhau dọc theo khắp nhiễm sắc thể  tạo nên nhiễm sắc thể nhuộm màu huỳnh quang khác nhau.  Ứng dụng để xác định các tái sắp xếp mới, các nhiễm sắc thể chỉ thị ứng dụng trong lâm sàng và di truyền tế bào ung thư.  Nhược điểm: bị hạn chế bới số lượng ít các thuốc nhuộm huỳnh quang có màu khác nhau  khó phân biệt các nhiễm sắc thể khác nhau. Lai hệ gen so sánh (CGH)  CGH là kỹ thuật mở rộng của kỹ thuật tô màu nhiễm sắc thể  Nhuộm màu nhiễm sắc thể với hai màu khác nhau sử dụng mẫu dò là ADN tổng số từ 2 nguồn khác nhau.   thể hiện sự khác biệt do mất hoặc thêm đoạn hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể. 1.4 Các bất thường nhiễm sắc thể ở người  Các đột biến dòng mầm: có mặt ở tất cả các tế bào của cơ thể  Đột biến soma  Các dạng bất thường nhiễm sắc thể  Bất thường số lượng Polyploidy (đa bội): ít khi sống sót Triploidy (Tam bội) Tetraploidy (tứ bội): một số tế bào đa bội ở người bình thường: tế bào gan, cơ tim Lệch bội (Aneuploidy) Mixoploidy  Bất thường cấu trúc Danh pháp bất thường nhiễm sắc thể người 02_19.jpg 8 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể  Lệch bội  Thể ba nhiễm (Trisomy): e.g. 47,XX, +21; 47,XY, +21 (Down syndrome)  Monosomy: e.g. 45,X (Turner syndrome)  Cơ chế: không phân ly ở kỳ sau GFI hoặc GFII sự chậm kỳ sau: trì hoãn phân ly nst ở kỳ sau giảm phân  mất nst ở tế bào con. Bất thường số lượng nhiễm sắc thể  Mixoploidy  một cá thể mang hai hoặc nhiều dòng tế bào khác nhau về mặt di truyền  tạo thành từ cùng một hợp tử (mosaicism) hoặc từ các hợp tử khác nhau (chimerism)  Thể khảm lệch bội: từ bất thường của một trong các lần nguyên phân ở giai đoạn phôi sớm  Thể khảm đa bội (2n/3n mosaics): tạo thành từ dung hợp thể cực với một trong các nhân của hợp tử 2n bìn thường. 04_10.jpg Hậu quả lâm sàng của các bất thường nhiễm sắc thể  Tạo nên sự mất cân bằng về mức độ sản phẩm gen  Hội chứng Down: trisomy (47, XX,+21)  Thể một nhiễm sắc thể thường có hậu quả nghiêm trọng hơn các thể ba nhiễm  thời gian sống lâu hơn  Bất thường nhiễm sắc thể giới tính có ít tác động nghiêm trọng so với các bất thường nhiễm sắc thể thường.  Thể một nhiễm sắc thể thường thường gây chết ở giai đoạn phôi sớm. Bất thường cấu trúc  Đứt gãy nhiễm sắc thể  ở pha G2 :  một trong 2 chromatide bị ảnh hưởng  ở pha G1:  cả hai chromatid bị ảnh hưởng  nst không tâm: thiếu tâm động  Nst hai tâm:  Hậu quả của các đứt gãy nhiễm sắc thể  Mất đoạn tận cùng  Mất đoạn trong  Đảo đoạn (Inversion)  Lặp đoạn hoặc mất đoạn do trao đổi không cân các chromatide chị em 11_07.jpg 9 02_20.jpg Bất thường cấu trúc  Chuyển đoạn (2 đứt gãy): tái tổ hợp giữa các nst không tương đồng  Chuyển đoạn tương hỗ (Reciprocal translocation)  Chuyển đoạn Robertson  Lặp đoạn hoặc mất đoạn do tái tổ hợp không cân (Fig. 11-7) 02_21.jpg 02_22.jpg 02_23.jpg 10 Hậu quả của đột biến cấu trúc  Mất cân bằng nếu không trở lại trạng thái ban đầu về hàm lượng vật chất di truyền  cân bằng  không có ảnh hưởng về kiểu hình. Có ảnh hưởng, nếu:  phá vỡ gen quan trọng  ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen  chuyển đoạn cân bằng giữa nst X và nst thường có thể ảnh hưởng tới sự bất hoạt nst X.