Đang tải... (xem toàn văn)
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD
i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ____________________ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2009 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _____________________ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS Chuyên ngành : Hoá phân tích Mã số : 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT Hà Nội - Năm 2009 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM với sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Hùng Việt. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng Việt đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Dương Hồng Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứ u. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè và đồng nghiệp đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, cùng các thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm luận văn. Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Học viên Đ Đ i i n n h h Đ Đ ă ă n n g g H H u u y y i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 - TỔNG QUAN .4 1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ .4 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản 6 1.3. Đại cương về axít domoic (DA) 8 1.3.1. Tính chất hóa lý. .8 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: 8 1.3.3. Độc tính của DA .9 1.4. Một số phương pháp phân tích DA .9 1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột 10 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS) 11 1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA . 12 1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột 12 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng 12 1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] 12 1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản .13 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) 15 1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng 23 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột 23 1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký .26 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: 27 1.7.2. Chiết pha rắn SPE: 27 Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài .29 2.2. Mô hình thực nghiệm 29 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: .29 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: 29 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: .30 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu: .30 2.5. Xác định các thông số tối ưu: 31 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS .31 2.5.2. Cột: 31 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: 32 2.5.4. Dung môi chiết: .32 2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: 32 2.5.6. Tính toán : .33 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: .33 2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .33 2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: .34 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp: 34 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể 35 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1. Xác định các thông số tối ưu: 36 3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS 36 ii 3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. .40 3.1.3. Dung môi chiết: .45 3.2. Khoảng tuyến tính: 47 3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .49 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .49 3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể 51 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: 52 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. 54 3.7.1. Phạm vi áp dụng: 54 3.7.2. Nguyên tắc: .54 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: .54 3.7.4. Chuẩn bị mẫu: .57 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: 58 3.7.6. Đảm bảo chất lượng 60 3.7.7. Tính toán kết quả: .60 KẾT LUẬN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN .1 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU .4 PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH 13 PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ .19 PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ ………….BẰNG HPLC –UV 29 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt DA Axít domoic Axít Domoic DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array EU European Liên minh Châu Âu FA Formic acid Axít Formic FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng NPLC Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận ND Not detected Không phát hiện RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic UV Ultra Violet Cự c tím VIS Visible Nhìn thấy iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diễn giải Trang Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .26 Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm 30 Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản 36 Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone 37 Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm .38 Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm 39 Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1 .40 Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1 41 Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2 42 Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2 43 Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2 44 Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm .47 Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark not defined. Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 49 Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. .49 Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) 51 Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS .53 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Diễn giải Trang Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng .16 Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp 17 Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm 17 Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .18 Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .19 Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử 20 Hình 07. Bộ ion hóa hóa học .20 Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực 22 Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS 23 Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18 .24 Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất .24 Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. 25 Hình 14. Mô hình thực nghiệm .29 Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV .37 Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V .38 Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .39 Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV .40 Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 41 Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 42 Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 43 Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 44 Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 45 Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 46 Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93 46 Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .47 Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .48 Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV .53 Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV 54 1 MỞ ĐẦU Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các nước phát triển. Xuấ t khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong công tác xuất kh ẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm 2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD. Một trong các thị trường nh ập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu, để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiể m tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xu ất khẩu cùng với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích. Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên 2 quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ). Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có công thức cấu tạo: Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC- UV và LC/MS n , phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … ) là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghi ệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất khẩu. Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại [...]...phòng thí nghiệm để Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam 3 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Hiện tượng thủy triều đỏ Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản xuất sơ cấp đồng thời... nhất định để định lượng Đối 11 với đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z Trên cơ sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng, khẳng định về một hợp chất nào đó 1.5 Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA 1.5.1 Phương pháp sinh. .. được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều hợp chất cùng nhóm) Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép làm các thử nghiệm trên động vật 1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một phương pháp khá nhạy và có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí phân tích ở mức trung bình Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển... số phòng kiểm nghiệm Sau đây là một số phương pháp điển hình, phù hợp đáp ứng được phân tích dư lượng DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản: 1.4.1 Phương pháp sinh hóa trên chuột Pha loãng dung dịch chuẩn ASP ở một số nồng độ tăng dần bằng nước vô trùng và tiêm vào màng bụng một số con chuột, tiêm mỗi con 1 ml cho đến khi xác định được nồng độ gây chết chuột trong khoảng thời gian từ 5 đến 7 phút... tụ độc tố sinh học biển, ta có thể nuôi lưu (nuôi ở trong môi trường nước biển sạch) thì có thể làm giảm hàm lượng độc tố Ví dụ, theo nghiên cứu của (Novaczek, 1992): 50% hàm lượng DA trong loài vẹm xanh được rửa giải trong vòng 24 h nuôi lưu, trong khi đó phải mất 86 ngày để rửa giải 50% DA trong razor clams (Siliqua patula) (Horner et al., 1993) 1.3.3 Độc tính của DA LD50 của DA khoảng 2,3 mg/kg khối. .. cầu trong nước là vô cùng cần thiết 1.6 Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] 12 Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau Kỹ thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng 1.6.1 Một số định. .. chuột đối với độc tố Sư thay đổi này đòi hỏi phải thay đổi hệ số CF [Sổ tay phương pháp của Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 2009] 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LCMS/MS) Thường mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần) Sau đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống... một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et al., 1996) 1.2 Độc tố sinh học biển trong thủy sản a Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù du... khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút Qua các phân tích nêu trên, ta thấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết Vì vậy việc nghiên cứu xây... triển để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với mức giới hạn cho phép thấp (ppb) Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra của các
